Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af somatisk hypermutation i JH4 intron af Germinal Center B celler fra Mouse Peyer's Patches

Published: April 20, 2021 doi: 10.3791/61551
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biology, The City College of New York and The Graduate Center of The City University of New York, 2Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Præsenteret her er en analyse for at kvantificere somatisk hypermutation inden for immunoglobulin tunge kæde gen locus ved hjælp af germinal center B-celler fra musen Peyer's patches.

Abstract

Inden for germinale centre af lymfoide organer ændrer modne B-celler deres udtrykte immunoglobulin (Ig) ved at indføre umådelige mutationer i de variable kodningsekoner af Ig tunge og lette kædegen loci. Denne proces med somatisk hypermutation (SHM) kræver enzymet aktiveringsinduceret cytidin deaminase (AID), som omdanner deoxycytidiner (C), til deoxyuridiner (U). Behandling af AID-genererede U: G mismatches i mutationer ved basen excision og mismatch reparation veje introducerer nye Ig kodning sekvenser, der kan producere en højere affinitet Ig. Mutationer i AID eller DNA reparation gener kan blokere eller væsentligt ændre de typer af mutationer observeret i Ig loci. Vi beskriver en protokol til at kvantificere JH4 intronmutationer, der bruger fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), PCR og Sanger sekventering. Selv om denne analyse ikke direkte måle Ig affinitet modning, det er tegn på mutationer i Ig variabel kodning sekvenser. Derudover anvender disse metoder almindelige molekylærbiologiske teknikker, der analyserer mutationer i Ig-sekvenser af flere B-cellekloner. Således er denne analyse et uvurderligt værktøj i undersøgelsen af SHM og Ig diversificering.

Introduction

B-celler, medlemmer af det adaptive immunsystem, genkender og eliminerer antigener ved at producere antistoffer, også kendt som immunoglobuliner (Ig). Hver Ig består af to tunge (IgH) og to lette (IgL) kæde polypeptider, som holdes sammen af disulfidbindinger for at danne den karakteristiske "Y" formstruktur af Ig1. N-termini af IgH og IgL omfatter variabel (V) region af hver polypeptid og tilsammen udgør de antigen bindende sted for Ig, mens den konstante region IgH bibringer effector funktion Ig. Udvikling af B-celler i knoglemarven omarrangerer V-kodnings exons af IgH og IgL i en proces, der kaldes V(D)J rekombination2,3,4. Transskription af de rekombinerede V exons, kombineret med de respektive konstante region exons, danner mRNA, der er oversat til Ig.

Modne B-celler, der udtrykker en membranbundet Ig, også kendt som en B-cellereceptor (BCR), cirkulerer til sekundære lymfoide organer, såsom milt, lymfeknude eller Peyers pletter, hvor de undersøger miljøet for antigener og interagerer med andre celler i immunsystemet1. Inden for germinale centre (GC) af sekundære lymfoide organer, B-celler, der genkender antigen gennem BCR bliver aktiveret. Hjulpet af follikulære dendritiske celler og follikulær hjælper T-celler kan aktiverede B-celler derefter formere sig og differentiere sig til plasma- og hukommelsesceller, som er vigtige effektorer af et robust immunrespons5,6,7,8,9. Derudover kan disse aktiverede B-celler gennemgå sekundære Ig-gendiversificeringsprocesser - klassekontakt rekombination (CSR) og somatisk hypermutation (SHM). Under CSR udveksler B-celler standard μ konstant region i IgH-polypeptid med en anden konstant region (γ, α ε) gennem en DNA-deletional-rekombinationsreaktion (Figur 1). Dette giver mulighed for at udtrykke en anden konstant exon og oversættelse af et nyt Ig. B-cellen skifter fra at udtrykke IgM til en anden isotype (IgG, IgA, IgE). CSR ændrer Ig's virknings- eller funktion uden at ændre dens antigenspecifikitet10,11,12. Under SHM muterer B-cellerne imidlertid V-kodningsregionerne IgH og IgL for at muliggøre produktion og udvælgelse af højere affinitetS-IGS, hvilket mere effektivt kan eliminere et antigen13,14,15 ( Figur1). Det er vigtigt, at både CSR og SHM afhænger af et enzym: aktiveringsinduceret cytidindeaminase (AID)16,17,18. Mennesker og mus mangelfuld i AID kan ikke fuldføre CSR eller SHM og til stede med forhøjede IgM serum titers eller Hyper-IgM17,19.

I CSR deaminerer AID deoxycytidiner (C) i de gentagne switchområder, der går forud for hver konstant kodningseknuder, omdanner dem til deoxyuridiner (U)20,21, hvilket skaber uoverensstemmende basisparring mellem deoxyuridiner og deoxyguanosiner (U:G). Disse U:G-uoverensstemmelser omdannes til dobbeltstrengede DNA-pauser, som er nødvendige for DNA-rekombination, enten ved reparation af basis excision (BER) eller Uoverensstemmelsesreparation (MMR) vej22,23,24,25,26,27,28,29. I SHM deaminerer AID C inden for V-kodnings exons. Replikation på tværs af U:G-mismatchet genererer C:G til T:A-overgangsmutationer, mens fjernelse af uracilbasen af BER-proteinet, uracil DNA glycosylase (UNG), før DNA-replikation producerer både overgangs- og transversionsmutationer16. Null-mutationer i UNG øger C:G til T:A-overgangsmutationer21,22betydeligt . I lighed med CSR kræver SHM MFR's og BER's komplementære roller. Under SHM genererer MFR mutationer ved A:T basepar. Inaktivering af mutationer i MutS homologi 2 (MSH2) eller DNA polymerase η (Polη) reducerer mutationer på A:T baser og sammensatte mutationer i MSH2 og Polη næsten afskaffer mutationer på A:T baser21,30,31. I overensstemmelse med den kritiske rolle, som BER og MFR spiller i konverteringen af AID-genereret U til overgangs- eller transversionsmutationer, viser mus, der mangler for både MSH2 og UNG (MSH2-/-UNG-/-), kun C:G til T:A-overgangsmutationer som følge af replikation på tværs af U:G mismatch21.

