Summary
Apresentado aqui é um ensaio para quantificar a hipermutação somática dentro do lócus genético da cadeia pesada da imunoglobulina usando células germinais do centro B das manchas do rato Peyer.
Abstract
Dentro dos centros germinales de órgãos linfoides, as células B maduras alteram sua imunoglobulina expressa (Ig) introduzindo mutações não estencaradas nos exons de codificação variável do gene loci da cadeia pesada e leve. Este processo de hipermutação somática (SHM) requer a deaminase citidina induzida pela ativação da enzima (AID), que converte desoxicitidinas (C), em desoxyuridinas (U). Processar as incompatibilidades U:G geradas pelo AID em mutações pelas vias de excisão base e descompasso introduz novas sequências de codificação de Ig que podem produzir uma IG de maior afinidade. Mutações em genes de reparação de AUXÍLIO ou DNA podem bloquear ou alterar significativamente os tipos de mutações observadas no Ig loci. Descrevemos um protocolo para quantificar mutações intronsas JH4 que usa fluorescência ativada de classificação celular (FACS), PCR e sequenciamento Sanger. Embora este ensaio não meça diretamente a maturação da afinidade Ig, é indicativo de mutações em sequências de codificação variável Ig. Além disso, esses métodos utilizam técnicas comuns de biologia molecular que analisam mutações em sequências de Ig de múltiplos clones de células B. Assim, este ensaio é uma ferramenta inestimável no estudo da diversificação de SHM e Ig.
Introduction
As células B, membros do sistema imunológico adaptativo, reconhecem e eliminam antígenos produzindo anticorpos, também conhecidos como imunoglobulinas (Ig). Cada Ig é composto por dois polípeptídeos de cadeia de cadeia leve (IgL) que são mantidos juntos por ligações de dissulfeto para formar a estrutura de forma "Y" característica do Ig1. O N-termini de IgH e IgL compreendem a região variável (V) de cada polipeptídeo e juntos formam o local de ligação de antígeno do Ig, enquanto a região constante de IgH transmite a função efetiva do Ig. O desenvolvimento de células B na medula óssea reorganiza os exons de codificação V de IgH e IgL em um processo conhecido como recombinação V(D)J2,3,4. A transcrição dos exons V recombinados, juntamente com os respectivos exons de região constante, forma o mRNA que é traduzido para o Ig.
Células B maduras expressando uma Ig ligada à membrana, também conhecida como receptor de células B (BCR), circulam para órgãos linfoides secundários, como o baço, o linfonodo ou as manchas de Peyer, onde pesquisam o ambiente para antígenos e interagem com outras células do sistema imunológico1. Dentro dos centros germinais (GC) de órgãos linfoides secundários, as células B que reconhecem o antígeno através do BCR tornam-se ativadas. Auxiliadas por células dendríticas foliculares e células T foliculares, as células B ativadas podem então proliferar e diferenciar-se em células plasmáticas e de memória, que são importantes efeitos de uma resposta imune robusta5,6,7,8,9. Além disso, essas células B ativadas podem sofrer processos secundários de diversificação genética Ig - recombinação de interruptor de classe (RSR) e hipermutação somática (SHM). Durante a RSE, as células B trocam a região padrão μ constante do polipeptídeo IgH por outra região constante (γ, α, ε) através de uma reação de recombinação de exclusão de DNA(Figura 1). Isso permite a expressão de um exon constante diferente e tradução de um novo Ig. A célula B mudará de expressar IgM para outro isótipo (IgG, IgA, IgE). RSE altera a função do efeito do Ig sem alterar sua especificidade de antígeno10,11,12. No entanto, durante o SHM, as células B mutam as regiões de codificação V de IgH e IgL para permitir a produção e seleção de Igs de maior afinidade, o que pode eliminar de forma mais eficaz um antígeno13,14,15 (Figura 1). É importante ressaltar que tanto a RSE quanto a SHM dependem da função de uma enzima: deaminase de citidina induzida por ativação (AID)16,17,18. Humanos e camundongos deficientes em AID não podem completar CSR ou SHM e apresentar com títulos de soro IgM elevados ou Hiper-IgM17,19.
