Summary

Planarian Scrunching als quantitatives Behavioral Readout für Noxious Stimuli Sensing

Published: July 30, 2020
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Summary

Süßwasserplanarier weisen drei Gangarten (Gleiten, Peristaltik und Scrunching) auf, die sich durch quantitative Verhaltensanalysen unterscheiden. Wir beschreiben eine Methode, um Scrunching mit verschiedenen schädlichen Reizen, Quantifizierung davon und Unterscheidung von Peristaltik und Gleiten zu induzieren. Anhand von Gen Knockdown zeigen wir die Spezifität des Scrunchings als quantitative phänotypische Auslesung.

Abstract

Süßwasserplanarier gleiten normalerweise sanft durch Ziliarantrieb auf ihrer ventralen Seite. Bestimmte Umgebungsbedingungen können jedoch muskulierungsgetriebene Formen der Fortbewegung induzieren: Peristalsis oder Scrunching. Während peristaltik auf einen Ziliardefekt zurückgeht, ist das Zerkleinern unabhängig von der Zilienfunktion und eine spezifische Reaktion auf bestimmte Reize, einschließlich Amputation, schädliche Temperatur, extremer pH-Wert und Ethanol. So sind diese beiden muskulentgetriebenen Gangarten mechanistisch verschieden. Sie können jedoch qualitativ schwer zu unterscheiden sein. Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion von Scrunching mit verschiedenen physikalischen und chemischen Reizen zur Verfügung. Wir beschreiben die quantitative Charakterisierung des Scrunchings, mit dem man es mit frei verfügbarer Software von Peristaltik und Gleiten unterscheidet. Da Scrunching ein universeller planarischer Gang ist, wenn auch mit charakteristischen artspezifischen Unterschieden, kann dieses Protokoll bei geeigneten Überlegungen allgemein auf alle Arten von Planariern angewendet werden. Um dies zu demonstrieren, vergleichen wir die Reaktion der beiden beliebtesten planarianArten, die in der Verhaltensforschung verwendet werden, Dugesia japonica und Schmidtea mediterranea, mit dem gleichen Satz physikalischer und chemischer Reize. Darüber hinaus ermöglicht die Scrunching-Spezifität die Verwendung dieses Protokolls in Verbindung mit RNA-Interferenzen und/oder pharmakologischer Exposition zur Sezieren der molekularen Ziele und neuronalen Schaltkreise, was potenziell mechanistische Einblicke in wichtige Aspekte der Nozieption und neuromuskulären Kommunikation bietet.

Introduction

Zusätzlich zu ihrer Popularität für Die Stammzell- und Regenerationsforschung1,2,3, Süßwasserplanarier sind seit langem in Verhaltensstudien verwendet4,5, unter Ausnutzung ihrer vergleichsweise großen (ein paar Millimeter In-Länge), Leichtigkeit und niedrige Kosten der Laborwartung, und breites Spektrum von beobachtbaren Verhaltensweisen. Die Einführung von Computer Vision und automatisiertes Tracking in planarische Verhaltensstudien6,7,8,9,10,11 haben eine quantitative Differenzierung von Verhaltensphänotypen ermöglicht. Tierverhalten ist eine direkte Auslesung der neuronalen Funktion. Da das planarische Nervensystem von mittlerer Größe und Komplexität ist, aber konservierte Schlüsselelemente mit dem Wirbeltier gehirn12,13,14teilen, kann das Studium des planarischen Verhaltens Einblicke in konservierte Mechanismen neuronaler Wirkung geben, die in komplexeren Organismen schwer direkt zu erforschen sind. So sind Planarier ein wertvolles Modell für vergleichende neurobiologische Studien8,12,15,16,17,18,19,20,21. Darüber hinaus ermöglicht die aquatische Umwelt eine schnelle und einfache Exposition gegenüber Chemikalien, um ihre Wirkung auf die Gehirnfunktion bei regenerierenden und erwachsenen Planariern zu untersuchen, was sie zu einem beliebten System für Neurotoxikologie22,23,24,25,26macht.

Die Planarier besitzen drei verschiedene Gangarten, die als Gleiten, Peristalismus und Zerkleinern bezeichnet werden. Jeder Gang wird unter bestimmten Umständen ausgestellt: Gleiten ist der Standard-Gang, Peristaltik tritt auf, wenn Die Ziliarfunktion kompromittiert wird7,27, und Scrunching ist ein Escape-Gang – unabhängig von der Zilienfunktion – als Reaktion auf bestimmte schädliche Reize7. Wir haben gezeigt, dass Scrunching eine spezifische Reaktion ist, die durch das Gefühl bestimmter chemischer oder physikalischer Hinweise, einschließlich extremer Temperaturen oder pH-Wert, mechanischer Verletzungen oder spezifischer chemischer Induktoren, ausgelöst wird, und daher keine allgemeine Stressreaktionist 7,28,29.

Aufgrund seiner Spezifität und stereotypen Parameter, die leicht mit diesem Protokoll quantifiziert werden können, ist Scrunching ein leistungsstarker Verhaltens-Phänotyp, der es Forschern ermöglicht, mechanistische Studien durchzuführen, die sensorische Bahnen und neuronale Kontrolle des Verhaltenssezieren 25,28. Zusätzlich, Scrunching hat sich gezeigt, dass ein empfindlicher Endpunkt zu assay nachteilige chemische Auswirkungen auf die Entwicklung des Nervensystems und Funktion in neurotoxikologischen Studien22,24,25,30. Da mehrere verschiedene Sinneswege zu konvergieren scheinen, um Durchschnaufen durch verschiedene Mechanismen zu induzieren28, scrunching unterscheidet sich von anderen planarischen Verhaltensweisen, weil verschiedene, aber spezifische, Reize verwendet werden können, um verschiedene neuronale Schaltkreise zu sezieren und zu studieren, wie verschiedene Signale integriert sind, um den scrunching Phänotyp zu produzieren.

