Summary
Modelli animali per la pancreatite acuta grave consentono lo studio dei cambiamenti fisiopatologici nella fase iniziale, facilitando l'osservazione dell'evoluzione degli eventi infiammatori. Qui forniamo un protocollo per l'induzione della pancreatite biliare acuta grave mediante infusione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto pancreatico di topi C57BL/6 anestetizzati.
Abstract
L'induzione della pancreatite acuta biliare mediante infusione di taurocolato di sodio è stata ampiamente utilizzata dalla comunità scientifica a causa della rappresentazione della condizione clinica umana e della riproduzione di eventi infiammatori corrispondenti all'insorgenza della pancreatite biliare clinica. La gravità del danno pancreatico può essere valutata misurando la concentrazione, la velocità e il volume dell'acido biliare infuso. Questo studio fornisce una lista di controllo aggiornata dei materiali e dei metodi utilizzati nella riproduzione del protocollo e mostra i principali risultati di questo modello di pancreatite acuta (AP). La maggior parte delle pubblicazioni precedenti si sono limitate a riprodurre questo modello nei ratti. Abbiamo applicato questo metodo nei topi, che fornisce ulteriori vantaggi (cioè la disponibilità di un arsenale di reagenti e anticorpi per questi animali insieme alla possibilità di lavorare con ceppi di topi geneticamente modificati) che possono essere rilevanti per lo studio. Per l'induzione della pancreatite acuta nei topi, presentiamo un protocollo sistematico, con una dose definita del 2,5% di taurocolato di sodio a una velocità di infusione di 10 μL / min per 3 minuti nei topi C57BL / 6 che raggiunge il suo massimo livello di gravità entro 12 ore dall'induzione ed evidenzia i risultati con risultati che convalidano il metodo. Con la pratica e la tecnica, il tempo totale stimato, dall'induzione dell'anestesia al completamento dell'infusione, è di 25 minuti per animale.
Introduction
Nell'uomo, la presenza di calcoli biliari è la causa più comune di pancreatite dovuta all'ostruzione della porzione terminale del coledocale, interrompendo il flusso delle secrezioni pancreatiche e causando un intenso processo infiammatorio nel pancreas, con un aumento della concentrazione di enzimi digestivi nel siero e mediatori infiammatori1,2.
Sono state proposte due diverse teorie per spiegare lo sviluppo della pancreatite acuta (AP). La teoria del "canale comune" suggerisce che le pietre presenti nella cistifellea ostruiscono il sistema del dotto biliare comune distale, consentendo alla secrezione biliare di fluire retrograda nel dotto pancreatico. La seconda teoria (la teoria dell'"ostruzione del dotto") suggerisce che l'ostruzione del dotto pancreatico da parte di calcoli biliari in eccesso provoca un blocco nel flusso della secrezione pancreatica al duodeno, causando ipertensione duttale3. Sebbene i meccanismi che portano alla pancreatite biliare acuta non siano completamente compresi, il risultato è un intenso processo infiammatorio. L'eruzione enzimatica digestiva e l'autodigestione del pancreas portano a cambiamenti istopatologici, un aumento delle citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α) nel liquido ascitico e nel siero e un aumento delle proteine di fase acuta4,5,6.
La pancreatite acuta grave è una condizione che merita attenzione clinica a causa del coinvolgimento di più organi e di un alto rischio di mortalità. I modelli animali per la riproduzione della pancreatite acuta (AP) sono importanti in quanto spiegano i meccanismi fisiopatologici della malattia e aiutano a monitorare l'evoluzione degli eventi infiammatori, a partire dalle fasi iniziali della malattia. Questo di solito non è possibile nelle cliniche2,7. Inoltre, l'accesso ai tessuti pancreatici è facile negli studi preclinici, favorendo la delucidazione dei cambiamenti legati alle condizioni cliniche8 insieme alla possibilità di lavorare con specie isogeniche, eliminando variabili indesiderate e rispecchiando la somiglianza clinica con gli esiti osservati nella condizione umana9.
