Exploración planarian como una lectura cuantitativa del comportamiento para la detección de estímulos nocivos
Summary
Los planarios de agua dulce exhiben tres marchas (deslizamiento, peristalsis y esquivar) que se distinguen por el análisis cuantitativo del comportamiento. Describimos un método para inducir la ejecución utilizando diversos estímulos nocivos, la cuantificación de los mismos y la distinción de la peristalsis y el deslizamiento. Usando el derribo genético, demostramos la especificidad de la escorrida como una lectura fenotípica cuantitativa.
Abstract
Los planarios de agua dulce normalmente se deslizan suavemente a través de la propulsión ciliar en su lado ventral. Ciertas condiciones ambientales, sin embargo, pueden inducir formas de locomoción impulsadas por la musculatura: peristalsis o scrunching. Mientras que la peristalsis es el resultado de un defecto ciliar, el scrunching es independiente de la función de los cilios y es una respuesta específica a ciertos estímulos, incluyendo la amputación, la temperatura nociva, el pH extremo y el etanol. Por lo tanto, estas dos marchas impulsadas por la musculatura son mecánicamente distintas. Sin embargo, pueden ser difíciles de distinguir cualitativamente. Aquí, proporcionamos un protocolo para inducir scrunching usando diversos estímulos físicos y químicos. Detallamos la caracterización cuantitativa del scrunching, que se puede utilizar para distinguirla de la peristalsis y el deslizamiento, utilizando software de libre disposición. Dado que el scrunching es una marcha planaria universal, aunque con diferencias específicas de especies características, este protocolo se puede aplicar ampliamente a todas las especies de planarios, cuando se utilizan consideraciones apropiadas. Para demostrarlo, comparamos la respuesta de las dos especies planarias más populares utilizadas en la investigación conductual, Dugesia japonica y Schmidtea mediterranea,con el mismo conjunto de estímulos físicos y químicos. Además, la especificidad de la scrunching permite que este protocolo se utilice junto con la interferencia del ARN y/o la exposición farmacológica para diseccionar las dianas moleculares y los circuitos neuronales implicados, proporcionando potencialmente una visión mecanicista de aspectos importantes de la nocisión y la comunicación neuromuscular.
Introduction
Además de su popularidad para la investigación de células madre y regeneración1,2,3, planarios de agua dulce se han utilizado durante mucho tiempo en estudios de comportamiento4,5, aprovechando su tamaño comparativamente grande (unos pocos milímetros de longitud), facilidad y bajo costo de mantenimiento de laboratorio, y amplio espectro de comportamientos observables. La introducción de la visión computarizada y el seguimiento automatizado de los estudios de comportamiento plano6,,7,8,9,10,11 han permitido la diferenciación cuantitativa de los fenotipos conductuales. El comportamiento animal es una lectura directa de la función neuronal. Debido a que el sistema nervioso plano es de tamaño y complejidad medio, pero comparte elementos clave conservados con el cerebro vertebrado12,13,14, el estudio del comportamiento planario puede proporcionar información sobre mecanismos conservados de acción neuronal que pueden ser difíciles de sondear directamente en organismos más complejos. Así, los planarios son un modelo valioso para estudios comparativos de neurobiología8,,12,15,16,17,18,19,20,21. Además, el medio acuático permite una exposición rápida y fácil a los productos químicos para estudiar su efecto sobre la función cerebral en los planarios regeneradores y adultos, convirtiéndolos en un sistema popular para la neurotoxicología22,,23,,24,,25,,26.
Los planarios poseen tres marchas distintas, conocidas como deslizamiento, peristalsis y esquivar. Cada marcha se exhibe en circunstancias específicas: el deslizamiento es la marcha por defecto, la peristalsis se produce cuando la función ciliar se ve comprometida7,27, y el scrunching es una marcha de escape – independiente de la función de los cilios – en respuesta a ciertos estímulos nocivos7. Hemos demostrado que el scrunching es una respuesta específica, provocada por la sensación de ciertas señales químicas o físicas, incluyendo temperaturas extremas o pH, lesiones mecánicas o inductores químicos específicos, y por lo tanto no es una respuesta de estrés general7,,28,,29.
