Planarian Scrunching als quantitatives Behavioral Readout für Noxious Stimuli Sensing
Summary
Süßwasserplanarier weisen drei Gangarten (Gleiten, Peristaltik und Scrunching) auf, die sich durch quantitative Verhaltensanalysen unterscheiden. Wir beschreiben eine Methode, um Scrunching mit verschiedenen schädlichen Reizen, Quantifizierung davon und Unterscheidung von Peristaltik und Gleiten zu induzieren. Anhand von Gen Knockdown zeigen wir die Spezifität des Scrunchings als quantitative phänotypische Auslesung.
Abstract
Süßwasserplanarier gleiten normalerweise sanft durch Ziliarantrieb auf ihrer ventralen Seite. Bestimmte Umgebungsbedingungen können jedoch muskulierungsgetriebene Formen der Fortbewegung induzieren: Peristalsis oder Scrunching. Während peristaltik auf einen Ziliardefekt zurückgeht, ist das Zerkleinern unabhängig von der Zilienfunktion und eine spezifische Reaktion auf bestimmte Reize, einschließlich Amputation, schädliche Temperatur, extremer pH-Wert und Ethanol. So sind diese beiden muskulentgetriebenen Gangarten mechanistisch verschieden. Sie können jedoch qualitativ schwer zu unterscheiden sein. Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion von Scrunching mit verschiedenen physikalischen und chemischen Reizen zur Verfügung. Wir beschreiben die quantitative Charakterisierung des Scrunchings, mit dem man es mit frei verfügbarer Software von Peristaltik und Gleiten unterscheidet. Da Scrunching ein universeller planarischer Gang ist, wenn auch mit charakteristischen artspezifischen Unterschieden, kann dieses Protokoll bei geeigneten Überlegungen allgemein auf alle Arten von Planariern angewendet werden. Um dies zu demonstrieren, vergleichen wir die Reaktion der beiden beliebtesten planarianArten, die in der Verhaltensforschung verwendet werden, Dugesia japonica und Schmidtea mediterranea, mit dem gleichen Satz physikalischer und chemischer Reize. Darüber hinaus ermöglicht die Scrunching-Spezifität die Verwendung dieses Protokolls in Verbindung mit RNA-Interferenzen und/oder pharmakologischer Exposition zur Sezieren der molekularen Ziele und neuronalen Schaltkreise, was potenziell mechanistische Einblicke in wichtige Aspekte der Nozieption und neuromuskulären Kommunikation bietet.
Introduction
Zusätzlich zu ihrer Popularität für Die Stammzell- und Regenerationsforschung1,2,3, Süßwasserplanarier sind seit langem in Verhaltensstudien verwendet4,5, unter Ausnutzung ihrer vergleichsweise großen (ein paar Millimeter In-Länge), Leichtigkeit und niedrige Kosten der Laborwartung, und breites Spektrum von beobachtbaren Verhaltensweisen. Die Einführung von Computer Vision und automatisiertes Tracking in planarische Verhaltensstudien6,7,8,9,10,11 haben eine quantitative Differenzierung von Verhaltensphänotypen ermöglicht. Tierverhalten ist eine direkte Auslesung der neuronalen Funktion. Da das planarische Nervensystem von mittlerer Größe und Komplexität ist, aber konservierte Schlüsselelemente mit dem Wirbeltier gehirn12,13,14teilen, kann das Studium des planarischen Verhaltens Einblicke in konservierte Mechanismen neuronaler Wirkung geben, die in komplexeren Organismen schwer direkt zu erforschen sind. So sind Planarier ein wertvolles Modell für vergleichende neurobiologische Studien8,12,15,16,17,18,19,20,21. Darüber hinaus ermöglicht die aquatische Umwelt eine schnelle und einfache Exposition gegenüber Chemikalien, um ihre Wirkung auf die Gehirnfunktion bei regenerierenden und erwachsenen Planariern zu untersuchen, was sie zu einem beliebten System für Neurotoxikologie22,23,24,25,26macht.
Die Planarier besitzen drei verschiedene Gangarten, die als Gleiten, Peristalismus und Zerkleinern bezeichnet werden. Jeder Gang wird unter bestimmten Umständen ausgestellt: Gleiten ist der Standard-Gang, Peristaltik tritt auf, wenn Die Ziliarfunktion kompromittiert wird7,27, und Scrunching ist ein Escape-Gang – unabhängig von der Zilienfunktion – als Reaktion auf bestimmte schädliche Reize7. Wir haben gezeigt, dass Scrunching eine spezifische Reaktion ist, die durch das Gefühl bestimmter chemischer oder physikalischer Hinweise, einschließlich extremer Temperaturen oder pH-Wert, mechanischer Verletzungen oder spezifischer chemischer Induktoren, ausgelöst wird, und daher keine allgemeine Stressreaktionist 7,28,29.