Modelli biliari e non biliari per l'induzione della pancreatite acuta in ratti e specie di topi sono stati frequentemente studiati nella letteratura scientifica. I metodi di induzione non biliari includono la somministrazione di dosi stimolanti sopramassimali del secretagogo colecistochinina o della sua ceruleina analogica10; somministrazione di dosi quasi letali di L-arginina; o la somministrazione di una dieta carente di colina integrata con etionina11. Sebbene questi metodi siano facili da riprodurre e provochino infiammazione pancreatica, non replicano i meccanismi che in teoria innescano l'AP (cioè il reflusso della secrezione biliare nel dotto pancreatico). La tecnica che affronta il modello biliare si basa sull'infusione retrograda di acidi biliari nel dotto pancreatico e richiede ricercatori ben addestrati per eseguire questo protocollo. Diversi studi sono stati pubblicati utilizzando questo metodo nei ratti (apparentemente per ragioni tecniche poiché questi esperimenti comportano procedure chirurgiche)12,13. Tuttavia, l'approccio nei topi può offrire risultati più interessanti nello studio dell'infiammazione3,14,15. In questo studio, mostreremo una lista di controllo dei passaggi da seguire per la riproduzione della pancreatite acuta grave mediante infusione di taurocolato di sodio in topi anestetizzati C57BL/6.
Per i lavori che comportano la necessità di esperimenti con anticorpi e analisi dell'espressione genica e proteica, l'uso di topi è preferibile a causa del maggiore arsenale di materiali per questi animali e della possibilità di lavorare con specie isogeniche e knockout, tra gli altri che possono essere utilizzati rilevanti per gli studi16. Mice C57BL/6 è un ceppo inbred di topi originariamente sviluppato per lo studio dell'attività antitumorale e dell'immunologia. Questo ceppo è sempre più preferito dai ricercatori per essere isogenico, consentendo una maggiore riproducibilità dei risultati, il che può implicare l'uso di un numero minore di animali in un esperimento e una minore variabilità dei risultati tra lo stesso gruppo17,18.
Perides et al. (2010)14 hanno pubblicato un protocollo per l'induzione di AP nei topi mediante infusione di taurocolato di sodio. Qui aggiorniamo questo modello utilizzando una maggiore concentrazione di taurocolato di sodio (2,5%) nei topi C57BL/6, con un volume e una velocità di infusione definiti (Figura 1). Il livello massimo di gravità viene raggiunto entro 12 ore dall'induzione nei topi. L'innalzamento della concentrazione di IL-6 sia nel siero che nella cavità peritoneale è correlato alla progressione dell'AP. Con la pratica, il tempo totale stimato dall'induzione dell'anestesia al completamento dell'infusione è di 25 minuti per animale. È essenziale che un ricercatore qualificato conduca questo esperimento. Per garantire che la soluzione venga iniettata correttamente nel dotto biliare comune, eseguire diverse sessioni di addestramento pilota utilizzando il blu di metilene anziché il taurocolato di sodio.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico per l'uso di animali della USP Medicine School, Num. Progetto: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Per questo protocollo sono stati utilizzati topi C57BL/6, di età pari o superiore a 6 settimane, del peso di 20 ± 2 g (n = 9/gruppo).
1. Laparotomia
- Anestetizzare gli animali con xilazina (10 mg/kg) e soluzione di ketamina (80 mg/kg), per via sottocutanea (0,1 ml/10 g di peso corporeo) utilizzando una siringa da 1 mL e un ago 13x0,45 mm 26G 1/2. Verificare la presenza di una profondità di anestesia sufficiente pizzicando la punta. Controlla la temperatura corporea utilizzando cuscinetti riscaldati. Assicurarsi che tutti i materiali chirurgici siano sterili.
- Pulire la zona addominale con una soluzione di povidone-iodio al 5% e utilizzare un trimmer per rimuovere i peli tra il torace e l'addome inferiore (circa 2 cm2). Pulire l'area chirurgica con il 70% di alcol.
- Immobilizzare l'animale sulla scheda chirurgica usando il nastro chirurgico. Utilizzare le forbici per tagliare 5 mm della pelle orizzontalmente, sulla parte superiore dell'addome e 1 cm sotto il processo xifoide. Ripetere il taglio sul peritoneo. Ciò si tradurrà in una laparotomia con un'esposizione minima della cavità.
2. Localizzazione ed esposizione del pancreas
- Con l'aiuto di un divaricatore, tirare il fegato verso la testa del topo, a ~ 1 cm dall'intestino.
