Summary
Exosoom toepassing is een opkomende tool voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. We stellen een exosoom isolatieprotocol op met een hoge zuiverheid om exosomen te isoleren van nieuw geïdentificeerde stamcellen genaamd CB-SC voor mechanistische studies. We cocultuur cb-sc-afgeleide exosomen met menselijke monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in fenotypically verschillende macrofagen.
Abstract
Stamcel educator (SCE) therapie is een nieuwe klinische aanpak voor de behandeling van type 1 diabetes en andere auto-immuunziekten. SCE-therapie circuleert de bloedmononucleaire cellen van de geïsoleerde patiënt (bijvoorbeeld lymfocyten en monocyten) via een aferesemachine, co-culturen van de patiënt bloed mononucleaire cellen met aanhangende navelstrengbloed afgeleide stamcellen (CB-SC) in de SCE-apparaat, en vervolgens keert deze "opgeleide" immuuncellen naar het bloed van de patiënt. Exosomen zijn nano-sized extracellulaire vesicles tussen 30\u2012150 nm bestaande in alle biofluïde en celkweek media. Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan SCE-therapie verder te onderzoeken en de acties van exosomen die vrijkomen bij CB-SC te bepalen, onderzoeken we welke cellen deze exosomen phagocytiseren tijdens de behandeling met CB-SC. Door dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) mede te kweken, ontdekten we dat cb-SC-afgeleide exosomen voornamelijk werden overgenomen door menselijke CD14-positieve monocyten, wat leidde tot de differentiatie van monocyten in type 2 macrofagen (M2), met spindelachtige morfologie en expressie van M2-geassocieerde oppervlaktemoleculaire markers. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en karakterisering van cb-SC-afgeleide exosomen en het protocol voor de co-cultuur van CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke monocyten en het toezicht op M2 differentiatie.
Introduction
Navelstrengbloedstamcellen (CB-SC) zijn uniek type stamcellen die zijn geïdentificeerd uit menselijk navelstrengbloed en onderscheiden zich van andere bekende soorten stamcellen zoals mesenchymale stamcellen (MSC) en hematopoietische stamcellen (HSC)1. Op basis van hun unieke eigenschappen van immuunmodulatie en hun vermogen om zich strak aan het oppervlak van petrischaaltjes te houden, ontwikkelden we een nieuwe technologie die is aangewezen als Stem Cell Educator (SCE) therapie in klinische studies2,3. Tijdens de SCE-therapie worden de perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van een patiënt verzameld en verspreid via een celafscheider en co-gekweekt met aanhangende CB-SC in vitro. Deze "opgeleide" cellen (CB-SC-behandelde PBMC) worden vervolgens teruggegeven aan de circulatie van de patiënt in een gesloten-lus systeem. Klinische studies hebben al aangetoond dat de klinische veiligheid en werkzaamheid van SCE-therapie voor de behandeling van auto-immuunziekten, waaronder type 1 diabetes (T1D)2,4 en alopecia areata (AA)5.
Exosomen zijn een familie van nanodeeltjes met diameters variërend 30\u2012150 nm en bestaan in alle biofluïde en celkweek media6. Exosomen zijn verrijkt met vele bioactieve moleculen, waaronder lipiden, mRNAs, eiwitten en microRNAs (miRNA), en spelen een belangrijke rol in cel-tot-cel communicatie. De laatste tijd zijn exosomen aantrekkelijker geworden voor onderzoekers en farmaceutische bedrijven vanwege hun therapeutische mogelijkheden in klinieken7,8,9. Onlangs hebben onze mechanistische studies aangetoond dat CB-SC-vrijgegeven exosomen bijdragen aan de immuunmodulatie van SCE therapie10.