Em RSE, o AID desamina desoxicitidinas (C) nas regiões de comutação repetitiva que precedem cada exons de codificação constante, convertendo-os em desoxyuridinas (U)20,21, que cria pareamento de base incomparável entre desoxyuridinas e desoxyguanosines (U:G). que são necessários para a recombinação de DNA, tanto pelo reparo de excisão base (BER) ou pela via de reparação de incompatibilidade (MMR)22,23,24,25,26,27,28,29. Em SHM, o AID desaminaliza C dentro dos exons de codificação V. A replicação através da incompatibilidade U:G gera mutações de transição C:G a T:A, enquanto a remoção da base uracil pela proteína BER, uracil DNA glicosylase (UNG), antes da replicação do DNA produz mutações de transição e transversão16. Mutações nulas em UNG aumentam significativamente c:g para T:A mutações de transição21,22. Semelhante à RSE, a SHM requer as funções complementares de MMR e BER. Durante o SHM, a RMM gera mutações em pares de bases A:T. Mutações inativantes na homologia muts 2 (MSH2) ou polimerase de DNA η(Polη)reduz significativamente mutações em bases A:T e mutações compostas em MSH2 e Polη praticamente aboli mutações nas bases A:T21,30,31. Consistente com o papel crítico para BER e MMR na conversão de U gerado pelo AID em mutações de transição ou transversão, os camundongos deficientes tanto para MSH2 quanto para UNG(MSH2-/-UNG-/-) exibemapenasmutações de transição C:G para T:A resultantes da replicação em todo o U:G incompatibilidade21.
A análise do SHM em regiões de codificação V permanece complicada porque o desenvolvimento de células B pode recombinar qualquer um dos exons de codificação V(D)J no IgH e IgL loci1,2,4. A análise precisa dessas regiões V combinadas e somaticamente mutadas requer a identificação e isolamento de clones de células B ou do Ig mRNA11,13. O JH4 intron, que é 3' do último exon de codificação J no lócus IgH, abriga mutações somáticas devido à disseminação de mutações 3' do promotor V32,33,34 e, portanto, é frequentemente usado como marcador substituto para SHM nas regiões V31,35 (Figura 1). Para elucidar experimentalmente como genes específicos ou mutações genéticas alteram padrões ou taxas de SHM, o intron JH4 pode ser sequenciado a partir das células B do centro B (GCBCs) do centro germinal de Peyer (GCBCs), que sofrem altas taxas de SHM36,37,38. Os GCBCs podem ser facilmente identificados e isolados com anticorpos fluorescentes conjugados contra marcadores de superfície celular (B220+PNAHI)17,39.
Um protocolo detalhado é apresentado para caracterizar mutações intronsas JH4 em PP GCBCs de camundongos usando uma combinação de FACS (fluorescência ativada de células), PCR e sequenciamento Sanger(Figura 2).
Protocol
Todos os ratos mutantes foram mantidos em um fundo C57BL/6. Os camundongos machos e fêmeas com idade (2-5 meses de idade) foram usados para todos os experimentos. A criação e experimentos com camundongos foram conduzidas de acordo com protocolos aprovados pelo The City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dissecção das manchas de Peyer
- Eutanize o rato com 100% de CO2 a 3 L/min por 5 min seguido de luxação cervical para confirmar a morte. Esterilizar ferramentas de dissecção (tesoura, fórceps, fórceps finos) e mãos enluvadas com 70% de etanol.
- Coloque o rato na almofada de dissecção com o abdômen exposto. Pulverize generosamente o corpo do mouse com 70% de etanol antes de fazer qualquer incisão para esterilizar a área de dissecção.
- Faça uma incisão na pele através do abdômen e remova a pele do abdômen puxando simultaneamente em ambos os lados da incisão em direção à cabeça e cauda usando fórceps (ou mãos esterilizadas e enluvadas).
- Fixar os membros traseiros e traseiros do mouse.
- Corte a cavidade peritoneal com uma tesoura para expor os órgãos internos.
- Localize o intestino delgado entre o estômago e o caecum (estrutura em forma de "J" perto do cólon). Remova o intestino delgado cortando abaixo do estômago e acima do caecum.
- Remova qualquer tecido conjuntivo e gordura que ligue as dobras do intestino delgado.
