Summary
外显体应用是药物开发和再生医学的新兴工具。我们建立了一种高纯度的外体分离方案，将外体与称为CB-SC的新鲜干细胞分离出来，用于机械研究。我们还与人类单核细胞共同培养CB-SC衍生的外体，导致它们分化成表型的分形巨噬细胞。
Abstract
干细胞教育者（SCE）疗法是治疗1型糖尿病和其他自身免疫性疾病的一种新型临床方法。SCE 治疗通过密码机循环分离患者的血液单核细胞（如淋巴细胞和单核细胞），在 SCE 设备中用粘附脐带血源干细胞 （CB-SC） 共同培养患者的血液单核细胞，然后将这些"受过教育的"免疫细胞返回到患者的血液中。外显子是纳米大小的细胞外囊泡，在30\u2012150 nm之间，存在所有生物流体和细胞培养基。为了进一步探索SCE治疗的分子机制，并确定从CB-SC释放的外体的行为，我们调查哪些细胞在用CB-SC治疗期间对这些外体进行噬菌体。通过与人类外周血单核细胞（PBMC）共同培养具有Dio标签的CB-SC衍生外体，我们发现CB-SC衍生的外显体主要由人类CD14阳性单细胞组成，导致单细胞分化为2型巨噬细胞（M2），具有主轴样形和M2相关表面分子标记的表达。在这里，我们提出了一个协议，用于分离和表征CB-SC衍生外体，以及CB-SC衍生外体与人类单核细胞共同培养和M2分化监测的协议。
Introduction
脐带血干细胞（CB-SC）是从人脐带血中鉴定的独特干细胞类型，与其他已知类型的干细胞（如中生血缘干细胞）和造血干细胞（HSC）1等不同。基于其独特的免疫调节特性和紧贴培养皿表面的能力，我们在临床试验2、3中开发出一种被指定为干细胞教育者（SCE）疗法的新技术。在SCE治疗期间，患者的外周血单核细胞（PBMC）通过细胞分离器收集和循环，并在体外与粘附的CB-SC共同培养。这些"受教育"细胞（CB-SC治疗的PBMC）然后返回到患者的循环在闭环系统。临床试验已经证明了SCE疗法治疗自身免疫性疾病的临床安全性和有效性，包括1型糖尿病（T1D）2、4和脱发（AA）5。
外显体是一个纳米粒子系列，直径范围为30\u2012150 nm，存在于所有生物流体和细胞培养介质6中。外显子富含许多生物活性分子，包括脂质、mRNA、蛋白质和微RNA（miRNA），并在细胞到细胞之间的通信中发挥重要作用。最近，外显体已经变得更加有吸引力的研究人员和制药公司，因为他们的治疗潜力在诊所7，8，9。最近，我们的机械研究表明，CB-SC释放的外体有助于SCE治疗10的免疫调节。
在这里，我们描述了通过CB-SC释放的外细胞来探索针对单细胞的SCE治疗机制的协议。首先，使用超离心方法从CB-SC衍生的调节介质中分离出CB-SC释放的外体，并经流式细胞学、西印（WB）和动态光散射（DLS）验证。其次，CB-SC衍生的外体被标记为绿色荧光嗜白染料：迪奥。第三，他们与PBMC共同培养，通过流细胞学检查Dio标记的CB-SC衍生外显子体在PBMC的不同亚细胞的阳性百分比。该协议为研究干细胞免疫调节的外体作用提供了指导。
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Protocol
该协议遵循发现和创新中心机构人类研究伦理委员会的指导方针，哈肯萨克子午线健康。从纽约血液中心（纽约，纽约）购买了人类布衣血单位。人体脐带血单位是从健康的献血者那里收集的，从 Cryo-Cell 国际血库（佛罗里达州的奥德斯马尔）购买。纽约血液中心和 Cryo-Cell 都获得了所有血液收集和分配的认证，并获得 IRB 的批准，并签署了捐赠者的同意书。
1. 细胞培养和制备CB-SC衍生的有条件介质
- 将超过20 mL的脐带血（材料表）转移到50 mL锥形管中，超过20 mL的密度梯度介质（γ = 1.077）。
- 在 20°C 的摆动 桶转 子中，以 1，690 x g 的温度下离心 20 分钟，无需制动器。