Hier beschrijven we het protocol om het mechanisme van SCE-therapie te verkennen gericht op monocyten door CB-SC-vrijgegeven exosomen. Ten eerste werden door CB-SC vrijgegeven exosomen geïsoleerd van door CB-SC afgeleide geconditioneerde media met behulp van ultracentrifugeringsmethoden en gevalideerd door stromingscytometrie, western blot (WB) en dynamic light scattering (DLS). Ten tweede werden cb-SC-afgeleide exosomen gelabeld met een groene fluorescerende lipofiele kleurstof: Dio. Ten derde werden ze samen met PBMC gecoökt om de positieve percentages van dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen te onderzoeken op de verschillende subpopulaties van PBMC door flow cytometrie. Dit protocol biedt richtlijnen om de werking van exosomen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de immuunmodulatie van stamcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de institutionele human research ethische commissie van Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Menselijke buffy jas bloed eenheden werden gekocht bij de New York Blood Center (New York, NY). Menselijke navelstrengbloed eenheden werden verzameld van gezonde donoren en gekocht bij Cryo-Cell International bloedbank (Oldsmar, FL). Zowel New York Blood Center als Cryo-Cell hebben alle accreditaties voor bloedcollecties en distributies ontvangen, met IRB-goedkeuring en ondertekende toestemmingsformulieren van donoren.
1. Celkweek en bereiding van door CB-SC afgeleid geconditioneerd medium
- Breng 25 mL navelstrengbloed(Tabel van materialen) over meer dan 20 mL dichtheidsgradiënt medium (γ = 1.077) over in een conische buis van 50 mL.
- Centrifuge bij 1.690 x g gedurende 20 minuten bij 20 °C in een slingerende bakrotor zonder rem.
- Breng de mononucleaire cellaag (buffy coat) voorzichtig over naar een nieuwe 50 mL conische buis. Vul de conische buis met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 40 mL. Meng en centrifuge tot pelletcellen met 751 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C.
- Gooi de supernatant weg en voeg 15 mL ACK lyse buffer(Tabel van materialen)toe aan de celpellet. Cellen opnieuw ophangen door pipeting. Dan incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Deze stap verwijdert de rode bloedcellen. - Vul de conische buis met 25 mL PBS. Centrifuge op 751 x g gedurende 5 min en gooi supernatant om pelleted mononucleaire cellen te verkrijgen.
- Was 2x met 40 mL PBS om de resterende lysebuffer te verwijderen.
- Centrifuge op 751 x g gedurende 5 min om de cellen pellet.
- Gooi de supernatant weg en schort snoerbloedmononucleaire cellen opnieuw op met 10 mL chemisch gedefinieerd serumvrij medium(Tabel van materialen)per buis.
- Combineer navelstrengbloed mononucleaire cellen tot één buis.
- Neem 20 μL celsuspensie en meng met 20 μL van 0,4% trypanblauwe oplossing(Tabel van materialen)in een buis van 1,5 mL.
- Laad in de kamerdia en kwantificeer het celnummer en de levensvatbaarheid van de cel met een geautomatiseerde celteller.
OPMERKING: Celsuspensie wordt verdund bij 1:10 als de celconcentratie hoger is dan 1 x 107 cellen/mL. - Zaadmononucleaire cellen in 150 mm x 15 mm petrischaaltjes bij 1 x 106 cellen/mL, 25 mL/schotel in chemisch gedefinieerd serumvrij celkweekmedium.
- Incubeer bij 37 °C onder 8% CO2-omstandigheden gedurende 10\u201214 dagen tot CB-SC meer dan 80% samenvloeiing bereikt.
- Gooi de supernatant weg en was met 15 mL PBS per petrischaaltje; Verwijder vervolgens de PBS.
LET OP: CB-SC zijn stevig aan petrischaaltjes bevestigd. - Herhaal stap 1.14 twee keer.
- Voeg 25 mL chemisch gedefinieerd serumvrij medium per petrischaaltje toe.
- Incubeer bij 37 °C onder 8% CO2-omstandigheden gedurende 3\u20124 dagen.
- Verzamel het CB-SC-afgeleide geconditioneerde medium in 50 mL conische buizen.
2. Karakterisering van CB-SC
- Maak CB-SC los door 10 mL op PBS gebaseerde celdissociatiebuffer op en neer te spuiten met een pipetpunt van 5 mL(Tabel van materialen).
- Centrifuge met 1.690 x g gedurende 5 minuten aan pelletcellen en opnieuw op te schorten in 200 μL PBS.
