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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

मानव गर्भनाल रक्त स्टेम सेल (सीबी-एससी) के साथ उपचार के बाद फेनोटायपिक रूप से अलग मैक्रोफेज में मोनोसाइट्स का भेदभाव-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61562
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 1
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health Center, 2Department of Chemistry and Chemistry Biology, Stevens Institute of Technology

Summary

एक्सोसोम एप्लिकेशन दवा विकास और पुनर्योजी दवा के लिए एक उभरता हुआ उपकरण है। हम मशीनी अध्ययन के लिए सीबी-एससी नामक उपन्यास की पहचान स्टेम कोशिकाओं से एक्सोसोम को अलग करने के लिए उच्च शुद्धता के साथ एक एक्सोसोम आइसोलेशन प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं। हम मानव मोनोसाइट्स के साथ सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स को भी सहसंस्कृत करते हैं, जिससे फेनोथिपिक रूप से अलग मैक्रोफेज में उनका भेदभाव होता है।

Abstract

स्टेम सेल शिक्षक (एससीई) थेरेपी प्रकार 1 मधुमेह और अन्य ऑटोइम्यून रोगों के उपचार के लिए एक उपन्यास नैदानिक दृष्टिकोण है। एससीई थेरेपी एक एफेरेसिस मशीन के माध्यम से अलग रोगी की रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (जैसे, लिम्फोसाइट्स और मोनोसाइट्स) को प्रसारित करती है, सह-संस्कृतियों रोगी की रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को एससीई डिवाइस में अनुयायी कॉर्ड रक्त-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (सीबी-एससी) के साथ, और फिर रोगी के रक्त में इन "शिक्षित" प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लौटाता है। एक्सोसोम्स सभी बायोफ्लुइड और सेल कल्चर मीडिया में मौजूद 30\u2012150 एनएम के बीच नैनो आकार के एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स हैं। एससीई चिकित्सा में अंतर्निहित आणविक तंत्र का पता लगाने और सीबी-एससी से जारी एक्सोसोम्स के कार्यों का पता लगाने के लिए, हम जांच करते हैं कि सीबी-एससी के साथ उपचार के दौरान कौन सी कोशिकाएं इन एक्सोसोम्स को फगोसाइटाइज करती हैं। मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के साथ डियो-लेबल सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स को सह-संस्कृति द्वारा, हमने पाया कि सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम मुख्य रूप से मानव सीडी 14-पॉजिटिव मोनोसाइट्स द्वारा उठाए गए थे, स्पिंडल जैसी आकृति विज्ञान और M2-संबद्ध सतह आणविक मार्कर की अभिव्यक्ति के साथ, टाइप 2 मैक्रोफेज (एम 2) में मोनोसाइट्स का भेदभाव करने के लिए अग्रणी। यहां, हम सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के अलगाव और लक्षण वर्णन और मानव मोनोसाइट्स के साथ सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की सह-संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल और एम 2 भेदभाव की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Introduction

कॉर्ड ब्लड स्टेम सेल (सीबी-एससी) मानव गर्भनाल रक्त से पहचाने जाने वाले स्टेम कोशिकाओं के अद्वितीय प्रकार हैं और अन्य ज्ञात प्रकार के स्टेम कोशिकाओं जैसे मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) और हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी)1से प्रतिष्ठित हैं। प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन के उनके अद्वितीय गुणों और पेट्री व्यंजनों की सतह का कसकर पालन करने की उनकी क्षमता के आधार पर, हमने नैदानिक परीक्षणों2,3में स्टेम सेल शिक्षक (एससीई) चिकित्सा के रूप में नामित एक नई तकनीक विकसित की। एससीई चिकित्सा के दौरान, एक रोगी की परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को सेल सेपरेटर के माध्यम से एकत्र और परिचालित किया जाता है और इन विट्रो में अनुयायी सीबी-एससी के साथ सह-संस्कारी होता है। इन "शिक्षित" कोशिकाओं (सीबी-एससी-इलाज PBMC) तो एक बंद पाश प्रणाली में रोगी के संचलन के लिए वापस आ रहे हैं । नैदानिक परीक्षणों ने पहले ही टाइप 1 मधुमेह (टी1डी)2,4 और एलोपेसिया एरेटा (एए)5सहित ऑटोइम्यून रोगों के उपचार के लिए एससीई थेरेपी की नैदानिक सुरक्षा और प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है।

एक्सोसोम्स नैनोकणों का एक परिवार है जिसका व्यास 30 \u2012150 एनएम है और सभी बायोफ्लुइड और सेल कल्चर मीडिया6में मौजूद है । एक्सोसोम्स लिपिड, mRNAs, प्रोटीन, और microRNAs (miRNA) सहित कई जैव सक्रिय अणुओं के साथ समृद्ध हैं, और सेल से सेल संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । हाल ही में, एक्सोसोम शोधकर्ताओं और दवाकंपनियों के लिए क्लीनिक7,8,9में चिकित्सीय क्षमता के कारण अधिक आकर्षक हो गए हैं। हाल ही में, हमारे मशीनी अध्ययनों से पता चला है कि सीबी-एससी-जारी एक्सोसोम एससीई थेरेपी10के प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन में योगदान देते हैं।

