Представлено здесь является анализ для количественной соматической гипермутации в иммуноглобулин тяжелых цепных генов локус с использованием зародышевых клеток центра В из патчей мыши Пейер.
В зародышевых центрах лимфоидных органов, зрелые В-клетки изменяют их выраженный иммуноглобулин (Ig), вводя неоплатенные мутации в переменное кодирование экзонов ig тяжелых и легких цепных генных локусов. Этот процесс соматической гипермутации (SHM) требует фермента активации индуцированной цитидина деаминазы (AID), который преобразует дезоксицитидины (C), в дезоксиуридины (U). Обработка НЕСОВМЕСТИМЫХ несоответствий в мутации базовым иссечением и несоответствующей ремонтной дорожкой вводит новые последовательности кодирования Ig, которые могут привести к более высокому сродству Ig. Мутации в генах AID или ДНК могут блокировать или значительно изменять типы мутаций, наблюдаемых в локусах Ig. Мы описываем протокол количественной оценки интрон мутаций JH4, который использует флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), ПЦР и секвенирования Sanger. Хотя этот анализ непосредственно не измеряет созревание сродства Ig, это свидетельствует о мутациях в переменных последовательностях кодирования Ig. Кроме того, эти методы используют общие методы молекулярной биологии, которые анализируют мутации в последовательностях Ig нескольких клонов В-клеток. Таким образом, этот анализ является бесценным инструментом в изучении SHM и Ig диверсификации.
В-клетки, члены адаптивной иммунной системы, распознают и устраняют антигены, вырабатывая антитела, также известные как иммуноглобулины (Ig). Каждый Ig состоит из двух тяжелых (IgH) и двух легких (IgL) цепных полипептидов, которые проводятся вместе дисульфидными связями, чтобы сформировать характерную структуру формы “Y” Ig1. N-termini IgH и IgL составляют переменную (V) область каждого полипептида и вместе они образуют антиген связывания сайта Ig, в то время как постоянная область IgH придает эффектор функции Ig. Развитие B-клеток в костном мозге переставить V кодирования экзонов IgH и IgL в процессе, известном как V (D)J рекомбинации2,3,4. Транскрипция рекомбинированного V exons, в сочетании с соответствующими постоянными экзонами региона, образует мРНК, которая переводится в Ig.
Зрелые В-клетки, выражаюющие мембрану связаны Ig, также известный как рецептор В-клеток (BCR), циркулируют во вторичные лимфоидные органы, такие как селезенка, лимфатический узел, или патчи Пейера, где они обследуют среду для антигенов и взаимодействуют с другими клетками иммуннойсистемы 1. В зародышевых центрах (GC) вторичных лимфоидных органов, B клетки, которые признают антиген через BCR становятся активированными. С помощью фолликулярных дендритных клеток и фолликулярных помощников Т-клеток, активированные В-клетки могут размножаться и дифференцироваться в плазменные клетки и клетки памяти, которые являются важными эффекторами надежного иммунного ответа5,6,7,8,9. Кроме того, эти активированные В-клетки могут проходить вторичные процессы диверсификации генов Ig – рекомбинацию коммутатора класса (CSR) и соматическую гипермутацию (SHM). Во время КСО В-клетки обмениваются по умолчанию μ постоянной областью полипептида IgH с другой постоянной областью (γ, α, ε) через реакциюудаления ДНК-рекомбинации (рисунок 1). Это позволяет выражение различных постоянных exon и перевод нового Ig. Ячейка B перейдет от выражения IgM к другому изотипу (IgG, IgA, IgE). КСО изменяет функцию эффектора Ig, не изменяя его антигеннуюспецифичность 10,11,12. Тем не менее, во время SHM, B-клетки мутируют V кодирования регионов IgH иIgL,чтобы производство и выбор более высокого сродства Igs, которые могут более эффективно устранить антиген13,14,15 (Рисунок 1). Важно отметить, что и КСО, и SHM зависят от функции одного фермента: активация индуцированной цитидин деаминазы (AID)16,17,18. Люди и мыши, не хватает AID не может завершить КСО или SHM и настоящее время с повышенным IgM сыворотки титеры или Hyper-IgM17,19.