NOTA: A gordura terá uma cor branca distinta, ao contrário da cor rosa do intestino delgado. - Examine a superfície externa do intestino delgado para as manchas do Peyer (PPs), que são pequenas (~1 mm), estruturas em forma oval que parecem brancas abaixo de uma fina camada de células epiteliais translúcidas.
- Extir esse pp com uma tesoura.
NOTA: Um mouse C57BL/6 wild-type (WT) pode render 4-8 PPs, enquanto um AID-/- mouse terá 6-10 PPs. - Colete os PPs em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão FACS no gelo.
NOTA: O PP deve afundar, enquanto a gordura flutuará para a superfície e pode ser removida.
2. Isolamento celular para FACS
- Coloque um filtro de 40 μm em um prato de 6 poços com 1 mL de tampão FACS frio (4 °C).
- Despeje os PPs do tubo de 1,5 mL no filtro.
- Lave os PPs com 1 mL de tampão FACS frio, certificando-se de que eles estão sempre em líquido e no gelo.
- Use a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de 1 mL como pilão para esmagar os PPs no filtro até que apenas o tecido conjuntivo permaneça no filtro.
- Lave o filtro e o êmbolo com 1 mL de tampão FACS frio para liberar as células no prato de 6 poços.
- Colete as ~4 mL de células em tampão FACS frio e filtre-as através de um tubo FACS de 40 μm.
- Lave a tampa do coador com 1 mL de tampão FACS frio.
- Pelota as células a 600 x g a 4 °C por 5 min em uma centrífuga de balde balançando.
- Decantar o supernatante.
- Resuspense as células em 0,4 mL de tampão FACS frio.
- Remova 10 μL para contagem de células para verificar o rendimento (espere ~5 x 106 células/mouse, consulte Figura 3A)
- Filtre as células restantes através de uma tampa de coador de 40 μm em um tubo FACS e prossiga para coloração para FACS.
3. GCBCs de coloração para FACS
- Adicione 1 bloco μL Fc (cd16/CD32 anti-rato sem rótulo) à suspensão celular de 400 μL e coloque as células no gelo por 15 minutos.
- Adicione 2 mL de tampão FACS frio para lavar as células.
- Células de pelota a 600 x g a 4 °C por 5 min e descartam o supernasce.
- Resuspense as células em 80 μL de tampão FACS frio.
- Remova 10 μL de células do WT PP para cada controle de coloração (4 no total, incluindo 3 controles de manchas únicos e 1 controle não manchado). Deixe 40 μL do WT PP para o próximo passo. Alternativamente, use contas de compensação para os controles de coloração.
- Colorique cada uma das amostras experimentais (por exemplo, WT e AID-/-) em 500 μL de tampão FACS frio com 2,5 μL de aglutina de amendoim (PNA)-biotina por 15 min no gelo.
- Adicione 2 mL de tampão FACS frio para lavar as células.
- Células de pelota a 600 x g a 4 °C por 5 min e descartam o supernasce.
- Manche cada amostra experimental com 500 μL do coquetel no escuro, no gelo, por 15 min (Tabela 1). Certifique-se de que as células estão totalmente resuspendidas no coquetel de coloração.
- Prepare controles de manchas simples para a matriz de compensação.
- Colorir as células em 500 μL de tampão FACS frio usando as diluições especificadas na Tabela 2.
- Incubar os controles de coloração no escuro, no gelo, por 15 minutos.
- Adicione 2 mL de tampão FACS frio a todos os tubos nas etapas 3.7 e 3.8, pelota as células e descarte o supernatante para lavar anticorpos ou DAPI desvinculados.
- Resuspense as células em 500 μL de tampão FACS frio e coloque no gelo.
- Usando um classificador de células, colete B220+PNAHI de cada amostra experimental manchada. A Figura 3B mostra os percentuais típicos de B220+ PNAHI obtidos de WT e AID-/- PPs. A Figura 3C exibe a estratégia de gating FACS.
4. Extração de DNA de GCBCs
- Células classificadas de pelota a 600 x g a 4 °C por 5 min e descartam o supernascedor.
- Resuspenda as células em 1 mL de tampão FACS frio e transfira as células para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Pelota as células a 600 x g a 4 °C por 5 min e descarte o supernasce.
- Resuspend as células em 500 μL de tampão de extração de DNA e 5 μL de 20 mg/mL Proteinase K.