Analysen af SHM i V-kodningsområder er fortsat kompliceret,fordi udvikling af B-celler kan rekombinere en hvilken som helst af V(D)J-kodnings exons i IgH og IgL loci1,2,4. Nøjagtig analyse af disse unikt rekombinerede og somatically muterede V-områder kræver identifikation og isolering af kloner af B-celler eller Ig mRNA11,13. Den JH4 intron, som er 3 'af de sidste J kodning exon i IgH locus, havne somatiske mutationer på grund af spredning af mutationer 3 'af V promotor32,33,34 og derfor ofte bruges som en surrogat markør for SHM i V regioner31,35 ( Figur1). For eksperimentelt at belyse, hvordan specifikke gener eller genetiske mutationer ændrer SHM-mønstre eller -satser, kan JH4-intronen sekventeres fra Peyers patches (PP) germinale center B-celler (GCBCs), som gennemgår høje SHM36,37,38. GCBCs kan let identificeres og isoleres med fluorescerende konjugerede antistoffer mod celleoverflademarkører (B220+PNAHI)17,39.

En detaljeret protokol præsenteres for at karakterisere JH4 intronmutationer i PP GCBCs fra mus ved hjælp af en kombination af FACS (fluorescensaktiveret cellesortering), PCR og Sanger sekventering (Figur 2).

Protocol

Alle mutantmus blev opretholdt på en C57BL/6 baggrund. Aldersmatchede (2-5 måneder gamle) mandlige og kvindelige mus blev brugt til alle eksperimenter. Opdræt af og eksperimenter med mus blev udført i henhold til protokoller godkendt af The City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Dissektion af Peyer's patches

  1. Aflive musen med 100% CO2 ved 3 L/min i 5 min efterfulgt af cervikal dislokation for at bekræfte døden. Steriliser dissektionsværktøjer (saks, pincet, fine pincet) og behandskede hænder med 70% ethanol.
  2. Læg musen på dissektionspuden med maven udsat. Spray generøst musens krop med 70% ethanol, før du foretager snit for at sterilisere dissektionsområdet.
  3. Lav et snit ind i huden over maven og fjern huden fra maven ved at trække samtidigt på begge sider af snittet mod hoved og hale ved hjælp af pincet (eller steriliserede, behandskede hænder).
  4. Pin ned forgrunden og bagbenene af musen.
  5. Skær peritoneal hulrummet med en saks for at afsløre de indre organer.
  6. Find tyndtarmen mellem maven og caecum ("J" formet struktur nær tyktarmen). Fjern tyndtarmen ved at skære under maven og over caecum.
  7. Fjern eventuelle bindevæv og fedt forbinder folderne i tyndtarmen sammen.
    BEMÆRK: Fedt vil have en karakteristisk hvid farve, i modsætning til den lyserøde farve på tyndtarmen.
  8. Undersøg tyndtarmens ydre overflade for Peyers pletter (PPs), som er små (~ 1 mm), ovalformede strukturer, der vises hvide under et tyndt lag gennemskinnelige epitelceller.
  9. Forsigtigt punktafgifter alle synlige PP med en saks.
    BEMÆRK: En C57BL/6 wild-type (WT) mus kan give 4-8 PPs, mens en AID-/- mus vil have 6-10 PPs.
  10. PPs opsamles i et 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 1 mL FACS-buffer på is.
    BEMÆRK: PP skal synke, mens fedt vil flyde til overfladen og kan fjernes.

2. Celleisolation for FACS

  1. Et 40 μm filter anbringes i en 6-brønds skål med 1 mL kold (4 °C) FACS-buffer.
  2. Hæld PP'erne fra 1,5 mL-røret på filteret.
  3. Vask pc'er med 1 mL kold FACS buffer, og sørg for, at de altid er i væske og på is.
  4. Brug stemplets flade ende fra en 1 mL sprøjte som en pestle til at knuse PPs på filteret, indtil der kun er bindevæv tilbage på filteret.
  5. Filteret og stemplet vaskes med 1 mL kold FACS-buffer for at frigøre cellerne i 6-brøndsskålen.
  6. Opsamling af ~4 mL celler i kold FACS-buffer, og filtrer dem gennem et FACS-rør med 40 μm sihætte.
  7. Sien med 1 mL kold FACS-buffer.
  8. Cellerne pellets ved 600 x g ved 4 °C i 5 min. i en svingende skovlcentrifuge.
  9. Dekanter supernatanten.
  10. Resuspend cellerne i 0,4 mL kold FACS buffer.
  11. Fjern 10 μL for celletælling for at kontrollere udbyttet (forvent ~5 x 106 celler/mus, se figur 3A)
  12. Filtrer de resterende celler gennem en 40 μm sihætte i et FACS-rør, og fortsæt med farvning for FACS.

3. Farvning afGCBCs til FACS

  1. Der tilsættes 1 μL Fc-blok (ikke-mærket antimus CD16/CD32) til celleaffjedringen på 400 μL, og cellerne anbringes på is i 15 min.
  2. Tilsæt 2 mL kold FACS buffer til at vaske cellerne.
    1. Pelletceller ved 600 x g ved 4 °C i 5 min. og supernatanten kasseres.
  3. Resuspend cellerne i 80 μL kold FACS buffer.
  4. 10 μL celler fjernes fra WT PP for hver farvningskontrol (i alt 4, herunder 3 enkeltpletkontroller og 1 ikke-rodfæstet kontrol). Efterlad 40 μL af WT PP til næste trin. Alternativt kan du bruge kompensationsperler til farvningskontrollerne.
  5. Alle forsøgsprøverne (f.eks.
  6. Tilsæt 2 mL kold FACS buffer til at vaske cellerne.
    1. Pelletceller ved 600 x g ved 4 °C i 5 min. og supernatanten kasseres.
  7. Plette hver forsøgsprøve med 500 μL cocktail i mørke, på is, i 15 minutter (tabel 1). Sørg for, at cellerne er helt genbrugt i farvning cocktail.
  8. Forbered enkelte pletkontroller til kompensationsmatrixen.
    1. Cellerne plettes i 500 μL kold FACS-buffer ved hjælp af de fortyndinger, der er angivet i tabel 2.
    2. Inkubere farvning kontrol i mørke, på is, i 15 min.
  9. Tilsæt 2 mL kold FACS buffer til alle rørene i trin 3.7 og 3.8, pellet cellerne, og kassér supernatanten for at vaske ubundet antistoffer eller DAPI.
  10. Resuspend cellerne i 500 μL kold FACS buffer og sted på is.
  11. Brug en cellesortering til at indsamle B220+PNAHI fra hver farvet eksperimentel prøve. Figur 3B viser de typiske procentdele af B220+ PNAIII fra WT og AID-/- PPs. Figur 3C viser FACS-gatingstrategien.