- Fix en permeabilize cellen voor intracellulaire vlekken via kleuring voorbereiding kit(Tabel van materialen).
- Voeg 5 μL Fc-blokker(Tabel van materialen)per monster toe en broed gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De fc-blokker remt niet-specifieke binding bij het beitsen met antilichamen. - Voeg fluorescentie-geconjugeerde muis anti-menselijke monoklonale antilichamen, waaronder CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270, en Galectin 9 op 25 μg /mL (Tabel van materialen) tot 100 μL volume van de cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met lichtbescherming.
- Na het bevlekken, was cellen met 1 mL PBS en centrifuge op 751 x g gedurende 10 min tot pelletcellen.
- Stel cellen opnieuw op met 200 μL PBS en breng over in een buis van 5 mL.
- Voer stroomcytometrie uit om de expressie van CB-SC-geassocieerde boven specifieke markeringen te valideren.
3. Isolatie van uit CB-SC afgeleide exosomen
- Centrifugeren het geconditioneerde medium verzameld van stap 1.18 bij 300 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Breng de supernatant over naar een nieuwe 50 mL conische buis.
- Centrifuge de supernatant verzameld van stap 3.1 op 2.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Breng de supernatant over naar een nieuwe 50 mL conische buis.
- Centrifuge de supernatant verzameld van stap 3.2 op 10.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Breng de supernatant over naar een nieuwe 50 mL conische buis.
LET OP: De rotor met vaste hoek wordt gebruikt zodat de celpellets aan de zijkant van de buis worden neergeslagen. Markeer de zijkant van de dop en teken een cirkel aan de zijkant van de buis waar de pellet wordt verwacht. - Filtersupernatants verzameld vanaf stap 3.3 met een filter van 0,22 μm (Tabel van materialen).
- Breng 15 mL media over naar elke 10 kDa centrifugaalfiltereenheid(Tabel van materialen).
- Centrifuge op 4.000 x g gedurende 30 minuten om de geconcentreerde exosoom media te isoleren.
- Breng de geconcentreerde exosomen over naar een ultracentrifugebuis. Dan, pellet exosomen op 100.000 x g gedurende 80 min bij 4 °C.
- Gooi de supernatant weg en hang de pelletexosomen opnieuw op in 10 mL PBS.
- Centrifuge bij 100.000 x g gedurende 80 minuten bij 4 °C om de exosomenpellet te verzamelen.
- Schort de exosomenpel opnieuw op in 200 μL PBS door op en neer te pipetten.
4. Karakterisering van uit CB-SC afgeleide exosomen
- Kwantificeren van de totale eiwitconcentratie van exosoompreparaat door bicinchoninic acid assay (BCA) kit
- Pipette 10 μL van elk albumin standaard en geïsoleerd exosoom monster bereid in stap 3.10 in een 96-put plaat in duplicaat.
- Voeg 200 μL van het werkende reagens uit de BCA-kit toe aan elke put. Meng de inhoud van de plaat grondig op de plaatshaker gedurende 10 s.
OPMERKING: Werkreagens (WR): 50-delige reagens A met 1-delige reagens B. - Bedek de platen met folie en broed ze 30 minuten bij 37 °C.
- Koel de platen af op kamertemperatuur (RT).
- Meet monsterabsorptie op 562 nm via een plaatlezer.
- Bereiding en kleuring van exosomen voor stroomcytometrie
- Leg exosomen vast door 20 μL anti-menselijke CD63 magnetische kralen (4,5 μm grootte)(Tabel van materialen)toe te voegen aan 25 μg cb-SC-afgeleide exosomen bereid in stap 3.10 in totaal 100 μL volume pbs.
- Incubeer de buis 's nachts (18\u201222 h) bij 4 °C op de shaker bij 800 rpm.
- Centrifugeren de buis op 300 x g voor 30 s om het monster te verzamelen aan de onderkant van de buis.
- Voeg 300 μL isolatiebuffer (0,1% runderserum albumine (BSA) toe in PBS) en meng voorzichtig door pipetting.