यहां, हम सीबी-एससी-रिलीज एक्सोसोम्स द्वारा मोनोसाइट्स को लक्षित करने वाले एससीई थेरेपी के तंत्र का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, सीबी-एससी-जारी एक्सोसोम्स को अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन विधियों का उपयोग करके सीबी-एससी-व्युत्पन्न वातानुकूलित मीडिया से अलग किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री, पश्चिमी दाग (डब्ल्यूबी) और गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) द्वारा मान्य किया गया था। दूसरा, सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स को हरे फ्लोरोसेंट लिपोफिलिक डाई के साथ लेबल किया गया था: डियो। तीसरा, वे पीबीएमसी के साथ सह-संस्कारी थे ताकि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पीबीएमसी की विभिन्न उप-आबादी पर डियो-लेबल सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के सकारात्मक प्रतिशत की जांच की जा सके । यह प्रोटोकॉल स्टेम कोशिकाओं के प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन में अंतर्निहित एक्सोसोम्स की कार्रवाई का अध्ययन करने के लिए मार्गदर्शन प्रदान करता है।

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Protocol

प्रोटोकॉल डिस्कवरी और नवाचार, हैकेनबोरी मेरिडियन स्वास्थ्य के लिए केंद्र में संस्थागत मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है । ह्यूमन बफी कोट ब्लड यूनिट न्यूयॉर्क ब्लड सेंटर (न्यूयॉर्क, एनवाई) से खरीदे गए थे। मानव गर्भनाल रक्त इकाइयों को स्वस्थ दाताओं से एकत्र किया गया और क्रायो-सेल इंटरनेशनल ब्लड बैंक (ओल्डस्मार, एफएल) से खरीदा गया। न्यूयॉर्क ब्लड सेंटर और क्रायो-सेल दोनों को आईआरबी अनुमोदन और दानदाताओं से सहमति प्रपत्रों के साथ रक्त संग्रह और वितरण के लिए सभी मान्यताएं प्राप्त हुई हैं।

1. सेल संस्कृति और सीबी-एससी-व्युत्पन्न वातानुकूलित माध्यम की तैयारी

  1. कॉर्ड रक्त के 25 एमएल(सामग्री की तालिका)घनत्व ढाल माध्यम के 20 मिलील से अधिक (γ = 1.077) को 50 मिलीएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
  2. ब्रेक के बिना एक झूल-बाल्टी रोटर में 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1,690 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  3. ध्यान से मोनोन्यूक्लियर सेल लेयर (बफी कोट) को एक नई 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 40 एमएल तक फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ शंकु नली भरें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 751 x ग्राम पर पैलेट कोशिकाओं को मिलाएं और अपकेंद्रित्र करें।
  4. सुपरनेट को त्यागें और सेल पेलेट में ACK लाइसिस बफर(सामग्री की तालिका) के15 एमएल जोड़ें। पाइपिंग के माध्यम से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: यह कदम लाल रक्त कोशिकाओं को हटा देता है।
  5. पीबीएस के 25 एमएल के साथ शंकु नली भरें। 5 मिनट के लिए 751 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और पैलेट किए गए मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सुपरनैंट को त्यागें।
  6. शेष लाइसिस बफर को हटाने के लिए पीबीएस के 40 एमएल के साथ 2x धोएं।
  7. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 5 मिनट के लिए 751 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  8. सुपरनैंट को त्यागें और प्रति ट्यूब रासायनिक-परिभाषित सीरम-मुक्त माध्यम(सामग्रीकी तालिका) के 10 एमएल के साथ कॉर्ड रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  9. कॉर्ड ब्लड मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को एक ट्यूब में मिलाएं।
  10. 20 माइक्रोन सेल सस्पेंशन लें और 1.5 एमएल ट्यूब में 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन(मैटेरियल की टेबल) के20 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
  11. कक्ष स्लाइड में लोड करें और स्वचालित सेल काउंटर के साथ सेल नंबर और सेल व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: सेल निलंबन 1:10 पर पतला है अगर सेल एकाग्रता 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल से ऊपर है ।
  12. 150 मिमी x 15 मिमी पेट्री व्यंजन में बीज मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल, रासायनिक-परिभाषित सीरम-मुक्त सेल संस्कृति माध्यम में 25 एमएल/डिश।
  13. सीबी-एससी 80% से अधिक संगम तक पहुंचने तक 10\u201214 दिनों के लिए 8% सीओ 2 शर्तों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  14. सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस प्रति पेट्री डिश के 15 एमएल से धोएं; फिर, पीबीएस को हटा दें।
    नोट: सीबी-अनुसूचित जाति पेट्री व्यंजन कसकर से जुड़े हुए हैं ।
  15. दो बार चरण 1.14 दोहराएं।
  16. प्रति पेट्री डिश रासायनिक-परिभाषित सीरम मुक्त माध्यम के 25 एमएल जोड़ें।
  17. 3\u20124 दिनों के लिए 8% सीओ2 शर्तों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  18. सीबी-एससी-व्युत्पन्न वातानुकूलित माध्यम को 50 एमएल शंकु नलियों में ले लीजिए।

2. सीबी-एससी का लक्षण वर्णन

  1. पीबीएस आधारित सेल वियोजन बफर के 10 एमएल को 5 एमएल पिपेट टिप(सामग्री की तालिका)के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके डीटच सीबी-एससी।
  2. 5 मिनट के लिए 1,690 x ग्राम पर सेंट्रलाइज पैलेट सेल और पीबीएस के 200 माइक्रोल में फिर से निलंबित करें।
  3. धुंधला तैयारी किट(सामग्रीकी तालिका) के माध्यम से इंट्रासेलुलर धुंधला के लिए कोशिकाओं को ठीक करें और पार करें।
  4. प्रति नमूना एफसी अवरोधक(सामग्री की तालिका) के5 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: एफसी अवरोधक एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने पर गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकता है।
  5. सीडी 34, सीडी 45, सोक्स2, ऑक्ट 3/4, सीडी270, और गैलेक्टिन 9 पर फ्लोरेसेंस-कंजूस माउस एंटी-ह्यूमन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को 25 माइक्रोग्राम/एमएल(सामग्री की तालिका)में 100 माइक्रोनल मात्रा में जोड़ें। प्रकाश सुरक्षा के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. धुंधला होने के बाद, पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं और 10 मिनट के लिए 751 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को गोली कोशिकाओं तक धोएं।
  7. पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. विशिष्ट मार्कर के ऊपर सीबी-एससी-संबद्ध की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री करें।

3. सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स का अलगाव

  1. सेंट्रलाइज 1.18 स्टेप 1.18 से 300 एक्स ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एकत्र किया गया है। सुपरनैंट को एक नई 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
  2. सेंट्रलाइज सुपरनेट स्टेप 3.1 से 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 एक्स ग्राम पर एकत्र किया गया। सुपरनैंट को एक नई 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
  3. सेंट्रलाइज सुपरनेट स्टेप 3.2 से 10,000 एक्स ग्राम पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किया गया। सुपरनैंट को एक नई 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    नोट: फिक्स्ड एंगल रोटर का उपयोग किया जाता है ताकि सेल छर्रों को ट्यूब के किनारे पर उपजी हो। टोपी के किनारे को चिह्नित करें और ट्यूब के किनारे पर एक सर्कल बनाएं जहां गोली की उम्मीद है।
  4. 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर(सामग्री की तालिका)के साथ चरण 3.3 से एकत्र किए गए फ़िल्टर सुपरनेटेंट।
  5. प्रत्येक 10 केडीए सेंट्रलाइज्ड फिल्टर यूनिट(सामग्रियों की तालिका)में मीडिया के 15 एमएल ट्रांसफर करें।
  6. केंद्रित एक्सोसोम मीडिया को अलग करने के लिए 30 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रलाइज।
  7. केंद्रित एक्सोसोम्स को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 80 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर गोली एक्सोसोम्स।
  8. सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 10 एमएल में पैलेट एक्सोसोम्स को फिर से निलंबित करें।
  9. एक्सोसोम्स पेलेट को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 80 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  10. पीबीएस के 200 माइक्रोल में एक्सोसोम्स पैलेट को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से निलंबित करें।

4. सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स का लक्षण वर्णन

  1. बिसिनकोनिक एसिड परख (बीसीए) किट द्वारा एक्सोसोम तैयारी की कुल प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करना
    1. प्रत्येक एल्बुमिन मानक के पिपेट 10 माइक्रोन और डुप्लिकेट में 96-वेल प्लेट में चरण 3.10 में तैयार अलग एक्सोसोम नमूना।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से बीसीए किट से काम कर रहे रिएजेंट के 200 μL जोड़ें। प्लेट की सामग्री को 10 एस के लिए प्लेट शेकर पर अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: वर्किंग रिएजेंट (WR): ५०-भाग अभिकर्षक एक के साथ 1-भाग अभिजेंट बी ।
    3. प्लेटों को पन्नी से ढककर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. प्लेटों को कमरे के तापमान (आरटी) में ठंडा करें।
    5. एक प्लेट रीडर के माध्यम से 562 एनएम पर नमूना अवशोषण को मापें।
  2. फ्लो साइटोमेट्री के लिए एक्सोसोम्स की तैयारी और धुंधला होना
    1. पीबीएस के कुल 100 माइक्रोल वॉल्यूम में कदम 3.10 में तैयार सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के 25 माइक्रोन में एंटी-ह्यूमन सीडी 63 चुंबकीय मोतियों (4.5 माइक्रोन आकार)(सामग्रीकी तालिका) के 20 माइक्रोन जोड़कर एक्सोसोम्स को कैप्चर करें।
    2. 800 आरपीएम पर शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्यूब (18\u201222 h) इनक्यूबेट करें।
    3. ट्यूब के नीचे नमूना एकत्र करने के लिए 30 एस के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें।
    4. 300 माइक्रोन आइसोल बफर (पीबीएस में 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जोड़ें और धीरे-धीरे पिपटिंग करके मिलाएं।
      नोट: यह कदम मनका-बाध्य एक्सोसोम्स को धोता है।
    5. ट्यूब को 1 मिनट (सामग्री की तालिका) के लिए चुंबक स्टैंड पर रखें और सुपरनैंट को त्याग दें।
    6. दोहराएं कदम 4.2.4\u20124.2.5।
    7. 400 μL आइसोलेशन बफर के साथ मनका-बाध्य एक्सोसोम्स को फिर से निलंबित करें।
    8. प्रत्येक ट्यूब के लिए मनका-बाध्य एक्सोसोम्स के 100 माइक्रोन को उद्धृत करें।
    9. सीडी 63 मनका-कैप्चर एक्सोसोम के साथ प्रत्येक प्रवाह ट्यूब में क्रमशः 25 माइक्रोग्राम/एमएल में फ्लोरेसेंस-कंजूस एंटीबॉडी (सीडी 9-फिटसी, सीडी 81-पीई, और सीडी 63-फिटसी) जोड़ें।
      नोट: आइसोटाइप से मेल खाते आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।
    10. 800 आरपीएम पर शेखर पर प्रकाश सुरक्षा के साथ कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    11. दोहराएं कदम 4.2.4\u20124.2.5।
    12. 200 μL में एमका-बाउंड एक्सोसोम्स को फिर से निलंबित करें और 5 एमएल फ्लो ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    13. फ्लो साइटोमीटर के सैंपल हिंडोला में ट्यूब्स रखें।
    14. एक्सोसोम परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल खोलें।
    15. फ्लो साइटोमीटर द्वारा अपने आप नमूना चलाएं।
  3. पश्चिमी दाग द्वारा एक्सोसोम डिटेक्शन
    नोट: पश्चिमी दाग एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है और हम विधि के विवरण में ही नहीं जाना होगा ।
    1. Lyse सीबी-एससी के छर्रों-व्युत्पन्न exosomes कदम ३.१० से RIPA बफर, पिपेट 20x के १०० μL के साथ, तो 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है ।
    2. बीसीए किट द्वारा एक्सोसोम लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें और प्रति अच्छी तरह से 25 माइक्रोग्राम प्रोटीन लोड करें।
    3. 150 वी पर 40 मिनट के लिए जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्रोटीन को अलग करें।
    4. सेमी-ड्राई ट्रांसफरिंग मेथड11का उपयोग करके प्रोटीन को पॉलीविनाइलाइडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें।
    5. झिल्ली को 30 मिनट के लिए 5% गैर-वसा वाले दूध के साथ ब्लॉक करें।
    6. 2 μg/mL एंटी-ह्यूमन एलिक्स(सामग्री की तालिका)और 1 μg/ml एंटी-ह्यूमन कैल्नेक्सिन एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका) केसाथ इनक्यूबेट ।
    7. डिजिटल इमेजिंग सिस्टम के साथ रसायनिनीसेकेंस द्वारा प्रोटीन का पता लगाएं।
  4. गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) द्वारा एक्सोसोम सत्यापन
    1. पीबीएस के 1 एमएल में सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम नमूनों के 10 माइक्रोग्राम को पतला करें।
    2. पतला नमूने के 1 एमएल को डिस्पोजेबल सेमी-माइक्रो क्यूवेट(सामग्री की तालिका) में स्थानांतरित करें।
    3. सीएलएस इंस्ट्रूमेंट में क्यूवेट रखें। सभी नमूना मॉनिटर के लिए अपवर्तक सूचकांक (आरआई) को 1.39 के रूप में सेट करें।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस पर नमूने चलाएं और औसत आकार वितरण प्राप्त करने के लिए प्रति अंश तीन माप प्राप्त करें।
  5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा एक्सोसोम सत्यापन
    1. 300 जाल तांबा ग्रिड12 (सामग्री की तालिका)पर कोट फॉर्मवार।
    2. फॉर्मवार को कॉपर ग्रिड पर वाष्पित कार्बन की अतिरिक्त परत से मजबूत करें12.
      नोट: इस तरह के एक कोटिंग दृष्टिकोण नमूना समर्थन के लिए उत्कृष्ट है ।
    3. ग्रिड पर एक्सोसोम नमूनों के 10 μL लोड और हवा सूखी करने के लिए छोड़ दें ।
    4. 5 मिनट के लिए यूरेसिल एसीटेट के साथ नकारात्मक दाग नमूने।
    5. डीआई पानी से तीन बार धोएं और हवा-सूखी तक छोड़ दें।
    6. TEM के तहत नमूनों का निरीक्षण और फोटोग्राफ। 200 केवी और स्पॉट साइज में 200 केवी और स्पॉट साइज पर तेज वोल्टेज सेट करें।

5. पीबीएमसी के विभिन्न उपआबादी द्वारा उठाए गए डियो-लेबल सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स को मापें

  1. लेबल सीबी-एससी-ग्रीन फ्लोरोसेंट लिपोफिलिक डाई डियो के साथ एक्सोसोम्स
    1. सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के 100 माइक्रोन (चरण 3.10 में तैयार) को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. पीबीएस के साथ 5 एमएल के लिए पतला नमूना।
    3. हरे फ्लोरोसेंट लिपोफिलिक डाई डियो(सामग्री की तालिका)जोड़ें जब तक काम एकाग्रता 5 माइक्रोन तक पहुंच जाती है।
    4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट प्रकाश से संरक्षित।
    5. नमूने को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. 80 मिनट के लिए 100,000 x g पर सेंट्रलाइज को पैलेट डियो-लेबल सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स।
    7. पीबीएस के 200 माइक्रोन में लेबल किए गए एक्सोसोम्स को फिर से निलंबित करें।
  2. मानव पीबीएमसी की तैयारी
    1. मानव बफी कोट के 25 एमएल(सामग्री की तालिका)घनत्व ढाल माध्यम (γ = 1.077) के 20 एमएल से अधिक एक 50 मिलीएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. चरण 1.2 से 1.11 तक दोहराएं।
    3. 1 x 106 पीएमसी को गैर-ऊतक-उपचारित हाइड्रोफोबिक 24-वेल प्लेट (1 एमएल/वेल) में स्थानांतरित करें।
      नोट: मोनोसाइट्स का पालन करने से बचने के लिए एक गैर-ऊतक-उपचारित प्लेट का उपयोग किया गया था।
  3. पीएमसी के साथ सह-संस्कृति डियो-लेबल एक्सोसोम्स
    1. 40 माइक्रोन डियो-लेबल सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स को प्रत्येक पीबीएमसी में तैयार किया गया है- जो 200 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके 24-अच्छी प्लेट में अच्छी तरह से युक्त है। कुओं को नियंत्रित करने के लिए पीबीएस की एक ही मात्रा जोड़ें।
    2. 10x पाइपिंग करके मिलाएं। 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए Hoechst 33342 के साथ 200 μL exosome-इलाज पीबीएमसी और लेबल ले लीजिए।
    4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 100 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    5. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट कोशिकाओं।
    6. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए Hoechst 33342-लेबल पीबीएमसी के साथ डियो-लेबल सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की बातचीत का निरीक्षण और फोटोग्राफ करें।
    7. शेष कोशिकाओं को चरण 5.3.3 से 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 200 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    9. प्रति नमूना एफसी अवरोधक के 5 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    10. पीएमसी को दागने के लिए एंटीबॉडी (सीडी 3, सीडी 4, सीडी 8, सीडी 11सी, सीडी 14, सीडी 19, और सीडी 56 को 25 माइक्रोग्राम/एमएल)(सामग्री की तालिका)में जोड़ें।
      नोट: आइसोटाइप से मेल खाते आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।
    11. प्रकाश सुरक्षा के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    12. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर पीबीएस और सेंट्रलाइज का 1 एमएल जोड़ें।
    13. 200 μL PBS के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्रोपिडियम आयोडाइड के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    14. पीबीएमसी की विभिन्न उप-आबादी में डियो-लेबल एक्सोसोम तेज के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें।