4. DNA-ekstraktion fraGCBCs

  1. Pellet sorterede celler ved 600 x g ved 4 °C i 5 min og kassér supernatanten.
  2. Resuspend cellerne i 1 mL kold FACS buffer og overføre cellerne til en 1,5 mL mikrocentrifuge rør.
    1. Cellerne pellets ved 600 x g ved 4 °C i 5 min. og supernatanten kasseres.
  3. Resuspend cellerne i 500 μL DNA-ekstraktionsbuffer og 5 μL på 20 mg/mL Proteinase K.
  4. Inkuber ved 56 °C natten over.
  5. Dna udfældes med 500 μL isopropanol og 1 μL på 20 mg/mL glykogen. Bland røret grundigt ved at vende 5-6x.
  6. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
  7. Centrifuge i en mikrocentrifuge i 15 min ved 25 °C ved 21.000 x g.
    1. Kassér supernatanten og bevar pelleten, som indeholder det udfældede DNA og glykogen.
  8. Vask DNA pellet med 1 mL af 70% ethanol.
    1. DNA'et pellets i en mikrocentrifuge i 10 minutter ved 25 °C ved 21.000 x g.
    2. Fjern 70% ethanol og lufttørre DNA pellet i 5-10 min.
      BEMÆRK: Undgå overtørring, da DNA'et muligvis ikke rehydrerer fuldstændigt.
  9. Dna'et genbruges i 30 μL TE-buffer og inkuberes natten over ved 56 °C.

5. JH4 intronsekvensforstærkning og -analyse

  1. Kvantificere DNA ved at måle absorbansen ved en bølgelængde på 260 nm (A260).
    BEMÆRK: Den typiske koncentration af DNA genvundet fra sorteret B220+PNAHI GCBCs af en C57BL/6 mus er 20-40 ng/μL.
  2. Udfør den indlejrede PCR for JH4-intronen (Tabel 3, Tabel 4). Den samlede mængde genomisk DNA, der anvendes i den første PCR, normaliseres til den mindst koncentrerede prøve. (hvis den mindst koncentrerede prøve f.eks. er 5 ng/μL, skal der anvendes 58,75 ng DNA til alle prøverne i det maksimale vandvolumen (11,75 μL) i PCR-#1).
  3. Løs PCR-produktet på en 1,5% agarosegel ved 200 V i 20 min. Den forventede amplicon størrelse er 580 bp.
  4. Ampliconen fjernes fra gelen, og DNA'et ekstraheres ved hjælp af et gelekstraktionssæt i overensstemmelse med producentens anvisninger (se supplerende figur 1).
    1. Elute DNA'et med 30 μL vand og kvantificere mængden af DNA ved at måle A260.
      BEMÆRK: Den typiske koncentration af det rensede PCR-produkt er 3-10 ng/μL.
  5. Ligate det rensede PCR-produkt i et plasmid med stumpe ender. Standardisere den samlede mængde PCR-produkter, der anvendes ved hver ligationreaktion (tabel 5).
    1. Ligationsreaktionen inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. eller natten over ved 16 °C.
  6. Elektrokompetente bakterieceller omdannes med 2 μL af ligationsreaktionen.
    1. Elektroporat ved 1,65 kV.
    2. Redning i 600 μL SOC-medier i 1 time ved 37 °C i en rysteinkubator ved 225 omdrejninger i minuttet.
    3. Plade 100 μL omdannede bakterier på LB suppleret med ampicillin (100 μg/mL) agarplader og inkuberes natten over ved 37 °C.
  7. Indsend pladen af bakteriekolonier til Sanger sekventering ved hjælp af T7 fremad primer. Alternativt kan du dyrke natten kulturer i hver bakteriekoloni og udføre en plasmid rensning.
    1. Gentag om nødvendigt PCR, ligation og/eller transformation for at optimere udbyttet af bakteriekolonier
      BEMÆRK: Der skal plukkes mindst 30 kolonier fra hver plade.
  8. Standardisere sekvensdataene i de .txt filer
    1. Slet plasmidsekvensen.
    2. Sørg for, at hver sekvens er orienteret 5' til 3' i henhold til JH4 intronreferencesekvensen (NG_005838). Generer det omvendte komplement for enhver sekvens efter behov.
  9. Juster de sekvenser, der er opnået for hver PCR, i forhold til JH4 intronreferencesekvensen (NG_005838) ved hjælp af en Clustal Omega-software (Figur 4A).
    1. Identificere forskelle fra referencesekvensen som mutationer
    2. Kontroller, at alle mutationer er sande punktmutationer ved at undersøge elektrofemogrammet i Sanger-sekventeringen. Gentag rækkefølgen, hvis det er nødvendigt. (Figur 4B, C).
  10. Tabulere og kvantificere unikke mutationer i JH4-intronen for hver genotype (figur 5).
    1. Tæl kun sekvenser med identiske mutationer én gang
      BEMÆRK: Det er ikke muligt at afgøre, om de identiske sekvenser blev genereret under PCR eller identiske SHM-hændelser i forskellige B-celler.
    2. Tæl alle forekomster af WT-kimlinjen JH4 intronsekvenser (dvs. dem uden mutationer) som en unik sekvens.

