Summary
Eksosomapplikasjon er et nytt verktøy for legemiddelutvikling og regenerativ medisin. Vi etablerer en eksosom isolasjonsprotokoll med høy renhet for å isolere eksosomer fra nye identifiserte stamceller kalt CB-SC for mekanistiske studier. Vi har også coculture CB-SC-avledede eksosomer med menneskelige monocytter, noe som fører til deres differensiering i fenotypisk distinkte makrofager.
Abstract
Stamcellepedagog (SCE) terapi er en ny klinisk tilnærming for behandling av type 1 diabetes og andre autoimmune sykdommer. SCE terapi sirkulerer den isolerte pasientens blod mononukleære celler (f.eks, lymfocytter og monocytter) gjennom en apheresis maskin, co-kulturer pasientens blod mononukleære celler med tilhenger ledningen blod-avledede stamceller (CB-SC) i SCE enheten, og deretter returnerer disse "utdannet" immunceller til pasientens blod. Eksosomer er nano-størrelse ekstracellulære vesikler mellom 30 \\ u2012150 nm eksisterende i alle biofluid og celle kultur medier. For ytterligere å utforske molekylære mekanismer underliggende SCE terapi og bestemme handlingene til eksosomer utgitt fra CB-SC, undersøker vi hvilke celler fagocytize disse eksosomer under behandlingen med CB-SC. Ved å co-culturing Dio-merket CB-SC-avledede eksosomer med humant perifert blod mononukleære celler (PBMC), fant vi at CB-SC-avledede eksosomer hovedsakelig ble tatt opp av menneskelige CD14-positive monocytter, noe som førte til differensiering av monocytter i type 2 makrofager (M2), med spindellignende morfologi og uttrykk for M2-tilhørende overflatemolekylære markører. Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og karakterisering av CB-SC-avledede eksosomer og protokollen for co-kulturen til CB-SC-avledede eksosomer med menneskelige monocytter og overvåking av M2 differensiering.
Introduction
Cord blod stamceller (CB-SC) er unik type stamceller identifisert fra menneskelig ledning blod og skiller seg fra andre kjente typer stamceller som mesenchymal stamceller (MSC) og hematopoetiske stamceller (HSC)1. Basert på deres unike egenskaper for immunmodulering og deres evne til å holde seg tett til overflaten av Petri-retter, utviklet vi en ny teknologi utpekt som stamcellepedagog (SCE) terapi i kliniskestudier 2,3. Under SCE-behandling samles en pasients perifere mononukleære blodceller (PBMC) og sirkuleres gjennom en celleseparator og co-kultivert med tilhenger CB-SC in vitro. Disse "utdannede" cellene (CB-SC-behandlet PBMC) returneres deretter til pasientens sirkulasjon i et lukket sløyfesystem. Kliniske studier har allerede vist klinisk sikkerhet og effekt av SCE-behandling for behandling av autoimmune sykdommer, inkludert type 1 diabetes (T1D)2,4 og alopecia areata (AA)5.
Eksosomer er en familie av nanopartikler med diameter som spenner 30 \\ u2012150 nm og finnes i alle biofluid og celle kultur media6. Eksosomer er beriket med mange bioaktive molekyler, inkludert lipider, mRNAer, proteiner og microRNAs (miRNA), og spiller en viktig rolle i celle-til-celle-kommunikasjon. I det siste har eksosomer blitt mer attraktive for forskere og farmasøytiske selskaper på grunn av deres terapeutiske potensialer iklinikker 7,8,9. Nylig viste våre mekanistiske studier at CB-SC-utgitte eksosomer bidrar til immunmodulering av SCE-terapi10.
Her beskriver vi protokollen for å utforske mekanismen for SCE-terapi rettet mot monocytter av CB-SC-utgitte eksosomer. Først ble CB-SC-utgitte eksosomer isolert fra CB-SC-avledede besamlede besamlede besamlede medier ved hjelp av ultracentrifugation metoder og validert av strømningscytometri, vestlig flekk (WB) og dynamisk lyssprying (DLS). For det andre ble CB-SC-avledede eksosomer merket med et grønt fluorescerende lipofilt fargestoff: Dio. For det tredje ble de co-kultivert med PBMC for å undersøke de positive prosentandelene av Dio-merkede CB-SC-avledede eksosomer ved de forskjellige underpopulasjonene av PBMC ved flytcytometri. Denne protokollen gir veiledning for å studere virkningen av eksosomer som ligger til grunn for immunmodulering av stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene til institusjonell human research ethics committee ved Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Menneskelige buffy coat blodenheter ble kjøpt fra New York Blood Center (New York, NY). Blodenheter i navlestrengen ble samlet inn fra friske donorer og kjøpt fra Cryo-Cell International blodbank (Oldsmar, FL). Både New York Blood Center og Cryo-Cell har mottatt alle akkrediteringer for blodsamlinger og distribusjoner, med IRB-godkjenning og signerte samtykkeskjemaer fra givere.
1. Cellekultur og fremstilling av CB-SC-avledet betinget medium
- Overfør 25 ml ledningsblod (Materialstabell ) over 20 ml tetthetsgradientmedium (γ = 1,077) til et konisk rør på 50 ml.
- Sentrifuge ved 1690 x g i 20 min ved 20 °C i en svingende bøtterotor uten brems.
- Overfør forsiktig det mononukleære cellelaget (buffy coat) til et nytt konisk rør på 50 ml. Fyll det koniske røret med fosfatbufret saltvann (PBS) til 40 ml. Bland og sentrifuge til pelletceller ved 751 x g i 10 min ved 20 °C.
- Kast supernatanten og tilsett 15 ml ACK lysisbuffer (Materialsovertred) til cellepelleten. Re-suspendere celler gjennom pipettering. Deretter inkubere i 10 min ved romtemperatur.
MERK: Dette trinnet fjerner de røde blodlegemene. - Fyll det koniske røret med 25 ml PBS. Sentrifuge ved 751 x g i 5 min og kast overnatant for å oppnå pelleted mononukleære celler.
- Vask 2x med 40 ml PBS for å fjerne den gjenværende lysisbufferen.
- Sentrifuge ved 751 x g i 5 min for å pellet cellene.
- Kast de supernatante og re-suspendere ledningen blod mononukleære celler med 10 ml kjemisk definert serum-fri medium (Table of Materials) per rør.
- Kombiner ledningen blod mononukleære celler til ett rør.
- Ta 20 μL celle suspensjon og bland med 20 μL av 0,4% trypan blå oppløsning (Table of Materials) i en 1,5 ml rør.
- Legg inn i kammeret lysbildet og kvantifisere cellenummer og celle levedyktighet med en automatisert celle teller.
MERK: Cellefjæring fortynnes ved 1:10 hvis cellekonsentrasjonen er over 1 x10 7 celler /ml. - Frø mononukleære celler i 150 mm x 15 mm Petri retter på 1 x 106 celler / ml, 25 ml / tallerken i kjemisk definert serum-fri celle kultur medium.
- Inkuber ved 37 °C under 8 % CO2-forhold i 10\u201214 dager til CB-SC når mer enn 80 % samløpet.
- Kast supernatant og vask med 15 ml PBS per petriskål; deretter fjerner du PBS-
MERK: CB-SC er godt festet til Petri-retter. - Gjenta trinn 1.14 to ganger.
- Tilsett 25 ml kjemisk definert serumfritt medium per petriskål.
- Inkuber ved 37 °C under 8 % CO2-forhold i 3\u20124 dager.
- Samle CB-SC-avledet betinget medium i 50 ml koniske rør.
2. Karakterisering av CB-SC
- Løsne CB-SC ved å pipettering 10 ml PBS-basert celledissosiasjonsbuffer opp og ned med en 5 ml pipettespiss (Materialsekk).
- Sentrifuge ved 1690 x g i 5 min til pelletceller og re-suspendere i 200 μL PBS.
- Fest og gjennomsyre celler for intracellulær farging via fargingsforberedelsessett (Materialsekk).
- Tilsett 5 μL fc-blokkering (materialståp) per prøve og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
MERK: Fc blocker hemmer ikke-spesifikk binding ved farging med antistoffer. - Legg fluorescens-konjugert mus anti-menneskelige monoklonale antistoffer inkludert CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270, og Galectin 9 ved 25 μg / ml (Table of Materials) til 100 μL volum av celler. Inkuber i 30 min ved romtemperatur med lysbeskyttelse.
- Etter farging, vask celler med 1 ml PBS og sentrifuge ved 751 x g i 10 min til pelletceller.
- Re-suspendere celler med 200 μL PBS og overføre til en 5 ml rør.
- Utfør flytcytometri for å validere uttrykket for CB-SC-tilknyttede over bestemte markører.
3. Isolering av CB-SC-avledede eksosomer
- Sentrifuge det bedede mediet samlet fra trinn 1,18 ved 300 x g i 10 min ved 4 °C. Overfør det overnaturlige til et nytt konisk rør på 50 ml.
- Sentrifuger supernatanten samlet fra trinn 3,1 ved 2000 x g i 20 min ved 4 °C. Overfør det overnaturlige til et nytt konisk rør på 50 ml.
- Sentrifuger supernatanten samlet fra trinn 3,2 ved 10 000 x g i 30 min ved 4 °C. Overfør det overnaturlige til et nytt konisk rør på 50 ml.
MERK: Den faste vinkelrotoren brukes slik at cellepellets utløses til siden av røret. Merk siden av hetten og tegn en sirkel på siden av røret der pelleten forventes. - Filtrer supernativa samlet inn fra trinn 3,3 med et 0,22 μm filter (Materialtabell).
- Overfør 15 ml medier til hver 10 kDa sentrifugalfilterenhet (Materialse ).
- Sentrifuge på 4000 x g i 30 min for å isolere konsentrert eksosom media.
- Overfør de konsentrerte eksosomer til en ultracentrifuge tube. Deretter pellet eksosomer ved 100.000 x g i 80 min ved 4 °C.
- Kast supernatanten og suspender pellets eksosomer i 10 ml PBS.
- Sentrifuge ved 100.000 x g i 80 min ved 4 °C for å samle eksosomer pellet.
- Re-suspendere eksosomer pellet i 200 μL pbs ved å pipetter opp og ned.
4. Karakterisering av CB-SC-avledede eksosomer
- Kvantifisere total proteinkonsentrasjon av eksosompreparat ved bicinchoninsyreanalysesett (BCA)
- Pipette 10 μL av hver albumin standard og isolert eksosomprøve utarbeidet i trinn 3.10 til en 96-brønns plate i duplikat.
- Tilsett 200 μL av arbeidsreagensen fra BCA-settet til hver brønn. Bland innholdet på platen grundig på plateshakeren i 10 s.
MERK: Arbeidsreagens (WR): 50-delers reagens A med 1delt reagens B. - Dekk platene med folie og inkuber dem ved 37 °C i 30 min.
- Avkjøl platene til romtemperatur (RT).
- Mål prøveabsorbansen ved 562 nm via en plateleser.
- Forberedelse og farging av eksosomer for strømningscytometri
- Fang eksosomer ved å legge til 20 μL anti-menneskelige CD63 magnetiske perler (4,5 μm størrelse) (Materialtabell) i 25 μg CB-SC-avledede eksosomer tilberedt i trinn 3,10 totalt 100 μL volum PBS.
- Inkuber røret over natten (18\u201222 h) ved 4 °C på risten ved 800 o/min.
- Sentrifuger røret på 300 x g i 30 s for å samle prøven nederst på røret.
- Tilsett 300 μL isolasjonsbuffer (0,1 % storfe serumalbumin (BSA) i PBS) og bland forsiktig ved pipettering.
MERK: Dette trinnet vasker de perlebundne eksosomer. - Plasser røret på et magnetstativ i 1 min (Materials bord) og kast det overnaturlige.
- Gjenta trinn 4.2.4\u20124.2.5.
- Suspender de perlebundne eksosomer med 400 μL isolasjonsbuffer.
- Aliquot 100 μL av perlebundne eksosomer til hvert rør.
- Tilsett fluorescenskonjugerte antistoffer (CD9-FITC, CD81-PE og CD63-FITC ved henholdsvis 25 μg/ml) til hvert strømningsrør med CD63 perlefangede eksosomer.
MERK: Isotype-samsvarende IgGs fungerer som negative kontroller. - Inkuber i 45 min ved romtemperatur med lysbeskyttelse på shakeren ved 800 o/min.
- Gjenta trinn 4.2.4\u20124.2.5.
- Re-suspendere perle-bundet eksosomer i 200 μL isolasjonbuffer og overføre til 5 ml strømningsrør.
- Plasser rørene i prøvekarusellen til strømningscytometeret.
- Åpne protokollen for eksosomtesting.
- Kjør prøven automatisk etter flow cytometer.
- Eksosomdeteksjon av vestlig flekk
MERK: Western blot er en veletablert metode, og vi vil ikke gå inn i detaljer om selve metoden.- Lyse pellets av CB-SC-avledet eksosomer fra trinn 3.10 med 100 μL RIPA buffer, pipette 20x, deretter plassere på is i 5 min.
- Kvantifisere proteinkonsentrasjonen av eksosomlylat med BCA-sett og last 25 μg protein per brønn.
- Separer proteinene ved gelelektroforese i 40 min ved 150 V.
- Overfør proteinet til polyvinylidfluorid (PVDF) membran ved hjelp av halvtørre overføringsmetode11.
- Blokker membranen med 5% fettfattig melk i 30 min.
- Inkuber med 2 μg/ml antimenneskende Alix (materialtabell) og 1 μg/ml anti-humane Calnexin antistoffer (Materialtabell).
- Oppdag proteinet ved chemiluminescence med et digitalt bildebehandlingssystem.
- Eksosomvalidering ved dynamisk lysspreding (DLS)
- Fortynn 10 μg CB-SC-avledede eksosomer i 1 ml PBS.
- Overfør 1 ml fortynnet prøve til engangs semi-mikro cuvette (Table of Materials).
- Plasser cuvette i DLS-instrumentet. Still inn brytningsindeksen (RI) som 1,39 for alle prøveskjermene.
- Kjør prøver ved 25 °C og hent tre målinger per brøk for å få en gjennomsnittlig størrelsesfordeling.
- Eksosomvalidering ved overføring av elektronmikroskopi (TEM)
- Coat formvar på 300 mesh kobbergitter12 (Table of Materials).
- Styrke formvar med det ekstra laget av fordampet karbon på kobbernett12.
MERK: En slik beleggtilnærming er utmerket for prøvestøtte. - Legg 10 μL eksosogprøver på gitter og la det lufttørke.
- Negativt flekkprøver med uranylacetat i 5 min.
- Vask tre ganger med DI-vann og la det lufttørke.
- Ta hensyn til og fotografer prøvene under TEM. Still inn den akselererende spenningen ved 200 kV og spotstørrelse ved 2.
5. Mål Dio-merket CB-SC-avledede eksosomer opp tatt av ulike underpopulasjoner av PBMC
-
Etikett CB-SC-avledede eksosomer med grønn fluorescerende lipofil fargedio
- Overfør 100 μg CB-SC-avledede eksosomer (tilberedt i trinn 3,10) til et 15 ml sentrifugerør.
- Fortynn prøven med PBS til 5 ml.
- Tilsett grønn fluorescerende lipofil fargedio (materialtabell) til arbeidskonsentrasjonen når 5 μM.
- Inkuber i 15 min ved romtemperatur beskyttet mot lys.
- Overfør prøven til et ultrasentrisk rør.
- Sentrifuge på 100.000 x g i 80 min til pellet Dio-merket CB-SC-avledede eksosomer.
- Suspender de merkede eksosomer i 200 μL PBS.
-
Fremstilling av menneskelig PBMC
- Overfør 25 ml menneskelig buffy coat (Table of Materials) over 20 ml tetthet gradient medium (γ = 1,077) inn i en 50 ml konisk rør.
- Gjenta trinn 1.2 til 1.11.
- Overfør 1 x 106 PBMC til en ikke-vevsbehandlet hydrofob 24-brønnsplate (1 ml/brønn).
MERK: En ikke-vevsbehandlet plate ble brukt til å unngå å følge monocytter.
-
Co-kultur Dio-merkede eksosomer med PBMC
- Overfør 40 μL Dio-merkede CB-SC-avledede eksosomer tilberedt i trinn 5.1.7 til hver PBMC-inneholdende brønn i en 24-brønns plate ved hjelp av en 200 μL pipette. Legg til samme volum av PBS for å kontrollere brønner.
- Bland ved å pipettering 10x. Inkuber i 4 timer.
- Samle 200 μL eksosombehandlet PBMC og etikett med Hoechst 33342 i 10 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved romtemperatur. Kast det overnaturante og suspender cellepelleten på en 100 μL PBS.
- Monter celler på mikroskoplysbildene.
- Observere og fotografere samspillet mellom Dio-merkede CB-SC-avledede eksosomer med Hoechst 33342-merket PBMC ved hjelp av et mikroskop.
- Overfør de resterende cellene fra trinn 5.3.3 til et 1,5 ml rør.
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4 °C. Kast det overnaturlige og suspender cellepelleten på en re-μL i 200 μL pbs.
- Tilsett 5 μL fc-blokkering per prøve. Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Legg til antistoffer (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 og CD56 ved 25 μg/ml) (Materialsekk) for å flekke PBMC.
MERK: Isotype-samsvarende IgGs fungerer som negative kontroller. - Inkuber i 30 min ved romtemperatur med lysbeskyttelse.
- Tilsett 1 ml PBS og sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4 °C for å pellet cellene.
- Re-suspendere cellene med 200 μL PBS. Tilsett 5 μL propidiumjodid.
- Bruk strømningscytometri til å evaluere nivået av Dio-merket eksosometopptak i ulike underpopulasjoner av PBMC.
6. Undersøk virkningen av CB-SC-avledede eksosomer på monocytter
- Isolasjon menneskelige CD14-positive monocytter
- Overfør 3 x 107 menneskelig PBMC til et 15 ml rør.
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4 °C.
- Plasser separasjonskolonnen (Materialsekk )i magnetseparatoren (Materialsekk).
- Vask separasjonskolonner tre ganger med 2 ml kaldløpsbuffer (Materialsekk).
- Re-suspendere cellene i 300 μL av kald PBS. Tilsett 60 μL CD14 mikroperler. Bland godt og inkuber på is i 15 min.
- Tilsett 6 ml kald PBS. Sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4 °C.
- Suspender pelletedcellene i 500 μL kaldløpsbuffer.
- Overfør celler til separasjonskolonnen (klargjort i trinn 6.14) og la dem passere gjennom.
- Vask separasjonskolonnen tre ganger med 2 ml løpebuffer per vask. Løft kolonnen fra magnetseparatoren og plasser den i et 15 ml sentrifugerør.
MERK: 15 ml røret skal plasseres på is på grunn av tilslutning av CD14-positive monocytter til røret ved romtemperatur. - Overfør 2 ml kaldløpsbuffer til toppen av kolonnen og isolere CD14-positive celler i 15 ml rør.
- Sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4 °C for å pellet CD14-positive celler.
- Re-suspendere cellene med 2 ml kaldt kjemisk definert serumfritt medium (Table of Materials).
- Overfør 50 μL celler til et 1,5 ml rør.
- Beis med 10 μL Krome Oransje-konjugert anti-menneskelig CD14 mAb (Materialsekke) i 20 min.
MERK: Isotype-samsvarende IgGs fungerer som negative kontroller. - Legg til 1 ml PBS i cellene. Sentrifuge ved 300 x g i 10 min til pelletceller.
- Re-suspendere celler i 200 μL pbs og overføre den til en 5 ml rør. Bestem renheten til CD14-positive monocytter ved strømningscytometri.
- Behandling av monocytter med CB-SC-avledede eksosomer
- Frø 1 x 106 rensede monocytter med kjemisk definert serumfri kulturmedium(Table of Materials)i vevskulturbehandlet 6-brønnsplate (2 ml/brønn).
- Inkuber i 2 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
- Kast supernatanten med 1 ml pipette. Tilsett 2 ml forvarmet kjemikaliedefinert serumfri kulturmedium ( Materialstable of Materials)forsiktig.
MERK: Monocytter ble festet til platen innen 2 timer. Flytende celler ble identifisert som døde eller andre cellekontamineringer. - Tilsett 80 μg CB-SC-avledede eksosomer isolert fra trinn 3,10 til monocyttkulturer i en 6-brønns plate med totalt volum på 2 ml.
MERK: Det samme volumet av PBS ble lagt til for å kontrollere brønner. - Inkuber ved 37 °C under 5 % CO2 i 3\u20124 dager.
- Fotografer cellemorfologien ved hjelp av et invertert mikroskop ved 200× forstørrelse (Materialsekk).
- Løsne celler ved å pipetter opp og ned i 1 ml av en PBS-basert celledissosiasjonsbuffer med 1 ml pipettespiss.
- Høst de resterende vedlagte cellene via en celleskraper.
MERK: Siden primære monocytter eller differensierte makrofager festes tett, forblir noen celler festet til bunnen etter behandlingen med dissosiasjonsbuffer. Derfor høstes disse cellene med en celleskraper. - Samle celler på 1690 x g i 5 min. Re-suspendere celler i 200 μL av PBS.
- Tilsett 5 μL fc-blokkering (25 μg/ml) for å blokkere ikke-spesifikk binding.
- Legg til antistoffer (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 og CD209 ved 25 μg/ml, Materialtabell)i cellene. Inkuber i 30 min ved romtemperatur.
MERK: Isotype-samsvarende IgGs fungerer som negativ kontroll - Tilsett 1 ml PBS i celler og sentrifuge ved 300 x g i 10 min. Kast supernatant og re-suspendere med 200 μL PBS.
- Tilsett 5 μL propidiumjodid per prøve (200 μL) og overfør celler til et nytt 5 ml strømningsrør.
- Utfør strømningscytometrien og evaluer nivåene av CD14-, CD80-, CD86-, CD163-, CD206- og CD209-uttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utgangspunktet ble fenotypen og renheten til CB-SC undersøkt ved flytcytometri med CB-SC-tilknyttede markører som leukocytt vanlige antigen CD45, ES cellespesifikke transkripsjonsfaktorer OCT3/4 og SOX2. CB-SC viser høye nivåer av CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og galectin 9 uttrykk, men ingen uttrykk for CD34 (Figur 1A). Flow cytometri analyse bekreftet uttrykket av eksosom-spesifikke markører inkludert CD9, CD81, og CD63 var på CB-SC-avledede eksosomer (Figur 1B). Morfologi og størrelsesfordeling av eksosomer var preget av TEM og DLS (figur 1C, D),med størrelsen på 79,38 ± 20,07 nm. Vestlig flekk beviste videre uttrykket for eksosom-assosiert markør Alix, uten uttrykk for DEN ER-tilknyttede markøren Calnexin (figur 1E).
PBMC ble behandlet med Dio-merket CB-SC-Exo. Mikroskopiobservasjonen viste direkte interaksjon mellom Dio-merket CB-SC-Exo med PBMC (figur 2A). For bedre å definere hvilken cellepopulasjon som samhandlet med Dio-merket CB-SC-Exo, ble forskjellige cellerom inngjerdet med cellespesifikke markører som CD3 for T-celler, CD11c for myeloid dendrittiske celler (DC), CD14 for monocytter, CD19 for B-celler og CD56 for NK-celler (figur 2B). Etter en inkubasjon i 4 timer viste strømningscytometri at forskjellige blodcellerom viste ved forskjellig median fluorescensintensitet (MFI) av Dio-positive eksosomer (figur 2C). Spesielt viste monocytter høyere median fluorescensintensitet av Dio-positiv CB-SC-Exo enn for andre immunceller (figur 2C), som fremhevet at monocytter primært var målrettet av CB-SC-avledede eksosomer.
For å utforske de direkte effektene av CB-SC-avledede eksosomer på monocytter, ble de rensede CD14+ monocytter co-kultivert med CB-SC-avledede eksosomer i 3 dager. Den eksosombehandlet monocytt vellykket differensiert i spindel-lignende morfologier (Figur 3A). Deretter ble fenotyper av CB-SC-Exo behandlet eller ubehandlede monocytter testet, og avslørte uttrykkene til M2-tilknyttede markører, inkludert CD163, CD206, CD209, ble markert økt blant den eksosombehandlede gruppen (figur 3B, rødt histogrammet). Sammenligning med de konvensjonelle M2 makrofager generert av M-CSF + IL-4, CB-SC-Exo-behandlet monocytter uttrykt lignende nivåer av M2-tilknyttede markører som CD163, CD206, CD209, uten signifikante forskjeller (Figur 3C). Dataene indikerer derfor at monocytter skiller seg inn i makrofager med M2 fenotype etter behandling med CB-SC-avledede eksosomer.
Figur 1: Karakterisering av CB-SC-avledede eksosomer. (A) Fenotypisk karakterisering av CB-SC, høyt uttrykk for CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og Galectin-9, ingen uttrykk for CD34. (B) Uttrykk for eksosomer-tilknyttede markører (CD63, CD9, CD81) på CB-SC-avledede eksosomer. Isotype-matchet IgGs fungerte som kontroller for strømningscytometri (grå histogrammet). (C) Transmisjon elektronmikroskopi (TEM) bilde av CB-SC-avledede eksosomer. (D)Størrelsesfordeling av CB-SC-avledede eksosomer ved hjelp av dynamitisk lyssprerende (DLS). (E)Vestlige flekker viser at CB-SC-avledede eksosomer viser eksosomen-spesifikk markør Alix, men negativ for endoplasmatisk retikuulum (ER)-assosiert markør Calnexin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Interaksjon av CB-SC-avledede eksosomer med ulike populasjoner av PBMC. (A)Samspillet mellom Dio-merket CB-SC-Exo (grønn) med PBMC (blå, kjernefysisk farging med Hoechst 33342) ble fotografert med Nikon Eclipse Ti2 mikroskop med NIS-Elements programvareversjon 5.11.02, med høy forstørrelse som viser fordelingen av Dio-merkede eksosomer (grønn) i PBMC-cellene etter co-inkubasjon for 4 t 5% CO2 i ikke-vev kultur-behandlet 24-brønns plate. n = 2. (B)Gating strategi for flyt cytometri analyse med celle-spesifikke overflate markører for ulike underpopulasjoner i PBMC, inkludert CD3 for T-celler, CD14 for monocytter, CD19 for B-celler, CD56 for NK-celler og CD11c for DCer. (C) Vis forskjellig median fluorescensintensitet (MFI) av Dio-merket eksosom blant forskjellige PBMC-underpopulasjoner (f.eks. T-celler, monocytter, B-celler, NK-celler, DCer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekter av CB-SC-avledede eksosomer på monocytter. (A) Morfologisk endring av monocytter til spindellignende celler etter behandling med CB-SC-avledede eksosomer. (B)Oppregulert nivået av M2-tilknyttede markører uttrykk etter behandling med CB-SC-avledede eksosomer, for eksempel CD163, CD206, og CD209 (rød linje). Ubehandlede monocytter (grønn linje) fungerte som kontroll. Isotype-matchende IgGs fungerte som negative kontroller (grå linje). (C) Fenotypisk sammenligning mellom konvensjonelle M2 makrofager og CB-SC-Exo-induserte M2 makrofager. For å generere de konvensjonelle M2-makrofagene ble de rensede CD14+ monocytter behandlet med 50 ng / ml makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) ved 37 ° C, 5% CO2-forhold i 7 dager, og etterfulgt av overnattingsbehandlingen med 10 ng / ml IL-4. M2-tilknyttede markører, inkludert CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 og CD209 ble evaluert av strømningscytometri. Isotype-matchet immunglobulin G (IgG) fungerer som kontroll. Dataene presenteres som gjennomsnitt ± SD; N = 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelse av eksosomer er et fremvoksende felt for klinisk diagnose, legemiddelutvikling og regenerativ medisin. Her presenterer vi en detaljert protokoll om utarbeidelse av CB-SC-avledede eksosomer og funksjonell studie av eksosomer om differensiering av menneskelige monocytter. Den nåværende protokollen viste at funksjonelle CB-SC-avledede eksosomer er isolert av sekvensiell sentrifugering og ultracentrifugation med høy renhet og viser immunmodulasjon på monocytter.
Sammenlignet med andre konvensjonelle protokoller, er ultrafiltrering en etablert tilnærming for isolasjon og rensing av eksosomer fra forskjellige celler eller medier, basert på molekylvekt og ekskluderingsstørrelser som er forskjellige fra andre ekstracellulære vesikler (EV).sammenlignet med andre konvensjonelle protokoller, er ultrafiltrering en etablert tilnærming til isolasjon og rensing av eksosomer fra forskjellige celler eller medier, basert på molekylvekts- og ekskluderingsstørrelsene som er forskjellige fra andre ekstracellulære vesikler (EV-er). Selv om ultrafiltreringsisolering er mer tidsbesparende enn den ultrasentriske separasjonen, kan det forårsake strukturell skade på vesikler i store størrelser. Eksosomer kan også samles inn av polyetylenglykol (PEG)-mediert nedbør til lave kostnader, selv om denne metoden risikerer eksosomet renhet på grunn avproteinforurensninger 13,14. Derfor var den nåværende protokollen kostnadseffektiv å produsere eksosomer ved høy renhet. Basert på immunmodulasjoner av CB-SC-avledede eksosomer10,karakterisering av CB-SC-avledede eksosomer kan tilby en verdifull biomarkør for å evaluere styrken av Stamcellepedagog med CB-SC før kliniske anvendelser.
Makrofager er profesjonelle antigen-presentere celler mot virale og bakterielle infeksjoner, med varierte biologiske funksjoner og heterogeniteter. Basert på deres forskjeller i overflatemarkører og immunfunksjon kategoriseres makrofager med to underpopulasjoner: type 1 makrofager (M1, konvensjonelle makrofager som forårsaker betennelse) og type 2 makrofager (M2, viser anti-betennelse)15. Denne studien fastslo at rensede humane monocytter ble differensiert til type 2 makrofager etter behandling med CB-SC-avledede eksosomer, viser en anti-betennelse fenotype10. CB-SC-avledede eksosomer-behandlede monocytter viste langstrakt morfologi og uttrykte M2-tilknyttede overflatemarkører (f.eks CD163, CD206 og CD209), med lignende fenotype som de konvensjonelle M2-makrofagene generert ved hjelp av cytokiner M-CSF + IL-4. Slike fenotypiske endringer av monocytter fremhever den nye mekanismen som ligger til grunn for immunmodulering av CB-SC for behandling av type 1 diabetes og andre autoimmune sykdommer. Under SCE-behandlingen ble pasientenes immunceller co-kultivert med CB-SC i rundt 8\u20129 h. De SCE-behandlede monocytter bar CB-SC-avledede eksosomer tilbake i kroppen, noe som bidro til M2 differensiering og utvidelse av induksjon av immuntoleranse, noe som førte til forbedring av kliniske resultater etter behandling med SCE-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Zhao er en grunnlegger av Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Dr. Zhao er en oppfinner av Stem Cell Educator teknologi. Alle andre forfattere har ingen økonomiske interesser som kan være relevante for det innsendte arbeidet.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Mr. Poddar og Mr. Ludwig for sjenerøs finansiering støtte via Hackensack UMC Foundation. Vi setter pris på Laura Zhao for engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