OPMERKING: Deze stap wast de kralengebonden exosomen. - Plaats de buis 1 min op een magneetstandaard (Tabel van materialen) en gooi de supernatant weg.
- Herhaal stap 4.2.4\u20124.2.5.
- Schort de kralengebonden exosomen opnieuw op met 400 μL isolatiebuffer.
- Aliquot 100 μL kraalgebonden exosomen aan elke buis.
- Voeg fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (CD9-FITC, CD81-PE en CD63-FITC op respectievelijk 25 μg/mL) toe aan elke stroombuis met CD63-kraal-gevangen exosomen.
OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controles. - Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur met lichtbescherming op de shaker bij 800 rpm.
- Herhaal stap 4.2.4\u20124.2.5.
- Schort de kraalgebonden exosomen opnieuw op in 200 μL isolatiebuffer en breng over op 5 mL-stroombuizen.
- Plaats de buizen in de monstercarrousel van de stroomcytometer.
- Open het protocol voor exosoomtesten.
- Voer het monster automatisch uit met stroomcytometer.
- Exosoom detectie door westerse vlek
OPMERKING: Westerse vlek is een gevestigde methode en we zullen niet ingaan op details van de methode zelf.- Lyse de pellets van CB-SC-afgeleide exosomen van stap 3.10 met 100 μL RIPA buffer, pipet 20x, dan plaats op ijs gedurende 5 min.
- Kwantificeer de eiwitconcentratie exosoom lysaat door BCA kit en laad 25 μg eiwit per put.
- Scheid de eiwitten door gel elektroforese gedurende 40 min bij 150 V.
- Breng het eiwit over op polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met behulp van semi-droge overdrachtsmethode11.
- Blokkeer het membraan met 5% vetvrije melk gedurende 30 minuten.
- Incubeer met 2 μg/mL anti-menselijke Alix (Tabel van materialen) en 1 μg/mL anti-menselijke Calnexin antilichamen ( Tabel vanmaterialen).
- Detecteer het eiwit door chemiluminescentie met een digitaal beeldvormingssysteem.
- Exosoomvalidatie door dynamic light scattering (DLS)
- Verdun 10 μg uit CB-SC-afgeleide exosoommonsters in 1 mL PBS.
- Breng het verdunde monster 1 mL over in wegwerp halfmicro cuvette(Tabel van materialen).
- Plaats de cuvette in het DLS-instrument. Stel de brekingsindex (RI) in als 1,39 voor alle voorbeeldmonitor.
- Voer monsters uit bij 25 °C en verkrijg drie metingen per fractie om een gemiddelde grootteverdeling te krijgen.
- Exosoomvalidatie door transmissieelektronenmicroscopie (TEM)
- Coat formvar op 300 mesh koperen roosters12 (Tabel van materialen).
- Versterk de formvar met de extra laag verdampte koolstof op koperen roosters12.
LET OP: Een dergelijke coatingbenadering is uitstekend geschikt voor monsterondersteuning. - Laad 10 μL exosoommonsters op roosters en laat aan de lucht drogen.
- Negatief vlekken monsters met uranyl acetaat gedurende 5 min.
- Was drie keer met DI-water en laat het drogen aan de lucht.
- Observeer en fotografeer de monsters onder TEM. Stel de acceleraterende spanning in op 200 kV en spotgrootte op 2.
5. Maatregel Meting met het label CB-SC-afgeleide exosomen van de verschillende subpopulaties van PBMC
-
Label CB-SC-afgeleide exosomen met groene fluorescerende lipofiele kleurstof Dio
- Breng 100 μg uit CB-SC-afgeleide exosomen (bereid in stap 3.10) over in een centrifugebuis van 15 mL.
- Verdun het monster met PBS tot 5 mL.
- Voeg groene fluorescerende lipofiele kleurstof Dio (Tabel van materialen) tot de werkconcentratie 5 μM bereikt.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Breng het monster in een ultracentrifugebuis.
- Centrifuge met 100.000 x g gedurende 80 minuten om dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen te pelleteren.
- Schort de gelabelde exosomen opnieuw op in 200 μL PBS.