- 小心地将单核细胞层（布菲涂层）转移到新的 50 mL 锥形管中。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 填充锥形管至 40 mL。在 20 °C 下，以 751 x g 混合 并离心 到颗粒细胞，10 分钟。
- 丢弃上流剂，在细胞颗粒中加入15 mL的CK解液缓冲液（材料表）。通过移液重新悬浮细胞。然后在室温下孵育10分钟。
注：此步骤去除红血球。 - 用 25 mL 的 PBS 填充锥形管。在751 x g下 离心5分钟，并丢弃上一代，以获得颗粒单核细胞。
- 用 40 mL 的 PBS 清洗 2x 以去除剩余的解液缓冲液。
- 在 751 x g 下 离心 5 分钟，以对细胞进行分粒。
- 每管用10 mL的化学定义无血清介质（材料表）丢弃上流水线和重新悬浮脐带血单核细胞。
- 将脐带血单核细胞组合到一根管中。
- 以20μL细胞悬浮液，与20μL的0.4%的锥蓝溶液（材料表）混合在1.5 mL管中。
- 加载到腔室幻灯片中，使用自动细胞计数器量化细胞数量和细胞生存能力。
注：如果细胞浓度高于1 x 107 个细胞/mL，细胞悬浮液在1：10稀释。 - 种子单核细胞在150毫米×15毫米培养皿在1 x 106 细胞/mL，25 mL/菜在化学定义的无血清细胞培养培养培养。
- 在 37 °C 下孵育 8% CO2 条件 10°u201214 天，直到 CB-SC 达到 80% 以上的汇合。
- 丢弃上一杯，用每培养皿15 mL的PBS清洗;然后，删除 PBS。
注：CB-SC 与培养皿紧密连接。 - 重复步骤 1.14 两次。
- 每个培养皿加入25 mL的化学定义血清自由介质。
- 在 37 °C 下孵育 8% CO2 条件 3°u20124 天。
- 将 CB-SC 衍生的调节介质收集到 50 mL 锥形管中。
2. CB-SC 的特征
- 通过移液 10 mL 的基于 PBS 的细胞分离缓冲液，用 5 mL 移液器尖端上下分离 CB-SC（材料表）。
- 在 1，690 x g 下离心 5 分钟，以在 200 μL PBS 中分离细胞，然后重新悬浮。
- 通过染色制备套件（材料表）修复和渗透细胞，用于细胞内染色。
- 每个样品加入5μL的Fc阻滞剂（材料表），在室温下孵育15分钟。
注：Fc阻滞剂在用抗体染色时抑制非特异性结合。 - 添加荧光结合小鼠抗人单克隆抗体，包括CD34、CD45、SOX2、OCT3/4、CD270和Galectin 9，体积为25微克/mL（材料表），达到100μL的细胞体积。在室温下孵育30分钟，有光保护。
- 染色后，用1 mL的PBS清洗细胞，并在751 x g下离 心 10分钟，以颗粒细胞。
- 用200μL的PBS重新悬浮细胞，并转移到5 mL管中。
- 执行流细胞学以验证特定标记上方关联的 CB-SC 表达式。
3. 隔离CB-SC衍生的外体
- 将从步骤 1.18 收集的调节介质在 300 x g 下离 心 ，在 4 °C 下 10 分钟。 将上流液转移到新的 50 mL 锥形管中。
- 将从步骤 3.1 收集的上一代在 2，000 x g 下离 心 ，在 4 °C 下 20 分钟。 将上流液转移到新的 50 mL 锥形管中。
- 将从步骤 3.2 收集的上一代在 10，000 x g 下离 心 ，在 4 °C 下 30 分钟。 将上流液转移到新的 50 mL 锥形管中。
注：使用固定角度转子，使细胞颗粒沉淀到管的一侧。标记盖的侧面，并在需要颗粒的管子侧面画一个圆圈。 - 使用 0.22 μm 过滤器（材料表）从步骤 3.3 中收集的超滤剂。
- 将 15 mL 介质传输到每个 10 kDa 离心滤波器单元（材料表）。
- 在 4，000 x g 下离心 30 分钟，以分离浓缩外体介质。
- 将浓缩的外显体转移到超离心管。然后，在100，000 x g的颗粒 外显 体在4°C下80分钟。
- 丢弃上一级，在10 mL的PBS中重新悬浮颗粒体。
- 在 4 °C 下以 100，000 x g 的离心机 80 分钟收集外体颗粒。
- 通过上下移液，在200μL的PBS中重新悬浮外体颗粒。
4. CB-SC衍生外体特征
- 通过双辛辛酸测定（BCA）试剂盒，量化外体制剂的总蛋白质浓度
- 在步骤3.10中制备的每个白素标准和分离的外显体样品的移液10μL，并重复地放入96井板中。
- 将 BCA 试剂盒中 200 μL 的工作试剂添加到每个井中。将板内的内容完全混合在板摇床上 10 s。
注：工作试剂（WR）：50部分试剂 A，带1部分试剂B。 - 用铝箔盖住盘子，并在37°C下孵育30分钟。
- 将板冷却至室温 （RT）。
- 通过板读卡器测量 562 nm 的样品吸光度。
- 流细胞学外体的准备和染色
- 通过将20μL的抗人CD63磁珠（4.5μm大小）（材料表）加入25μg的CB-SC衍生外体，在步骤3.10中制备，总共100μL的PBS体积，捕获外体。
- 在 800 rpm 的摇床上 4 °C 下孵育管过夜 （18\u201222 h）。
- 将管以 300 x g 离心 30 s，以收集管底的样品。
- 加入300μL的分离缓冲液（PBS中的0.1%牛血清白蛋白（BSA），通过移液轻轻混合。
注：此步骤清洗珠装外体。 - 将管子放在磁铁支架上 1 分钟（材料表），然后丢弃上经剂。
- 重复步骤 4.2.4\u20124.2.5。
- 使用 400 μL 隔离缓冲液重新悬挂珠束外体。
- 阿里克 100 μL 的珠束外显体到每个管。
- 将荧光结合抗体（CD9-FITC、CD81-PE 和 CD63-FITC，分别以 25 μg/mL）添加到每个流管中，并加入 CD63 珠捕获的外体。
注：等型匹配的 IgG 用作负控件。 - 在室温下孵育45分钟，在800 rpm的摇床上提供光保护。
- 重复步骤 4.2.4\u20124.2.5。
- 在 200 μL 隔离缓冲液中重新悬挂珠束外体，并转移到 5 mL 流量管。
- 将管子放在流动环流仪的样品旋转木马中。
- 打开用于外体测试的协议。
- 通过流量环测仪自动运行样品。
- 西方印迹的外显体检测
注意：西方印迹是一种成熟的方法，我们不会详细讨论该方法本身。- 将 CB-SC 衍生的外体颗粒从步骤 3.10 中与 100 μL 的 RIPA 缓冲液、移液器 20 倍混合，然后放在冰上 5 分钟。
- 通过 BCA 试剂盒量化外体酸酯的蛋白质浓度，每井装载 25 μg 蛋白质。
- 在150V下，用凝胶电泳分离蛋白质40分钟。
- 使用半干转移方法11将蛋白质转移到聚乙烯氟化物（PVDF）膜。
- 用5%的非脂牛奶阻断膜30分钟。
- 用2μg/mL抗人阿利克斯（材料表）和1微克/mL抗人卡内辛抗体（材料表）进行孵育。
- 使用数字成像系统通过化学发光检测蛋白质。
- 通过动态光散射 （DLS） 进行外显体验证
- 在 1 mL PBS 中稀释 10 μg 的 CB-SC 衍生外体样本。
- 将1 mL稀释样品转移到一次性半微盒中（材料表）。
- 将库放在 DLS 仪器中。将所有样品监视器的折射率 （RI） 设置为 1.39。
- 在 25°C 下运行样品，并获取每个分数的三次测量，以获得平均尺寸分布。
- 通过透射电子显微镜 （TEM） 进行外显体验证
- 在300个网格铜网格12（材料表）上涂覆形式。
- 在铜网格12上增加蒸发碳层，加强形态。
注：这种涂层方法非常适合试样支撑。 - 将 10 μL 的外显组样品加载到网格上，然后保持空气干燥。
- 用醋酸尿酸尿酸的负染色样品5分钟。
- 用DI水洗三次，然后保持空气干燥。
- 观察和拍摄TEM下的样品。将加速电压设置为 200 kV，将点尺寸设置为 2。
5. 测量 PBMC 不同亚人口所测量的 Dio 标记 CB - SC 衍生的外体
-
标签CB-SC衍生的外体与绿色荧光嗜白染料迪奥
- 将 100 μg 的 CB-SC 衍生外体（在步骤 3.10 中制备）转移到 15 mL 离心管中。
- 用 PBS 稀释样品至 5 mL。
- 加入绿色荧光嗜白染料迪奥 （材料表 ），直到工作浓度达到 5 μM.
- 在室温下孵育15分钟，防止光线。
- 将样品转移到超离心管中。
- 在 100，000 x g 下 离心 80 分钟，以颗粒 Dio 标记的 CB-SC 衍生外体。
- 在 200 μL 的 PBS 中重新悬挂标记的外体。
-
人类PBMC的制备
- 将 25 mL 的人类布衣（材料表）传输为 50 mL 锥形管中，超过 20 mL 的密度梯度介质 （γ = 1.077）。
- 重复步骤 1.2 到 1.11。
- 将 1 x 106 PBMC 转移到非组织处理的疏水 24 井板（1 mL/well） 中。
注：使用非组织处理板避免粘附单核细胞。
-
与 PBMC 共同培养 Dio 标记的外体
- 使用 200 μL 移液器将步骤 5.1.7 中制备的 40 μL Dio 标签 CB-SC 衍生外体转移到 24 井板中每个含 PBMC 的井中。添加相同体积的 PBS 来控制油井。
- 通过移液10倍混合。孵育4小时。
- 收集 200 μL 外体处理 PBMC，并在室温下用 Hoechst 33342 贴上标签 10 分钟。
- 在室温下以300 x g 离心10分钟。丢弃上一液，在 100 μL 的 PBS 中重新悬浮细胞颗粒。
- 将细胞安装到显微镜幻灯片上。
- 使用显微镜观察和拍摄 Dio 标记的 CB-SC 衍生外体与 Hoechst 33342 标记的 PBMC 的相互作用。
- 将剩余的细胞从步骤 5.3.3 转移到 1.5 mL 管中。
- 在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。 丢弃上一液，在 200 μL 的 PBS 中重新悬浮细胞颗粒。
- 每个样品添加 5 μL 的 Fc 阻滞剂。在室温下孵育15分钟。
- 添加抗体（CD3、CD4、CD8、CD11c、CD14、CD19 和 CD56，以 25 μg/mL）（材料表）染色 PBMC。
注：等型匹配的 IgG 用作负控件。 - 在室温下孵育30分钟，有光保护。
- 加入1 mL的PBS，在300 x g 下离心机，在4°C下10分钟，对细胞进行颗粒。
- 使用 200 μL PBS 重新悬浮电池。加入5μL的碘化丙烯。
- 使用流细胞学评估PBMC不同亚体中迪奥标记的外体吸收水平。
6. 检查CB-SC衍生外体对单核细胞的作用
- 分离人类CD14阳性单核细胞
- 将 3 x 107 人类 PBMC 转移到 15 mL 管中。
- 在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
- 将分离列（材料表）放在磁体分离器（材料表）中。
- 用2 mL的冷运行缓冲液洗三次分离柱（材料表）。
- 将细胞重新悬浮在300μL的冷PBS中。加入 60 μL 的 CD14 微珠。混合好，在冰上孵育15分钟。
- 加入 6 mL 的冷 PBS。在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
- 将颗粒细胞重新悬浮在500μL的冷运行缓冲液中。
- 将单元格转移到分离列（在步骤 6.14 中准备），并让它们通过。
- 每次洗涤时用 2 mL 的运行缓冲液清洗分离柱三次。从磁铁分离器上提起柱，将其放在 15 mL 离心管中。
注：由于CD14正极单核在室温下附在管上，15 mL管应放在冰上。 - 将 2 mL 的冷运行缓冲液转移到柱的顶部，将 CD14 阳性细胞分离到 15 mL 管中。
- 在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟，以对 CD14 阳性细胞进行颗粒化。
- 用2 mL的冷化学定义血清自由介质（材料表）重新悬浮细胞。
- 将50μL的细胞转移到1.5 mL管中。
- 用 10 μL 的 Krome 橙结合抗人类 CD14 mAb （材料表） 染色 20 分钟。
注：等型匹配的 IgG 用作负控件。 - 向细胞添加 1 mL PBS。在300 x g下离心 10分钟，以产生细胞颗粒。
- 在200μL的PBS中重新悬浮细胞，并转移到5 mL管中。通过流式细胞测定CD14正单核细胞的纯度。
- 使用CB-SC衍生外体治疗单细胞
- 种子 1 x 106 纯化单核细胞与化学定义的无血清培养培养物 （材料表） 在组织培养处理 6 井板 （2 mL/well）.
- 在37°C下孵育2小时，低于5%CO2。
- 用 1 mL 移液器丢弃上流液。轻轻加入2 mL 37°C预热化学定义无血清培养基（材料表）。
注：单核细胞在2小时内粘附在板上。漂浮细胞被确定为死亡或其他细胞污染。 - 在总体积为 2 mL 的 6 井板中加入 80 μg CB-SC 衍生的外体，从步骤 3.10 分离到单细胞培养物。
注：为控制油井添加了相同体积的PBS。 - 在37°C下孵育5%CO23\u20124天。
- 以200倍的放大倍率（材料表）×的倒置显微镜拍摄细胞形态。
- 通过移液在基于 PBS 的细胞分离缓冲液中，用 1 mL 移液器尖端上下移液分离细胞。
- 通过细胞刮刀收集剩余的附着细胞。
注：由于原发性单核细胞或分化巨噬细胞紧密附着，一些细胞在治疗后仍依附于底部，使用分离缓冲液。因此，这些细胞用细胞刮刀收获。 - 以 1，690 x g 收集细胞 5 分钟。在200μL的PBS中重新悬浮细胞。
- 添加 5 μL 的 Fc 阻滞剂 （25 μg/mL） 以阻止非特异性绑定。
- 将抗体（CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209在25μg/mL， 材料表）添加到细胞中。在室温下孵育30分钟。
注： 等型匹配 IgG 用作负控制 - 将 1 mL PBS 添加到电池中，以 300 x g 的离心机 进行 10 分钟。使用 200 μL 的 PBS 丢弃上一液并重新挂起。
- 每个样品添加 5 μL 的碘化丙二钠 （200 μL），并将细胞转移到新的 5 mL 流量管中。
- 执行流式细胞测量并评估 CD14、CD80、CD86、CD163、CD206 和 CD209 表达式的水平。
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Representative Results
最初，CB-SC的表型和纯度通过流式细胞学与CB-SC相关标记物（如白细胞常见抗原CD45、ES细胞特异性转录因子OCT3/4和SOX2）进行检验。CB-SC 显示高级别的 CD45、OCT3/4、SOX2、CD270 和 galectin 9 表达式，但没有 CD34 的表达式（图 1A）。流细胞学分析证实，包括CD9、CD81和CD63在内的外体特异性标记的表达在CB-SC衍生外体（图1B）上。外体形态和大小分布的特点是TEM和DLS（图1C，D），大小为79.38±20.07nm。西方的印迹进一步证明了外体相关标记阿利克斯的表达，没有ER相关标记Calnexin的表达（图1E）。
PBMC 使用标有 Dio 的 CB-SC-Exo 进行治疗。显微镜观测显示，Dio标记的CB-SC-Exo与PBMC的直接相互作用（图2A）。为了更好地定义哪些细胞群体与 Dio 标记的 CB-SC-Exo 相互作用，不同的细胞隔间被封闭，并配有细胞特异性标记，如 T 细胞的 CD3、骨髓性树突状细胞 （DC）、单细胞的 CD14、B 细胞的 CD19 和 NK 细胞的 CD56（图2B）。经过4小时的孵育，流细胞仪表明，不同的血细胞室显示不同的中位荧光强度（MFI）的迪奥阳性外显体（图2C）。值得注意的是，单核细胞表现出高于其他免疫细胞的Dio阳性CB-SC-Exo的中位荧光强度（图2C），突出表明单核细胞主要针对CB-SC衍生的外体。
为了探索CB-SC衍生外体对单核细胞的直接影响，纯化CD14+ 单细胞与CB-SC衍生外体共培养3天。外显体处理的单核细胞成功地分化成主轴样（图3A）。接下来，对经过治疗或未经治疗的单核细胞的CB-SC-Exo表型进行了检测，揭示了包括CD163、CD206、CD209在内的M2相关标记在外显体治疗组中显著增加的表达（图3B，红色直方图）。与M-CSF =IL-4产生的常规M2巨噬细胞相比，CB-SC-Exo处理的单核细胞表示的M2相关标记水平相似，如CD163、CD206、CD209，无显著差异（图3C）。因此，数据表明，单核细胞在用CB-SC衍生的外体治疗后，分化成具有M2表型的巨噬细胞。
图1：CB-SC衍生外体特征。（A） CB-SC的表型特征，CD45、OCT3/4、SOX2、CD270和Galectin-9的高表达，无CD34的表达。（B） 在CB-SC衍生的外体体上外体相关标记（CD63、CD9、CD81）的表达。等型匹配的IgG用作流式细胞学（灰色直方图）的控件。（C） CB-SC衍生外体透射电子显微镜（TEM）图像。（D） 使用动态光散射 （DLS） 的 CB-SC 衍生外体的大小分布。（E） 西方印迹显示CB-SC衍生的外体显示外体特异性标记阿利克斯，但对内质神经（ER）相关标记Calnexin呈负。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：CB-SC衍生外体与PBMC不同种群的相互作用。（A） Dio 标记的 CB-SC-Exo（绿色）与 PBMC 的相互作用（蓝色、 用NiknEclipse Ti2显微镜用NIS-Elements软件版本5.11.02拍摄核染色，高放大倍率显示在非组织培养处理24孔板中共育4小时5%CO2 后，在PBMC细胞中，Dio标记的外体（绿色）的分布。n = 2。（B） 用于流量细胞学分析的浇注策略，用于PBMC中不同亚体细胞特异性表面标记， 包括T细胞的CD3、单细胞的CD14、B细胞的CD19、NK细胞的CD56和DC的CD11c。 （C） 在不同的PBMC亚细胞（如T细胞、单细胞、B细胞、NK细胞、DCs）之间显示Dio标记外体的不同中位荧光强度（MFI）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：CB-SC衍生外显体对单核细胞的影响。（A） 使用CB-SC衍生的外体治疗后，单核细胞形态变化成主轴类细胞。（B） 在对CB-SC衍生的外体（如CD163、CD206和CD209（红线）进行治疗后，对M2-关联标记的表达水平进行上调节。未经处理的单核细胞（绿线）作为控制。等型匹配的 IgG 用作负控件（灰色线）。（C） 常规 M2 巨噬细胞与 CB-SC-Exo 诱导的 M2 巨噬细胞之间的表型比较。为了产生传统的M2巨噬细胞，纯化的CD14+单细胞在37°C下用50纳克/mL巨噬细胞群刺激因子（M-CSF）治疗，5%CO2条件为7天，随后用10纳克/mL IL-4进行过夜治疗。M2 相关标记，包括 CD14。CD80、CD86、CD163、CD206和CD209通过流式细胞学进行评价。异型匹配免疫球蛋白G（IgG）作为控制。数据以 SD 的均±显示;N = 3。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
外显体的应用是临床诊断、药物开发、再生医学的新兴领域。在这里，我们提出了一个详细的协议，关于CB-SC衍生的外体的准备和外体的功能研究，人类单细胞的分化。目前的方案表明，功能性CB-SC衍生的外显体通过顺序离心和高纯度的超离心分离，并表现出对单核细胞的免疫调节。
与其他常规协议相比，超滤是一种基于不同于其他细胞外囊泡（EV）的分子量和排除尺寸的分离和纯化不同细胞或介质的既定方法。虽然超滤隔离比基于超离心的分离更省时，但它可能会对大尺寸的囊泡造成结构损伤。外显体也可以通过聚乙二醇（PEG）的沉淀以低成本收集，尽管这种方法由于蛋白质污染13，14，使外显体纯度有风险。因此，目前的协议具有成本效益，可以生产出高纯度的外体。基于CB-SC衍生外体10的免疫调节，CB-SC衍生外体表征可能为在临床应用前用CB-SC评估干细胞教育者的效力提供有价值的生物标志物。
巨噬细胞是对抗病毒和细菌感染的专业抗原细胞，具有不同的生物功能和异质性。根据其在表面标记和免疫功能上的差异，巨噬细胞分为两个子群：1型巨噬细胞（M1，引起炎症的常规巨噬细胞）和类型2巨噬细胞（M2，显示抗炎）15。本研究证实，纯化的人类单核细胞在用CB-SC衍生的外体治疗后，被分化成2型巨噬细胞，表现出一种抗炎表型10。CB-SC衍生外体处理的单细胞表现出拉长形态，并表达M2相关表面标记（例如CD163、CD206和CD209），其表型与使用细胞因子M-CSF +IL-4产生的常规M2巨噬细胞相似。单核细胞的这种表型变化突出了CB-SC用于治疗1型糖尿病和其他自身免疫性疾病的免疫调节的新机制。在SCE治疗期间，患者的免疫细胞与CB-SC共同培养约8\u20129小时。SCE 治疗的单核细胞将 CB-SC 衍生的外体带回体内，这促成了 M2 分化和免疫耐受性诱导的扩大，从而在使用 SCE 治疗后改善了临床结果。
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Disclosures
赵博士是天河干细胞生物技术公司的创始人，赵博士是干细胞教育者技术的发明者。所有其他作者没有可能与提交的作品相关的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢波达尔先生和路德维希先生通过哈肯萨克UMC基金会的慷慨资助。我们感谢赵老师的英文编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
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