Aufgrund seiner Spezifität und stereotypen Parameter, die leicht mit diesem Protokoll quantifiziert werden können, ist Scrunching ein leistungsstarker Verhaltens-Phänotyp, der es Forschern ermöglicht, mechanistische Studien durchzuführen, die sensorische Bahnen und neuronale Kontrolle des Verhaltenssezieren 25,28. Zusätzlich, Scrunching hat sich gezeigt, dass ein empfindlicher Endpunkt zu assay nachteilige chemische Auswirkungen auf die Entwicklung des Nervensystems und Funktion in neurotoxikologischen Studien22,24,25,30. Da mehrere verschiedene Sinneswege zu konvergieren scheinen, um Durchschnaufen durch verschiedene Mechanismen zu induzieren28, scrunching unterscheidet sich von anderen planarischen Verhaltensweisen, weil verschiedene, aber spezifische, Reize verwendet werden können, um verschiedene neuronale Schaltkreise zu sezieren und zu studieren, wie verschiedene Signale integriert sind, um den scrunching Phänotyp zu produzieren.
Wichtig ist, dass es Artenunterschiede gibt, wobei eine Chemikalie bei einer planarienden Art zerkleinern kann, aber eine andere Verhaltensreaktion in einer anderen. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass Anandamid bei der planarischen Art Dugesia japonica Zerkleinerung induziert, aber Peristalsis in Schmidtea mediterranea28induziert. Dieses Beispiel unterstreicht die Bedeutung der zuverlässigen Unterscheidung zwischen den verschiedenen Gangarten, da sie die phänotypischen Manifestationen unterschiedlicher molekularer Mechanismen sind. Die Unterscheidung von Derperistaltik ist jedoch schwierig, wenn man qualitative Beobachtungsdaten verwendet, da beide Gangarten muskulierungsgetrieben sind und qualitative Ähnlichkeiten aufweisen7,28. Daher ist es notwendig, zilienbildende Oder eine quantitative Verhaltensstudie durchzuführen, die eine Unterscheidung anhand der charakteristischen Parameter7,28ermöglicht. Da die Zilien-Bildgebung experimentell anspruchsvoll ist und spezielle Geräte wie ein Hochvergrößerungsmikroskop und eine Hochgeschwindigkeitskamera7,28erfordert, ist sie für Forscher nicht so breit zugänglich wie quantitative Verhaltensanalysen.
Hier stellen wir ein Protokoll für (1) die Induktion von Scrunching unter Verwendung verschiedener physikalischer (noxious temperature, amputation, near-UV light) und chemical (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyd) Reize und (2) die quantitative Analyse des planarischen Verhaltens mit frei verfügbarer Software vor. Durch die Quantifizierung von vier Parametern (Frequenz der Körperlängenschwingungen, relative Geschwindigkeit, maximale Amplitude und Asymmetrie der Körperdehnung und Kontraktion)7kann das Schrumpfen von Gleiten, Peristalismus und anderen in der Literatur berichteten Verhaltenszuständen unterschieden werden, wie schlangenartige Fortbewegung15 oder Epilepsien15. Darüber hinaus, während Scrunching zwischen verschiedenen planrischen Artenkonserviertwird 7 , jede Art hat ihre eigene charakteristische Häufigkeit und Geschwindigkeit; Sobald also die Gleit- und Schimmergeschwindigkeiten einer Art bestimmt sind, kann die Geschwindigkeit allein als Mittel verwendet werden, um das Schrumpfen von Gleiten und Peristalismus29zu unterscheiden. Das Protokoll geht davon aus, dass es keine vorherige Ausbildung in computergestützter Bildanalyse oder Verhaltensstudien gibt und somit auch für planare Verhaltensexperimente in einem Lehrlaborkontext auf Bachelor-Ebene angewendet werden kann. Beispieldaten zur Erleichterung der Protokollanpassung finden Sie im Ergänzungsmaterial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit diesem Protokoll kann man die Auswirkungen physikalischer und chemischer Reize7,28,29 oder genetische Manipulation (RNAi)28,29 auf planare Fortbewegung quantitativ untersuchen. Um die räumliche Auflösung zu maximieren, ist es am besten, die Kamera so nah wie möglich an die Arena zu bewegen und gleichzeitig sicherzustellen, dass sich die gesamte Arena im Sichtfeld …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Herrn Tapan Goel für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den NSF CAREER Grant 1555109 finanziert.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