- Individuare la regione del pancreas che verrà iniettata con taurocolato di sodio (testa del pancreas). Individuare il duodeno con riferimento al fegato- sotto il fegato, sul lato destro (a sinistra come viene visualizzato il topo). Il duodeno è la prima parte dell'intestino tenue ed è collegato alla porzione finale dello stomaco.
- Con l'aiuto di una pinza, sollevare il fegato verso la testa dell'animale e tirare delicatamente la porzione dell'intestino tenue. Fissare le due estremità laterali dell'intestino tenue con una sutura in polipropilene 6-0 per visualizzare meglio la porzione distale del dotto biliare comune.
3. Induzione di pancreatite acuta grave
- Occludere temporaneamente il dotto biliare comune prossimale con una clip a microvaso per evitare che l'infusione retrograda fuoriesca nel fegato. Il dotto biliare comune può essere visto sul lato epatico del duodeno e la sua giunzione con il duodeno apparirà bianca. Esporre l'organo fuori dalla cavità addominale.
- Perforare la regione periampullaria (parte biancastra della parete dell'intestino tenue) per accedere al dotto biliare comune con un ago da 0,4 mm collegato a un tubo di polietilene da 0,54 mm.
- Fare un'occlusione temporanea del dotto biliare comune distale con 8-0 per evitare che la soluzione di taurocolato di sodio fuoriesca nel duodeno.
- Avviare la pompa per infusione e programmare un'infusione di taurocolato di sodio al 2,5% (diluita in soluzione salina allo 0,9%) a una velocità costante di 10 μL/10 g di peso corporeo per 3 minuti.
- Dopo l'infusione, rimuovere la clip del microvaso, il temporaneo 8-0 e l'ago per iniezione dal dotto pancreatico biliare per ricostituire il flusso fisiologico della bile.
- Alla fine, suturare l'addome con sutura monofilamento monofilamento non assorbente 6-0 sutura in polipropilene. Il tempo tra la laparotomia e la sutura finale dovrebbe essere di massimo 30 minuti (vedere Figura 1).
- Dopo l'intervento chirurgico, ospitare gli animali in scatole di polietilene rivestite con trucioli di legno e acqua e cibo ad libitum.
- Trattare i topi di controllo allo stesso modo dei topi sperimentali, ma assicurarsi che l'infusato sia costituito solo da soluzione salina. Eseguire la procedura chirurgica e l'infusione di soluzione salina (10 ml / min, per 3 minuti) in un gruppo di controllo (SHAM) per eliminare il pregiudizio infiammatorio causato dalla chirurgia e dalla cannulazione.
- Utilizzare tramadolo 12,5 mg / kg per via sottocutanea ogni 8 ore, a partire dal recupero post-chirurgico.
4. Metodi di analisi
- A 12 ore dall'induzione dell'AP, anestetizzare gli animali con xilazina (10 mg/kg) e ketamina (80 mg/kg) per raccogliere circa 250 μL di sangue attraverso il plesso orbitale.
- Tenere delicatamente la pelle sul retro, favorendo una leggera sporgenza del bulbo oculare, e posizionarla con l'occhio rivolto verso l'alto.
- Instillare una goccia di unguento per gli occhi contenente anestetico locale nell'occhio dell'animale.
- Posizionare l'estremità del tubo capillare nell'angolo mediale dell'occhio e inserirlo delicatamente sotto il bulbo oculare, con un angolo di ~30°-45°. Ruotare il tubo capillare fino all'inizio del flusso sanguigno. Ricorda che non è necessario usare la forza per la procedura.
- Una volta terminata la raccolta, assicura l'omeostasi tenendo le palpebre chiuse da una leggera compressione con la garza. Scartare il tubo capillare nel contenitore di taglienti19.
- Centrifugare il siero (700 x g, 15 min) e immagazzinare il surnatante per il dosaggio di amilasi e IL-6 (fasi 4.7 e 4.8).
- Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO2 .
- Utilizzare un ago da 27 G per iniettare 4 ml di PBS 1x ghiacciato nella cavità peritoneale. Tened la pelle addominale e assicurarsi che l'ago viene spinto lentamente nel peritoneo per non perforare alcun organo. Dopo l'iniezione, massaggiare delicatamente il peritoneo per 10 s per rimuovere le cellule aderenti al peritoneo.
- Usando forbici e pinzette, fai un piccolo taglio (0,5 cm) sulla pelle interna e sulla muscolatura per esporre la cavità addominale. Inserire una pipetta a bulbo nel peritoneo e raccogliere il fluido. Fare attenzione a non aspirare il tessuto adiposo o altri organi.