Representative Results

Flowcytometry
Modne B-celler cirkulerer til germinale centre, hvor de gennemgår affinitetsmodning, klonisk ekspansion og differentiering i plasma- eller hukommelsesceller40,41,42,43,44. Disse GCBCs kan identificeres ved talrige celle overflade markører, herunder højt udtryk for CD45R/B220 receptor og binding af peanut agglutinin (PNA)45,46. For at isolere aktiverede GCBCs, PP celler blev plettet med anti-B220 antistoffer konjugeret til phycoerythrin (PE) og biotinyleret-PNA, efterfulgt af streptavidin konjugeret til APC-eFluor780. Døde celler blev elimineret ved hjælp af fluorescerende 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) farvestof, som pletter nukleinsyre af døende eller døde celler47,48. De farvede celler blev efterfølgende analyseret og sorteret via flowcytometri. PP'erne bestod af ~80% B220+ celler49,50. WT PP'er indeholder i gennemsnit 4 x 106 celler pr. mus (Figur 3A). Ca. 8% af WT PP-cellerne var B220+PNAHI, hvilket er halvdelen af det antal, der blev observeret i AID-/ - ( Figur3B). Således blev 0,3-0,6 x 106 B220+PNAHI GCBCs opnået efter sortering, som var tilstrækkelige til at analysere mutationer i JH4 intronen.

JH4-sekvensanalyse
Den JH4 intron blev forstærket af en indlejret PCR ved hjælp af fælles VHJ558 familie primere (J558FR3Fw og VHJ558.2) efterfulgt af JH4 intron spænder primere VHJ558.3 og VHJ558.435,37. Af de 105 unikke sekvenser fra WT GCBCs blev der fundet i alt 226 mutationer (Figur 5A). Analyse af GCBC mutationsspektret i WT-musene viste en række overgange og transversioner med en hastighed på 4 x 10-3 mutationer / bp, som blev beregnet ved at dividere det samlede antal muterede baser med det samlede antal baser, der blev sekventeret32,36,37,38. Derudover indeholdt hvert JH4 PCR-produkt fra WT GCBCs 1-25 mutationer (Figur 5B), hvor der ofte blev fundet flere mutationer på en sekvens33,36. Kun to mutationer blev identificeret i 113 AID-/- sekvenser (Figur 5A). AID-/- B-celler udstillede 1,66 x 10-5 mutationer/bp, hvilket var betydeligt lavere end WT B-celler (p <0,05)36 og sammenligner med fejlprocenten for high fidelity polymerase (5,3 x 10-7 sub/base/fordobling)51,52. Aid -/- B-celler fungerede således som en nyttig negativ kontrol for denne analyse.

Figure 1
Figur 1: Skematisk over IgH-genet locus og de regioner, der er omfattet af AID under VSA og SHM. Den røde bjælke angiver de 580 bp JH4 intron, der er 3 'af VDJH4 omlejringer og analyseres i denne protokol. I VSA fremmer AID-afhængig deamination af intronic switch-regioner (Sμ og Sε) DSB-dannelse, der giver mulighed for deletional-rekombination og udtryk for en ny antistofisotype (IgM til IgE). Under SHM akkumulerer V-områder (grå bokse) mutationer (blå linjer), der kan føre til højere affinitet Ig. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang til at analysere SHM af JH4 intron i GCBCs isoleret fra PC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af KPC'er. (A) Samlet antal PP-celler fra WT- og AID-/- mus (n = 4 pr. genotype). Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen fra middelværdien. (B) Procentdel af B220+PNAHI GCBCs fremstillet af PP'er af WT og AID-/- mus (n = 4 pr. genotype)36. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen fra middelværdien * p<0,05 ved hjælp af elevens t-test. (C) Repræsentative FACS-plots til sortering af B220+PNAHI GCBCs fra pc'er. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Analyse af JH4 Sanger sekvensdata. (A) Prøvesekvensjusteringer af Sanger-sekvensdata for JH4 PCR-produktet fra WT (øverst) og AID-/- (nederst) GCBCs til referencegenomsekvensen (NG_005838), som er sekvensen umiddelbart under de nummererede aksemærker. Justeringer blev genereret ved hjælp af Clustal Omega. (B) Elektropherogram af høj kvalitet Sanger sekvensdata, som viste forskellige toppe for hver base. (C) Elektropherogram af sekvensdata af lav kvalitet, som viste tvetydige toppe og uspecificerede baser (N). Den nukleotid, der vises med rødt, skal kommenteres manuelt i sekvenstekstfilen.  Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Analyse af mutationer i JH4-intronen i WT og AID-/- GCBCs. (A)Det samlede antal overgangs- (røde) og transversionsmutationer (blå) ved A-, C-, G- og T-baserne for hver genotype er opsummeret i tabellerne. Det samlede antal analyserede sekvenser er angivet under tabellen. (B) Antallet af mutationer pr. PCR-amplicon for hver genotype er afbildet i cirkeldiagrammerne. Dette tal er blevet ændret fra Choi et al.36 Copyright 2020. American Association of Immunologists, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Farvning Cocktail for GCBCs Volumen: 500 μL
Antistof eller farvestof Fluorophore Fortynding Μl
B220 Pe 1000 0.5
Streptavidin APC-eFluor780 500 1
DAPI Nielsen 500 1

Tabel 1: Farvning af cocktails til GCBCs. Cocktail af de angivne antistoffer eller farvestoffer (angivet med kursiv) ved de angivne fortyndinger blev anvendt til at plette PP-celler i 500 μL til flowcytometri.

   

Enkelt pletter for kompensation Volumen: 500 μL
Antistof eller farvestof Fluorophore Fortynding Μl
B220 Pe 1000 0.5
B220 APC-eFluor780 750 0.67
DAPI Nielsen 500 1

Tabel 2: Kontrol med enkelt plet med henblik på kompensation. B220 antistoffer konjugeret til de angivne fluorophorer blev brugt til enkelt plet kontrol for at kompensere for spektral overlapning.