- Incubar a 56 °C durante a noite.
- DNA precipitado com isopropanol de 500 μL e 1 μL de 20 mg/mL de glicogênio. Misture bem o tubo invertendo 5-6x.
- Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
- Centrífuga em microcentrifuge por 15 min a 25 °C a 21.000 x g.
- Descarte o supernatante e retenha a pelota, que contém o DNA precipitado e o glicogênio.
- Lave a pelota de DNA com 1 mL de 70% de etanol.
- Pelota o DNA em uma microcentrifuagem por 10 min a 25 °C a 21.000 x g.
- Remova o etanol 70% e seque a pelota de DNA por 5-10 min.
NOTA: Evite a secagem excessiva, pois o DNA pode não se reidratar completamente.
- Resuspenque o DNA em 30 μL TE tampão e incubar durante a noite a 56 °C.
5. Amplificação e análise da sequência intron JH4
- Quantifique o DNA medindo a absorvância em um comprimento de onda de 260 nm (A260).
NOTA: A concentração típica de DNA recuperada de B220+PNAHI GCBCs de um mouse C57BL/6 é de 20-40 ng/μL. - Realize o PCR aninhado para o JH4 intron (Tabela 3, Tabela 4). Normalizar a quantidade total de DNA genômico usado no primeiro PCR para a amostra menos concentrada. (por exemplo, se a amostra menos concentrada for de 5 ng/μL, use 58,75 ng de DNA para todas as amostras no volume máximo de água (11,75 μL) em PCR #1).
- Resolva o produto PCR em um gel de 1,5% agarose a 200 V por 20 min. O tamanho esperado de amplicon é de 580 bp.
- Extirpar o amplicon do gel e extrair o DNA usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante (ver Figura Suplementar 1).
- Elute o DNA com 30 μL de água e quantifique a quantidade de DNA medindo o A260.
NOTA: A concentração típica do produto PCR purificado é de 3-10 ng/μL.
- Elute o DNA com 30 μL de água e quantifique a quantidade de DNA medindo o A260.
- Ligate o produto PCR purificado em um plasmídeo com extremidades cegas. Padronize a quantidade total de produto PCR utilizado em cada reação de ligadura(Tabela 5).
- Incubar a reação de ligadura à temperatura ambiente por 5 minutos ou durante a noite a 16 °C.
- Transforme células bacterianas eletrocompetente com 2 μL da reação de ligadura.
- Eletroporato a 1,65 kV.
- Resgate em 600 μL de mídia SOC por 1 h a 37 °C em uma incubadora de agitação a 225 rpm.
- Placa 100 μL de bactérias transformadas em LB suplementada com placas de ágar ampicillina (100 μg/mL) e incubar durante a noite a 37 °C.
- Envie a placa de colônias bacterianas para sequenciamento Sanger usando o primer T7 para a frente. Alternativamente, cultivar culturas durante a noite de cada colônia bacteriana e realizar uma purificação plasmida.
- Se necessário, repita o PCR, ligadura e/ou transformação para otimizar o rendimento das colônias bacterianas
NOTA: Um mínimo de 30 colônias devem ser colhidas de cada prato.
- Se necessário, repita o PCR, ligadura e/ou transformação para otimizar o rendimento das colônias bacterianas
- Padronize os dados de sequência nos arquivos .txt
- Exclua a sequência plasmida.
- Certifique-se de que cada sequência seja orientada de 5' a 3' de acordo com a sequência de referência intron JH4 (NG_005838). Gere o complemento inverso de qualquer sequência, conforme necessário.
- Alinhe as sequências obtidas para cada PCR em relação à sequência de referência JH4 intron (NG_005838) usando um software Ômega Clustal(Figura 4A).
- Identifique diferenças da sequência de referência como mutações
- Verifique se todas as mutações são verdadeiras mutações de ponto examinando o eletroferograma do sequenciamento Sanger. Repita o sequenciamento, se necessário. (Figura 4B,C).
- Tabala e quantifica mutações únicas no intron JH4 para cada genótipo(Figura 5).