Debido a su especificidad y parámetros estereotípicos, que se pueden cuantificar fácilmente mediante este protocolo, el scrunching es un potente fenotipo conductual que permite a los investigadores realizar estudios mecánicos diseccionando vías sensoriales y control neuronal del comportamiento25,,28. Además, se ha demostrado que el esquivismo es un punto final sensible para el ensayo de efectos químicos adversos en el desarrollo del sistema nervioso y la función en los estudios de neurotoxicología22,24,25,30. Como varias vías sensoriales diferentes parecen converger para inducir el scrunching a través de varios mecanismos28, el scrunching se diferencia de otros comportamientos planarios porque se pueden utilizar diversos, pero específicos, estímulos para diseccionar distintos circuitos neuronales y estudiar cómo se integran diferentes señales para producir el fenotipo esquiroido.
Es importante destacar que existen diferencias de especies, en las que un producto químico puede provocar esquivar en una especie planaria, pero una respuesta conductual diferente en otra. Por ejemplo, hemos encontrado que la anandamida induce esquivar en la especie planaria Dugesia japonica, pero induce la peristalsis en Schmidtea mediterranea28. Este ejemplo destaca la importancia de poder distinguir de forma fiable entre las diferentes marchas, porque son las manifestaciones fenotípicas de mecanismos moleculares distintos. Sin embargo, la distinción de scrunching de peristalsis es difícil utilizando datos observacionales cualitativos, porque ambas marchas están impulsadas por la musculatura y comparten similitudes cualitativas7,,28. Así, para distinguir las marchas es necesario realizar imágenes de cilios o un estudio de comportamiento cuantitativo, que permita la distinción basada en los parámetros característicos7,,28. Debido a que las imágenes de cilios son experimentalmente desafiantes y requieren equipos especializados como un microscopio compuesto de alto aumento y una cámara de alta velocidad7,,28, no es tan ampliamente accesible para los investigadores como el análisis cuantitativo del comportamiento.
Aquí, presentamos un protocolo para (1) la inducción de scrunching utilizando diversos estímulos físicos (temperatura nociva, amputación, luz casi UV) y químicos (alilo isotiocianato (AITC), cinnamaldehído) y (2) el análisis cuantitativo del comportamiento planario utilizando software de libre disponibilidad. Mediante la cuantificación de cuatro parámetros (frecuencia de oscilaciones de longitud corporal, velocidad relativa, amplitud máxima y asimetría de alargamiento y contracción corporal)7, el esquivar se puede diferenciar de deslizamiento, peristalsis y otros estados de comportamiento reportados en la literatura, como locomoción similar a una serpiente15 o epilepsias15. Además, mientras que el scrunching se conserva entre las diferentes especies planarias7, cada especie tiene su propia frecuencia y velocidad característica; por lo tanto, una vez que se han determinado las velocidades de deslizamiento y esquivar de una especie, la velocidad por sí sola puede utilizarse como un medio para distinguir el esquivar del deslizamiento y la peristalsis29. El protocolo no supone ningún entrenamiento previo en análisis computacional de imágenes o estudios de comportamiento y, por lo tanto, también se puede aplicar para experimentos de comportamiento plano en un contexto de laboratorio de enseñanza a nivel de pregrado. En el Material Suplementario se proporcionan datos de ejemplo para facilitar la adaptación del protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando este protocolo, se pueden estudiar cuantitativamente los efectos de los estímulos físicos y químicos7,28,29 o la manipulación genética (RNAi)28,29 en la locomoción plana. Para maximizar la resolución espacial, lo mejor es mover la cámara lo más cerca posible de la arena mientras se asegura de que toda la arena esté en el campo de visión. Para aumentar e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Sr. Tapan Goel los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
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