   

PCR-#1
Reagens Volumen Termocykelforhold
5x buffer 4 μL 1 95 °C 3 min.
10 mM dNTP 2 μL 2 94 °C 30 sek.
10 μM J558FR3Fw 1 μL 3 55 °C 30 sek.
10 μM VHJ558,2 1 μL 4 72 °C 13:30
High Fidelity DNA polymerase 0,25 μL Cyklus 2-4 9x
Dna x (standardisere til mindst koncentreret prøve)
H2O til 20 μL 5 72 °C 5 min.
Pcr-produkt fortyndes 1:5 i H2O, inden der #2

Tabel 3: Indlejret PCR af JH4 intron. PCR-komponenter og termocykelforhold for den første forstærkningsreaktion. Det første PCR-produkt fortyndes 1:5 med vand, og der anvendes 1 μL af denne fortynding til den anden PCR.

   

PCR-#2
Reagens Volumen Thermocycler Betingelser #2
5x buffer 4 μL 1 94 °C 3 min.
10 mM dNTP 2 μL 2 94 °C 30 sek.
10 μM VHJ558,3 1 μL 3 55 °C 30 sek.
10 μM VHJ558,4 1 μL 4 72 °C 30 sek.
High Fidelity DNA polymerase 0,25 μL Cyklus 2-4 21x
Fortyndet PCR#1 1 μL
H2O til 20 μL 5 72 °C 5 min.

Tabel 4: PCR-komponenter og termocykelforhold for den anden PCR.

   

Reagens Volumen
2x Buffer 10 μL
Renset PCR x (standardisere til mindst koncentreret prøve)
Plasmid med stumpe ender 1 μL
T4 DNA Ligase 1 μL
H2O til 20 μL
Inkuber ved rumtemperatur i 5 minutter eller natten over ved 16ºC

Tabel 5: Ligationsreaktion. Komponenter til ligation af det rensede JH4 intron PCR-produkt i plasmidet.

   

Facs-buffer
Varm inaktivere FBS ved 56 °C i en time før brug. Tillæg PBS, pH 7,4 (Gibco, #10010049) med 2,5% (v/v) af varmeaktiverede FBS. Opbevares ved 4 °C.
DNA-ekstraktionsbuffer (100 mM Tris pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% (w/v) SDS)
Tilføj 50 mL af 1 M Tris pH 8,0, 100mL af 0,5 M EDTA, og 12,5 mL af 20% SDS. Tilsæt destilleret vand til 500 mL. Opbevares ved stuetemperatur.
TE Buffer (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA)
Der tilsættes 2,5 mL 1 M Tris pH 8,0 og 500 mL på 0,5 M EDTA. Tilsæt destilleret vand til 250 mL. Opbevares ved stuetemperatur.

Tabel 6: Buffer opskrifter.

   

Oligonukleotider Liste
J558FR3Fw 5'-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3'
VHJ558.2 5'-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3'
VHJ558.3 5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3'
VHJ558.4 5'-TCTCTAGACAGCAACTAC-3'

Tabel 7: Oligonukleotider anvendt i analysen.

   

Supplerende figur 1: Repræsentativt agarosegelbillede efter afslutningen af trin 5.4. Den JH4 intron indlejret PCR produkt blev løst på en 1,5% agarose gel og 580 bp amplicon blev fjernet. WT PP angiver, at WT PP GCBC genomisk DNA blev brugt som skabelon for den første PCR, og AID PP angiver, at AID-/- PP GCBC genomisk DNA blev brugt som skabelon for den første PCR. ɸ angiver ingen skabelon PCR kontrol og - angiver intet blev indlæst i brønden af agarose gel. Den sidste vognbane viser en 100 bp DNA stige. Klik her for at downloade dette tal.

Discussion

Karakterisere SHM inden for IgH og IgL V kodning sekvenser af en heterogen B celle befolkning udgør en udfordring, da hver B-celle entydigt reorganiserer V kodning segmenter under V (D) J rekombination34. I dette papir beskriver vi en metode til at identificere mutationer i JH4 intron af GCBCs. JH4-intronen, der er placeret 3' af det sidste J-kodningssegment i IgH-locus, bruges som surrogat for SHM i V-regioner (Figur 1)31,33,34,35. For at katalogisere disse JH4 intronmutationer og vurdere, hvordan specifikke gener påvirker produktionen eller mønsteret af mutationer, analyseres PP GCBCs specifikt. Disse celler akkumulerer JH4 intronmutationer som følge af kronisk stimulation ved tarmmikrobiota53. Desuden B220+PNAHI GCBCs fra PC'er af unimmunized mus har en mutation spektre, der sammenligner med milt GCBCs fra immuniserede dyr54,55. Mutationer i JH4-intronen kan imidlertid ikke korreleres med Ig-affinitetsmodning, fordi disse mutationer ikke er kodning.

For at afgøre, om SHM ændrer Ig affinitet, mus bør immuniseres intraperitoneally med et antigen, såsom NP (4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl) konjugeret til CGG (kylling gamma globulin) eller KLH (nøglehullet limpet hemocyanin)56. Derefter kan mRNA renses fra milt B220+PNAHI GCBCs for at undersøge SHM inden for VH186.2, V-kodning exon, der oftest genkender NP og muteres efter NP-CGG eller NP-KLH immunisering31,57,58,59,60. Mutation af tryptophan-33 til en leucin i VH186,2 er blevet karakteriseret for at øge Ig affinitet op til 10 gange59,60 og er derfor en indikator for, at SHM og klonvalg har genereret høj affinitet Ig. Måling af NP7- og NP20-specifikke serum Ig titers ved ELISA og beregning af det Ig-specifikke NP7/NP20-forhold i løbet af immuniseringen dokumenterer også Ig affinitetsmodning som følge af SHM i V-regioner17,21,36. Begge disse assays kan bruges til at korrelere SHM inden for VH186,2 kodning sekvenser med ændringer i NP-specifikke Ig affinitet modning.

