Summary

Planarian scrunching som en kvantitativ atferdslesning for skadelige Stimuli Sensing

Published: July 30, 2020
doi:

Summary

Ferskvannsplanarianere viser tre gaits (gliding, peristaltikk og scrunching) som kan skilles ved kvantitativ atferdsanalyse. Vi beskriver en metode for å indusere scrunching ved hjelp av ulike skadelige stimuli, kvantifisering av disse, og skille fra peristaltikk og gliding. Ved hjelp av genbanke, viser vi spesifisiteten av scrunching som en kvantitativ fenotypisk avlesning.

Abstract

Ferskvannsplanarianere glir normalt jevnt gjennom ciliary fremdrift på deres ventrale side. Visse miljøforhold kan imidlertid indusere muskulaturdrevne former for bevegelse: peristaltikk eller scrunching. Mens peristaltikk skyldes en ciliary defekt, er scrunching uavhengig av flimmerhår funksjon og er en spesifikk respons på visse stimuli, inkludert amputasjon, skadelig temperatur, ekstrem pH og etanol. Dermed er disse to muskulaturdrevne gaits mekanistisk distinkte. Imidlertid kan de være vanskelige å skille kvalitativt. Her gir vi en protokoll for å indusere scrunching ved hjelp av ulike fysiske og kjemiske stimuli. Vi detaljer den kvantitative karakterisering av scrunching, som kan brukes til å skille den fra peristaltikk og gliding, ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Siden scrunching er en universell planarian gangart, om enn med karakteristiske artsspesifikke forskjeller, kan denne protokollen brukes bredt på alle arter av planarianere, når man bruker passende hensyn. For å demonstrere dette sammenligner vi responsen fra de to mest populære planariske artene som brukes i atferdsforskning, Dugesia japonica og Schmidtea mediterranea, med samme sett med fysiske og kjemiske stimuli. Videre gjør spesifisiteten av scrunching denne protokollen som skal brukes sammen med RNA-interferens og / eller farmakologisk eksponering for dissekere molekylære mål og nevronale kretser involvert, noe som potensielt gir mekanistisk innsikt i viktige aspekter ved nociception og nevromuskulær kommunikasjon.

Introduction

I tillegg til deres popularitet for stamcelle- og regenereringsforskning1,2,3, har ferskvannsplanarianere lenge vært brukt i atferdsstudier4,5, og drar nytte av deres relativt store størrelse (noen få millimeter i lengde), letthet og lave kostnader for laboratorievedlikehold og bredt spekter av observerbar atferd. Innføringen av datasyn og automatisert sporing til planære atferdsstudier6,7,8,9,10,11 har aktivert kvantitativ differensiering av atferdsfenotyper. Dyrs oppførsel er en direkte avlesning av nevronal funksjon. Fordi det planære nervesystemet er av middels størrelse og kompleksitet, men deler bevarte nøkkelelementer med virveldyr hjernen12,13,14, studere planarisk atferd kan gi innsikt i bevarte mekanismer for nevronal handling som kan være vanskelig å direkte sonde i mer komplekse organismer. Dermed er planarianere en verdifull modell for komparative nevrobiologistudier8,12,15,16,17,18,19,20,21. I tillegg gjør vannmiljøet mulighet for rask og facile eksponering for kjemikalier for å studere deres effekt på hjernefunksjonen i regenererende og voksne planarianere, noe som gjør dem til et populært system for nevrotoksikologi22,23,24,25,26.

Planarianere har tre forskjellige gaits, referert til som gliding, peristaltikk, og scrunching. Hver gangart er utstilt under spesielle omstendigheter: gliding er standard gangart, peristaltikk oppstår når ciliary funksjon erkompromittert 7,27, og scrunching er en flukt gangart – uavhengig av flimmerhår funksjon – som svar på visse skadelige stimuli7. Vi har vist at scrunching er en bestemt respons, fremkalt av følelsen av visse kjemiske eller fysiske signaler, inkludert ekstreme temperaturer eller pH, mekanisk skade eller spesifikke kjemiske induktorer, og dermed ikke er en generell stressrespons7,28,29.

På grunn av sin spesifisitet og stereotypiske parametere, som lett kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen, er scrunching en kraftig atferdsfenotype som gjør det mulig for forskere å utføre mekanistiske studier som dissekerer sensoriske veier og nevronal kontrollav atferd 25,28. I tillegg har scrunching vist seg å være et følsomt endepunkt for å analysere negative kjemiske effekter på nervesystemet utvikling og funksjon i nevrotoksikologistudier 22,,24,,25,,30. Som flere forskjellige sensoriske veier synes å konvergere for å indusere scrunching gjennom ulikemekanismer 28, scrunching skiller seg fra andre planære atferd fordi ulike, men spesifikke, stimuli kan brukes til å dissekere distinkte nevronale kretser og studere hvordan ulike signaler er integrert for å produsere scrunching fenotype.

Det er viktig at det finnes artsforskjeller, hvor ett kjemikalie kan fremkalle scrunching i en planarisk art, men en annen atferdsrespons i en annen. For eksempel har vi funnet ut at anandamid induserer scrunching i den planære arten Dugesia japonica men induserer peristaltikk i Schmidtea Middelhavet28. Dette eksemplet understreker viktigheten av å kunne skille pålitelig mellom de forskjellige gaits, fordi de er fenotypiske manifestasjoner av forskjellige molekylære mekanismer. Imidlertid er det vanskelig å skille seg fra peristaltikk ved hjelp av kvalitative observasjonsdata, fordi begge gaits er muskulaturdrevet og deler kvalitativelikheter 7,28. Dermed, for å skille gaits er det nødvendig å utføre cilia imaging eller en kvantitativ atferdsstudie, som tillater forskjell basert på karakteristiskeparametere 7,28. Fordi cilia imaging er eksperimentelt utfordrende og krever spesialisert utstyr som et høyforstørrelsessammensnisk mikroskop og et høyhastighetskamera7,28, er det ikke så bredt tilgjengelig for forskere som kvantitativ atferdsanalyse.

Her presenterer vi en protokoll for (1) induksjon av scrunching ved hjelp av ulike fysiske (skadelige temperatur, amputasjon, nær-UV-lys) og kjemisk (allylisothiocyanat (AITC), cinnamaldehyd) stimuli og (2) kvantitativ analyse av planarisk atferd ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Ved å kvantifisere fire parametere(hyppighetenav kroppslengdesvingninger, relativ hastighet, maksimal amplitude og asymmetri av kroppsforlengelse og sammentrekning) 7 , kan scrunching differensieres fra gliding, peristaltikk og andre atferdsmessige tilstander rapportert i litteraturen, for eksempel slangelignende bevegelse15 eller epilepsi15. Videre, mens scrunching er bevart blant ulike planære arter7, hver art har sin egen karakteristiske frekvens og hastighet; Derfor, når gliding og scrunching hastigheter av en art er bestemt, hastighet alene kan brukes som et middel til å skille scrunching fra gliding og peristaltikk29. Protokollen forutsetter ingen tidligere opplæring i beregningsbildeanalyse eller atferdsstudier, og kan dermed også brukes til planære atferdseksperimenter i en undervisningslaboratoriumkontekst på lavere nivå. Eksempeldata for å legge til rette for protokolltilpasning er gitt i tilleggsmaterialet.

Protocol

1. Kvantitative planære atferdsanalyser Eksperimentelt oppsettPlasser et dimbart LED-panel på et flatt underlag. LED-panelet tjener to formål: (1) for å gi en ensartet hvit bakgrunn og (2) som skal brukes som justerbar lyskilde for å oppnå passende kontrast. Plasser en 100 mm petriskålarena på LED-panelet.MERK: For å øke gjennomstrømningen kan en multibrønnplate brukes som arena23,24,men større arenaer forenkler automatisert bildeanalyse.<…

Representative Results

Ekstraokulær nær-UV-oppfatning i S. middelhavet planarians er TRPA1-avhengig og har blitt foreslått å være knyttet til H2O2 utgivelse17. Fordi H2O 2 eksponeringinduserer TRPA1-avhengig scrunching i S. Middelhavet og D. japonica planarians28, trinnene i § 2.1.4 kan brukes til å teste om nær-UV lyseksponering induserer scrunching i begge arter. Mens D. japonica planarians scrunch (10/10) n…

Discussion

Ved hjelp av denne protokollen kan man kvantitativt studere effekten av fysiske og kjemiske stimuli7,28,,29 eller genetisk manipulasjon (RNAi)28,29 på planær bevegelse. For å maksimere romlig oppløsning, er det best å flytte kameraet så nært som mulig til arenaen samtidig som hele arenaen er i synsfeltet. For å øke gjennomstrømningen kan oppførselen til flere …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Mr. Tapan Goel for kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av NSF CAREER Grant 1555109.

Materials

Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) Sigma-Aldrich 377430-5G CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4  Tamron 23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated Genesee Scientific  25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile MedSupply Partners 62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95% Sigma-Aldrich W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box Amazon B07HD631RP
Flea3 USB3 camera FLIR FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves Fisher Scientific 11-394-298
Hot plate Fisher Scientific HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water Instant Ocean SS15-10 Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water Sigma-Aldrich various Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene Simport D210-7
Pipette, 20-200 μL range Rainin 17008652
PYREX 150 mL beaker Sigma-Aldrich CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm VWR 55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber Rosco R21 Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red Rosco R27
Roscolux color filter:  Storaro Red Rosco R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture Thermo Fisher 691TS
Support stand  Fisher Scientific 12-947-976
Thermometer VWR 89095-600
UV laser pointer Amazon B082DGS86R This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.

References

  1. Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
  2. Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
  3. Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
  4. Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
  5. Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
  6. Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
  7. Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
  8. Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
  9. Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
  10. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
  11. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
  12. Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
  13. Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
  14. Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
  15. Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
  16. Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
  17. Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
  18. Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
  19. Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
  20. Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
  21. Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
  22. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
  23. Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
  24. Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
  25. Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
  26. Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
  27. Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
  28. Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
  29. Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
  30. Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  32. Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
  33. Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
  34. Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
  35. Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
  36. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
  37. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).

Play Video

Cite This Article
Sabry, Z., Rabeler, C., Ireland, D., Bayingana, K., Collins, E. S. Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing. J. Vis. Exp. (161), e61549, doi:10.3791/61549 (2020).

View Video