6. मोनोसाइट्स पर सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की कार्रवाई की जांच करें

  1. अलगाव मानव सीडी 14-सकारात्मक मोनोसाइट्स
    1. 3 x 107 मानव पीबीएमसी को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    3. चुंबक विभाजक(सामग्री की तालिका)में पृथक्करण स्तंभ(सामग्री की तालिका)रखें।
    4. कोल्ड रनिंग बफर (सामग्री की तालिका) के 2 एमएल के साथ तीन बार पृथक्करण कॉलमधोएं।
    5. ठंड पीबीएस के 300 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। CD14 माइक्रोमोतियों के 60 माइक्रोन जोड़ें। 15 मिनट के लिए बर्फ पर अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
    6. कोल्ड पीबीएस का 6 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    7. ठंड चलने वाले बफर के 500 माइक्रोन में पैलेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    8. कोशिकाओं को पृथक्करण कॉलम (चरण 6.14 में तैयार) में स्थानांतरित करें और उन्हें पारित होने दें।
    9. प्रति वॉश चलने वाले बफर के 2 एमएल के साथ तीन बार सेपरेशन कॉलम धोएं। चुंबक विभाजक से कॉलम उठाएं और इसे 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें।
      नोट: 15 एमएल ट्यूब को कमरे के तापमान पर ट्यूब के लिए CD14-सकारात्मक मोनोसाइट्स के पालन के कारण बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
    10. कॉलम के शीर्ष पर ठंडे चलने वाले बफर के 2 एमएल को स्थानांतरित करें और सीडी 14-पॉजिटिव कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में अलग करें।
    11. सीडी 14-पॉजिटिव कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    12. ठंडे रासायनिक-परिभाषित सीरम मुक्त माध्यम(सामग्रीकी तालिका) के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    13. कोशिकाओं के 50 माइक्रोन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    14. 20 मिनट के लिए क्रोम ऑरेंज-संयुग्मित एंटी-ह्यूमन सीडी 14 एमएबी(सामग्री की तालिका) के10 माइक्रोन के साथ दाग।
      नोट: आइसोटाइप से मेल खाते आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।
    15. कोशिकाओं में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें। 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज पैलेट कोशिकाओं के लिए।
    16. पीबीएस के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और इसे 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा CD14-सकारात्मक मोनोसाइट्स की शुद्धता का निर्धारण करें।
  2. सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के साथ मोनोसाइट्स का उपचार
    1. ऊतक संस्कृति में रासायनिक-परिभाषित सीरम-मुक्त संस्कृति माध्यम(सामग्री की तालिका) केसाथ बीज 1 x10 6 शुद्ध मोनोसाइट्स-इलाज 6-अच्छी प्लेट (2 एमएल/वेल)।
    2. 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर2घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    3. सुपरनेट को 1 एमएल पिपेट के साथ छोड़ दें। 37 डिग्री सेल्सियस के 2 एमएल पूर्व-गर्म रासायनिक-परिभाषित सीरम-मुक्त संस्कृति माध्यम(सामग्री की तालिका)धीरे से जोड़ें।
      नोट: मोनोसाइट्स 2 घंटे के भीतर थाली का पालन किया गया । फ्लोटिंग कोशिकाओं की पहचान मृत या अन्य कोशिका संदूषण के रूप में की गई थी।
    4. 2 मिलील की कुल मात्रा के साथ 6-वेल प्लेट में स्टेप 3.10 से मोनोसाइट संस्कृतियों में 80 माइक्रोन सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम जोड़ें।
      नोट: कुओं को नियंत्रित करने के लिए पीबीएस की एक ही मात्रा जोड़ा गया था ।
    5. 3\u20124 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. 200× आवर्धन(सामग्री की तालिका)पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल आकृति विज्ञान की तस्वीर देखें।
    7. 1 एमएल पिपेट टिप के साथ पीबीएस-आधारित सेल वियोजन बफर के 1 एमएल में ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अलग कोशिकाएं।
    8. एक सेल स्क्रैपर के माध्यम से शेष संलग्न कोशिकाओं को फसल।
      नोट: चूंकि प्राथमिक मोनोसाइट्स या विभेदित मैक्रोफेज कसकर संलग्न होते हैं, इसलिए कुछ कोशिकाएं वियोजन बफर के साथ उपचार के बाद नीचे की ओर पालन करती रहती हैं। इसलिए, इन कोशिकाओं को एक सेल स्क्रैपर के साथ काटा जाता है।
    9. 5 मिनट के लिए 1,690 x ग्राम पर कोशिकाओं को ले लीजिए। पीबीएस के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    10. गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को ब्लॉक करने के लिए एफसी अवरोधक (25 μg/mL) के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    11. कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206, और CD209 पर 25μg/mL, सामग्री की तालिका)जोड़ें । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: आइसोटाइप से मिलान आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं
    12. 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें। सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ फिर से निलंबित करें।
    13. प्रति नमूना (200 माइक्रोन) प्रति प्रोपिडियम आयोडाइड के 5 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को एक नई 5 एमएल प्रवाह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    14. प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन करें और सीडी 14, सीडी 80, सीडी 86, सीडी 163, सीडी 206 और सीडी 209 अभिव्यक्तियों के स्तर का मूल्यांकन करें।

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Representative Results

प्रारंभ में, सीबी-एससी के फेनोटाइप और शुद्धता की जांच सीबी-एससी से जुड़े मार्कर जैसे ल्यूकोसिट कॉमन एंटीजन सीडी 45, ईएस सेल-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर्स OCT3/4, और SOX2 के साथ फ्लो साइटोमेट्री द्वारा की गई थी । सीबी-एससी सीडी 45, OCT3/4, SOX2, CD270, और galectin 9 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर प्रदर्शित करते हैं, लेकिन CD34 की कोई अभिव्यक्ति(चित्रा 1A)। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने सीडी 9, सीडी 81 और सीडी 63 सहित एक्सोसोम-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति की पुष्टि की सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स(चित्रा 1B)पर थे। 20.07 एनएम के 79.38 ± आकार के साथ एक्सोसोम्स के आकृति विज्ञान और आकार वितरण को टेम और डीएलएस(चित्रा 1सी, डी)द्वारा चिह्नित किया गया था। पश्चिमी दाग आगे ईआर से जुड़े मार्कर Calnexin(चित्रा 1E)की अभिव्यक्ति के बिना, एक्सोसोम से जुड़े मार्कर Alix की अभिव्यक्ति साबित कर दिया ।

पीबीएमसी को डियो-लेबल सीबी-एससी-एक्सो के साथ इलाज किया गया । माइक्रोस्कोपी अवलोकन ने पीबीएमसी(चित्रा 2 ए)के साथ डियो-लेबल सीबी-एससी-एक्सो की सीधी बातचीत का प्रदर्शन किया । बेहतर परिभाषित करने के लिए जो सेल आबादी डियो लेबल सीबी-एससी-Exo के साथ बातचीत की, विभिन्न सेल डिब्बों सेल विशिष्ट मार्कर जैसे टी कोशिकाओं के लिए सीडी 3, myeloid dendritic कोशिकाओं के लिए CD11c (डीसी), मोनोसाइट्स के लिए CD14, बी कोशिकाओं के लिए CD19, और एनके कोशिकाओं के लिए CD56(चित्रा 2B)के साथ gated थे । 4 घंटे के लिए एक इनक्यूबेशन के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन किया है कि विभिन्न रक्त कोशिका डिब्बों डियो पॉजिटिव एक्सोसोम्स(चित्रा 2C)के विभिन्न औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) पर प्रदर्शित । विशेष रूप से, मोनोसाइट्स ने अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं(चित्रा 2 सी)की तुलना में डियो-पॉजिटिव सीबी-एससी-एक्सो की उच्च औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता का प्रदर्शन किया, जिसमें यह रेखांकित किया गया कि मोनोसाइट्स को मुख्य रूप से सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स द्वारा लक्षित किया गया था।

मोनोसाइट्स पर सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के प्रत्यक्ष प्रभावों का पता लगाने के लिए, शुद्ध सीडी 14+ मोनोसाइट्स को 3 दिनों के लिए सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के साथ सह-संस्कारी किया गया था। एक्सोसोम-इलाज मोनोसाइट सफलतापूर्वक धुरी की तरह मॉर्फोलोजी(चित्रा 3A)में विभेदित । इसके बाद, सीबी-एससी-एक्सो उपचारित या अनुपचारित मोनोसाइट्स के फेनोटाइप का परीक्षण किया गया, जिसमें CD163, सीडी 206, सीडी 209 सहित M2-संबद्ध मार्कर की अभिव्यक्ति का खुलासा करते हुए एक्सोसोम-उपचारित समूह(चित्रा 3B,लाल हिस्टोग्राम) के बीच स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई थी। एम-सीएसएफ + आईएल-4 द्वारा उत्पन्न पारंपरिक एम 2 मैक्रोफेज के साथ तुलना करते हुए, सीबी-एससी-एक्सो-इलाज मोनोसाइट्स ने M2-संबद्ध मार्कर जैसे CD163, CD206, CD209 के समान स्तर व्यक्त किए, जिसमें कोई महत्वपूर्ण अंतर(चित्रा 3C)नहीं था। इसलिए, डेटा इंगित करता है कि मोनोसाइट्स सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के साथ उपचार के बाद एम 2 फेनोटाइप के साथ मैक्रोफेज में अंतर करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स का लक्षण वर्णन। (A)सीबी-एससी का फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन, सीडी 45 की उच्च अभिव्यक्ति, OCT3/4, SOX2, CD270 और Galectin-9, CD34 की कोई अभिव्यक्ति नहीं । (ख)सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स पर एक्सोसोम-एसोसिएटेड मार्कर (सीडी63, सीडी9, सीडी 81) की अभिव्यक्ति । आइसोटाइप से मेल खाने वाले आईजीजीएस ने फ्लो साइटोमेट्री (ग्रे हिस्टोग्राम) के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य किया। (C)सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) छवि । (घ)डायनामिटिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस) का उपयोग करके सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स का आकार वितरण। (ई)वेस्टर्न ब्लॉट्स बताते हैं कि सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम एक्सोसोम्स एक्सोसोम-स्पेसिफिक मार्कर एलिक्स प्रदर्शित करते हैं, लेकिन एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) से जुड़े मार्कर कैल्नेक्स के लिए नकारात्मक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीबीएमसी की विभिन्न आबादी के साथ सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की बातचीत। (ए)पीबीएमसी (ब्लू,) के साथ डियो-लेबल सीबी-एससी-एक्सो (ग्रीन) की बातचीत Hoechst ३३३४२ के साथ परमाणु धुंधला) Nikon ग्रहण Ti2 माइक्रोस्कोप के साथ एनआईएस तत्व सॉफ्टवेयर संस्करण ५.११.०२ के साथ फोटो खिंचवाने गया था, एक उच्च आवर्धन के साथ पीएमसी कोशिकाओं में डियो लेबल एक्सोसोम (ग्रीन) के वितरण के बाद सह इनक्यूबेशन के बाद 4 एच 5% सीओ 2 गैर ऊतक संस्कृति में इलाज24 अच्छी तरह से थाली । एन = 2. (ख)पीबीएमसी में विभिन्न उपआबादी के लिए सेल-विशिष्ट सतह मार्कर के साथ प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति, टी कोशिकाओं के लिए CD3 सहित, मोनोसाइट्स के लिए CD14, बी कोशिकाओं के लिए CD19, एनके कोशिकाओं के लिए CD56, और डीसी के लिए CD11c।(C)विभिन्न पीबीएमसी उपजनसंख्या के बीच डियो-लेबल एक्सोसोम के विभिन्न औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) प्रदर्शित करें (जैसे, टी सेल, मोनोसाइट्स, बी सेल, एनके सेल, डीसीएस)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मोनोसाइट्स पर सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स का प्रभाव। (क)सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के साथ उपचार के बाद धुरी जैसी कोशिकाओं में मोनोसाइट्स का रूपात्मक परिवर्तन। (ख)सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स, जैसे सीडी 163, सीडी 206 और सीडी 209 (रेड लाइन) के साथ उपचार के बाद एम 2-एसोसिएट मार्कर की अभिव्यक्ति के स्तर को विनियमित करें। अनुपचारित मोनोसाइट्स (ग्रीन लाइन) नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। आइसोटाइप से मेल खाने वाले आईजीजीएस ने नकारात्मक नियंत्रण (ग्रे लाइन) के रूप में कार्य किया। (ग)पारंपरिक एम 2 मैक्रोफेज और सीबी-एससी-एक्सो-प्रेरित एम 2 मैक्रोफेज के बीच फेनोटाइपिक तुलना । पारंपरिक एम 2 मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए, शुद्ध सीडी 14+ मोनोसाइट्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 एनजी/एमएल मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के साथ इलाज किया गया, 7 दिनों के लिए 5% सीओ2 शर्तें, और इसके बाद 10 एनजी/एमएमएल आईएल-4 के साथ रात भर उपचार किया गया। CD14 सहित M2-संबद्ध मार्कर। सीडी 80, सीडी 86, सीडी 163, सीडी 206, और सीडी 209 का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। आइसोटाइप से मेल खाने वाला इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) नियंत्रण के रूप में काम करता है। डेटा एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; एन = 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एक्सोसोम्स का आवेदन नैदानिक निदान, दवा विकास और पुनर्योजी दवा के लिए एक उभरता हुआ क्षेत्र है। यहां, हम सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स की तैयारी और मानव मोनोसाइट्स के भेदभाव पर एक्सोसोम्स के कार्यात्मक अध्ययन के बारे में एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल ने यह दर्शाया कि कार्यात्मक सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स को अनुक्रमिक अपकेंद्रित्रण और उच्च शुद्धता के साथ अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन और मोनोसाइट्स पर प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन का प्रदर्शन करके अलग किया जाता है।

अन्य पारंपरिक प्रोटोकॉलों की तुलना में, अल्ट्राफिल्ट्रेशन विभिन्न कोशिकाओं या मीडिया से एक्सोसोम्स के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए एक स्थापित दृष्टिकोण है, जो आणविक वजन और बहिष्कार आकारों पर आधारित है जो अन्य बाह्य भार (ईवीएस) से अलग हैं। जबकि अल्ट्राफिल्ट्रेशन अलगाव अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन-आधारित पृथक्करण की तुलना में अधिक समय की बचत है, यह बड़े आकारों में वेसिकल्स को संरचनात्मक क्षति पहुंचा सकता है। एक्सोसोम्स को पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) द्वारा कम लागत पर मध्यस्थता वर्षा द्वारा भी एकत्र किया जा सकता है, हालांकि यह विधि प्रोटीन संदूषण13, 14के कारण एक्सोसोम शुद्धता को जोखिम में डालती है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च शुद्धता पर एक्सोसोम का उत्पादन करने के लिए लागत प्रभावी था। सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स10के प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन के आधार पर, सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स का लक्षण वर्णन नैदानिक अनुप्रयोगों से पहले सीबी-एससी के साथ स्टेम सेल शिक्षक की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान बायोमार्कर की पेशकश कर सकता है।

मैक्रोफेज विभिन्न जैविक कार्यों और विषमताओं के साथ वायरल और बैक्टीरियल संक्रमण के खिलाफ पेशेवर एंटीजन-पेश कोशिकाएं हैं। सतह मार्कर और प्रतिरक्षा समारोह में उनके मतभेदों के आधार पर, मैक्रोफेज को दो उप-आबादी के साथ वर्गीकृत किया जाता है: टाइप 1 मैक्रोफेज (एम 1, पारंपरिक मैक्रोफेज सूजन के कारण) और टाइप 2 मैक्रोफेज (एम 2, एंटी-सूजन प्रदर्शित करना)15। इस अध्ययन ने यह स्थापित किया कि शुद्ध मानव मोनोसाइट्स को सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स के साथ उपचार के बाद टाइप 2 मैक्रोफेज में विभेदित किया गया था, जिसमें एंटी-इनटॉलटेंसी फेनोटाइप10प्रदर्शित किया गया था। सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम-इलाज मोनोसाइट्स ने लम्बी आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया और M2-संबद्ध सतह मार्कर (जैसे, सीडी 163, सीडी 206, और सीडी 209) व्यक्त किए, इसी तरह के फेनोटाइप के साथ पारंपरिक एम 2 मैक्रोफेज साइटोकिन्स एम-सीएसएफ + आईएल-4 का उपयोग करके उत्पन्न हुए। मोनोसाइट्स के ऐसे फेनोटाइपिक परिवर्तन टाइप 1 मधुमेह और अन्य ऑटोइम्यून रोगों के उपचार के लिए सीबी-एससी के प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन में अंतर्निहित नए तंत्र को उजागर करते हैं। एससीई थेरेपी के दौरान, रोगियों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सीबी-एससी के साथ लगभग 8\u20129 h के लिए सह-संस्कारी किया गया था। एससीई-इलाज मोनोसाइट्स ने सीबी-एससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स को वापस शरीर में ले गए, जिसने एम2 भेदभाव और प्रतिरक्षा सहिष्णुता के प्रेरण के विस्तार में योगदान दिया, जिससे एससीई थेरेपी के साथ उपचार के बाद नैदानिक परिणामों में सुधार हुआ।

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Disclosures

डॉ झाओ तियानहे स्टेम सेल बायोटेक्नोलॉजी इंक के संस्थापक हैं डॉ झाओ स्टेम सेल शिक्षक प्रौद्योगिकी के आविष्कारक हैं । अन्य सभी लेखकों के पास कोई वित्तीय हित नहीं है जो प्रस्तुत किए गए कार्य के लिए प्रासंगिक हो सकता है।

Acknowledgments

हम हैकेनबोरी यूएमसी फाउंडेशन के माध्यम से उदार वित्तपोषण समर्थन के लिए श्री पोद्दार और श्री लुडविग के आभारी हैं। हम अंग्रेजी संपादन के लिए लौरा झाओ की सराहना करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
15 ml conical tube Falcon 352196
24-well plate Falcon 351147 Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) Millipore sigma D4292-20MG Store at 4 °C
300 Mesh Grids Ted Pella 1GC300
50 mL conical tube Falcon 352070
6-well plate Falcon 353046 Tissue culture plate
96-well plate Falcon 353072 Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E 100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit Millipore sigma UFC901024
Anti-Human Alix Biolegend 634501 store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin Biolegend 699401 store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 BD Bioscience 561356 store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange Beckman Coulter B36294 store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE BD Bioscience 556018 store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5 Beckman Coulter IM2643U store at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC BD Bioscience 551135 store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 BD Bioscience 564127 store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE Biolegend 318806 store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue Biolegend 300431 store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC Beckman Coulter IM2427U store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC BD Bioscience 555349 store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 Beckman Coulter IM3548U store at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE Beckman Coulter IM2073U store at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE BD Bioscience 561925 store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter A94686 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC Beckman Coulter B30642 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC BD Bioscience 561956 store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 Beckman Coulter B30646 store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC ThermoScientic MA5-16860 store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 Biolegend 348919 store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 ThermoScientic 50-5841-82 store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 ThermoScientic 53-9811-82 store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A1933
Buffy coat New York Blood Center 40-60 ml/unit
Cell scraper Falcon 353085
Disposable semi-micro cuvette VWR 97000590
Dissociation buffer Gibco 131510014 100 ml
Dual-Chanber cell counting slides Bio-Rad 1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent ThermoFisher Scientific 10606D store at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media GE Health 17-1440-03 500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°) Thermo Scientifc 75003698 Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer Beckman Coulter 3 lasers
10 Color Max
Human cord blood Cryo-Cell International 40-100 ml/unit
Human Fc Block BD Bioscience 564220 store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore Sigma SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge Beckman Coulter
Orbital Shaker MP4 BioExpress S-3500-1
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 500 ml
Propidium Iodide BD Bioscience 56-66211E store at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscope Nikon instruments Inc Eclipse Ti2 NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342 Thermo Scientifc 62249 5 ml
Revert microsopy Fisher scientific 12563518
Rotor 41 Ti Beckman Coulter 331362 Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientifc 75004381
Swinging Bucket Rotor Thermo Scientifc 75003655
TC-20 cell counter Bio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator ThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopy JEOL JEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tube Beckman Coulter 331372
X'VIVO 15 Serum-free medium Lonza BEBP04-744Q 1000 ml Culture medium, store at 4 °C

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References

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मानव गर्भनाल रक्त स्टेम सेल (सीबी-एससी) के साथ उपचार के बाद फेनोटायपिक रूप से अलग मैक्रोफेज में मोनोसाइट्स का भेदभाव-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स
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Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J.,… More

Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (165), e61562, doi:10.3791/61562 (2020).

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