Wichtig ist, dass es Artenunterschiede gibt, wobei eine Chemikalie bei einer planarienden Art zerkleinern kann, aber eine andere Verhaltensreaktion in einer anderen. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass Anandamid bei der planarischen Art Dugesia japonica Zerkleinerung induziert, aber Peristalsis in Schmidtea mediterranea28induziert. Dieses Beispiel unterstreicht die Bedeutung der zuverlässigen Unterscheidung zwischen den verschiedenen Gangarten, da sie die phänotypischen Manifestationen unterschiedlicher molekularer Mechanismen sind. Die Unterscheidung von Derperistaltik ist jedoch schwierig, wenn man qualitative Beobachtungsdaten verwendet, da beide Gangarten muskulierungsgetrieben sind und qualitative Ähnlichkeiten aufweisen7,28. Daher ist es notwendig, zilienbildende Oder eine quantitative Verhaltensstudie durchzuführen, die eine Unterscheidung anhand der charakteristischen Parameter7,28ermöglicht. Da die Zilien-Bildgebung experimentell anspruchsvoll ist und spezielle Geräte wie ein Hochvergrößerungsmikroskop und eine Hochgeschwindigkeitskamera7,28erfordert, ist sie für Forscher nicht so breit zugänglich wie quantitative Verhaltensanalysen.

Hier stellen wir ein Protokoll für (1) die Induktion von Scrunching unter Verwendung verschiedener physikalischer (noxious temperature, amputation, near-UV light) und chemical (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyd) Reize und (2) die quantitative Analyse des planarischen Verhaltens mit frei verfügbarer Software vor. Durch die Quantifizierung von vier Parametern (Frequenz der Körperlängenschwingungen, relative Geschwindigkeit, maximale Amplitude und Asymmetrie der Körperdehnung und Kontraktion)7kann das Schrumpfen von Gleiten, Peristalismus und anderen in der Literatur berichteten Verhaltenszuständen unterschieden werden, wie schlangenartige Fortbewegung15 oder Epilepsien15. Darüber hinaus, während Scrunching zwischen verschiedenen planrischen Artenkonserviertwird 7 , jede Art hat ihre eigene charakteristische Häufigkeit und Geschwindigkeit; Sobald also die Gleit- und Schimmergeschwindigkeiten einer Art bestimmt sind, kann die Geschwindigkeit allein als Mittel verwendet werden, um das Schrumpfen von Gleiten und Peristalismus29zu unterscheiden. Das Protokoll geht davon aus, dass es keine vorherige Ausbildung in computergestützter Bildanalyse oder Verhaltensstudien gibt und somit auch für planare Verhaltensexperimente in einem Lehrlaborkontext auf Bachelor-Ebene angewendet werden kann. Beispieldaten zur Erleichterung der Protokollanpassung finden Sie im Ergänzungsmaterial.

Protocol

1. Quantitative planarische Verhaltenstests Experimentelle EinrichtungLegen Sie ein dimmbares LED-Panel auf eine flache Oberfläche. Das LED-Panel dient zwei Zwecken: (1) einen einheitlichen weißen Hintergrund zu bieten und (2) als einstellbare Lichtquelle zu verwenden, um einen angemessenen Kontrast zu erhalten. Legen Sie eine 100 mm Petrischale Arena auf die LED-Platte.HINWEIS: Um den Durchsatz zu erhöhen, kann eine Multi-Well-Platte als Arena23,<sup class="xre…

Representative Results

Die extraokulare Nah-UV-Wahrnehmung bei S. mediterranea planarians ist TRPA1-abhängig und wurde vorgeschlagen, mit H2O2 Release17in Verbindung zu stehen. Da die H2O2-Exposition BEI S. mediterranea und D. japonica planarians28TRPA1-abhängiges Scrunching induziert, können die Schritte in Abschnitt 2.1.4 verwendet werden, um zu testen, ob die UV-nahe Lichtexposition bei beiden Arten zu Einem Scrunching f…

Discussion

Mit diesem Protokoll kann man die Auswirkungen physikalischer und chemischer Reize7,28,29 oder genetische Manipulation (RNAi)28,29 auf planare Fortbewegung quantitativ untersuchen. Um die räumliche Auflösung zu maximieren, ist es am besten, die Kamera so nah wie möglich an die Arena zu bewegen und gleichzeitig sicherzustellen, dass sich die gesamte Arena im Sichtfeld …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Herrn Tapan Goel für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den NSF CAREER Grant 1555109 finanziert.

Materials

Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) Sigma-Aldrich 377430-5G CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4  Tamron 23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated Genesee Scientific  25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile MedSupply Partners 62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95% Sigma-Aldrich W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box Amazon B07HD631RP
Flea3 USB3 camera FLIR FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves Fisher Scientific 11-394-298
Hot plate Fisher Scientific HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water Instant Ocean SS15-10 Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water Sigma-Aldrich various Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene Simport D210-7
Pipette, 20-200 μL range Rainin 17008652
PYREX 150 mL beaker Sigma-Aldrich CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm VWR 55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber Rosco R21 Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red Rosco R27
Roscolux color filter:  Storaro Red Rosco R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture Thermo Fisher 691TS
Support stand  Fisher Scientific 12-947-976
Thermometer VWR 89095-600
UV laser pointer Amazon B082DGS86R This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.

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Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).

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