Planarian scrunching som en kvantitativ atferdslesning for skadelige Stimuli Sensing

Summary

Ferskvannsplanarianere viser tre gaits (gliding, peristaltikk og scrunching) som kan skilles ved kvantitativ atferdsanalyse. Vi beskriver en metode for å indusere scrunching ved hjelp av ulike skadelige stimuli, kvantifisering av disse, og skille fra peristaltikk og gliding. Ved hjelp av genbanke, viser vi spesifisiteten av scrunching som en kvantitativ fenotypisk avlesning.

Abstract

Ferskvannsplanarianere glir normalt jevnt gjennom ciliary fremdrift på deres ventrale side. Visse miljøforhold kan imidlertid indusere muskulaturdrevne former for bevegelse: peristaltikk eller scrunching. Mens peristaltikk skyldes en ciliary defekt, er scrunching uavhengig av flimmerhår funksjon og er en spesifikk respons på visse stimuli, inkludert amputasjon, skadelig temperatur, ekstrem pH og etanol. Dermed er disse to muskulaturdrevne gaits mekanistisk distinkte. Imidlertid kan de være vanskelige å skille kvalitativt. Her gir vi en protokoll for å indusere scrunching ved hjelp av ulike fysiske og kjemiske stimuli. Vi detaljer den kvantitative karakterisering av scrunching, som kan brukes til å skille den fra peristaltikk og gliding, ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Siden scrunching er en universell planarian gangart, om enn med karakteristiske artsspesifikke forskjeller, kan denne protokollen brukes bredt på alle arter av planarianere, når man bruker passende hensyn. For å demonstrere dette sammenligner vi responsen fra de to mest populære planariske artene som brukes i atferdsforskning, Dugesia japonica og Schmidtea mediterranea, med samme sett med fysiske og kjemiske stimuli. Videre gjør spesifisiteten av scrunching denne protokollen som skal brukes sammen med RNA-interferens og / eller farmakologisk eksponering for dissekere molekylære mål og nevronale kretser involvert, noe som potensielt gir mekanistisk innsikt i viktige aspekter ved nociception og nevromuskulær kommunikasjon.

Introduction

I tillegg til deres popularitet for stamcelle- og regenereringsforskning^1,2,3, har ferskvannsplanarianere lenge vært brukt i atferdsstudier^4,5, og drar nytte av deres relativt store størrelse (noen få millimeter i lengde), letthet og lave kostnader for laboratorievedlikehold og bredt spekter av observerbar atferd. Innføringen av datasyn og automatisert sporing til planære atferdsstudier^{6,7,8,9,10,11 har} aktivert kvantitativ differensiering av atferdsfenotyper. Dyrs oppførsel er en direkte avlesning av nevronal funksjon. Fordi det planære nervesystemet er av middels størrelse og kompleksitet, men deler bevarte nøkkelelementer med virveldyr hjernen^12,13,14, studere planarisk atferd kan gi innsikt i bevarte mekanismer for nevronal handling som kan være vanskelig å direkte sonde i mer komplekse organismer. Dermed er planarianere en verdifull modell for komparative nevrobiologistudier^{8,12,15,16,17,18,19,20,21}. I tillegg gjør vannmiljøet mulighet for rask og facile eksponering for kjemikalier for å studere deres effekt på hjernefunksjonen i regenererende og voksne planarianere, noe som gjør dem til et populært system for nevrotoksikologi^{22,23,24,25,26}.

Planarianere har tre forskjellige gaits, referert til som gliding, peristaltikk, og scrunching. Hver gangart er utstilt under spesielle omstendigheter: gliding er standard gangart, peristaltikk oppstår når ciliary funksjon er^{kompromittert 7,27}, og scrunching er en flukt gangart – uavhengig av flimmerhår funksjon – som svar på visse skadelige stimuli⁷. Vi har vist at scrunching er en bestemt respons, fremkalt av følelsen av visse kjemiske eller fysiske signaler, inkludert ekstreme temperaturer eller pH, mekanisk skade eller spesifikke kjemiske induktorer, og dermed ikke er en generell stressrespons^7,28,29.

På grunn av sin spesifisitet og stereotypiske parametere, som lett kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen, er scrunching en kraftig atferdsfenotype som gjør det mulig for forskere å utføre mekanistiske studier som dissekerer sensoriske veier og nevronal kontroll^{av atferd 25,28}. I tillegg har scrunching vist seg å være et følsomt endepunkt for å analysere negative kjemiske effekter på nervesystemet utvikling og funksjon i nevrotoksikologi^{studier 22,,24,,25,,30}. Som flere forskjellige sensoriske veier synes å konvergere for å indusere scrunching gjennom ulike^{mekanismer 28}, scrunching skiller seg fra andre planære atferd fordi ulike, men spesifikke, stimuli kan brukes til å dissekere distinkte nevronale kretser og studere hvordan ulike signaler er integrert for å produsere scrunching fenotype.

Det er viktig at det finnes artsforskjeller, hvor ett kjemikalie kan fremkalle scrunching i en planarisk art, men en annen atferdsrespons i en annen. For eksempel har vi funnet ut at anandamid induserer scrunching i den planære arten Dugesia japonica men induserer peristaltikk i Schmidtea Middelhavet²⁸. Dette eksemplet understreker viktigheten av å kunne skille pålitelig mellom de forskjellige gaits, fordi de er fenotypiske manifestasjoner av forskjellige molekylære mekanismer. Imidlertid er det vanskelig å skille seg fra peristaltikk ved hjelp av kvalitative observasjonsdata, fordi begge gaits er muskulaturdrevet og deler kvalitative^{likheter 7,28}. Dermed, for å skille gaits er det nødvendig å utføre cilia imaging eller en kvantitativ atferdsstudie, som tillater forskjell basert på karakteristiske^{parametere 7,28}. Fordi cilia imaging er eksperimentelt utfordrende og krever spesialisert utstyr som et høyforstørrelsessammensnisk mikroskop og et høyhastighetskamera^7,28, er det ikke så bredt tilgjengelig for forskere som kvantitativ atferdsanalyse.

Her presenterer vi en protokoll for (1) induksjon av scrunching ved hjelp av ulike fysiske (skadelige temperatur, amputasjon, nær-UV-lys) og kjemisk (allylisothiocyanat (AITC), cinnamaldehyd) stimuli og (2) kvantitativ analyse av planarisk atferd ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Ved å kvantifisere fire parametere^(hyppighetenav kroppslengdesvingninger, relativ hastighet, maksimal amplitude og asymmetri av kroppsforlengelse og sammentrekning) 7 , kan scrunching differensieres fra gliding, peristaltikk og andre atferdsmessige tilstander rapportert i litteraturen, for eksempel slangelignende bevegelse¹⁵ eller epilepsi¹⁵. Videre, mens scrunching er bevart blant ulike planære arter⁷, hver art har sin egen karakteristiske frekvens og hastighet; Derfor, når gliding og scrunching hastigheter av en art er bestemt, hastighet alene kan brukes som et middel til å skille scrunching fra gliding og peristaltikk²⁹. Protokollen forutsetter ingen tidligere opplæring i beregningsbildeanalyse eller atferdsstudier, og kan dermed også brukes til planære atferdseksperimenter i en undervisningslaboratoriumkontekst på lavere nivå. Eksempeldata for å legge til rette for protokolltilpasning er gitt i tilleggsmaterialet.

Protocol

1. Kvantitative planære atferdsanalyser Eksperimentelt oppsettPlasser et dimbart LED-panel på et flatt underlag. LED-panelet tjener to formål: (1) for å gi en ensartet hvit bakgrunn og (2) som skal brukes som justerbar lyskilde for å oppnå passende kontrast. Plasser en 100 mm petriskålarena på LED-panelet.MERK: For å øke gjennomstrømningen kan en multibrønnplate brukes som arena23,24,men større arenaer forenkler automatisert bildeanalyse.<…

Representative Results

Ekstraokulær nær-UV-oppfatning i S. middelhavet planarians er TRPA1-avhengig og har blitt foreslått å være knyttet til H2O2 utgivelse17. Fordi H2O 2 eksponeringinduserer TRPA1-avhengig scrunching i S. Middelhavet og D. japonica planarians28, trinnene i § 2.1.4 kan brukes til å teste om nær-UV lyseksponering induserer scrunching i begge arter. Mens D. japonica planarians scrunch (10/10) n…

Discussion

Ved hjelp av denne protokollen kan man kvantitativt studere effekten av fysiske og kjemiske stimuli^7,28,,29 eller genetisk manipulasjon (RNAi)^28,29 på planær bevegelse. For å maksimere romlig oppløsning, er det best å flytte kameraet så nært som mulig til arenaen samtidig som hele arenaen er i synsfeltet. For å øke gjennomstrømningen kan oppførselen til flere …

Materials

Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)	Sigma-Aldrich	377430-5G	CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4	Tamron	23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated	Genesee Scientific	25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile	MedSupply Partners	62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95%	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box	Amazon	B07HD631RP
Flea3 USB3 camera	FLIR	FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves	Fisher Scientific	11-394-298
Hot plate	Fisher Scientific	HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water	Instant Ocean	SS15-10	Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water	Sigma-Aldrich	various	Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene	Simport	D210-7
Pipette, 20-200 μL range	Rainin	17008652
PYREX 150 mL beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm	VWR	55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber	Rosco	R21	Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red	Rosco	R27
Roscolux color filter:  Storaro Red	Rosco	R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture	Thermo Fisher	691TS
Support stand	Fisher Scientific	12-947-976
Thermometer	VWR	89095-600
UV laser pointer	Amazon	B082DGS86R	This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.