Uanset om immuniserede eller ikke-immuniserede dyr bruges til at analysere SHM af VH186.2 eller JH4 intron, skal GCBCs identificeres nøjagtigt. Vi præsenterer en FACS baseret tilgang til at isolere B220+PNAHI GCBCs. Alternativt kan Fas og ikke-sulfatt α2-6-sialyl-LacNAc antigen, som er anerkendt af GL7 antistof61,62,63,64, også bruges til at isolere GCBCs, som er identificeret som B220+Fas+GL7+65 eller CD19+Fas+GL7+37. GL7-udtryk afspejler PNA i aktiverede GCBCs af lymfeknuderne64,65,66. Ud over at anvende antistofmarkører, der er specifikke for GCBCs, bør farvning af cocktails maksimere udskillelsen af en fluorophore og påvisning af en biomarkør, samtidig med at spektral overlapning af fluorescensemission minimeres. Antigener udtrykt ved lave niveauer bør påvises med et antistof, der er konjugeret til en fluorophore med en robust emissionsfluorescens67. Den anbefalede farvningsprotokol blev optimeret til analyse på en cellesortering udstyret med fire lasere (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) og 12 filtre; Filterkonfigurationer og lasertilgængelighed varierer dog mellem cytometre. For at ændre protokollen i henhold til reagens og udstyr tilgængelighed, læseren henvises til yderligere ressourcer, online spektrum seere og offentliggjort litteratur67,68,69,70,71,72,73. Den multifarvede farvningsprotokol, der er beskrevet heri, kræver kompensation for spektral overlapning for at sikre, at de sorterede cellepopulationer er GCBCs snarere end unøjagtig påvisning af fluorescensemission. B220 fungerer som en nyttig farvningskontrol for de beskrevne FACS (tabel 1B), fordi pc'er vil have en karakteristisk B220-negativ og positiv population (figur 3C), som giver mulighed for passende kompensation for spektral overlapning. Den gatingstrategi, der præsenteres i figur 3C, bør anvendes som retningslinje. Strømningscytometriområderne kan variere afhængigt af farvningsbetingelserne og cytometerindstillingerne. Ikke desto mindre bør 4-10% af de levende celler være B220+PNAHI 35, 52.