- Raccogliere più fluido possibile e depositare la sospensione cellulare raccolta in tubi tenuti sul ghiaccio. Scartare la pipetta della lampadina nel contenitore di taglienti20. Centrifugare il liquido peritoneale (250 x g, 5 min) e immagazzinare il surnatante per il dosaggio di IL-6 (fase 4.9).
- Raccogliere la regione del pancreas adiacente al duodeno (<5mm).
- Elaborare il pancreas fissando il 10% di formalina e incorporarlo nella paraffina.
- Colorare i vetrini con ematossilina ed eosina per analisi istopatologiche al microscopio ottico. Utilizzare il protocollo di Schmidt21 (edema pancreatico, cellule acinari, lesioni/necrosi, infiammazione pancreatica) per valutare l'estensione dell'AP.
- Misurare l'amilasi (U/dL) utilizzando kit disponibili in commercio secondo le raccomandazioni del produttore.
- MisuraRE IL-6 mediante saggi Luminex utilizzando kit commerciali secondo le raccomandazioni del produttore.
- Conservare il siero e il surnatante del liquido peritoneale ottenuti nelle fasi 4.1 e 4.4 in un congelatore a -80 °C, se necessario.
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Representative Results
La gravità della pancreatite è stata valutata tra 0-3 secondo la scala di Schmidt21 dove zero corrisponde all'assenza, 1 corrisponde a una presenza lieve (<25%), 2 corrisponde a una presenza moderata (tra il 25 e il 50%) e 3 corrisponde a una presenza intensa (> 50%) (Tabella 1). Le misurazioni eseguite sono state l'attività plasmatica dell'amilasi, l'edema pancreatico, le cellule acinari, la lesione/necrosi, l'infiammazione pancreatica (mediante analisi istologica delle sezioni colorate di H&E) e la concentrazione di citochine IL-6 nel siero e nel liquido PerC. Dopo 12 ore di AP grave, il gruppo APTA ha mostrato un aumento della concentrazione sierica di amilasi (6194 ± 336,7 U/dL), rispetto al gruppo sham (3845 ± 135,7 U/dL). Allo stesso tempo, il gruppo APTA ha mostrato un aumento della concentrazione di citochine IL-6 nel siero e nel liquido PerC (Figura 2). La Figura 3 mostra una colorazione rappresentativa dell'ematossilina-eosina del gruppo sham e APTA .
Figura 1: Schemi di induzione della pancreatite acuta grave da parte del 2,5% di taurocolato di sodio nei topi C57BL/6. (A) cistifellea; B) dotto biliare comune; C) dotto pancreatico; D) vena porta; E) clip per microvasi; F) sito di puntura (ago fissato a un tubo di polietilene e collegato alla pompa per infusione); (G) fissazione temporanea dell'ago nel dotto biliare comune. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi dopo 12 ore di pancreatite acuta grave. (A) Concentrazione sierica di amilasi (U/dL) dell'animale. (B) Concentrazione di citochine IL-6 nel siero e nel liquido PerC. Le differenze tra i gruppi sono state valutate mediante analisi t-test non accoppiata * p <0,05 se APTA ≠ sham (n = 9 / gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Edema interstiziale | Infiltrazione infiammatoria | Necrosi del parenchima | Emorragia di parenchima | |
| FINTO | 1±0* | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| APTA · | 3±0* | 3±0 | 3±0 | 3±0 |
| *P<0,05 se SHAM≠APTA. |
Tabella 1: Alterazioni istologiche nel tessuto pancreatico dopo 12 ore di AP grave. Il pancreas è stato elaborato e analizzato secondo la scala di Schmidt21. I risultati sono stati espressi come ± SEM medi e le differenze tra i gruppi sono state valutate dal test Student t. * p <0,05 se APTA ≠ SHAM; (n=9/gruppo).
Figura 3: Colorazione rappresentativa di ematossilina-eosina nel tessuto pancreatico dopo 12 ore di AP grave. Cambiamenti istologici nel tessuto pancreatico (A) SHAM e (B) APTA (colorazione ematossilina-eosina- ingrandimento 40x). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo per indurre pancreatite acuta mediante infusione retrograda di taurocolato di sodio è già stato dimostrato nei ratti22,23,24. Tre lavori simili, pubblicati nel 2008, 2010 e 2015, sono serviti come riferimento per il protocollo3,14,15. In questo lavoro, elenchiamo tutti i passaggi critici per la riproduzione di questo metodo in topi C57BL / 6 e alcune possibilità per convalidarlo.
Un passo critico in questo test è il blocco del dotto biliare a livello dell'ilo con una clip a microvaso (fase 3.1) per evitare il reflusso di taurocolato di sodio nel fegato. Questo passaggio richiede molta attenzione, poiché la vena porta è accanto al condotto (Figura 1D), quindi è necessario prestare attenzione a non bloccarla insieme. L'ago deve essere inserito solo nella porzione più distale del dotto. Se viene introdotto in profondità nel condotto, può causare una rottura con l'acido traboccante al parenchima ghiandolare e/o ad altri dotti14. Controllare che il tubo di polietilene abbia aria all'interno per evitare l'ostruzione del dotto biliare comune.
Questo modello richiede un'incisione nell'addome del topo. L'inserimento della cannula attraverso l'orifizio del dotto pancreatico richiede esperienza ma ciò può essere ottenuto con l'allenamento15,25. È importante sottolineare che la gravità della pancreatite in questo modello dipende proporzionalmente dalla concentrazione, dal volume dell'infusione, dalla pressione dell'infusione e dal tempo di induzione dell'AP. Pertanto, è necessario utilizzare una macchina per infusione costante con volume e pressione controllati.
Per questo studio, abbiamo standardizzato una concentrazione del 2,5%, con una velocità di infusione di 10 μL / min, per 3 minuti e una pressione costante. A 12 ore di AP, sono stati osservati un aumento dei parametri infiammatori e necrosi dei tessuti pancreatici, con animali che muoiono entro 16 ore dall'induzione dell'AP.
Sebbene le principali cause di AP siano il consumo di alcol o calcoli biliari, questi modelli non sono riproducibili sperimentalmente26. Attualmente, il protocollo più utilizzato per l'induzione di AP nei topi prevede 7 iniezioni intraperitoneali di ceruleina (50 μg/kg di peso corporeo) a intervalli di 1 ora27. Ceruleina è stato usato per indurre una pancreatite acuta lieve o moderata pure. La variabilità in questo modello ne limita l'uso nello studio degli effetti distruttivi della malattia, che conferiscono morbilità clinica e mortalità10. I modelli che innescano un'alta mortalità in breve tempo sono rilevanti per lo studio dell'AP grave (necrotizzazione), in quanto possono valutare l'efficacia di nuovi farmaci o interventi. Tra questi modelli ci sono l'induzione emorragica di AP in giovani roditori di sesso femminile (tra 4 e 6 settimane) da parte di una dieta carente di colina28 e L-arginina (ad esempio, 3 x 3 g / kg o 2 x 4 g / kg) a base di induzione di pancreatite acuta nei topi, ma il corretto dosaggio di L-arginina per indurre AP deve essere testato da ciascun laboratorio e in ciascun ceppo di topo29. Nel 2015, uno studio ha dimostrato che un'infusione intra-duttale di taurocolato seguita da legatura del dotto biliare comune distale porta a un modello grave e necrotico di pancreatite nei topi3. Tuttavia, questo modello non è utile per testare l'efficacia e gli interventi farmacologici a causa della sua condizione irreversibile.
I risultati trovati in questo studio sono correlati con la letteratura recente come l'aumento della concentrazione sierica di amilasi e IL-6 associato alla progressione della malattia. È possibile che in futuro la misurazione di proteine come TNF-α, IL-1β e mieloperossidasi sarà un parametro prognostico clinico per la pancreatite acuta grave30,31,32.
In conclusione, il protocollo utilizzato nel presente studio per indurre AP nei topi mediante infusione di taurocolato di sodio direttamente nel dotto biliare comune provoca una grave pancreatite acuta con necrosi del tessuto pancreatico che può essere osservata anche a 12 ore dopo l'induzione con elevazione della citochina IL-6 nel siero e nel liquido peritoneale e con elevata letalità (mortalità al 100% in 16 ore, dati non mostrati).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Post Graduation Program in Medical Clinic dell'Università di San Paolo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e University of São Paulo Medical School (FMUSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | - |
| Styrofoam block | - | - | - |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | - |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
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