В КСО, AID deaminates дезоксицитидин (C) в повторяющихся регионах коммутатора, которые предшествуют каждой постоянной кодирования экзонов, превращая их в дезоксиуридины (U)20,21, что создает несовместимые базы сопряжения между дезоксиуридинов и дезоксигуанозинов (U:G). Эти U:G несоответствия преобразуются в двойной ДНК перерывов, которые необходимы для рекомбинации ДНК, либо путем ремонта иссечения базы (BER) или несоответствия ремонта (MMR)путь 22,23,24,25,26,27,28,29. В SHM AID deaminates C в эксонах кодирования V. Репликация через несоответствие U:G генерирует C:G к T: Переходные мутации, в то время как удаление базы uracil белком BER, гликозилаза ДНК uracil (UNG), до репликации ДНК производит как переход, так и трансверсиимутаций 16. Нулевые мутации в UNG значительно увеличивают C:G до T:A переходныхмутаций 21,22. Как и КСО, SHM требует дополнительных функций MMR и BER. Во время SHM MMR генерирует мутации в базовых парах A:T. Инактивирующие мутации в гомологии MutS 2 (MSH2)или полимеразе ДНК η (Pol) значительно уменьшают мутации на базах A:T и сложные мутации в MSH2 и Polе практически отменяет мутации на базах A:T21,30,31. В соответствии с критической ролью BER и MMR в преобразовании САИР-генерируемых U в переходные или трансверсионные мутации, мыши испытывают дефицит как для MSH2, так и для UNG (MSH2-/-UNG-/-)отображают только C:G к T:Переходные мутации в результате репликации через несоответствие U:G21.
Анализ SHM в регионах V кодирования остается сложным, потому что развивающиеся B-клетки могут рекомбинировать любой из экзонов кодирования V(D)J в локусе IgH и IgL1,2,4. Точный анализ этих уникально рекомбинированных и соматически мутировавших V областей требует идентификации и изоляции клонов В-клеток или Ig mRNA11,13. JH4 интрон, который является 3′ из последних J кодирования экзон в локусе IgH, гавани соматических мутаций из-за распространения мутаций 3′ из V промоутер32,33,34 и, следовательно, часто используется в качестве суррогатного маркера для SHM в V регионах31,35 (Рисунок 1). Чтобы экспериментально выяснить, как конкретные гены или генетические мутации изменить SHM моделей или ставок, JH4 интрон может быть секвенирован из патчей Пейера (PP) герминального центра B клеток (GCBCs), которые проходят высокие показатели SHM36,37,38. GCBCs можно легко определить и изолировать с флуоресцентно спряженными антителамипротив маркеров поверхности клетки (B220 и PNAHI)17,39.
Представлен подробный протокол для характеристики интронных мутаций JH4 в PP GCBCs у мышей с использованием комбинации FACS (сортировка активированных клеток флуоресценции), ПЦР и секвенированияСэнгера (рисунок 2).
Характеристика SHM в igH и IgL V кодирования последовательностей неоднородной популяции клеток B представляет собой проблему, учитывая, что каждая клетка B однозначно реорганизует V сегментов кодирования во время рекомбинации V(D)J34. В этой статье мы описываем метод выявления мутаций в интроне JH4 ГХК. JH4 интрон, который расположен 3′ из последнего сегмента кодирования J в локусе IgH, используется в качестве суррогата для SHM регионов V(рисунок 1)31,33,34,35. Чтобы каталогизировать эти интрон мутации JH4 и оценить, как конкретные гены влияют на производство или структуру мутаций, PP GCBCs специально анализируются. Эти клетки накапливают интрональные мутации JH4 в результате хронической стимуляции кишечной микробиотой53. Кроме того, B220иPNAHI GCBCs от PPs неиммунизированных мышей имеют спектр мутации, который сравнивается с splenic GCBCs от иммунизированныхживотных 54,55. Тем не менее, мутации в интроне JH4 не могут быть связаны с созреванием сродства Ig, потому что эти мутации не кодируются.
Чтобы определить, изменяет ли SHM сродство Ig, мыши должны быть иммунизированы intraperitoneally с антигеном, таких как NP (4-гидрокси-3-нитрофенилацетил) конъюгированных cGG (куриный гамма-глобулин) или KLH (ключ отверстие хрома hemocyanin)56. Впоследствии, мРНК может быть очищена отsplenic B220 и PNAHI GCBCs для изучения SHM в VH186.2, V кодирования экзон, который чаще всего распознает NP и мутировал после NP-CGG или NP-KLHиммунизации 31,57,58,59,60. Мутация триптофан-33 на лейцин в VH186.2 была охарактеризована для увеличения сродства Ig до 10 раз59,60 и,следовательно, один показатель того, что SHM и клональный отбор вызвал высокое сродство Ig. Измерение NP7- и NP20-специфических сывороток Ig титеры ELISA и расчета Ig-специфических NP7/NP20 соотношение в ходе иммунизации также документы Ig сродства созревания в результате SHM Vрегионов 17,21,36. Оба эти анализа могут быть использованы для корреляции SHM в VH186.2 кодирования последовательностей с изменениями в NP-специфических Ig сродства созревания.
Используются ли иммунизированные или неимунизированные животные для анализа SHM VH186.2 или интрона JH4, GCBCs должны быть точно идентифицированы. Мы представляем подход, основанный на FACS, чтобы изолировать B220 и PNAHI GCBCs. В качестве альтернативы, Фас и не сульфатных No 2-6-sialyl-LacNAc антиген, который признается антителом GL761,62,63,64,также могут быть использованы для изоляции GCBCs, которые определены как B220иFasNO GL7No 65 илиCD19 Выражение GL7 близко отражает PNA в активированных GCBCs лимфатических узлов64,65,66. В дополнение к использованию маркеров антител, характерных для ГХДК, окрашивание коктейлей должно максимизировать возбуждение флюорофора и обнаружение биомаркера при минимизации спектрального перекрытия флуоресцентного излучения. Антигены, выраженные на низких уровнях, должны быть обнаружены с антителом, которое спрягается с флюорофором с надежной флуоресценциейвыбросов 67. Рекомендуемый протокол окрашивания был оптимизирован для анализа на сортаторе клеток, оснащенном четырьмя лазерами (405 нм, 488 нм, 561 нм, 633 нм) и 12 фильтрами; однако конфигурации фильтров и доступность лазеров различаются между цитометрами. Для внесения изменений в протокол в соответствии с реагентом и наличием оборудования, читателю направляются дополнительные ресурсы, онлайн-зрители спектра и опубликованная литература67,68, 69,70,71,72,73. Многоцветный протокол окрашивания, описанный в настоящем, требует компенсации спектрального перекрытия для обеспечения того, чтобы отсортированная популяция клеток была ГХОК, а не неточного обнаружения флуоресцентного излучения. B220 служит полезным контролем окрашивания для описанного FACS(таблица 1B), потому что PPs будет иметь отличительные B220 отрицательных и положительных популяций (Рисунок 3C), что позволяет для соответствующей компенсации спектрального перекрытия. Стратегия гатинга, представленная на рисунке 3C, должна использоваться в качестве ориентира. Участки цитометрии потока могут варьироваться в зависимости от условий окрашивания и параметров цитометра. Тем не менее, 4-10% живых клеток должны быть B220иPNAHI 35, 52.
Все мутации в JH4 intron PP GCBCs должны быть проверены, чтобы убедиться, что наблюдаемые мутации действительно отражают SHM, а не артефакт ПЦР или секвенирования. AID-/- B-клетки могут служить полезным негативным контролем при изучении фенотипа SHM в других моделях мышей-мутантов, потому что эти клетки не могут завершить SHM17,19. Скорость мутации JH4 интрона в AID-/- GCBCs (1.66×10-5 мутаций/bp)20,21,36,37,38,50,74 сопоставима с погрешностью полимеразы высокой точности (5.3×10-7 sub/base/doubling)51,52, которая используется для усиления ДНК в вложенном ПЦР. Если AID-/- мыши недоступны, сравните наблюдаемую модель мутации и частоту с опубликованной литературой. Ig V регионов накапливаются 10-3-10-4 мутаций на базовую пару деления, что примерно в 106раз выше, чем скорость мутации других генныхлокусов 73,75. Результаты могут варьироваться в зависимости от возраста животного76. Кроме того, B220иPNALO клетки, которые марки не-GCBCs, могут быть использованы в качестве отрицательного контроля в отсутствие AID-/- мышей 52. Если частота мутаций в WT GCBCs ниже, чем ожидалось, ВТ зародышевой JH4 intronic последовательность может быть непропорционально представлены. В этом случае убедитесь, что ГХДК были окрашены и отсортированы надлежащим образом, а ПЦР свободны от загрязнения интроном WT germline JH4. Кроме того, необработанные данные секвенирования в электроферограммах должны быть тщательно проанализированы, чтобы убедиться, что мутации в текстовых данных последовательности не являются артефактами ошибок секвенирования. Например, плохие результаты секвенирования Sanger могут снизить надежность данных последовательности(рисунок 4). Такой контроль качества данных последовательности Sanger повысит точность и воспроизводимость анализа интрон мутаций JH4.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Тасуку Хонджо за ПОМОЩЬ-/- мышей. Эта работа была поддержана Национальным институтом по вопросам здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения (5G12MD007603), Национальным институтом рака (2U54CA132378) и Национальным институтом общих медицинских наук (1SC1GM132035-01).
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |