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Immunology and Infection

माउस पीयर के पैच से जर्मिनल सेंटर बी कोशिकाओं के जेएच4 इनट्रॉन में दैहिक हाइपरम्यूटेशन का विश्लेषण

Published: April 20, 2021 doi: 10.3791/61551
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biology, The City College of New York and The Graduate Center of The City University of New York, 2Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

यहां प्रस्तुत माउस पेयर के पैच से अंकुरित केंद्र बी कोशिकाओं का उपयोग करके इम्यूनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला जीन लोकस के भीतर दैहिक हाइपरम्यूटेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक परख है।

Abstract

लिम्फोइड अंगों के अंकुरित केंद्रों के भीतर, परिपक्व बी कोशिकाएं आईजी भारी और प्रकाश श्रृंखला जीन लोकी के चर कोडिंग एक्सोन में अनटेम्पेड म्यूटेशन शुरू करके अपने व्यक्त इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजी) को बदल देती हैं। दैहिक हाइपरम्यूटेशन (एसएचएम) की इस प्रक्रिया के लिए एंजाइम एक्टिवेशन-प्रेरित साइटिडीन डेमिनास (ईडी) की आवश्यकता होती है, जो डीऑक्सीसाइटिडिन्स (सी) को डिऑक्सी ऑरिडिडिन्स (यू) में परिवर्तित करता है। एड-जनित यू:जी बेमेल को आधार एक्सिशन और बेमेल मरम्मत मार्गों द्वारा म्यूटेशन में संसाधित करना नए आईजी कोडिंग दृश्यों का परिचय देता है जो उच्च आत्मीयता आईजी का उत्पादन कर सकते हैं। सहायता या डीएनए मरम्मत जीन में उत्परिवर्तन आईजी लोकी में देखे गए म्यूटेशन के प्रकारों को अवरुद्ध या काफी बदल सकते हैं। हम जेएच4 इनट्रॉन म्यूटेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS), पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करता है। हालांकि यह परख सीधे आईजी आत्मीयता परिपक्वता को मापने नहीं है, यह आईजी चर कोडिंग दृश्यों में उत्परिवर्तन का संकेत है । इसके अतिरिक्त, ये विधियां सामान्य आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करती हैं जो कई बी सेल क्लोन के आईजी दृश्यों में उत्परिवर्तन का विश्लेषण करती हैं। इस प्रकार, यह परख एसएचएम और आईजी विविधीकरण के अध्ययन में एक अमूल्य उपकरण है।

Introduction

बी कोशिकाओं, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के सदस्यों, पहचान और एंटीबॉडी, भी इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजी) के रूप में जाना जाता है उत्पादन द्वारा एंटीजन को खत्म । प्रत्येक आईजी दो भारी (आईजीएच) और दो प्रकाश (आईजीएल) चेन पॉलीपेप्टाइड्स से बना है, जो आईजी1की विशेषता "वाई" आकार संरचना बनाने के लिए डिसल्फाइड बांड द्वारा एक साथ आयोजित किए जाते हैं। आईजीएच और आईजीएल की एन-टर्मिनी में प्रत्येक पॉलीपेप्टाइड का वेरिएबल (वी) क्षेत्र शामिल है और एक साथ वे आईजी की एंटीजन बाध्यकारी साइट बनाते हैं, जबकि आईजीएच का निरंतर क्षेत्र आईजी के प्रभावक कार्य को प्रदान करता है। बोन मैरो में बी कोशिकाओं का विकास आईजीएच और आईजीएल के वी कोडिंग एक्सन को वी (डी) जे रिकॉम्बिनेशन2, 3, 4के नाम से जानाजाताहै । पुनः संमिलित वी एक्सोन्स का प्रतिलेखन, संबंधित निरंतर क्षेत्र exons के साथ मिलकर, एमआरएनए को आईजी में अनुवादित करता है।

परिपक्व बी कोशिकाएं एक झिल्ली बाध्य आईजी को व्यक्त करती हैं, जिसे बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) के रूप में भी जाना जाता है, माध्यमिक लिम्फोइड अंगों, जैसे तिल्ली, लिम्फ नोड, या पीयर के पैच में प्रसारित होते हैं, जहां वे एंटीजन के लिए पर्यावरण का सर्वेक्षण करते हैं और प्रतिरक्षा प्रणाली की अन्य कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं1। माध्यमिक लिम्फाइड अंगों के अंकुरण केंद्रों (जीसी) के भीतर, बी कोशिकाएं जो बीसीआर के माध्यम से एंटीजन को पहचानती हैं, सक्रिय हो जाती हैं। कूप डेंड्रिटिक कोशिकाओं और कूप सहायक टी कोशिकाओं द्वारा सहायता प्राप्त, सक्रिय बी कोशिकाएं तब प्लाज्मा और स्मृति कोशिकाओं में पैदा और अंतर कर सकती हैं, जोएक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5,6,7,8, 9के महत्वपूर्ण प्रभावक हैं। इसके अतिरिक्त, ये सक्रिय बी कोशिकाएं माध्यमिक आईजी जीन विविधीकरण प्रक्रियाओं से गुजर सकती हैं - क्लास स्विच रिकॉम्बेशन (सीएसआर) और दैहिक हाइपरम्यूटेशन (एसएचएम)। सीएसआर के दौरान, बी कोशिकाएं डीएनए विलोपन-पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया(चित्रा 1)के माध्यम से एक और निरंतर क्षेत्र (γ, α, ε) के साथ आईजीएच पॉलीपेप्टाइड के डिफ़ॉल्ट μ निरंतर क्षेत्र का आदान-प्रदान करती हैं। यह एक अलग निरंतर exon और एक नए पुलिस महानिरीक्षक के अनुवाद की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। बी सेल आईजीएम को दूसरे आइसोटाइप (आईजीजी, आईजीए, आईजीई) में व्यक्त करने से स्विच करेगा। सीएसआर अपनी एंटीजन विशिष्टता 10 ,11,12में फेरबदल किए बिना आईजी के प्रभावक कार्य में परिवर्तन करता है । हालांकि, एसएचएम के दौरान, बी कोशिकाएं आईजीएच और आईजीएल के वी कोडिंग क्षेत्रों को म्यूट करती हैं ताकि उच्च आत्मीयता आईजी के उत्पादन और चयन को सक्षम किया जा सके, जोएंटीजन13, 14,15(चित्रा 1)को अधिक प्रभावी ढंग से समाप्त कर सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएसआर और एसएचएम दोनों एक एंजाइम के कार्य पर निर्भर करते हैं: सक्रियण-प्रेरित साइटिडीन डेमिनास (सहायता)16,17,18। सहायता में मनुष्यों और चूहों की कमी सीएसआर या एसएचएम को पूरा नहीं कर सकती है और ऊंचा आईजीएम सीरम टाइटर्स या हाइपर-आईजीएम17, 19के साथ मौजूद है।

सीएसआर में, सहायता दोहराव वाले स्विच क्षेत्रों में deoxycytidines (सी) को deaminates करता है जो प्रत्येक निरंतर कोडिंग एक्सोन से पहले, उन्हें deoxyuridines (यू)20,21में परिवर्तित करता है, जो डेऑक्सीयूरिडिन्स और डिऑक्सीगुआनोसिन्सिन (यू:जी) के बीच बेमेल आधार बांधना बनाता है । ये यू: जी बेमेल जो डीएनए पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक हैं, या तो बेस एक्सिशन रिपेयर (बीईआर) या बेमेल रिपेयर (एमएमआर) मार्ग22,23,24,25, 26,27,28,29। एसएचएम में, वी कोडिंग एक्सन के भीतर सहायता सी को कम करता है। यू भर में प्रतिकृति: जी बेमेल सी उत्पन्न करता है: जी से टी: एक संक्रमण उत्परिवर्तन, जबकि BER प्रोटीन, uracil डीएनए ग्लाइकोसिलेज (UNG) द्वारा uracil आधार को हटाने, डीएनए प्रतिकृति से पहले दोनों संक्रमण और ट्रांसवर्सेशन म्यूटेशन16पैदा करता है । UNG में नल उत्परिवर्तन काफी सी: जी से टी के लिए वृद्धि: एक संक्रमण उत्परिवर्तन21,22। सीएसआर के समान, एसएचएम को एमएमआर और बीईआर की पूरक भूमिकाओं की आवश्यकता होती है। एसएचएम के दौरान, एमएमआर ए:टी बेस जोड़े में म्यूटेशन उत्पन्न करता है। म्यूट्स होमोलॉजी 2(एमईएसएच2)या डीएनए पॉलीमरेज η(Polη)में निष्क्रिय उत्परिवर्तन एमईएसएच 2 में ए:टी बेस और यौगिक उत्परिवर्तनों में काफी कमी करता है और Polη ए: टी बेस21,30, 31पर म्यूटेशन को लगभग समाप्त करता है। सहायता जनित यू को संक्रमण या ट्रांस्बर्नेस म्यूटेशन में बदलने में बीईआर और एमएमआर के लिए महत्वपूर्ण भूमिका के अनुरूप, MSH2 और UNG दोनों के लिए चूहों की कमी (MSH2-/-UNG-/-) केवल सी: जी से टी: एक संक्रमण म्यूटेशन यू भर में प्रतिकृति के परिणामस्वरूप प्रदर्शित: जी बेमेल 21।

वी कोडिंग क्षेत्रों में एसएचएम का विश्लेषण जटिल बना हुआ है क्योंकि बी कोशिकाओं के विकास से आईजीएच और आईजीएल लोकी 1,2,4में वी (डी) जे कोडिंग एक्सोन में से किसी को फिर से मिलाया जा सकता है। इन विशिष्ट रूप से पुनः संयोजन और दैहिक रूप से उत्परिवर्तित वी क्षेत्रों के सटीक विश्लेषण के लिए बी कोशिकाओं या आईजी एमआरएनए11,13के क्लोनों की पहचान और अलगाव की आवश्यकता होती है । जेएच4 इंट्रॉन, जो आईजीएच लोकस में अंतिम जे कोडिंग एक्सोन का 3' है, वी प्रमोटर32,33, 34 के म्यूटेशन 3 के प्रसार के कारण दैहिक उत्परिवर्तनों को बंदरगाह करता है और इसलिए अक्सर वी क्षेत्रों में एसएचएम के लिए सरोगेट मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है31,35 (चित्रा 1)। प्रयोगात्मक रूप से स्पष्ट करने के लिए कि कैसे विशिष्ट जीन या आनुवंशिक उत्परिवर्तन एसएचएम पैटर्न या दरों को बदलते हैं, जेएच4 इंट्रॉन को पेयर के पैच (पीपी) अंकुरित केंद्र बी कोशिकाओं (जीसीबीसी) से अनुक्रमित किया जा सकता है, जो एसएचएम36, 37,38की उच्च दरों से गुजरता है। जीसीबीसी को कोशिका सतह मार्कर (B220+PNAHI)17,39के खिलाफ फ्लोरोसेंट रूप से संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ आसानी से पहचाना और अलग किया जा सकता है।

एफएसीएस (फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग), पीसीआर और सेंगर सीक्वेंसिंग(चित्रा 2)के संयोजन का उपयोग करके चूहों से पीपी जीसीबीसी में JH4 इंट्रॉन म्यूटेशन की विशेषता के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।

Protocol

सभी उत्परिवर्ती चूहों एक C57BL/6 पृष्ठभूमि पर बनाए रखा गया । उम्र से मेल (2-5 महीने पुराना) पुरुष और मादा चूहों का उपयोग सभी प्रयोगों के लिए किया गया था। के पालन और चूहों के साथ प्रयोग न्यूयॉर्क संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के सिटी कॉलेज द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया ।

1. पीयर के पैच का विच्छेदन

  1. 5 मिनट के लिए 3 एल/मिनट पर १००% सीओ2 के साथ माउस इच्छामृत्यु और उसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद मौत की पुष्टि करने के लिए । विच्छेदन उपकरण (कैंची, संदंश, ठीक संदंश) और 70% इथेनॉल के साथ दस्ताने हाथों को स्टरलाइज करें।
  2. पेट के साथ विच्छेदन पैड पर माउस रखें। विच्छेदन क्षेत्र को स्टरलाइज करने के लिए किसी भी चीरे बनाने से पहले 70% इथेनॉल के साथ माउस के शरीर को उदारता से स्प्रे करें।
  3. पेट भर में त्वचा में एक चीरा बनाओ और सिर और पूंछ की ओर चीरा के दोनों किनारों पर एक साथ खींच द्वारा पेट से त्वचा को हटाने संदंश (या निष्फल, दस्ताने हाथ) का उपयोग कर।
  4. माउस के सामने और पिछले अंगों को पिन करें।
  5. आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए कैंची से पेरिटोनियल गुहा को काट लें।
  6. पेट और कैटम ("जे" कोलन के पास आकार की संरचना) के बीच छोटी आंत का पता लगाएं। छोटी आंत को पेट के नीचे और कैटम के ऊपर काटकर निकालें।
  7. छोटी आंत के गुंबदों को एक साथ जोड़ने वाले किसी भी कनेक्टिव ऊतक और वसा को हटा दें।
    नोट: वसा एक विशिष्ट सफेद रंग होगा, छोटी आंत के गुलाबी रंग के विपरीत ।
  8. पेयर के पैच (पीपीएस) के लिए छोटी आंत की बाहरी सतह की जांच करें, जो छोटे (~ 1 मिमी), अंडाकार आकार की संरचनाएं हैं जो पारदर्शी एपिथेलियल कोशिकाओं की पतली परत के नीचे सफेद दिखाई देती हैं।
  9. ध्यान से कैंची के साथ सभी दिखाई पीपी आबकारी।
    नोट: एक C57BL/6 जंगली प्रकार (WT) माउस 4-8 पीपीएस उपज कर सकते हैं, जबकि एक सहायता-/-माउस 6-10 पीपीएस होगा ।
  10. बर्फ पर FACS बफर के 1 एमएल युक्त 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पीपीएस ले लीजिए।
    नोट: पीपी डूब जाना चाहिए, जबकि वसा सतह पर तैरना होगा और हटाया जा सकता है ।

2. FACS के लिए सेल अलगाव

  1. 1 एमएल ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) एफएएफएस बफर के साथ 6-वेल डिश में 40 माइक्रोन फिल्टर रखें।
  2. फिल्टर पर 1.5 एमएल ट्यूब से पीपीएस डालो।
  3. ठंडे FACS बफर के 1 मिलीएल के साथ पीपीएस धोएं, सुनिश्चित करें कि वे हमेशा तरल और बर्फ पर हैं।
  4. फिल्टर पर पीपीएस को कुचलने के लिए एक मूसल के रूप में एक 1 एमएल सिरिंज से प्लंजर के फ्लैट अंत का उपयोग करें जब तक कि केवल कनेक्टिव ऊतक फिल्टर पर रहता है।
  5. 6 अच्छी तरह से पकवान में कोशिकाओं को छोड़ने के लिए ठंडे FACS बफर के 1 मिलील के साथ फिल्टर और प्लंजर धोएं।
  6. ठंडे FACS बफर में कोशिकाओं के ~ 4 एमएल ले लीजिए और उन्हें एक 40 μm छलनी टोपी FACS ट्यूब के माध्यम से फ़िल्टर।
  7. छन्नी टोपी को कोल्ड एफएस बफर के 1 एमएल से धोएं।
  8. एक झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली।
  9. सुपरनैंट को डिकेंट करें।
  10. कोल्ड एफएस बफर के 0.4 एमएल में कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ल करें।
  11. उपज को सत्यापित करने के लिए सेल गिनती के लिए 10 μL निकालें (~ 5 x 106 कोशिकाओं/माउस की उम्मीद है, चित्रा 3Aदेखें)
  12. एक 40 माइक्रोन छलनी टोपी के माध्यम से शेष कोशिकाओं को एक FACS ट्यूब में फ़िल्टर करें और FACS के लिए धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें।

3. FACS के लिए धुंधला जीसीबीसी

  1. 400 माइक्रोन सेल निलंबन में 1 μL एफसी ब्लॉक (अवेलेबल एंटी-माउस सीडी 16/सीडी32) जोड़ें और कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  2. कोशिकाओं को धोने के लिए कोल्ड एफएस बफर का 2 एमएल जोड़ें।
    1. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 x ग्राम पर पैलेट कोशिकाएं और सुपरनैंट को त्यागें।
  3. कोल्ड एफएएफएस बफर के 80 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से रीसल करें।
  4. प्रत्येक धुंधला नियंत्रण के लिए डब्ल्यूटीई पीपी से कोशिकाओं के 10 μL निकालें (कुल में 4, 3 एकल दाग नियंत्रण और 1 अन दाग नियंत्रण सहित) । अगले चरण के लिए डब्ल्यूटीई पीपी के 40 माइक्रोन छोड़ दें। वैकल्पिक रूप से, धुंधला नियंत्रण के लिए मुआवजा मोती का उपयोग करें।
  5. प्रयोगात्मक नमूनों में से प्रत्येक दाग (जैसे, WT और सहायता-/-)ठंड FACS बफर के ५०० μL में मूंगफली agglutinin (PNA)-बायोटिन के २.५ माइक्रोन के साथ बर्फ पर 15 मिनट के लिए ।
  6. कोशिकाओं को धोने के लिए कोल्ड एफएस बफर का 2 एमएल जोड़ें।
    1. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 x ग्राम पर पैलेट कोशिकाएं और सुपरनैंट को त्यागें।
  7. 15 मिनट (तालिका 1) के लिए, बर्फ पर, अंधेरे में कॉकटेल के 500 माइक्रोन के साथ प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने को दाग दें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से धुंधला कॉकटेल में फिर से निलंबित कर रहे हैं ।
  8. मुआवजा मैट्रिक्स के लिए एकल दाग नियंत्रण तैयार करें।
    1. टेबल 2में निर्दिष्ट कमजोर पड़ने का उपयोग करके ठंडे एफएएफएस बफर के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को दाग दें।
    2. अंधेरे में धुंधला नियंत्रण, बर्फ पर, 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  9. चरण 3.7 और 3.8 में सभी ट्यूबों में 2 एमएल कोल्ड एफएस बफर जोड़ें, कोशिकाओं को गोली दें, और अनबाउंड एंटीबॉडी या डीएपीआई को धोने के लिए सुपरनैंट को त्यागें।
  10. ठंडे FACS बफर के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और बर्फ पर रखें।
  11. एक सेल सॉर्टर का उपयोग करना, प्रत्येक दाग प्रयोगात्मक नमूने से B220+PNAHI इकट्ठा करें। चित्रा 3B WT औरAID-/-PPs से प्राप्त B220+ PNAHI के विशिष्ट प्रतिशत को दिखाता है । चित्रा 3C FACS गेटिंग रणनीति प्रदर्शित करता है ।

4. जीसीबीसी से डीएनए निष्कर्षण

  1. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 x ग्राम पर गोली सॉर्ट कोशिकाओं और सुपरनैंट त्यागें।
  2. कोशिकाओं को कोल्ड एफएस बफर के 1 एमएल में फिर से खर्च करें और कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    1. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली दें और सुपरनैंट को त्यागें।
  3. डीएनए निष्कर्षण बफर के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के 5 माइक्रोन करें।
  4. रात 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. 500 माइक्रोन आइसोप्रोपेनॉल और 20 मिलीग्राम/ ट्यूब को 5-6x उलटा करके अच्छी तरह मिला लें।
  6. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  7. 21,000 x ग्रामपर 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में सेंट्रलाइज।
    1. सुपरनेट को त्यागें और गोली को बनाए रखें, जिसमें उपजी डीएनए और ग्लाइकोजन होता है।
  8. डीएनए गोली को 70% इथेनॉल के 1 मिलील से धोएं।
    1. 21,000 x ग्राम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में डीएनए को गोली दें।
    2. 70% इथेनॉल निकालें और हवा-5-10 मिनट के लिए डीएनए गोली सूखी।
      नोट: अधिक सुखाने से बचें क्योंकि डीएनए पूरी तरह से रीहाइड्रेट नहीं हो सकता है।
  9. डीएनए को 30 माइक्रोन ते बफर में फिर से खर्च करें और रात भर 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

5. JH4 intron अनुक्रम प्रवर्धन और विश्लेषण

  1. 260 एनएम (A260) की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापकर डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: एक C57BL/6 माउस के हल B220+PNAHI GCBCs से बरामद डीएनए की ठेठ एकाग्रता 20-40 एनजी/μL है ।
  2. JH4 intron(तालिका 3, तालिका 4)के लिए नेस्टेड पीसीआर प्रदर्शन करते हैं । कम से कम केंद्रित नमूने के लिए पहली पीसीआर में इस्तेमाल जीनोमिक डीएनए की कुल राशि को सामान्य करें। (उदाहरण के लिए, यदि सबसे कम केंद्रित नमूना 5 एनजी/माइक्रोन है, तो पीसीआर #1 में पानी की अधिकतम मात्रा (11.75 माइक्रोएल) में सभी नमूनों के लिए डीएनए के 58.75 एनजी का उपयोग करें।
  3. पीसीआर उत्पाद को 20 मिनट के लिए 200 वी पर 1.5% एगरेग्लेड जेल पर हल करें। अपेक्षित एम्प्लीकॉन का आकार 580 बीपी है।
  4. जेल से एम्प्लिकॉन को उत्पादित करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए निकालें (पूरक चित्रा 1देखें)।
    1. पानी के 30 माइक्रोन के साथ डीएनए Elute और A260 मापने के द्वारा डीएनए की मात्रा मात्रा निर्धारित करते हैं ।
      नोट: शुद्ध पीसीआर उत्पाद की विशिष्ट एकाग्रता 3-10 एनजी/μL है ।
  5. शुद्ध पीसीआर उत्पाद को कुंद सिरों के साथ एक प्लाज्मिड में लिगेट करें। हर लिगेशन रिएक्शन(टेबल 5)में इस्तेमाल होने वाले पीसीआर उत्पाद की कुल राशि का मानकीकरण करें।
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट या रात 16 डिग्री सेल्सियस पर लिगेशन प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
  6. लिगेशन रिएक्शन के 2 माइक्रोन के साथ इलेक्ट्रोकंपिटेंट बैक्टीरियल कोशिकाओं को बदलें।
    1. 1.65 केवी पर इलेक्ट्रोपोरेट।
    2. 225 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एसओसी मीडिया के 600 माइक्रोल में बचाव।
    3. प्लेट 100 माइक्रोन एलबी पर परिवर्तित बैक्टीरिया एम्पिसिलिन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) आगर प्लेटों के साथ पूरक और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  7. T7 फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण के लिए बैक्टीरियल कॉलोनियों की प्लेट सबमिट करें। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक बैक्टीरियल कॉलोनी की रातोंरात संस्कृतियों को विकसित करें और एक प्लाज्मिड शुद्धि करें।
    1. यदि आवश्यक हो, तो बैक्टीरियल कॉलोनियों की उपज को अनुकूलित करने के लिए पीसीआर, लिगेशन और/या परिवर्तन दोहराएं
      नोट: प्रत्येक प्लेट से कम से कम 30 कॉलोनियों को चुना जाना चाहिए।
  8. .txt फ़ाइलों में अनुक्रम डेटा का मानकीकरण करें
    1. प्लाज्मिड सीक्वेंस को डिलीट करें।
    2. सुनिश्चित करें कि हर अनुक्रम उन्मुख है 5 ' 3 ' JH4 intron संदर्भ अनुक्रम (NG_005838) के अनुसार । आवश्यक के रूप में, किसी भी अनुक्रम के रिवर्स पूरक उत्पन्न करें।
  9. एक क्लस्टल ओमेगा सॉफ्टवेयर (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके जेएच4 इनट्रॉन संदर्भ अनुक्रम (NG_005838) के खिलाफ प्रत्येक पीसीआर के लिए प्राप्तअनुक्रमों को संरेखितकरें।
    1. म्यूटेशन के रूप में संदर्भ अनुक्रम से मतभेदों की पहचान करें
    2. सत्यापित करें कि सेंगर अनुक्रमण के इलेक्ट्रोफेरोग्राम की जांच करके सभी म्यूटेशन सही बिंदु उत्परिवर्तन हैं। यदि आवश्यक हो तो अनुक्रमण दोहराएं। (चित्रा 4बी, सी)।
  10. प्रत्येक जीनोटाइप(चित्रा 5)के लिए जेएच4 इंस्टट्रॉन में अद्वितीय उत्परिवर्तनों को सारणीबद्ध और मात्राबद्ध करें।
    1. केवल एक बार समान उत्परिवर्तन के साथ दृश्यों की गणना करें
      नोट: यह निर्धारित करना संभव नहीं है कि पीसीआर या विभिन्न बी कोशिकाओं में समान एसएचएम घटनाओं के दौरान समान दृश्य उत्पन्न हुए थे या नहीं।
    2. डब्ल्यूटी जर्मलाइन JH4 इनट्रॉन दृश्यों (यानी, कोई उत्परिवर्तन के साथ उन) के हर उदाहरण को एक अद्वितीय अनुक्रम के रूप में गिनाएं।

Representative Results

फ्लो साइटोमेट्री
परिपक्व बी कोशिकाएं अंकुरण केंद्रों में प्रसारित होती हैं जहां वे आत्मीयता परिपक्वता, क्लोनल विस्तार, और प्लाज्मा या स्मृति कोशिकाओं में भेदभाव से गुजरते हैं40,41,42, 43,44। इन जीसीबीसी की पहचान कई सेल सतह मार्कर द्वारा की जा सकती है, जिसमें CD45R/B220 रिसेप्टर की उच्च अभिव्यक्ति और मूंगफली एग्लुटिनिन (PNA)45, 46की बाध्यकारी शामिल है। सक्रिय जीसीबीसी को अलग करने के लिए, पीपी कोशिकाओं को एंटी-बी 220 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था जो फाइकोरीथ्रिन (पीई) और बायोटिनेलेटेड-पीएनए के लिए संयुग्मित थे, जिसके बाद एपीसी-eFluor780 को स्ट्रेप्टाविडिन का संयुग्म किया गया था। फ्लोरोसेंट 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (डीएपीआई) डाई का उपयोग करके मृत कोशिकाओं को समाप्त कर दिया गया था, जो मरने या मृत कोशिकाओं47, 48के न्यूक्लिक एसिड को दाग देता है। दाग कोशिकाओं को बाद में विश्लेषण किया गया और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से हल किया गया। पीपीएस में ~ 80% B220+ कोशिकाएं49,50शामिल थीं । डब्ल्यूटीपी में औसतन 4 x 106 कोशिकाएं प्रति माउस(चित्रा 3A)होती हैं। डब्ल्यूटी पीपी कोशिकाओं का लगभग 8% B220+PNAHIथा, जो सहायतामें देखी गई संख्या आधीहै-/-(चित्रा 3B)। इस प्रकार, 0.3-0.6 x 106 B220+PNAHI GCBCs छंटाई के बाद प्राप्त किए गए थे, जो JH4 intron में म्यूटेशन का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त थे।

JH4 अनुक्रम विश्लेषण
जेएच4 इंट्रॉन को आम वीएचजे558 फैमिली प्राइमर (J558FR3Fw और VHJ558.2) का उपयोग करके एक नेस्टेड पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था, इसके बाद जेएच4 इनट्रॉन में फैले प्राइमर VHJ558.3 और VHJ558.435,37। डब्ल्यूटी जीसीबीसी से प्राप्त 105 अद्वितीय दृश्यों में से कुल 226 म्यूटेशन पाए गए(चित्रा 5A)। डब्ल्यूटीई चूहों में जीसीबीसी उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम के विश्लेषण में 4 x 10-3 म्यूटेशन/बीपी की दर से संक्रमण और ट्रांसवर्सन की एक श्रृंखला दिखाई गई, जिसकीगणना32, 36, 37,38के कुल आधारों द्वारा उत्परिवर्तित ठिकानों की कुल संख्या को विभाजित करके की गई थी। इसके अतिरिक्त, डब्ल्यूटी जीसीबीसी के प्रत्येक जेएच4 पीसीआर उत्पाद में 1-25 म्यूटेशन(चित्रा 5बी)होते थे, जहां एक अनुक्रम33, 36पर अक्सर कई उत्परिवर्तन पाए जाते थे। ११३ सहायता-/-दृश्यों (चित्रा 5A)में केवल दो म्यूटेशन की पहचान की गई । सहायता-/-बी कोशिकाओं का प्रदर्शन १.६६ x 10-5 म्यूटेशन/बीपी, जो डब्ल्यूटी बी कोशिकाओं (पी & ०.०५)३६ से काफी कम था और उच्च निष्ठा बहुलक (५.३ x 10-7 उप/आधार/दोहरीकरण) ५१,५२की त्रुटि दर की तुलना में । इस प्रकार, सहायता-/-बी कोशिकाओं को इस परख के लिए एक उपयोगी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया ।

Figure 1
चित्रा 1: आईजीएच जीन लोकस और सीएसआर और एसएचएम के दौरान सहायता द्वारा लक्षित क्षेत्रों की योजनाबद्ध। लाल पट्टी 580 बीपी JH4 intron इंगित करता है जो VDJH4 पुनर्व्यवस्थाओं का 3'है और इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण किया जाता है। सीएसआर में, इंट्रोनिक स्विच क्षेत्रों (Sμ और Sε) का सहायता-निर्भर वितालि डीएसबी गठन को बढ़ावा देता है जो हटाने-पुनर्संयोजन और एक नए एंटीबॉडी आइसोटाइप (आईजीएम से आईजीईई) की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। एसएचएम के दौरान, वी क्षेत्र (ग्रे बॉक्स) म्यूटेशन (नीली रेखाएं) जमा करते हैं जो उच्च आत्मीयता आईजी का कारण बन सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीपीएस से अलग जीसीबीसी में जेएच4 इंस्टट्रॉन के एसएचएम का विश्लेषण करने के लिए कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पीपी जीसीबीसी का लक्षण वर्णन। (A)डब्ल्यूटीई औरएड-/-चूहों (एन = 4 प्रति जीनोटाइप) से पीपी कोशिकाओं की कुल संख्या । त्रुटि सलाखों के मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । (B)डब्ल्यूटी औरएड-/-चूहों (एन = 4 प्रति जीनोटाइप)36के पीपीएस से प्राप्त बी 220+पीएनएएचआई जीसीबीसी का प्रतिशत। त्रुटि सलाखों के मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं, * पी एंड एलटी; 0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करते हैं । (ग)प्रतिनिधि एफएसीएस भूखंड पीपीएस से B220+PNAHI GCBCs सॉर्ट करने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: JH4 Sanger अनुक्रम डेटा का विश्लेषण। (ए)डब्ल्यूटीई (टॉप) औरएड-/-(बॉटम) जीसीबीसी से जेएच4 पीसीआर उत्पाद के सेंगर सीक्वेंस डेटा का नमूना अनुक्रम संरेखण संदर्भ जीनोमिक अनुक्रम (NG_005838) के लिए है, जो गिने हुए टिक मार्क्स के तुरंत नीचे अनुक्रम है । क्लैस्टल ओमेगा का उपयोग करके संरेखण उत्पन्न किए गए थे। (ख)उच्च गुणवत्ता वाले सेंगर अनुक्रम डेटा का इलेक्ट्रोफेरोग्राम, जिसने प्रत्येक आधार के लिए अलग-अलग चोटियों को प्रदर्शित किया। (C)कम गुणवत्ता वाले अनुक्रम डेटा का इलेक्ट्रोफेरोग्राम, जिसमें अस्पष्ट चोटियों और अनिर्दिष्ट कुर्सियां (एन) दिखाई दीं । लाल रंग में दिखाए गए न्यूक्लियोटाइड को अनुक्रम टेक्स्ट फ़ाइल में मैन्युअल रूप से एनोटेट किया जाना चाहिए।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: डब्ल्यूटीई और एड-/-जीसीबीसी में जेएच4 इंट्रॉन में म्यूटेशन का विश्लेषण । (क)प्रत्येक जीनोटाइप के लिए ए, सी, जी और टी बेस पर संक्रमण (लाल) और ट्रांसवर्जन (नीला) म्यूटेशन की कुल संख्या तालिकाओं में संक्षेप में दी जाती है । विश्लेषण किए गए दृश्यों की कुल संख्या तालिका के नीचे इंगित की गई है। (ख)प्रत्येक जीनोटाइप के लिए पीसीआर एम्प्लीकॉन प्रति म्यूटेशन की संख्या पाई चार्ट में दर्शाई गई है । इस आंकड़े को Choi et al.36 कॉपीराइट 2020 से संशोधित किया गया है। अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ इम्यूनोलॉजिस्ट, इंक कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीसीबीसी के लिए धुंधला कॉकटेल वॉल्यूम: 500 माइक्रोल
एंटीबॉडी या डाई फ्लोरोफोर कमजोर पड़ने माइक्रोल
B220 शारीरिक शिक्षा 1000 0.5
स्ट्रेप्टाविडिन एपीसी-eFluor780 500 1
दापी N/A 500 1

तालिका 1: जीसीबीसी के लिए कॉकटेल धुंधला। निर्दिष्ट कमजोर पड़ने पर संकेतित एंटीबॉडी या डाई (इटालिक्स में इंगित) का कॉकटेल प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 500 माइक्रोन में पीपी कोशिकाओं को दाग देने के लिए उपयोग किया जाता था।

   

मुआवजे के लिए एकल दाग वॉल्यूम: 500 माइक्रोल
एंटीबॉडी या डाई फ्लोरोफोर कमजोर पड़ने माइक्रोल
B220 शारीरिक शिक्षा 1000 0.5
B220 एपीसी-eFluor780 750 0.67
दापी N/A 500 1

तालिका 2: मुआवजे के लिए एकल दाग नियंत्रण। स्पेक्ट्रल ओवरलैप की भरपाई के लिए एकल दाग नियंत्रण के लिए संकेत ति फ्लोरोफोरस के लिए संयोजित B220 एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता था।

   

पीसीआर #1
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन थर्मोसाइकिलर की स्थिति
5x बफर 4 माइक्रोन 1 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
10 एमएमएम डीएनटीपी 2 माइक्रोन 2 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
10 μM J558FR3Fw 1 माइक्रोल 3 55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
10 μM VHJ558.2 1 माइक्रोल 4 72 डिग्री सेल्सियस 1:30 मिनट
उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक 0.25 माइक्रोल साइकिल 2-4 9x
डीएनए x (कम से कम केंद्रित नमूने का मानकीकरण)
एच2ओ 20 माइक्रोल करने के लिए 5 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
पीसीआर #2 में आगे बढ़ने से पहले एच 2 ओ में पतला पीसीआर उत्पाद1:5

तालिका 3: JH4 intron की नेस्टेड पीसीआर। पहली प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए पीसीआर घटक और थर्मोसाइकिलर की स्थिति। पहले पीसीआर उत्पाद को पानी के साथ पतला करें और दूसरी पीसीआर के लिए इस कमजोर पड़ने के 1 माइक्रोन का उपयोग करें।

   

पीसीआर #2
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन थर्मोसाइकिलर की स्थिति #2
5x बफर 4 माइक्रोन 1 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट
10 एमएमएम डीएनटीपी 2 माइक्रोन 2 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
10 μM VHJ558.3 1 माइक्रोल 3 55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
10 μM VHJ558.4 1 माइक्रोल 4 72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक 0.25 माइक्रोल साइकिल 2-4 21x
पतला पीसीआर #1 1 माइक्रोल
एच2ओ 20 माइक्रोल करने के लिए 5 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट

तालिका 4: पीसीआर घटक और दूसरी पीसीआर के लिए थर्मोसाइकिलर की स्थिति।

   

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन
2x बफर 10 माइक्रोल
शुद्ध पीसीआर x (कम से कम केंद्रित नमूने का मानकीकरण)
कुंद समाप्त होता है के साथ प्लाज्मिड 1 माइक्रोल
T4 डीएनए लिगाज़ 1 माइक्रोल
एच2ओ 20 माइक्रोल करने के लिए
5 मिनट या रात भर के लिए कमरे में अस्थायी पर 16ºC पर इनक्यूबेट

तालिका 5: लिगेशन प्रतिक्रिया। प्लाज्मिड में शुद्ध JH4 intron पीसीआर उत्पाद के बंधन के लिए घटक।

   

FACS बफर
उपयोग करने से पहले एक घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर एफबीएस को गर्मी निष्क्रिय करें। हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस के 2.5% (v/v) के साथ पीबीएस, पीएच 7.4 (गिब्को, #10010049) को पूरक करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
डीएनए निष्कर्षण बफर (100 m Tris पीएच 8.0, 0.1 M EDTA, 0.5% (w/v) SDS)
1 एम ट्रिस पीएच 8.0 का 50 मिलियन, 0.5 एम ईडीटीए का 100 एमएल और 20% एसडीएस का 12.5 एमएल जोड़ें। 500 एमएल में डिस्टिल्ड पानी डालें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
ते बफर (10 m Tris पीएच 8.0, 1 m EDTA)
1 एम ट्रिस पीएच 8.0 का 2.5 एमएल और 0.5 एम ईडीटीए का 500 मिलियन एलए जोड़ें। 250 एमएल में आसुत पानी जोड़ें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

तालिका 6: बफर व्यंजनों।

   

ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स सूची
J558FR3Fw 5'-GCCTGACATCTGACATGACTCTGC-3'
VHJ558.2 5'-CTGGACTTTTTTTG-3'
VHJ558.3 5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3'
VHJ558.4 5'-TCTAGACAGCAACTAC-3'

तालिका 7: परख में उपयोग किए जाने वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स।

   

अनुपूरक चित्रा 1: चरण 5.4 के पूरा होने के बाद प्रतिनिधि एगर उठे जेल छवि। जेएच4 इंट्रॉन नेस्टेड पीसीआर उत्पाद को 1.5% एगरल्ड जेल पर हल किया गया था और 580 बीपी एम्प्लाइसन को उत्पादित किया गया था। डब्ल्यूटी पीपी इंगित करता है कि डब्ल्यूटीपी जीसीबीसी जीनोमिक डीएनए का उपयोग पहले पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया गया था और सहायता पीपी इंगित करता है कि सहायता-/पीपी जीसीबीसी जीनोमिक डीएनए का उपयोग पहली पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में किया गया था । ɸ कोई टेम्पलेट पीसीआर नियंत्रण इंगित करता है और इंगित करता है कि कुछ भी एगर उठे जेल के कुएं में लोड नहीं किया गया था। अंतिम लेन में १०० बीपी डीएनए सीढ़ी दिखाई गई है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एक विषम बी सेल आबादी के आईजीएच और आईजीएल वी कोडिंग दृश्यों के भीतर एसएचएम की विशेषता एक चुनौती प्रस्तुत करती है, यह देखते हुए कि प्रत्येक बी सेल विशिष्ट रूप से वी (डी) जे पुनर्संयोजन34के दौरान वी कोडिंग सेगमेंट को पुनर्गठित करता है। इस पेपर में, हम जीसीबीसी के जेएच4 इंस्टट्रॉन में म्यूटेशन की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। जेएच4 इंट्रॉन,जो आईजीएच लोकस में अंतिम जे कोडिंग सेगमेंट के 3' स्थित है, का उपयोग वीक्षेत्रों(चित्रा 1)33, 34, 35)के एसएचएम के लिए किराए के रूप में कियाजाताहै। इन JH4 intron म्यूटेशन सूची और कैसे विशिष्ट जीन उत्पादन या उत्परिवर्तन के पैटर्न को प्रभावित करने का आकलन करने के लिए, पीपी GCBCs विशेष रूप से विश्लेषण कर रहे हैं । ये कोशिकाएं आंतों के माइक्रोबायोटा53द्वारा पुरानी उत्तेजना के परिणामस्वरूप जेएच4 इंट्रॉन म्यूटेशन जमा करती हैं । इसके अलावा, असंरक्षित चूहों के पीपीएस से बी 220+पीएनएएचआई जीसीबीसी में एक उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा होता है जो प्रतिरक्षित जानवरों54,55से प्लीहा जीसीबीसी की तुलना करता है। हालांकि, JH4 intron में म्यूटेशन आईजी आत्मीयता परिपक्वता से सहसंबद्ध नहीं किया जा सकता है क्योंकि इन उत्परिवर्तनों गैर कोडिंग कर रहे हैं ।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एसएचएम आईजी आत्मीयता को बदल देता है, चूहों को एक एंटीजन के साथ इंट्रापेरिटी रूप से प्रतिरक्षित किया जाना चाहिए, जैसे एनपी (4-हाइड्रोक्सी-3-निट्रोफेनिलेटाइल) सीजीजी (चिकन गामा ग्लोबुलिन) या केएलएच (कीहोल लिम्पेट हेमोकिनोइन)56से संयुगत किया गया। इसके बाद, एमआरएन कोवीएच186.2 के भीतर एसएचएम की जांच करने के लिए प्लीहा बी 220+पीएनएएच जीआईसीबीसी से शुद्ध किया जा सकता है, वी कोडिंग एक्सोन जो अक्सर एनपी को पहचानता है और एनपी-सीजीजी या एनपी-केएलएच प्रतिरक्षण31, 57,58,59,60के बाद उत्परिवर्तितहोताहै। वीएच186.2 में एक ल्यूसिन के लिए ट्रिप्टोफान-33 का उत्परिवर्तन 10 गुना59,60 तक आईजी आत्मीयता बढ़ाने की विशेषता है और इसलिए, एक संकेतक है कि एसएचएम और क्लोनल चयन ने उच्च आत्मीयता आईजी उत्पन्न की है। एलिसा द्वारा NP7 और NP20-विशिष्ट सीरम आईजी टाइटर्स को मापने और प्रतिरक्षण के दौरान आईजी-विशिष्ट NP7/NP20 अनुपात की गणना करने के साथ ही आईजी आत्मीयता परिपक्वता भी दस्तावेज करता है जिसके परिणामस्वरूप वी क्षेत्रों के एसएचएम17,21,36होते हैं। इन दोनों परख का उपयोग एनपी-विशिष्ट आईजी आत्मीयता परिपक्वता में परिवर्तन के साथ वीएच186.2 कोडिंग दृश्यों के भीतर एसएचएम को सहसंबंधित करने के लिए किया जा सकता है।

चाहे प्रतिरक्षित या असंरक्षित जानवरों का उपयोग वीएच186.2 या जेएच4 आईएनट्रॉन के एसएचएम का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जीसीबीसी की सही पहचान की जानी चाहिए। हम B220+PNA HI GCBCs को अलग करने के लिए एक FACS आधारित दृष्टिकोण पेशकरते हैं। वैकल्पिक रूप से, FAs और गैर-सल्फेट α2-6-sialyl-LacNAc एंटीजन, जोGL7 एंटीबॉडी61, 62,63,64द्वारा मान्यता प्राप्त है, का उपयोग जीसीबीसी को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है, जिनकी पहचान बी 220 + फास + जीएल 7+ 65 या सीडी 19 + फास+GL7+ 37के रूप में की जाती है। GL7 अभिव्यक्ति लिम्फ नोड्स64 , 65,66के सक्रिय जीसीबीसी में पीएनए को बारीकी से प्रतिबिंबित करती है। जीसीबीसी के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी मार्कर का उपयोग करने के अलावा, धुंधला कॉकटेल फ्लोरोफोर की उत्तेजन को अधिकतम करना चाहिए और फ्लोरोसेंस उत्सर्जन के स्पेक्ट्रल ओवरलैप को कम करते हुए बायोमार्कर का पता लगाना चाहिए। निम्न स्तर पर व्यक्त किए गए एंटीजन का पता एंटीबॉडी से लगाया जाना चाहिए जो फ्लोरोफोर के साथ एक मजबूत उत्सर्जन फ्लोरेसेंस67के साथ संयुग्मित है। अनुशंसित धुंधला प्रोटोकॉल चार लेजर (405एनएम, 488एनएम, 561एनएम, 633एनएम) और 12 फिल्टर से लैस सेल सॉर्टर पर विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था; हालांकि, फिल्टर कॉन्फ़िगरेशन और लेजर उपलब्धता साइटोमीटर के बीच भिन्न होती है। रिएजेंट और उपकरण उपलब्धता के अनुसार प्रोटोकॉल में संशोधन करने के लिए, पाठक को अतिरिक्त संसाधनों, ऑनलाइन स्पेक्ट्रम दर्शकों और प्रकाशित साहित्य67, 68,69, 70,71,72,73केलिए संदर्भित कियाजाताहै। यहां वर्णित बहु-रंग धुंधला प्रोटोकॉल को यह सुनिश्चित करने के लिए स्पेक्ट्रल ओवरलैप के मुआवजे की आवश्यकता होती है कि फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का गलत पता लगाने के बजाय सॉर्ट सेल आबादी जीसीबीसी हैं। B220 वर्णित FACS(तालिका 1B)के लिए एक उपयोगी धुंधला नियंत्रण के रूप में कार्य करता है क्योंकि पीपीएस विशिष्ट B220 नकारात्मक और सकारात्मकआबादी (चित्रा 3 सी),जो स्पेक्ट्रल ओवरलैप के उचित मुआवजे के लिए अनुमति देता है होगा । चित्रा 3सी में प्रस्तुत गेटिंग रणनीति को दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट धुंधला स्थितियों और साइटोमीटर सेटिंग्स के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। फिर भी, जीवित कोशिकाओं का 4-10% B220+PNAHI 35, 52होना चाहिए।

पीपी जीसीबीसी के जेएच4 इंट्रॉन के भीतर सभी म्यूटेशन को यह सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया जाना चाहिए कि मनाया गया उत्परिवर्तन वास्तव में एसएचएम को प्रतिबिंबित कर रहे हैं न कि पीसीआर या अनुक्रमण का एक विरूपण। सहायता-/-बी कोशिकाएं अन्य उत्परिवर्ती माउस मॉडलों में एसएचएम फेनोटाइप की जांच करते समय एक उपयोगी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकती हैं क्योंकि ये कोशिकाएं एसएचएम17, 19को पूरा नहीं करसकतीं। सहायता-/जीसीबीसी (1.66x10 -5 म्यूटेशन/बीपी)20, 21,36, 37, 38,50,74 उच्च निष्ठा बहुलक (5.3x10-7 उप/आधार/दोहरीकरण)51, 52है कि नेस्टेड पीसीआर में डीएनए बढ़ाना करने के लिए प्रयोग कियाजाता है की त्रुटि दर के बराबर है। यदि सहायता-/-चूहों उपलब्ध नहीं हैं, तो प्रकाशित साहित्य के लिए मनाया उत्परिवर्तन पैटर्न और आवृत्ति की तुलना करें । आईजी वी क्षेत्रों में आधार जोड़ी प्रभाग प्रति 10-3-10 -4 म्यूटेशन जमा होते हैं, जो अन्य जीन लोकी73, 75की उत्परिवर्तन दर से लगभग 106गुना अधिक है। परिणाम पशु76की आयु के साथ भिन्न हो सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, B220+PNAलो कोशिकाओं, जो गैर-GCBCs को चिह्नित करता है, सहायताके अभाव में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताहै-/-चूहों ५२। यदि डब्ल्यूटी जीसीबीसी में उत्परिवर्तन आवृत्ति अपेक्षा से कम है, तो डब्ल्यूटी जर्मलाइन जेएच4 इनट्रॉनिक अनुक्रम का असंगत रूप से प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। इस मामले में, यह सुनिश्चित करें कि जीसीबीसी को दाग दिया गया और उचित रूप से हल किया गया और पीसीआर डब्ल्यूटी जर्मलाइन जेएच4 इंट्रॉन संदूषण से मुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफेरोग्राम में कच्चे अनुक्रमण डेटा का अच्छी तरह से विश्लेषण किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अनुक्रम पाठ डेटा में उत्परिवर्तन अनुक्रमण त्रुटियों की कलाकृतियां नहीं हैं । उदाहरण के लिए, खराब सेंगर अनुक्रमण परिणाम अनुक्रम डेटा(चित्र 4)की विश्वसनीयता को कम कर सकते हैं। सेंगर सीक्वेंस डेटा का यह गुणवत्ता नियंत्रण जेएच4 इंट्रॉन उत्परिवर्तन विश्लेषण की सटीकता और प्रजनन क्षमता में वृद्धि करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सहायताके लिए Tasuku Honjo शुक्रिया अदाकरते हैं-/चूहों । इस काम को राष्ट्रीय अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं पर संस्थान (5G12MD007603), राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (2U54CA132378), और राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान (1SC1GM132035-01) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed USA Scientific 1402-4708
Ampicillin sodium salt Fisher BP1760-5
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 eBioscience 47-0452-80 clone RA3-6B2
BD FACSAria II BD 643186 four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50),
AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40),
PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))
BD slip tip 1mL syringe Fisher 14-823-434 sterile
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) Vector Labs B-1075-5
C57BL/6J mice Jackson Laboratories 664
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap Fisher 08-771-23
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) Fisher D1306 0.5 mg/ml
dNTP NEB N0447L 10 mM
ElectroMAX DH10B competent cells Fisher 18-290-015
Falcon cell strainer 40mm Fisher 08-771-1
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) Fisher 14-959-5
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) Fisher 149591A
Fetal bovine serum R&D Systems (Atlanta Biologicals) S11150
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 Fisher 10-010-049
Glycogen Sigma 10901393001
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) DNA Star version 15
PE anti-CD45R/B220 BD 553090 clone RA3-6B2
Proteinase K Fisher BP1700-100
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate eBioscience 47-4317-82
T4 DNA ligase NEB M020L
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit ThermoFisher FERK1231
Tissue culture plate 6 well Fisher 08-772-1B sterile
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD Fisher BDB553142 Clone 2.4G2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeyway's Immunobiology. , Garland science. (2016).
  2. Alt, F. W., et al. VDJ recombination. Immunology Today. 13 (8), 306-314 (1992).
  3. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V (D) J recombination. Nature Reviews Immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
  4. Oettinger, M. A., Schatz, D. G., Gorka, C., Baltimore, D. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V (D) J recombination. Science. 248 (4962), 1517-1523 (1990).
  5. Berek, C., Berger, A., Apel, M. Maturation of the immune response in germinal centers. Cell. 67 (6), 1121-1129 (1991).
  6. Linterman, M. A., et al. Foxp3+ follicular regulatory T cells control the germinal center response. Nature Medicine. 17 (8), 975 (2011).
  7. Shulman, Z., et al. T follicular helper cell dynamics in germinal centers. Science. 341 (6146), 673-677 (2013).
  8. Good-Jacobson, K. L., et al. PD-1 regulates germinal center B cell survival and the formation and affinity of long-lived plasma cells. Nature Immunology. 11 (6), 535 (2010).
  9. Kerfoot, S. M., et al. Germinal center B cell and T follicular helper cell development initiates in the interfollicular zone. Immunity. 34 (6), 947-960 (2011).
  10. Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 541-552 (2004).
  11. Alt, F. W., Zhang, Y., Meng, F. L., Guo, C., Schwer, B. Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in the immune system. Cell. 152 (3), 417-429 (2013).
  12. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nature Reviews Immunology. 12 (7), 517-531 (2012).
  13. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annual Reviews of Biochemistry. 76, 1-22 (2007).
  14. Peled, J. U., et al. The biochemistry of somatic hypermutation. Annual Review of Immunology. 26, 481-511 (2008).
  15. Liu, M., Schatz, D. G. Balancing AID and DNA repair during somatic hypermutation. Trends in Immunology. 30 (4), 173-181 (2009).
  16. Methot, S., Di Noia, J. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advances in Immunology. 133, 37-87 (2017).
  17. Muramatsu, M., et al. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102 (5), 553-563 (2000).
  18. Petersen-Mahrt, S. K., Harris, R. S., Neuberger, M. S. AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature. 418 (6893), 99 (2002).
  19. Revy, P., et al. Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell. 102 (5), 565-575 (2000).
  20. Petersen-Mahrt, S. DNA deamination in immunity. Immunological Reviews. 203 (1), 80-97 (2005).
  21. Rada, C., Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Mismatch recognition and uracil excision provide complementary paths to both Ig switching and the A/T-focused phase of somatic mutation. Molecular Cell. 16 (2), 163-171 (2004).
  22. Rada, C., et al. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Current Biology. 12 (20), 1748-1755 (2002).
  23. Schrader, C. E., Vardo, J., Stavnezer, J. Role for mismatch repair proteins Msh2, Mlh1, and Pms2 in immunoglobulin class switching shown by sequence analysis of recombination junctions. The Journal of Experimental Medicine. 195 (3), 367-373 (2002).
  24. Martin, A., et al. Msh2 ATPase activity is essential for somatic hypermutation at AT basepairs and for efficient class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1171-1178 (2003).
  25. Imai, K., et al. Human uracil-DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin class-switch recombination. Nature Immunology. 4 (10), 1023-1028 (2003).
  26. Masani, S., Han, L., Yu, K. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 is the essential nuclease during immunoglobulin class switch recombination. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1468-1473 (2013).
  27. Guikema, J. E., et al. APE1-and APE2-dependent DNA breaks in immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3017-3026 (2007).
  28. Schrader, C. E., Guikema, J. E., Wu, X., Stavnezer, J. The roles of APE1, APE2, DNA polymerase β and mismatch repair in creating S region DNA breaks during antibody class switch. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1517), 645-652 (2009).
  29. Roa, S., et al. MSH2/MSH6 complex promotes error-free repair of AID-induced dU: G mispairs as well as error-prone hypermutation of A: T sites. PLoS One. 5 (6), 11182 (2010).
  30. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase η is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 17-23 (2007).
  31. Maul, R. W., Gearhart, P. J. AID and somatic hypermutation. Advances in Immunology. 105, 159-191 (2010).
  32. Shen, H. M., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. Somatic hypermutation and class switch recombination in Msh6-/- Ung-/- double-knockout mice. The Journal of Immunology. 177 (8), 5386-5392 (2006).
  33. Cheng, H. L., et al. Integrity of the AID serine-38 phosphorylation site is critical for class switch recombination and somatic hypermutation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (8), 2717-2722 (2009).
  34. Lebecque, S. G., Gearhart, P. J. Boundaries of somatic mutation in rearranged immunoglobulin genes: 5'boundary is near the promoter, and 3'boundary is approximately 1 kb from V (D) J gene. The Journal of Experimental Medicine. 172 (6), 1717-1727 (1990).
  35. Jolly, C. J., Klix, N., Neuberger, M. S. Rapid methods for the analysis of immunoglobulin gene hypermutation: application to transgenic and gene targeted mice. Nucleic Acids Research. 25 (10), 1913-1919 (1997).
  36. Choi, J. E., Matthews, A. J., Michel, G., Vuong, B. Q. AID Phosphorylation Regulates Mismatch Repair-Dependent Class Switch Recombination and Affinity Maturation. The Journal of Immunology. 204 (1), 13-22 (2020).
  37. McBride, K. M., et al. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. The Journal of Experimental Medicine. 205 (11), 2585-2594 (2008).
  38. Liu, M., et al. Two levels of protection for the B cell genome during somatic hypermutation. Nature. 451 (7180), 841-845 (2008).
  39. Ross, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  40. Zhang, J., MacLennan, I. C., Liu, Y. J., Lane, P. J. Is rapid proliferation in B centroblasts linked to somatic mutation in memory B cell clones. Immunology Letters. 18 (4), 297-299 (1988).
  41. Nieuwenhuis, P., Opstelten, D. Functional anatomy of germinal centers. American Journal of Anatomy. 170 (3), 421-435 (1984).
  42. Lau, A. W., Brink, R. Selection in the germinal center. Current Opinion in Immunology. 63, 29-34 (2020).
  43. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  44. Mesin, L., Ersching, J., Victora, G. D. Germinal center B cell dynamics. Immunity. 45 (3), 471-482 (2016).
  45. Reichert, R. A., Gallatin, W. M., Weissman, I. L., Butcher, E. C. Germinal center B cells lack homing receptors necessary for normal lymphocyte recirculation. The Journal of Experimental Medicine. 157 (3), 813-827 (1983).
  46. Rose, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  47. Hamada, S., Fujita, S. DAPI staining improved for quantitative cytofluorometry. Histochemistry. 79 (2), 219-226 (1983).
  48. Otto, F. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  49. Butcher, E., et al. Surface phenotype of Peyer's patch germinal center cells: implications for the role of germinal centers in B cell differentiation. The Journal of Immunology. 129 (6), 2698-2707 (1982).
  50. Rogerson, B. J., Harris, D. P., Swain, S. L., Burgess, D. O. Germinal center B cells in Peyer's patches of aged mice exhibit a normal activation phenotype and highly mutated IgM genes. Mechanisms of Ageing and Development. 124 (2), 155-165 (2003).
  51. Potapov, V., Ong, J. L. Examining sources of error in PCR by single-molecule sequencing. PloS One. 12 (1), 0169774 (2017).
  52. Gonzalez-Fernandez, A., Milstein, C. Analysis of somatic hypermutation in mouse Peyer's patches using immunoglobulin kappa light-chain transgenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (21), 9862-9866 (1993).
  53. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer's patches: organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  54. Betz, A. G., Rada, C., Pannell, R., Milstein, C., Neuberger, M. S. Passenger transgenes reveal intrinsic specificity of the antibody hypermutation mechanism: clustering, polarity, and specific hot spots. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (6), 2385-2388 (1993).
  55. Rada, C., Gupta, S. K., Gherardi, E., Milstein, C. Mutation and selection during the secondary response to 2-phenyloxazolone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (13), 5508-5512 (1991).
  56. Heise, N., Klein, U. Somatic Hypermutation and Affinity Maturation Analysis Using the 4-Hydroxy-3-Nitrophenyl-Acetyl (NP) System. Methods in Molecular Biology. 1623, 191-208 (2017).
  57. Smith, F., Cumano, A., Licht, A., Pecht, I., Rajewsky, K. Low affinity of kappa chain bearing (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl (NP)-specific antibodies in the primary antibody repertoire of C57BL/6 mice may explain lambda chain dominance in primary anti-NP responses. Molecular Immunology. 22 (10), 1209-1216 (1985).
  58. Takahashi, Y., Dutta, P. R., Cerasoli, D. M., Kelsoe, G. In situ studies of the primary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl. V. Affinity maturation develops in two stages of clonal selection. The Journal of Experimental Medicine. 187 (6), 885-895 (1998).
  59. Allen, D., Simon, T., Sablitzky, F., Rajewsky, K., Cumano, A. Antibody engineering for the analysis of affinity maturation of an anti-hapten response. The EMBO Journal. 7 (7), 1995-2001 (1988).
  60. Cumano, A., Rajewsky, K. Clonal recruitment and somatic mutation in the generation of immunological memory to the hapten NP. The EMBO Journal. 5 (10), 2459-2468 (1986).
  61. Smith, K., Nossal, G., Tarlinton, D. M. FAS is highly expressed in the germinal center but is not required for regulation of the B-cell response to antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11628-11632 (1995).
  62. Hao, Z., et al. Fas receptor expression in germinal-center B cells is essential for T and B lymphocyte homeostasis. Immunity. 29 (4), 615-627 (2008).
  63. Cervenak, L., Magyar, A., Boja, R., László, G. Differential expression of GL7 activation antigen on bone marrow B cell subpopulations and peripheral B cells. Immunology Letters. 78 (2), 89-96 (2001).
  64. Naito, Y., et al. Germinal center marker GL7 probes activation-dependent repression of N-glycolylneuraminic acid, a sialic acid species involved in the negative modulation of B-cell activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  65. Olson, W. J., et al. Orphan Nuclear Receptor NR2F6 Suppresses T Follicular Helper Cell Accumulation through Regulation of IL-21. Cell Reports. 28 (11), 2878-2891 (2019).
  66. Dorsett, Y., et al. MicroRNA-155 suppresses activation-induced cytidine deaminase-mediated Myc-Igh translocation. Immunity. 28 (5), 630-638 (2008).
  67. Goetz, C., Hammerbeck, C., Bonnevier, J. Flow Cytometry Basics for the Non-Expert. , Springer. (2018).
  68. Hawley, T. S., Herbert, D. J., Eaker, S. S., Hawley, R. G. Flow Cytometry Protocols. , Springer. (2004).
  69. Costa, E., et al. A new automated flow cytometry data analysis approach for the diagnostic screening of neoplastic B-cell disorders in peripheral blood samples with absolute lymphocytosis. Leukemia. 20 (7), 1221-1230 (2006).
  70. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
  71. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. , 139-150 (2018).
  72. Lucchesi, S., et al. Computational Analysis of Multiparametric Flow Cytometric Data to Dissect B Cell Subsets in Vaccine Studies. Cytometry Part A. 97, 259-267 (2019).
  73. Longerich, S., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. The very 5' end and the constant region of Ig genes are spared from somatic mutation because AID does not access these regions. The Journal of Experimental Medicine. 202 (10), 1443-1454 (2005).
  74. Retter, I., et al. Sequence and characterization of the Ig heavy chain constant and partial variable region of the mouse strain 129S1. The Journal of Immunology. 179 (4), 2419-2427 (2007).
  75. Shen, H. M., Peters, A., Baron, B., Zhu, X., Storb, U. Mutation of BCL-6 gene in normal B cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. Science. 280 (5370), 1750-1752 (1998).
  76. Richter, K., et al. Altered pattern of immunoglobulin hypermutation in mice deficient in Slip-GC protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (38), 31856-31865 (2012).

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Sible, E., Zheng, S., Choi, J. E., Vuong, B. Q. Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (170), e61551, doi:10.3791/61551 (2021).

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