- Conte sequências com mutações idênticas apenas uma vez
NOTA: Não é possível determinar se as sequências idênticas foram geradas durante os eventos PCR ou SHM idênticos em diferentes células B. - Conte todas as instâncias de sequências intronsas de germinação WT JH4 (ou seja, aquelas sem mutações) como uma sequência única.
- Conte sequências com mutações idênticas apenas uma vez
Representative Results
Citometria de fluxo
As células B maduras circulam para centros germinais onde sofrem maturação de afinidade, expansão clonal e diferenciação em células plasmáticas ou de memória40,41,42,43,44. Estes GCBCs podem ser identificados por numerosos marcadores de superfície celular, incluindo alta expressão do receptor CD45R/B220 e ligação de aglutinina de amendoim (PNA)45,46. Para isolar as GCBCs ativadas, as células PP foram manchadas com anticorpos anti-B220 conjugados à ficoerthrina (PE) e biotinilado-PNA, seguidos de streptavidina conjugado ao APC-eFluor780. As células mortas foram eliminadas usando o corante fluorescente 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), que mancha o ácido nucleico das células mortas ou mortas47,48. As células manchadas foram posteriormente analisadas e classificadas por citometria de fluxo. Os PPs consistiam de ~80% B220+ células49,50. Os PPs WT contêm em média 4 x 106 células por mouse(Figura 3A). Aproximadamente 8% das células WT PP eram B220+PNAHI, que é metade do número observado em AID-/ - ( Figura3B). Assim, foram obtidos 0,3-0,6 x 106 B220+PNAHI GCBCs após a triagem, o que foi suficiente para analisar mutações no intron JH4.
Análise de sequência jh4
O JH4 intron foi amplificado por um PCR aninhado usando primers familiares VHJ558 comuns (J558FR3Fw e VHJ558.2), seguidos pelos primers JH4 intron VHJ558.3 e VHJ558.435,37. Das 105 sequências únicas obtidas dos WT GCBCs, foram encontradas 226 mutações(Figura 5A). A análise do espectro de mutação GCBC nos camundongos WT mostrou uma série de transições e transversões a uma taxa de 4 x 10-3 mutações/bp, que foi calculada dividindo o número total de bases mutadas pelo número total de bases que foram sequenciadas32,36,37,38. Além disso, cada produto JH4 PCR do WT GCBCs continha 1-25 mutações(Figura 5B),onde múltiplas mutações eram frequentemente encontradas em uma sequência33,36. Apenas duas mutações foram identificadas em 113 AIDSas (Figura 5A). AID-/- As células B apresentaram mutações de 1,66 x 10-5/bp, significativamente inferiores às células WT B (p <0,05)36 e comparam-se à taxa de erro da polimerase de alta fidelidade (5,3 x 10-7 sub/base/duplicação)51,52. Assim, as células B do AID serviram como um controle negativo útil para este ensaio.
Figura 1: Esquema do lócus genético IgH e das regiões visadas pelo AID durante a RSE e a SHM. A barra vermelha indica o intron JH4 de 580 bp que é 3' de rearranjos VDJH4 e é analisado neste protocolo. Na RSE, a deaminação dependente de AUXÍLIO das regiões de switch intronic (Sμ e Sε) promove a formação de DSB que permite a recombinação de exclusão e a expressão de um novo isótipo de anticorpos (IgM para IgE). Durante o SHM, as regiões V (caixas cinzentas) acumulam mutações (linhas azuis) que podem levar a maior afinidade Ig. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho para analisar o SHM do intron JH4 em GCBCs isolados de PPs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização de PP GCBCs. (A) Número total de células PP de WT e AID-/- camundongos (n = 4 por genótipo). As barras de erro representam o desvio padrão da média. (B) Percentual de B220+PNAHI GCBCs obtidos de PPs de WT e AID-/- camundongos (n = 4 por genótipo)36. As barras de erro representam o desvio padrão da média, *p<0.05 usando o teste t do aluno. (C) Representante FACS plots para classificar B220+PNAHI GCBCs de PPs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise dos dados de sequência de JH4 Sanger. (A) Os alinhamentos de sequência de amostras dos dados de sequência Sanger do produto JH4 PCR de WT (superior) e GCBCs (inferior) para a sequência genômica de referência (NG_005838), que é a sequência imediatamente abaixo das marcas numéricas de tique-taque. Os alinhamentos foram gerados usando Ômega Clustal. (B) Eletroferograma de dados de sequência Sanger de alta qualidade, que exibiam picos distintos para cada base. (C) Eletroferograma de dados de sequência de baixa qualidade, que mostraram picos ambíguos e bases não especificadas (N). O nucleotídeo mostrado em vermelho deve ser anotado manualmente no arquivo de texto sequencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise de mutações no JH4 intron em WT e AID-/- GCBCs. (A) O número total de mutações de transição (vermelha) e transversão (azul) nas bases A, C, G e T para cada genótipo é resumido nas tabelas. O número total de sequências analisadas está indicado abaixo da tabela. (B) O número de mutações por amplicon PCR para cada genótipo é retratado nos gráficos de tortas. Este valor foi modificado a partir de Choi et al.36 Copyright 2020. A Associação Americana de Imunologistas, Inc. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Coquetel de Coloração para GCBCs | Volume: 500 μL | ||
| Anticorpo ou Corante | Fluoróforo | diluição | μL |
| B220 | Pe | 1000 | 0.5 |
| Streptavidina | APC-eFluor780 | 500 | 1 |
| DAPI | N/A | 500 | 1 |
Tabela 1: Coquetéis de coloração para GCBCs. Coquetel dos anticorpos ou corantes indicados (indicados em itálico) nas diluições especificadas foram utilizados para colorir células PP em 500 μL para citometria de fluxo.
| Manchas únicas para compensação | Volume: 500 μL | ||
| Anticorpo ou Corante | Fluoróforo | diluição | μL |
| B220 | Pe | 1000 | 0.5 |
| B220 | APC-eFluor780 | 750 | 0.67 |
| DAPI | N/A | 500 | 1 |
Tabela 2: Controles de manchas simples para compensação. Os anticorpos B220 conjugados aos fluoroforos indicados foram utilizados para controles de manchas únicos para compensar a sobreposição espectral.
| #1 pcr | ||||
| Reagente | volume | Condições do termciclador | ||
| Tampão de 5x | 4 μL | 1 | 95 °C | 3 min. |
| 10 mM dNTP | 2 μL | 2 | 94 °C | 30 segundos |
| 10 μM J558FR3Fw | 1 μL | 3 | 55 °C | 30 segundos |
| 10 μM VHJ558.2 | 1 μL | 4 | 72 °C | 1:30 min |
| Polimerase de DNA de alta fidelidade | 0,25 μL | Ciclo 2-4 9x | ||
| ADN | x (padronizar para amostra menos concentrada) | |||
| H2O | a 20 μL | 5 | 72 °C | 5 min. |
| Produto PCR diluído 1:5 em H2O antes de prosseguir para PCR #2 | ||||
Tabela 3: PCR aninhado do intron JH4. Componentes PCR e condições do termociclador para a primeira reação de amplificação. Diluir o primeiro produto PCR 1:5 com água e use 1 μL desta diluição para o segundo PCR.
| #2 pcr | ||||
| Reagente | volume | Condições do termciclador #2 | ||
| Tampão de 5x | 4 μL | 1 | 94 °C | 3 min. |
| 10 mM dNTP | 2 μL | 2 | 94 °C | 30 segundos |
| 10 μM VHJ558.3 | 1 μL | 3 | 55 °C | 30 segundos |
| 10 μM VHJ558.4 | 1 μL | 4 | 72 °C | 30 segundos |
| Polimerase de DNA de alta fidelidade | 0,25 μL | Ciclo 2-4 21x | ||
| PCR #1 diluído | 1 μL | |||
| H2O | a 20 μL | 5 | 72 °C | 5 min. |
Tabela 4: Componentes PCR e condições do termociclador para o segundo PCR.
| Reagente | volume |
| Tampão 2x | 10 μL |
| PCR purificado | x (padronizar para amostra menos concentrada) |
| Plasmid com pontas cegas | 1 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
| H2O | a 20 μL |
| Incubar na temperatura da sala por 5 min ou durante a noite a 16ºC | |
Tabela 5: Reação de ligadura. Componentes para a ligadura do produto PCR intron purificado JH4 no plasmídeo.