-
Voorbereiding van menselijke PBMC
- Breng 25 mL menselijke buffycoat(Tabel van materialen)over meer dan 20 mL dichtheidsgradiënt medium (γ = 1.077) over in een 50 mL conische buis.
- Herhaal stap 1.2 tot en met 1.11.
- Breng 1 x 106 PBMC over in een niet-weefselbehandelde hydrofobe 24-putplaat (1 mL/put).
OPMERKING: Een niet-weefsel behandelde plaat werd gebruikt om te voorkomen dat het aanhangen van monocyten.
-
Co-cultuur Dio-gelabelde exosomen met PBMC
- Breng 40 μL Dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen die in stap 5.1.7 zijn bereid, over naar elke PBMC-bevattende put in een 24-putplaat met behulp van een pipet van 200 μL. Voeg hetzelfde volume PBS toe om putten te bedienen.
- Meng door pipetting 10x. Incubeer voor 4 uur.
- Verzamel 200 μL exosoombehandelde PBMC en label met Hoechst 33342 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 100 μL PBS.
- Zet cellen op microscoopdia's.
- Observeer en fotografeer de interactie van door Dio gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen met Hoechst 33342-label PBMC met behulp van een microscoop.
- Breng de resterende cellen van stap 5.3.3 over in een buis van 1,5 mL.
- Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 200 μL PBS.
- Voeg 5 μL Fc-blokker per monster toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg antilichamen (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 en CD56 op 25 μg/mL) toe aan vlek PBMC.
OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controles. - Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met lichtbescherming.
- Voeg 1 mL PBS en centrifuge toe bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
- Schort de cellen opnieuw op met 200 μL PBS. Voeg 5 μL propidium jodide toe.
- Gebruik stroomcytometrie om het niveau van dio-gelabelde exosoomopname in verschillende subpopulatie van PBMC te evalueren.
6. Onderzoek de werking van uit CB-SC afgeleide exosomen op monocyten
- Isolatie menselijke CD14-positieve monocyten
- Breng 3 x 107 menselijke PBMC over in een 15 mL buis.
- Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Plaats de scheidingskolom (Tabel van materialen) in de magneetafscheider ( Tabel vanmaterialen).
- Was scheidingskolommen drie keer met 2 mL koude lopende buffer(Tabel van Materialen).
- Schort de cellen opnieuw op in 300 μL koude PBS. Voeg 60 μL CD14 microbeads toe. Meng goed en broed op ijs gedurende 15 minuten.
- Voeg 6 mL koude PBS toe. Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Stel de pelletvormige cellen opnieuw op in 500 μL koude lopende buffer.
- Breng cellen over naar de scheidingskolom (voorbereid in stap 6.14) en laat ze passeren.
- Was de scheidingskolom drie keer met 2 mL lopende buffer per wasbeurt. Til de kolom van de magneetafscheider en plaats deze in een centrifugebuis van 15 mL.
OPMERKING: De buis van 15 mL moet op ijs worden geplaatst vanwege de hechting van CD14-positieve monocyten aan de buis bij kamertemperatuur. - Breng 2 mL koude lopende buffer naar de bovenkant van de kolom en isoleren van de CD14-positieve cellen in de 15 mL buis.
- Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 min bij 4 °C om de CD14-positieve cellen te pelleteren.
- Schort de cellen opnieuw op met 2 mL koud chemisch gedefinieerd serumvrij medium(Tabel van materialen).
- Breng 50 μL cellen over in een buis van 1,5 mL.
- Vlek met 10 μL krome oranje geconjugeerde anti-menselijke CD14 mAb (Tabel van materialen) gedurende 20 min.
OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controles. - Voeg 1 mL PBS toe aan de cellen. Centrifuge op 300 x g gedurende 10 min tot pelletcellen.
- Stel cellen opnieuw op in 200 μL PBS en breng deze over naar een buis van 5 mL. Bepaal de zuiverheid van CD14-positieve monocyten door flow cytometrie.
- Behandeling van monocyten met uit CB-SC-afgeleide exosomen
- Zaad 1 x 106 gezuiverde monocyten met chemisch gedefinieerd serumvrij kweekmedium (Tabel van materialen) in weefselkweekbehandelde 6-putplaat (2 mL/well).
- Incubeer voor 2 uur bij 37 °C onder 5% CO2.
- Gooi de supernatant met 1 mL pipet weg. Voeg 2 mL van 37 °C voorverwarmd chemisch gedefinieerd serumvrij kweekmedium(Tabel van materialen)voorzichtig toe.
LET OP: Monocyten werden binnen 2 uur aan de plaat gehangen. Drijvende cellen werden geïdentificeerd als dode of andere celverontreinigingen. - Voeg 80 μg CB-SC-afgeleide exosomen geïsoleerd van stap 3.10 tot monocyte culturen in een 6-well plaat met een totaal volume van 2 mL.
OPMERKING: Hetzelfde volume PBS is toegevoegd om putten te bedienen. - Incubeer bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 3\u20124 dagen.
- Fotografeer de celmorfologie met behulp van een omgekeerde microscoop op 200× vergroting (Tabel van materialen).
- Maak cellen los door op en neer te pipetten in 1 mL van een PBS-gebaseerde celdissociatiebuffer met 1 mL pipetpunt.
- Oogst de resterende cellen via een celschraper.
OPMERKING: Aangezien primaire monocyten of gedifferentieerde macrofagen stevig hechten, blijven sommige cellen na de behandeling aan de onderkant kleven met dissociatiebuffer. Daarom worden deze cellen geoogst met een celschraper. - Verzamel cellen op 1.690 x g gedurende 5 minuten. Cellen opnieuw opschorten in 200 μL PBS.
- Voeg 5 μL Fc blocker (25 μg/mL) toe om niet-specifieke binding te blokkeren.
- Voeg antilichamen (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 en CD209 op 25 μg/mL, Tabel van Materialen)toe aan cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controle - Voeg 1 mL PBS toe aan cellen en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en schors opnieuw met 200 μL PBS.
- Voeg 5 μL propidiumjodide per monster (200 μL) toe en breng cellen over naar een nieuwe 5 mL-stroombuis.
- Voer de stroomcytometrie uit en evalueer de niveaus van cd14-, CD80-, CD86-, CD163-, CD206- en CD209-expressies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aanvankelijk werden het fenotype en de zuiverheid van CB-SC onderzocht door stromingscytometrie met CB-SC-geassocieerde markers zoals leukocyten gemeenschappelijk antigeen CD45, ES-celspecifieke transcriptiefactoren OCT3/4 en SOX2. CB-SC tonen hoge niveaus van CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 en galectine 9 expressie, maar geen uitdrukking van CD34 (Figuur 1A). Flow cytometrie analyse bevestigde de expressie van exosoom-specifieke markers, waaronder CD9, CD81, en CD63 waren op CB-SC-afgeleide exosomen (Figuur 1B). Morfologie en grootteverdeling van exosomen werden gekenmerkt door TEM en DLS (figuur 1C, D), met een grootte van 79,38 ± 20,07 nm. Westelijke vlek bewees verder de uitdrukking van exosoom-geassociërde teller Alix, zonder uitdrukking van de ER-bijbehorende teller Calnexin (Figuur 1E).
PBMC werd behandeld met Het dio-gelabelde CB-SC-Exo. De microscopieobservatie toonde de directe interactie aan van de met Dio gelabelde CB-SC-Exo met PBMC (figuur 2A). Om beter te definiëren welke celpopulatie interactie had met de Cb-SC-Exo met dio-label, werden verschillende celcompartimenten afgesloten met celspecifieke markers zoals CD3 voor T-cellen, CD11c voor myeloïde dendritische cellen (DC), CD14 voor monocyten, CD19 voor B-cellen en CD56 voor NK-cellen(figuur 2B). Na een incubatie van 4 uur, flow cytometrie aangetoond dat verschillende bloedcel compartimenten weergegeven op verschillende mediane fluorescentie intensiteit (MFI) van Dio-positieve exosomen (Figuur 2C). Met name vertoonden monocyten een hogere mediane fluorescentieintensiteit van Dio-positieve CB-SC-Exo dan die van andere immuuncellen(figuur 2C),waarbij werd benadrukt dat monocyten voornamelijk het doelwit waren van de uit CB-SC afgeleide exosomen.
Om de directe effecten van cb-sc-afgeleide exosomen op monocyten te onderzoeken, werden de gezuiverde CD14+ monocyten gedurende 3 dagen samen gekweekt met uit CB-SC-afgeleide exosomen. De exosoombehandelde monocyt onderscheidde zich met succes in spindelachtige morfologieën(figuur 3A). Vervolgens werden fenotypes van de behandelde CB-SC-Exo of onbehandelde monocyten getest, waaruit de uitdrukkingen van M2-geassocieerde markers, waaronder CD163, CD206, CD209, aanzienlijk werden verhoogd onder de exosoom behandelde groep(figuur 3B, rood histogram). In vergelijking met de conventionele M2-macrofagen gegenereerd door M-CSF + IL-4, uitgedrukt cb-SC-Exo-behandelde monocyten vergelijkbare niveaus van M2-geassocieerde markers zoals CD163, CD206, CD209, zonder significante verschillen (figuur 3C). Daarom geven de gegevens aan dat monocyten zich onderscheiden in macrofagen met M2-fenotype na de behandeling met CB-SC-afgeleide exosomen.
Figuur 1: Karakterisering van uit CB-SC afgeleide exosomen. (A) Phenotypic karakterisering van CB-SC, hoge expressie van CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 en Galectin-9, geen uitdrukking van CD34. (B) Uitdrukkingen van exosoom-geassocieerde markers (CD63, CD9, CD81) op cb-SC-afgeleide exosomen. Isotype-matched IgGs diende als controles voor flow cytometrie (grijs histogram). (C) Transmission Electron Microscopie (TEM) afbeelding van de CB-SC-afgeleide exosomen. (D) Grootteverdeling van uit CB-SC afgeleide exosomen met behulp van Dynamitic Light Scattering (DLS). (E) Westerse vlekken tonen aan dat uit CB-SC-afgeleide exosomen de exosoomspecifieke marker Alix vertonen, maar negatief voor endoplasmisch reticulum (ER)-geassocieerde marker Calnexin. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Interactie van door CB-SC afgeleide exosomen met verschillende populaties van PBMC. a) De interactie van de met Dio geëtiketteerde CB-SC-Exo (groen) met PBMC (blauw, nucleaire kleuring met Hoechst 33342) werd gefotografeerd met Nikon Eclipse Ti2 microscoop met NIS-Elements software versie 5.11.02, met een hoge vergroting met de verdeling van Dio-gelabelde exosomen (groen) in de PBMC cellen na de co-incubatie voor 4 uur 5% CO2 in de niet-weefsel cultuur behandelde 24-well plaat. n = 2. (B) Gating-strategie voor de analyse van stroomcytometrie met celspecifieke oppervlaktemarkers voor verschillende subpopulaties in PBMC; waaronder CD3 voor T-cellen, CD14 voor monocyten, CD19 voor B-cellen, CD56 voor NK-cellen en CD11c voor DC's. (C) Verschillende mediane fluorescentieintensiteit (MFI) van Dio-gelabeld exosoom weergeven onder verschillende PBMC-subpopulaties (bijvoorbeeld T-cellen, Monocyten, B-cellen, NK-cellen, DC's). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Effecten van uit CB-SC afgeleide exosomen op monocyten. (A) Morfologische verandering van monocyten in de spindel-achtige cellen na behandeling met CB-SC-afgeleide exosomen. (B) Up-geregeld het niveau van M2-associëren markers expressie na de behandeling met CB-SC-afgeleide exosomen, zoals CD163, CD206, en CD209 (rode lijn). Onbehandelde monocyten (groene lijn) dienden als controle. Isotype-matched IgGs diende als negatieve controles (grijze lijn). c) Phenotypic vergelijking tussen conventionele M2 macrofagen en de CB-SC-Exo-geïnduceerde M2 macrofagen. Om de conventionele M2-macrofagen te genereren, werden de gezuiverde CD14+ monocyten behandeld met 50 ng/mL macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) bij 37 °C, 5% CO2-voorwaarden gedurende 7 dagen, gevolgd door de nachtelijke behandeling met 10 ng/mL IL-4. M2-gekoppelde markeringen, waaronder CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 en CD209 werden geëvalueerd door flow cytometrie. Isotype-matched immunoglobuline G (IgG) dienen als controle. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD; N = 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toepassing van exosomen is een opkomend gebied voor klinische diagnose, medicijnontwikkelingen en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met betrekking tot de voorbereiding van cb-SC-afgeleide exosomen en de functionele studie van exosomen over de differentiatie van menselijke monocyten. Het huidige protocol toonde aan dat functionele CB-SC-afgeleide exosomen worden geïsoleerd door sequentiële centrifugatie en ultracentrifugatie met een hoge zuiverheid en het vertonen van de immuunmodulatie op monocyten.
In vergelijking met andere conventionele protocollen is ultrafiltratie een vaste benadering voor de isolatie en zuivering van exosomen uit verschillende cellen of media, gebaseerd op het molecuulgewicht en de uitsluitingsgroottes die verschillen van andere extracellulaire vesicles (EV's). Hoewel ultrafiltratie-isolatie meer tijdbesparend is dan de scheiding op basis van ultracentrifugatie, kan het structurele schade aan agelsjes bij grote afmetingen veroorzaken. Exosomen kunnen ook worden verzameld door polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde neerslag tegen lage kosten, hoewel deze methode de exosoomzuiverheid als gevolg van de eiwitverontreinigingen13,14riskeert . Daarom was het huidige protocol kosteneffectief om exosomen te produceren bij hoge zuiverheid. Op basis van de immuunmodulaties van CB-SC-afgeleide exosomen10, kan karakterisering van CB-SC-afgeleide exosomen een waardevolle biomarker bieden om de potentie van Stem Cell Educator met CB-SC te evalueren vóór klinische toepassingen.
Macrofagen zijn professionele antigeen-presenterende cellen tegen virale en bacteriële infecties, met gevarieerde biologische functies en heterogeneïgenes. Op basis van hun verschillen in oppervlaktemarkers en immuunfunctie worden macrofagen gecategoriseerd met twee subpopulaties: type 1 macrofagen (M1, conventionele macrofagen die ontsteking veroorzaken) en type 2 macrofagen (M2, met ontstekingsremmende ontsteking)15. Deze studie stelde vast dat gezuiverde menselijke monocyten werden gedifferentieerd in type 2 macrofagen na de behandeling met CB-SC-afgeleide exosomen, met een anti-ontsteking fenotype10. Uit CB-SC-afgeleide exosoombehandelde monocyten vertoonden de langwerpige morfologie en drukten de M2-geassocieerde oppervlaktemarkeringen (bijvoorbeeld CD163, CD206 en CD209) uit, met hetzelfde fenotype als de conventionele M2-macrofagen die werden gegenereerd met cytokines M-CSF + IL-4. Dergelijke fenotypische veranderingen van monocyten benadrukken het nieuwe mechanisme dat ten grondslag ligt aan de immuunmodulatie van CB-SC voor de behandeling van diabetes type 1 en andere auto-immuunziekten. Tijdens de SCE-therapie werden de immuuncellen van patiënten ongeveer 8\u20129 uur samen met CB-SC gekweekt. De met SCE behandelde monocyten droegen de cb-SC-afgeleide exosomen terug in het lichaam, wat bijdroeg aan de M2-differentiatie en de uitbreiding van de inductie van immuuntolerantie, wat leidde tot de verbetering van de klinische resultaten na de behandeling met SCE-therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Zhao is een oprichter van Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc Dr Zhao is een uitvinder van Stem Cell Educator technologie. Alle andere auteurs hebben geen financiële belangen die relevant kunnen zijn voor het ingediende werk.
Acknowledgments
We zijn de heer Poddar en de heer Ludwig dankbaar voor de genereuze financiering via Hackensack UMC Foundation. We waarderen Laura Zhao voor Engelse montage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
