بلانكوري Scrunching كما قراءات سلوكية كمية لتحسس المحفزات الضارة
Summary
يحمل المُعَلِّقون في المياه العذبة ثلاث مشيات (مزلق، و peristalsis، وscrunching) يمكن تمييزها من خلال التحليل السلوكي الكمي. نحن وصف طريقة للحث على scrunching باستخدام مختلف المحفزات الضارة، وتحديد كم من ذلك، والتمييز من ال peristalsis وتزلق. باستخدام ضرب الجينات ، ونحن نبين خصوصية scrunching كمي phenotypic القراءة.
Abstract
تنزلق عادة ً ألواح المياه العذبة بسلاسة من خلال الدفع الإستهوي على جانبها البطني. ومع ذلك، يمكن أن تحفز بعض الظروف البيئية أشكال الحركة التي يحركها العضلات: التملق أو التحلل. بينما ينتج ال peristalsis عن عيب ciliary، scrunching مستقل عن وظيفة أهداب وهو استجابة محددة لبعض المحفزات، بما في ذلك بتر، درجة الحرارة الضارة، درجة الحرارة القصوى، والإيثانول. وهكذا، فإن هاتين المشيتين اللتين يحركهما الالعضلات متميزة بشكل ميكانيكي. ومع ذلك، قد يكون من الصعب التمييز بين نوعي. هنا، ونحن نقدم بروتوكولا لتحفيز scrunching باستخدام مختلف المحفزات الفيزيائية والكيميائية. نحن تفاصيل التوصيف الكمي من scrunching، والتي يمكن استخدامها لتمييزه عن ال peristalsis وتزلق، وذلك باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية. منذ scrunching هو مشية شاملة بلاناية، وإن كان مع اختلافات مميزة الأنواع محددة، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع لجميع أنواع من planarians، عند استخدام الاعتبارات المناسبة. لإثبات ذلك، قارنا استجابة النوعين الأكثر شعبية في البحوث السلوكية، دوديسيا جابونيكا وميتميديرانيا، إلى نفس المجموعة من المحفزات الفيزيائية والكيميائية. وعلاوة على ذلك، فإن خصوصية scrunching يسمح هذا البروتوكول لاستخدامها جنبا إلى جنب مع تدخل الحمض النووي الريبي و / أو التعرض الدوائية لتشريح الأهداف الجزيئية والدوائر العصبية المعنية، مما يحتمل أن يوفر رؤية ميكانيكية في الجوانب الهامة من nociception والاتصالات العصبية العضلية.
Introduction
بالإضافة إلى شعبيتها لابحاث الخلايا الجذعية وتجديد1,2,3, وقد استخدمت منذ فترة طويلة في الدراسات السلوكية4,5,الاستفادة من حجمها الكبير نسبيا (بضعة ملليمترات في الطول), سهولة وانخفاض تكلفة صيانة المختبر, وطيف واسع من السلوكيات الملاحظة. وقد مكنت مقدمة من رؤية الكمبيوتر وتتبع الآلي لدراسات السلوك6،7،8،9،10،11 التمايز الكمي من الأنماط الظاهرية السلوكية. سلوك الحيوان هو قراءات مباشرة من وظيفة الخلايا العصبية. لأن الجهاز العصبي غير المتوسط الحجم والتعقيد، ولكن أسهم العناصر الأساسية المحفوظة مع الدماغ الفقارية12،13،14، يمكن لدراسة السلوك بلانيوار توفير نظرة ثاقبة آليات الحفاظ على العمل العصبي الذي قد يكون من الصعب التحقيق مباشرة في الكائنات الحية أكثر تعقيدا. وهكذا، فإن البوليين نموذج قيم للدراسات البيولوجية العصبية المقارنة8،12،15،16،17،18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك، تسمح البيئة المائية بالتعرض السريع والواه للمواد الكيميائية لدراسة تأثيرها على وظيفة المخ في التجديد و 26 من الكائنات الخبيثة في مجال تجديد الخلايا السنية، مما يجعلها نظامًا شائعًا في علم السموم العصبية22،23،24،25،26.
يمتلك المواحنون ثلاث مشيات متميزة ، يشار إليها باسم الانزلاق ، وال peristalsis ، وscrunching. كل مشية يتم عرضها في ظروف محددة: مزلق هو مشية الافتراضي, peristalsis يحدث عندما يتم اختراق وظيفة ciliary7,27, وscrunching هو مشية الهروب – مستقلة عن وظيفة أهداب – ردا على بعض المحفزات الضارة7. لقد أظهرنا أن scrunching هو استجابة محددة ، التي أثارها الإحساس ببعض الإشارات الكيميائية أو الفيزيائية ، بما في ذلك درجات الحرارة القصوى أو درجة الحرارة ، والإصابة الميكانيكية ، أو محرضات كيميائية محددة ، وبالتالي ليست استجابة عامة للإجهاد7،28،29.
بسبب خصوصيته والمعلمات النمطية، والتي يمكن بسهولة كميا باستخدام هذا البروتوكول، scrunching هو نمط ظاهري السلوكية القوية التي تمكن الباحثين من إجراء دراسات ميكانيكية تشريح المسارات الحسية والسيطرة العصبية من السلوك25،28. بالإضافة إلى ذلك ، وقد تبين أن scrunching نقطة نهاية حساسة لمجرا الآثار الكيميائية الضارة على تطوير الجهاز العصبي وظيفة في دراسات السمومالعصبية 22،24،25،30. كما يبدو عدة مسارات حسية مختلفة للالتقاء للحث على scrunching من خلال آليات مختلفة28, scrunching يختلف عن السلوكيات الأخرى االحلاني لأن مختلف, ولكن محددة, يمكن استخدام المحفزات لتشريح الدوائر العصبية متميزة ودراسة كيفية دمج إشارات مختلفة لإنتاج النمط الظاهري scrunching.
والأهم من ذلك، توجد اختلافات في الأنواع، حيث قد تثير مادة كيميائية واحدة التشوّر في نوع واحد من الأنواع القارّة، ولكن استجابة سلوكية مختلفة في نوع آخر. على سبيل المثال، وجدنا أن anandamide يحفز scrunching في الأنواع بلانكاري Dugesia japonica ولكن يدفع peristalsis في شميدتيا mediterranea28. يسلط هذا المثال الضوء على أهمية القدرة على التمييز بشكل موثوق بين المشي المختلفة ، لأنها هي المظاهر الظاهرية للآليات الجزيئية المتميزة. ومع ذلك ، فإن التمييز بين الزخرف من ال peristalsis صعب استخدام بيانات الرصد النوعي ، لأن كلا المشية يحركها العضلات وتشترك في أوجه التشابه النوعي7،28. وهكذا، للتمييز بين المشي فمن الضروري إجراء التصوير أهداب أو دراسة سلوكية كمية، والتي تسمح التمييز على أساس المعلمات المميزة7،,28. لأن التصوير أهداب تحديا تجريبيا ويتطلب معدات متخصصة مثل المجهر المركب عالية التكبير وكاميرا عالية السرعة7,28, فإنه ليس في متناول الباحثين على نطاق واسع كما التحليل السلوكي الكمي.
هنا، نقدم بروتوكول لـ (1) تحريض scrunching باستخدام مختلف المادية (درجة الحرارة الضارة، بتر، الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة) والكيميائية (الأليل isothiocyanate (AITC)، cinnamaldehyde) المحفزات و (2) التحليل الكمي للسلوك البلاناري باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية. من خلال قياس أربعة معلمات (تردد تذبذبات طول الجسم ، والسرعة النسبية ، والحد الأقصى للسعة ، وعدم التماثل في اطالة الجسم والانكماش)7، يمكن تمييز scrunching عن الانزلاق ، وال peristalsis ، والدول السلوكية الأخرى المبلغ عنها في الأدب ، مثل التزحلق الشبيه بالثعبان15 أو الصرع15. وعلاوة على ذلك، في حين يتم حفظ scrunching بين الأنواع المختلفة7،كل نوع له ترددها وسرعتها المميزة الخاصة بها. لذلك، مرة واحدة تم تحديد السرعات مزلق وscrunching من الأنواع، يمكن استخدام السرعة وحدها كوسيلة للتمييز scrunching من الانزلاق وsing29. لا يفترض البروتوكول أي تدريب مسبق على تحليل الصور الحسابية أو الدراسات السلوكية وبالتالي يمكن تطبيقها أيضًا على التجارب السلوكية التخطيطية في سياق مختبري تعليمي على مستوى البكالوريوس. وتقدم بيانات المثال لتيسير تكييف البروتوكول في المادة التكميلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن دراسة كمية آثار المحفزات الفيزيائية والكيميائية7،,28،,29 أو التلاعب الجيني (RNAi)28،29 على الحركة بلاناري. لتحقيق أقصى قدر من الدقة المكانية، فمن الأفضل لنقل الكاميرا أقرب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون السيد تابان غول على تعليقاته على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل NSF منحة الوظيفي 1555109.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