| Tampão FACS |
| Aqueça a FBS a 56 °C durante uma hora antes do uso. Suplemento PBS, pH 7.4 (Gibco, #10010049) com 2,5% (v/v) de FBS inativados a calor. Armazenar a 4°C. |
| Tampão de Extração de DNA (100 mM Tris pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0,5% (w/v) SDS) |
| Adicione 50 mL de 1 M Tris pH 8.0, 100mL de 0,5 M EDTA e 12,5 mL de 20% SDS. Adicione água destilada a 500 mL. Armazene à temperatura ambiente. |
| Tampão TE (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA) |
| Adicione 2,5 mL de 1 M Tris pH 8.0, e 500 mL de 0,5 M EDTA. Adicione água destilada a 250 mL. Armazene à temperatura ambiente. |
Tabela 6: Receitas tampão.
| Lista de oligonucleotídeos | ||
| J558FR3Fw | 5'-GCCTGACATGAGGACTCTGC-3' | |
| VHJ558.2 | 5'-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3' | |
| VHJ558.3 | 5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3' | |
| VHJ558.4 | 5'-TCTCTAGACAGCAACTAC-3' | |
Tabela 7: Oligonucleotídeos utilizados no ensaio.
Figura suplementar 1: Imagem representativa do gel agarose após a conclusão da etapa 5.4. O produto JH4 intron aninhado PCR foi resolvido em um gel de 1,5% de agarose e o amplicon de 580 bp foi extirpado. WT PP indica que o DNA genômico WT PP GCBC foi usado como modelo para o primeiro PCR e AID PP indica que o DNA genômico DOPP GCBC foi usado como modelo para o primeiro PCR. ɸ indica o controle pcr sem modelo e - indica que nada foi carregado no poço do gel de agarose. A última pista mostra uma escada de DNA de 100 bps. Clique aqui para baixar este número.
Discussion
Caracterizar SHM dentro das sequências de codificação IgH e IgL V de uma população de células B heterogêneas apresenta um desafio, dado que cada célula B reorganiza exclusivamente segmentos de codificação V durante a recombinação V(D)J34. Neste artigo, descrevemos um método para identificar mutações no JH4 intron de GCBCs. O JH4 intron, que está localizado a 3' do último segmento de codificação J no lócus IgH, é usado como substituto para as regiões de SHM de V(Figura 1)31,33,34,35. Para catalogar essas mutações intronsas JH4 e avaliar como genes específicos afetam a produção ou padrão de mutações, os PP GCBCs são analisados especificamente. Essas células acumulam mutações intronas JH4 como resultado da estimulação crônica pela microbiota intestinal53. Além disso, os B220+PNAHI GCBCs dos PPs de camundongos não imunizados possuem um espectro de mutação que se compara aos GCBCs esplênicos de animais imunizados54,55. No entanto, mutações no intron JH4 não podem ser correlacionadas com a maturação da afinidade ig porque essas mutações não são codificadas.
Para determinar se o SHM altera a afinidade de Ig, os camundongos devem ser imunizados intraperitonealmente com um antígeno, como np (4-hidroxi-3-nitrofenylacetyl) conjugado a CGG (gamma globulina de frango) ou KLH (hemocianina limpet do buraco da fechadura)56. Posteriormente, o mRNA pode ser purificado a partir de B220xPNAHI GCBCs para examinar SHM dentro de VH186.2, o exon de codificação V que mais frequentemente reconhece NP e é mutado após a imunização NP-CGG ou NP-KLH31,57,58,59,60. A mutação do triptofano-33 para uma leucina em VH186.2 tem sido caracterizada para aumentar a afinidade de Ig até 10vezes 59,60 e é, portanto, um indicador de que a seleção shm e clonal gerou ig de alta afinidade. Medir os títulos de soro de soro específico NP7 e NP20 da ELISA e calcular a razão NP7/NP20 específica do Ig durante o curso da imunização também documenta a maturação da afinidade Ig resultante da SHM das regiõesV 17,21,36. Ambos os ensaios podem ser usados para correlacionar o SHM dentro das sequências de codificação VH186.2 com alterações na maturação da afinidade de Ig específica do NP.
Se os animais imunizados ou não imunizados são utilizados para analisar o SHM de VH186.2 ou o JH4 intron, os GCBCs devem ser identificados com precisão. Apresentamos uma abordagem baseada em FACS para isolar B220+PNAHI GCBCs. Alternativamente, fas e não-sulfated α2-6-sialyl-LacNAc antígeno, que é reconhecido pelo anticorpo GL761,62,63,64, também pode ser usado para isolar GCBCs, que são identificados como B220+Fas+GL7+65 ou CD19+Fas+GL7+37. A expressão GL7 espelha de perto pna em GCBCs ativados dos linfonodos64,65,66. Além do uso de marcadores de anticorpos específicos para GCBCs, coquetéis de coloração devem maximizar a excitação de um fluoróforo e a detecção de um biomarcador, minimizando a sobreposição espectral da emissão de fluorescência. Antígenos expressos em níveis baixos devem ser detectados com um anticorpo conjugado a um fluoróforo com uma fluorescência de emissão robusta67. O protocolo de coloração recomendado foi otimizado para análise em um classificador celular equipado com quatro lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) e 12 filtros; no entanto, as configurações do filtro e a disponibilidade do laser variam entre os citómetros. Para alterar o protocolo de acordo com a disponibilidade de reagentes e equipamentos, o leitor é encaminhado para recursos adicionais, espectadores de espectro online e literatura publicada67,68,69,70,71,72,73. O protocolo de coloração multicolorido descrito aqui requer compensação da sobreposição espectral para garantir que as populações celulares classificadas sejam GCBCs em vez de detecção imprecisa de emissão de fluorescência. O B220 serve como um controle de coloração útil para os FACS descritos (Tabela 1B)porque os PPs terão populações distintas B220 negativas e positivas(Figura 3C),o que permite a compensação adequada da sobreposição espectral. A estratégia de gating apresentada na Figura 3C deve ser utilizada como diretriz. As parcelas de citometria de fluxo podem variar dependendo das condições de coloração e das configurações do cítmetro. No entanto, 4-10% das células vivas devem ser B220+PNAHI 35, 52.
Todas as mutações dentro do JH4 intron de PP GCBCs devem ser validadas para garantir que as mutações observadas sejam verdadeiramente reflexivas do SHM e não um artefato de PCR ou sequenciamento. AID-/- As células B podem servir como um controle negativo útil ao examinar o fenótipo SHM em outros modelos de camundongos mutantes porque essas células não podem completar o SHM17,19. A taxa de mutação intron JH4 no de AID-/- GCBCs (1,66x10-5 mutações/bp)20,21,36,37,38,50,74 é comparável à taxa de erro da polimerase de alta fidelidade (5.3x10-7 sub/base/duplicação)51,52 que é usada para amplificar o DNA no PCR aninhado. Se o AID-/- os camundongos não estiverem disponíveis, compare o padrão de mutação observado e a frequência com a literatura publicada. As regiões Ig V acumulam 10-3-10-4 mutações por divisão de par de base, que é aproximadamente 106 vezesmaior do que a taxa de mutação de outros gene loci73,75. Os resultados podem variar com a idade do animal76. Alternativamente, as células B220+PNALO, que marcam não-GCBCs, podem ser usadas como um controle negativo na ausência de AID-/- camundongos52. Se a frequência de mutação em WT GCBCs for menor do que o esperado, a sequência intronic da germina WT JH4 pode ser desproporcionalmente representada. Neste caso, certifique-se de que os GCBCs foram manchados e classificados adequadamente e os PCRs estão livres da contaminação intron germina-germina JH4 da WT. Além disso, os dados de sequenciamento bruto em eletroferogramas devem ser analisados minuciosamente para garantir que mutações nos dados de texto sequenciais não sejam artefatos de erros de sequenciamento. Por exemplo, resultados de sequenciamento sanger pobres podem reduzir a confiabilidade dos dados de sequência(Figura 4). Este controle de qualidade dos dados da sequência Sanger aumentará a precisão e a reprodutibilidade da análise de mutação intron JH4.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Tasuku Honjo pelo AID-/- ratos. Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Disparidades em Saúde e Saúde das Minorias (5G12MD007603), Instituto Nacional do Câncer (2U54CA132378) e Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (1SC1GM132035-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
| APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
| BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
| BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
| Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
| dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
| ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
| Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
| Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
| Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
| Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
| Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
| Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
| Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
| PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
| Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
| Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
| Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |
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