Alle mutationer inden for JH4 intron af PP GCBCs skal valideres for at sikre, at de observerede mutationer er virkelig afspejler SHM og ikke en artefakt af PCR eller sekventering. AID-/- B-celler kan tjene som en nyttig negativ kontrol ved undersøgelse af SHM-fænotypen i andre mutantmusmodeller, fordi disse celler ikke kan fuldføre SHM17,19. JH4 intronmutationshastigheden i AID-/- GCBCs (1.66x10-5 mutationer/bp)20,21,36,37,38,50,74 kan sammenlignes med fejlprocenten for high fidelity polymerase (5.3x10-7 sub/base/fordobling)51,52, der bruges til at forstærke DNA'et i den indlejrede PCR. Hvis AID-/- mus ikke er tilgængelige, skal du sammenligne det observerede mutationsmønster og hyppighed med den publicerede litteratur. Ig V-regioner akkumulerer 10-3-10-4 mutationer pr. basepardivision, hvilket er ca. 106gange højere end mutationshastigheden for andre gen loci73,75. Resultaterne kan variere afhængigt af dyrets alder76. Alternativt kan B220+PNA LO-celler, der markerer ikke-GCBCs, anvendes som en negativ kontrol, hvis der ikke er TALE OM STØTTE-/- mus 52. Hvis mutationsfrekvensen i WT GCBCs er lavere end forventet, kan WT-kimlinjen JH4 intronic-sekvensen være uforholdsmæssigt repræsenteret. I dette tilfælde skal du sikre dig, at GCBC'er blev farves og sorteres korrekt, og PCR'er er fri for WT-kimlinje JH4 intronforurening. Derudover bør rå sekventeringsdata i elektrofeerogrammer analyseres grundigt for at sikre, at mutationer i sekvenstekstdataene ikke er artefakter af sekventeringsfejl. Dårlige Sanger-sekventeringsresultater kanf.eks. Denne kvalitetskontrol af Sanger sekvensdata vil øge nøjagtigheden og reproducerbarheden af JH4 intronmutationsanalysen.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Tasuku Honjo for AID-/- mus. Dette arbejde blev støttet af The National Institute on Minority Health and Health Disparities (5G12MD007603), The National Cancer Institute (2U54CA132378) og The National Institute of General Medical Sciences (1SC1GM132035-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed USA Scientific 1402-4708
Ampicillin sodium salt Fisher BP1760-5
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 eBioscience 47-0452-80 clone RA3-6B2
BD FACSAria II BD 643186 four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50),
AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40),
PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))
BD slip tip 1mL syringe Fisher 14-823-434 sterile
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) Vector Labs B-1075-5
C57BL/6J mice Jackson Laboratories 664
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap Fisher 08-771-23
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) Fisher D1306 0.5 mg/ml
dNTP NEB N0447L 10 mM
ElectroMAX DH10B competent cells Fisher 18-290-015
Falcon cell strainer 40mm Fisher 08-771-1
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) Fisher 14-959-5
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) Fisher 149591A
Fetal bovine serum R&D Systems (Atlanta Biologicals) S11150
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 Fisher 10-010-049
Glycogen Sigma 10901393001
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) DNA Star version 15
PE anti-CD45R/B220 BD 553090 clone RA3-6B2
Proteinase K Fisher BP1700-100
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate eBioscience 47-4317-82
T4 DNA ligase NEB M020L
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit ThermoFisher FERK1231
Tissue culture plate 6 well Fisher 08-772-1B sterile
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD Fisher BDB553142 Clone 2.4G2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeyway's Immunobiology. , Garland science. (2016).
  2. Alt, F. W., et al. VDJ recombination. Immunology Today. 13 (8), 306-314 (1992).
  3. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V (D) J recombination. Nature Reviews Immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
  4. Oettinger, M. A., Schatz, D. G., Gorka, C., Baltimore, D. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V (D) J recombination. Science. 248 (4962), 1517-1523 (1990).
  5. Berek, C., Berger, A., Apel, M. Maturation of the immune response in germinal centers. Cell. 67 (6), 1121-1129 (1991).
  6. Linterman, M. A., et al. Foxp3+ follicular regulatory T cells control the germinal center response. Nature Medicine. 17 (8), 975 (2011).
  7. Shulman, Z., et al. T follicular helper cell dynamics in germinal centers. Science. 341 (6146), 673-677 (2013).
  8. Good-Jacobson, K. L., et al. PD-1 regulates germinal center B cell survival and the formation and affinity of long-lived plasma cells. Nature Immunology. 11 (6), 535 (2010).
  9. Kerfoot, S. M., et al. Germinal center B cell and T follicular helper cell development initiates in the interfollicular zone. Immunity. 34 (6), 947-960 (2011).
  10. Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 541-552 (2004).
  11. Alt, F. W., Zhang, Y., Meng, F. L., Guo, C., Schwer, B. Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in the immune system. Cell. 152 (3), 417-429 (2013).
  12. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nature Reviews Immunology. 12 (7), 517-531 (2012).
  13. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annual Reviews of Biochemistry. 76, 1-22 (2007).
  14. Peled, J. U., et al. The biochemistry of somatic hypermutation. Annual Review of Immunology. 26, 481-511 (2008).
  15. Liu, M., Schatz, D. G. Balancing AID and DNA repair during somatic hypermutation. Trends in Immunology. 30 (4), 173-181 (2009).
  16. Methot, S., Di Noia, J. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advances in Immunology. 133, 37-87 (2017).
  17. Muramatsu, M., et al. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102 (5), 553-563 (2000).
  18. Petersen-Mahrt, S. K., Harris, R. S., Neuberger, M. S. AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature. 418 (6893), 99 (2002).
  19. Revy, P., et al. Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell. 102 (5), 565-575 (2000).
  20. Petersen-Mahrt, S. DNA deamination in immunity. Immunological Reviews. 203 (1), 80-97 (2005).
  21. Rada, C., Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Mismatch recognition and uracil excision provide complementary paths to both Ig switching and the A/T-focused phase of somatic mutation. Molecular Cell. 16 (2), 163-171 (2004).
  22. Rada, C., et al. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Current Biology. 12 (20), 1748-1755 (2002).
  23. Schrader, C. E., Vardo, J., Stavnezer, J. Role for mismatch repair proteins Msh2, Mlh1, and Pms2 in immunoglobulin class switching shown by sequence analysis of recombination junctions. The Journal of Experimental Medicine. 195 (3), 367-373 (2002).
  24. Martin, A., et al. Msh2 ATPase activity is essential for somatic hypermutation at AT basepairs and for efficient class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1171-1178 (2003).
  25. Imai, K., et al. Human uracil-DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin class-switch recombination. Nature Immunology. 4 (10), 1023-1028 (2003).
  26. Masani, S., Han, L., Yu, K. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 is the essential nuclease during immunoglobulin class switch recombination. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1468-1473 (2013).
  27. Guikema, J. E., et al. APE1-and APE2-dependent DNA breaks in immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3017-3026 (2007).
  28. Schrader, C. E., Guikema, J. E., Wu, X., Stavnezer, J. The roles of APE1, APE2, DNA polymerase β and mismatch repair in creating S region DNA breaks during antibody class switch. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1517), 645-652 (2009).
  29. Roa, S., et al. MSH2/MSH6 complex promotes error-free repair of AID-induced dU: G mispairs as well as error-prone hypermutation of A: T sites. PLoS One. 5 (6), 11182 (2010).
  30. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase η is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 17-23 (2007).
  31. Maul, R. W., Gearhart, P. J. AID and somatic hypermutation. Advances in Immunology. 105, 159-191 (2010).
  32. Shen, H. M., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. Somatic hypermutation and class switch recombination in Msh6-/- Ung-/- double-knockout mice. The Journal of Immunology. 177 (8), 5386-5392 (2006).
  33. Cheng, H. L., et al. Integrity of the AID serine-38 phosphorylation site is critical for class switch recombination and somatic hypermutation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (8), 2717-2722 (2009).
  34. Lebecque, S. G., Gearhart, P. J. Boundaries of somatic mutation in rearranged immunoglobulin genes: 5'boundary is near the promoter, and 3'boundary is approximately 1 kb from V (D) J gene. The Journal of Experimental Medicine. 172 (6), 1717-1727 (1990).
  35. Jolly, C. J., Klix, N., Neuberger, M. S. Rapid methods for the analysis of immunoglobulin gene hypermutation: application to transgenic and gene targeted mice. Nucleic Acids Research. 25 (10), 1913-1919 (1997).
  36. Choi, J. E., Matthews, A. J., Michel, G., Vuong, B. Q. AID Phosphorylation Regulates Mismatch Repair-Dependent Class Switch Recombination and Affinity Maturation. The Journal of Immunology. 204 (1), 13-22 (2020).
  37. McBride, K. M., et al. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. The Journal of Experimental Medicine. 205 (11), 2585-2594 (2008).
  38. Liu, M., et al. Two levels of protection for the B cell genome during somatic hypermutation. Nature. 451 (7180), 841-845 (2008).
  39. Ross, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  40. Zhang, J., MacLennan, I. C., Liu, Y. J., Lane, P. J. Is rapid proliferation in B centroblasts linked to somatic mutation in memory B cell clones. Immunology Letters. 18 (4), 297-299 (1988).
  41. Nieuwenhuis, P., Opstelten, D. Functional anatomy of germinal centers. American Journal of Anatomy. 170 (3), 421-435 (1984).
  42. Lau, A. W., Brink, R. Selection in the germinal center. Current Opinion in Immunology. 63, 29-34 (2020).
  43. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  44. Mesin, L., Ersching, J., Victora, G. D. Germinal center B cell dynamics. Immunity. 45 (3), 471-482 (2016).
  45. Reichert, R. A., Gallatin, W. M., Weissman, I. L., Butcher, E. C. Germinal center B cells lack homing receptors necessary for normal lymphocyte recirculation. The Journal of Experimental Medicine. 157 (3), 813-827 (1983).
  46. Rose, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  47. Hamada, S., Fujita, S. DAPI staining improved for quantitative cytofluorometry. Histochemistry. 79 (2), 219-226 (1983).
  48. Otto, F. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  49. Butcher, E., et al. Surface phenotype of Peyer's patch germinal center cells: implications for the role of germinal centers in B cell differentiation. The Journal of Immunology. 129 (6), 2698-2707 (1982).
  50. Rogerson, B. J., Harris, D. P., Swain, S. L., Burgess, D. O. Germinal center B cells in Peyer's patches of aged mice exhibit a normal activation phenotype and highly mutated IgM genes. Mechanisms of Ageing and Development. 124 (2), 155-165 (2003).
  51. Potapov, V., Ong, J. L. Examining sources of error in PCR by single-molecule sequencing. PloS One. 12 (1), 0169774 (2017).
  52. Gonzalez-Fernandez, A., Milstein, C. Analysis of somatic hypermutation in mouse Peyer's patches using immunoglobulin kappa light-chain transgenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (21), 9862-9866 (1993).
  53. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer's patches: organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  54. Betz, A. G., Rada, C., Pannell, R., Milstein, C., Neuberger, M. S. Passenger transgenes reveal intrinsic specificity of the antibody hypermutation mechanism: clustering, polarity, and specific hot spots. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (6), 2385-2388 (1993).
  55. Rada, C., Gupta, S. K., Gherardi, E., Milstein, C. Mutation and selection during the secondary response to 2-phenyloxazolone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (13), 5508-5512 (1991).
  56. Heise, N., Klein, U. Somatic Hypermutation and Affinity Maturation Analysis Using the 4-Hydroxy-3-Nitrophenyl-Acetyl (NP) System. Methods in Molecular Biology. 1623, 191-208 (2017).
  57. Smith, F., Cumano, A., Licht, A., Pecht, I., Rajewsky, K. Low affinity of kappa chain bearing (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl (NP)-specific antibodies in the primary antibody repertoire of C57BL/6 mice may explain lambda chain dominance in primary anti-NP responses. Molecular Immunology. 22 (10), 1209-1216 (1985).
  58. Takahashi, Y., Dutta, P. R., Cerasoli, D. M., Kelsoe, G. In situ studies of the primary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl. V. Affinity maturation develops in two stages of clonal selection. The Journal of Experimental Medicine. 187 (6), 885-895 (1998).
  59. Allen, D., Simon, T., Sablitzky, F., Rajewsky, K., Cumano, A. Antibody engineering for the analysis of affinity maturation of an anti-hapten response. The EMBO Journal. 7 (7), 1995-2001 (1988).
  60. Cumano, A., Rajewsky, K. Clonal recruitment and somatic mutation in the generation of immunological memory to the hapten NP. The EMBO Journal. 5 (10), 2459-2468 (1986).
  61. Smith, K., Nossal, G., Tarlinton, D. M. FAS is highly expressed in the germinal center but is not required for regulation of the B-cell response to antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11628-11632 (1995).
  62. Hao, Z., et al. Fas receptor expression in germinal-center B cells is essential for T and B lymphocyte homeostasis. Immunity. 29 (4), 615-627 (2008).
  63. Cervenak, L., Magyar, A., Boja, R., László, G. Differential expression of GL7 activation antigen on bone marrow B cell subpopulations and peripheral B cells. Immunology Letters. 78 (2), 89-96 (2001).
  64. Naito, Y., et al. Germinal center marker GL7 probes activation-dependent repression of N-glycolylneuraminic acid, a sialic acid species involved in the negative modulation of B-cell activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  65. Olson, W. J., et al. Orphan Nuclear Receptor NR2F6 Suppresses T Follicular Helper Cell Accumulation through Regulation of IL-21. Cell Reports. 28 (11), 2878-2891 (2019).
  66. Dorsett, Y., et al. MicroRNA-155 suppresses activation-induced cytidine deaminase-mediated Myc-Igh translocation. Immunity. 28 (5), 630-638 (2008).
  67. Goetz, C., Hammerbeck, C., Bonnevier, J. Flow Cytometry Basics for the Non-Expert. , Springer. (2018).
  68. Hawley, T. S., Herbert, D. J., Eaker, S. S., Hawley, R. G. Flow Cytometry Protocols. , Springer. (2004).
  69. Costa, E., et al. A new automated flow cytometry data analysis approach for the diagnostic screening of neoplastic B-cell disorders in peripheral blood samples with absolute lymphocytosis. Leukemia. 20 (7), 1221-1230 (2006).
  70. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
  71. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. , 139-150 (2018).
  72. Lucchesi, S., et al. Computational Analysis of Multiparametric Flow Cytometric Data to Dissect B Cell Subsets in Vaccine Studies. Cytometry Part A. 97, 259-267 (2019).
  73. Longerich, S., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. The very 5' end and the constant region of Ig genes are spared from somatic mutation because AID does not access these regions. The Journal of Experimental Medicine. 202 (10), 1443-1454 (2005).
  74. Retter, I., et al. Sequence and characterization of the Ig heavy chain constant and partial variable region of the mouse strain 129S1. The Journal of Immunology. 179 (4), 2419-2427 (2007).
  75. Shen, H. M., Peters, A., Baron, B., Zhu, X., Storb, U. Mutation of BCL-6 gene in normal B cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. Science. 280 (5370), 1750-1752 (1998).
  76. Richter, K., et al. Altered pattern of immunoglobulin hypermutation in mice deficient in Slip-GC protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (38), 31856-31865 (2012).

Tags

Tilbagetrækning immunoglobulin somatisk hypermutation germinal center B-celler Peyer's patches JH4 intron mus
Analyse af somatisk hypermutation i JH4 intron af Germinal Center B celler fra Mouse Peyer's Patches
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sible, E., Zheng, S., Choi, J. E.,… More

Sible, E., Zheng, S., Choi, J. E., Vuong, B. Q. Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (170), e61551, doi:10.3791/61551 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter