Summary
Exosome ansökan är ett framväxande verktyg för läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Vi upprättar en exosome isolering protokoll med hög renhet att isolera exosomer från nya identifierade stamceller som kallas CB-SC för mekanistiska studier. Vi även coculture CB-SC-härledda exosomer med mänskliga monocyter, vilket leder till deras differentiering till fenotypiskt distinkta makrofager.
Abstract
Stem Cell Educator (SCE) terapi är en ny klinisk metod för behandling av typ 1 diabetes och andra autoimmuna sjukdomar. SCE terapi cirkulerar den isolerade patientens blod mononukleära celler (t.ex., lymfocyter och monocyter) genom en aferes maskin, co-kulturer patientens blod mononukleära celler med anhängare navelsträng blod-derived stamceller (CB-SC) i SCE-enheten, och sedan returnerar dessa "utbildade" immunceller till patientens blod. Exosomer är nano-sized extracellulära vesiklar mellan 30\u2012150 nm existerande i alla biofluid och cell kultur media. För att ytterligare utforska molekylära mekanismer som ligger bakom SCE terapi och bestämma åtgärder av exosomer som frigörs från CB-SC, undersöker vi vilka celler som fagocytize dessa exosomer under behandlingen med CB-SC. Genom co-odling Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer med humant perifert blod mononukleära celler (PBMC), fann vi att CB-SC-härledda exosomer togs främst upp av mänskliga CD14-positiva monocyter, vilket leder till differentiering av monocyter i typ 2 makrofager (M2), med spindel-liknande morfologi och uttryck för M2-associerade ytan molekylära markörer. Här presenterar vi ett protokoll för isolering och karakterisering av CB-SC-härledda exosomer och protokollet för samkultur av CB-SC-härledda exosomer med mänskliga monocyter och övervakningen av M2 differentiering.
Introduction
Stamceller från navelsträngsblod (CB-SC) är unika typer av stamceller som identifieras från navelsträngsblod och särskiljs från andra kända typer av stamceller såsom mesenkymala stamceller (MSC) och hematopoitiska stamceller (HSC)1. Baserat på deras unika egenskaper immunmodulering och deras förmåga att tätt hålla sig till ytan av Petri rätter, utvecklade vi en ny teknik som utsetts till Stem Cell Educator (SCE) terapi i kliniska prövningar2,3. Under SCE terapi, en patients perifert blod mononuclear celler (PBMC) samlas in och cirkuleras genom en cell separator och co-odlade med anhängare CB-SC in vitro. Dessa "utbildade" celler (CB-SC-behandlade PBMC) sedan återförs till patientens cirkulation i en sluten loop system. Kliniska prövningar har redan visat den kliniska säkerheten och effekten av SCE-behandling för behandling av autoimmuna sjukdomar inklusive typ 1-diabetes (T1D)2,4 och alopecia areata (AA)5.
Exosomer är en familj av nanopartiklar med diametrar som sträcker sig 30\u2012150 nm och finns i alla biofluid och cellkultur media6. Exosomer är berikade med många bioaktiva molekyler inklusive lipider, mRNAs, proteiner och microRNAs (miRNA), och spelar en viktig roll i cell-till-cell kommunikation. På senare tid har exosomer blivit mer attraktiva för forskare och läkemedelsföretag på grund av deras terapeutiska potentialer ikliniker 7,8,9. Nyligen visade våra mekanistiska studier att CB-SC-släppt exosomer bidra till immun modulering av SCE terapi10.
Här beskriver vi protokollet för att utforska mekanismen för SCE terapi inriktning monocyter av CB-SC-släppt exosomer. Först var CB-SC-frisläppt exosomer isolerade från CB-SC-härledda betingade medier med hjälp av metoder ultracentrifugation och valideras av flödescytometri, västra blot (WB) och dynamiska ljusspridning (DLS). Andra, CB-SC-härledda exosomer var märkta med en grön fluorescerande lipophilic färgämne: Dio. För det tredje var de co-odlade med PBMC att undersöka de positiva procentsatserna av Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer på de olika subpopulationer av PBMC genom flöde cytometri. Detta protokoll ger vägledning för att studera verkan av exosomer som ligger bakom immunmoduleringen av stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna från institutionella mänskliga forskningsetiska kommitté vid Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Mänskliga buffy coat blod enheter köptes från New York Blood Center (New York, NY). Mänskliga navelsträngsblod enheter samlades in från friska givare och köptes från Cryo-Cell International blodbank (Oldsmar, FL). Både New York Blood Center och Cryo-Cell har fått alla ackrediteringar för blodsamlingar och distributioner, med IRB-godkännande och undertecknat Consent Forms från givare.
1. Cellodling och beredning av CB-SC-härlett konditionerat medium
- Överför 25 mL navelsträngsblod (Tabell över material) över 20 mL av densitetsgradientmedium (γ = 1,077) till ett 50 mL koniskt rör.
- Centrifugera vid 1 690 x g i 20 min vid 20 °C i en svängig-skopans rotor utan broms.
- Överför försiktigt det mononukleära cellskiktet (buffy coat) till ett nytt koniskt rör på 50 mL. Fyll det koniska röret med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till 40 mL. Blanda och centrifug till pelletsceller vid 751 x g i 10 min vid 20 °C.
- Kassera supernatanten och tillsätt 15 mL ACK lysbuffert (Table of Materials) till cellpelleten. Åter upphäva celler genom pipettering. Sedan inkubera i 10 min i rumstemperatur.
OBS: Detta steg tar bort de röda blodkropparna. - Fyll koniska röret med 25 mL PBS. Centrifugera vid 751 x g i 5 min och kassera supernatant för att erhålla pelleterade mononukleära celler.
- Tvätta 2x med 40 mL PBS för att avlägsna den återstående lysbufferten.
- Centrifug vid 751 x g i 5 min för att pelleta cellerna.
- Kassera de supernatant och åter suspendera sladdblod mononukleära celler med 10 mL av kemiskt definierade serumfria medium (Tabell of Materials) per rör.
- Kombinera navelsträngsblod mononukleära celler till ett rör.
- Ta 20 μL cellsupphängning och blanda med 20 μL av 0,4% trypan blå lösning (Tabell of Materials) i ett 1,5 mL rör.
- Ladda in i kammaren glida och kvantifiera cellen antalet och cellen livskraft med en automatiserad cellräknare.
OBS: Cell suspension späds vid 1:10 om cellkoncentrationen är över 1 x 107 celler/mL. - Frömonnukleära celler i 150 mm x 15 mm Petriskålar vid 1 x 106 celler/mL, 25 mL/maträtt i kemiskt definierat serumfritt cellodlingsmedium.
- Inkubera vid 37 °C under 8 % CO2-villkor under 10\u201214 dagar tills CB-SC når mer än 80 % sammanflödet.
- Kassera supernatanten och tvätta med 15 mL PBS per petriskål; sedan, ta bort PBS.
OBS: CB-SC är fästa på Petri rätter tätt. - Upprepa steg 1,14 två gånger.
- Tillsätt 25 mL av kemiskt definierat serum fritt medium per Petri-rätt.
- Inkubera vid 37 °C under 8 % CO2-villkor under 3\u20124 dagar.
- Samla in det CB-SC-härledda konditionerade mediet i 50 mL koniska rör.
2. Karakterisering av CB-SC
- Lösgör CB-SC genom pipettering av 10 mL PBS-baserad cellsuppdelningsbuffert uppåt och nedåt med en 5 mL pipettspets (Tabell of Materials).
- Centrifugera vid 1 690 x g i 5 min till pelletsceller och återstänger i 200 μL PBS.
- Fixera och permeabilisera celler för intracellulär färgning via färgningsberedningssats (Table of Materials).
- Tillsätt 5 μL av Fc blocker (Table of Materials) per prov och inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
OBS: FC-blockerare hämmar ospecifik bindning vid färgning med antikroppar. - Tillsätt fluorescens-konjugerad mus anti-mänskliga monoklonala antikroppar inklusive CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270, och Galectin 9 vid 25 μg/mL (Tabell över material) till 100 μL volym av celler. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur med ljusskydd.
- Efter färgning, tvätta celler med 1 mL PBS och centrifug vid 751 x g för 10 min till pelletceller.
- Åter suspendera celler med 200 μL PBS och överför till ett 5 mL-rör.
- Utför flödescytometri för att validera uttrycket av CB-SC-associerade ovanför specifika markörer.
3. Isolering av CB-SC-härledda exosomer
- Centrifugera det konditionerade mediumet som samlats från steg 1.18 vid 300 x g i 10 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt 50 mL koniskt rör.
- Centrifugera supernatanten som samlats från steg 3.1 vid 2 000 x g i 20 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt 50 mL koniskt rör.
- Centrifugera supernatanten som samlats från steg 3.2 vid 10 000 x g i 30 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt 50 mL koniskt rör.
OBS: Den fasta vinkelrotorn används så att cellpelletsen fälls ut mot rörets sida. Markera sidan av locket och rita en cirkel på sidan av röret där pelleten förväntas. - Filtrera supernatanter som samlats in från steg 3.3 med ett 0,22 μm filter (Table of Materials).
- Överför 15 mL media till varje 10 kDa centrifugalfilterenhet (Table of Materials).
- Centrifug vid 4 000 x g i 30 min för att isolera det koncentrerade exosomermediet.
- Överför de koncentrerade exosomerna till ett ultracentrifugrör. Sedan, pellet exosomer vid 100.000 x g för 80 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och åter upphäva pelletexosomerna i 10 mL PBS.
- Centrifugera vid 100 000 x g i 80 min vid 4 °C för att samla in exosomer pelleten.
- Återuppstäng exosompelletsen i 200 μL PBS genom pipettering upp och ner.
4. Karakterisering av CB-SC-härledda exosomer
- Kvantifierande total proteinkoncentration av exosompreparat genom bicinchoninsyraanalys (BCA) kit
- Pipett 10 μL av varje albumin-standard och isolerat exosomeprov som beretts i steg 3.10 till en 96-brunnsplatta i två exemplar.
- Tillsätt 200 μL av arbetsreagensen från BCA-satsen till varje brunn. Blanda innehållet i plattan noggrant på plattans shaker i 10 s.
OBS: Arbetsreagens (WR): 50-dels reagens A med 1-dels reagens B. - Täck plattorna med folie och inkubera dem vid 37 °C i 30 min.
- Kyl plattorna till rumstemperatur (RT).
- Mät provabsorbans vid 562 nm via en tallriksläsare.
- Beredning och färgning av exosomer för flödescytometri
- Fånga exosomer genom att tillsätta 20 μL anti-mänskliga CD63-magnetiska pärlor (4,5 μm storlek) (Tabell över material) i 25 μg CB-SC-härledda exosomer som beretts i steg 3.10 totalt 100 μL volym PBS.
- Inkubera röret över natten (18\u201222 h) vid 4 °C på skakmaskinen vid 800 varv/min.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 30 s för att samla provet i botten av röret.
- Tillsätt 300 μL isoleringsbuffert (0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS) och blanda försiktigt genom pipettering.
OBS: Detta steg tvättar pärlbundna exosomer. - Placera röret på ett magnetställ i 1 min (Table of Materials) och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 4.2.4\u20124.2.5.
- Åter upphäva pärla-bundna exosomer med 400 μL isolering buffert.
- Alikvot 100 μL av pärlbundna exosomer till varje rör.
- Tillsätt fluorescens-konjugerade antikroppar (CD9-FITC, CD81-PE, och CD63-FITC vid 25 μg/mL, respektive) till varje flödesrör med CD63-pärlfångade exosomer.
OBS: Isotype-matchade IgGs fungerar som negativa kontroller. - Inkubera i 45 min i rumstemperatur med ljusskydd på skakmaskinen vid 800 varv/min.
- Upprepa steg 4.2.4\u20124.2.5.
- Åter upphäva pärla-bundna exosomer i 200 μL av isolering buffert och överföring till 5 mL flödesrör.
- Placera rören i provkarusellen av flödescytometern.
- Öppna protokollet för exosomtestning.
- Kör provet automatiskt efter flödescytometer.
- Exosom upptäckt av västra blot
OBS: Western blot är en väletablerad metod och vi kommer inte att gå in på detaljer om själva metoden.- Lysa pellets av CB-SC-härledda exosomer från steg 3,10 med 100 μL AV RIPA buffert, pipetter 20x, sedan placera på is i 5 min.
- Kvantifiera proteinkoncentrationen av exosome lysate genom BCA-sats och ladda 25 μg protein per brunn.
- Separera proteinerna genom gelelektrofores i 40 min vid 150 V.
- Överför proteinet till polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) med halvtorka överföringsmetod11.
- Blockera membranet med 5% fettfri mjölk i 30 min.
- Inkubera med 2 μg/mL anti-human Alix (Tabell över material) och 1 μg/mL anti-humana Calnexin-antikroppar ( Tabell ofMaterials).
- Detektera proteinet genom chemiluminescence med ett digitalt bildsystem.
- Exosomvalidering genom dynamisk ljusspridning (DLS)
- Späd 10 μg CB-SC-härledda exosomprover i 1 mL pbs.
- Överför 1 mL av utspädd prov till engångs-halv-mikro-cuvette( Tabell över material).
- Placera cuvette i DLS instrumentet. Ange brytningsindex (RI) som 1,39 för alla exempelmonitorn.
- Kör prover vid 25 °C och förvärva tre mätningar per fraktion för att få en genomsnittlig storleksfördelning.
- Exosomvalidering genom transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Coat formvar på 300 nät koppar galler12 (Tabell över material).
- Stärka formvar med det extra skiktet av avdunstat kol på koppargaller12.
OBS: En sådan beläggningsstrategi är utmärkt för provstöd. - Lasta 10 μL exosomprover på galler och låt lufttorka.
- Fläckprover negativt med uranylacetat i 5 min.
- Tvätta tre gånger med DI vatten och låt lufttorka.
- Observera och fotografera proverna under TEM. Ställ in accelererande spänning på 200 kV och spotstorlek på 2.
5. Åtgärd Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer upp som tagits av olika subpopulationer av PBMC
-
Etikett CB-SC-härledda exosomer med grönt fluorescerande lipofila färgämne Dio
- Överför 100 μg CB-SC-härledda exosomer (beredda i steg 3.10) till ett centrifugrör på 15 mL.
- Späd prov med PBS till 5 mL.
- Tillsätt grönt fluorescerande lipofila färgämne Dio (Table of Materials) tills arbetskoncentrationen når 5 μM.
- Inkubera i 15 min vid rumstemperatur skyddad från ljus.
- Överför provet till ett ultracentrifugrör.
- Centrifugera vid 100 000 x g i 80 min till pellet Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer.
- Åter upphäva de märkta exosomerna i 200 μL pbs.
-
Förberedelse av mänskliga PBMC
- Överför 25 mL av human buffy coat (Table of Materials) över 20 mL av densitetsgradientmedium (γ = 1,077) till ett 50 mL koniskt rör.
- Upprepa steg 1.2 till 1.11.
- Överför 1 x 106 PBMC till en icke-vävnadsbehandlad hydrofoba 24-brunnsplatta (1 mL/brunn).
OBS: En icke-vävnadsbehandlad platta användes för att undvika att monocyter skulle följas.
-
Samkultur Dio-märkta exosomer med PBMC
- Överför 40 μL Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer som beretts i steg 5.1.7 till varje PBMC-innehållande brunn i en 24-brunnsplatta med hjälp av en 200 μL-pipett. Lägg till samma volym PBS för att kontrollera brunnar.
- Blanda genom pipettering 10x. Inkubera i 4 h.
- Samla 200 μL exosombehandlad PBMC och märk med Hoechst 33342 i 10 min i rumstemperatur.
- Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och åter uppstäng cellpelleten i 100 μL PBS.
- Montera celler på mikroskopglas.
- Observera och fotografera interaktionen mellan Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer med Hoechst 33342-märkt PBMC med hjälp av mikroskop.
- Överför de återstående cellerna från steg 5.3.3 till ett 1,5 mL-rör.
- Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och åter upphäva cellpelleten i 200 μL PBS.
- Tillsätt 5 μL fc-blockerare per prov. Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Lägg till antikroppar (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 och CD56 vid 25 μg/mL) (Table of Materials) för att fläcka av PBMC.
OBS: Isotype-matchade IgGs fungerar som negativa kontroller. - Inkubera i 30 min vid rumstemperatur med ljusskydd.
- Tillsätt 1 mL PBS och centrifug vid 300 x g i 10 min vid 4 °C för att pelleta cellerna.
- Åter upphäva cellerna med 200 μL PBS. Tillsätt 5 μL propidium-iodid.
- Använd flödescytometri för att utvärdera nivån av Dio-märkt exosomupptag i olika subpopulation av PBMC.
6. Undersök verkan av CB-SC-härledda exosomer på monocyter
- Isolering mänskliga CD14-positiva monocyter
- Överför 3 x 107 human PBMC till ett 15 mL-rör.
- Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
- Placera separationskolumnen (Tabell över material) i magnetavskiljaren ( Table ofMaterials).
- Tvätta separationskolumner tre gånger med 2 mL kall rinnande buffert (Table of Materials).
- Åter suspendera cellerna i 300 μL kallt PBS. Tillsätt 60 μL CD14 mikropärlor. Blanda väl och inkubera på is i 15 min.
- Tillsätt 6 mL kall PBS. Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
- Åter upphäva pelleterade cellerna i 500 μL kall rinnande buffert.
- Överför celler till separationskolumnen (förberedd i steg 6.14) och låt dem passera.
- Tvätta separationspelaren tre gånger med 2 mL löpbuffert per tvätt. Lyft upp kolonnen från magnetavskiljaren och lägg den i ett 15 mL-centrifugrör.
OBS: 15 mL-röret ska placeras på is på grund av vidhäftning av CD14-positiva monocyter till röret vid rumstemperatur. - Överför 2 mL kall rinnande buffert till kolonnens överkant och isolera DE CD14-positiva cellerna i 15 mL-röret.
- Centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C för att pelleta DE CD14-positiva cellerna.
- Re-suspend cellerna med 2 mL av kall kemisk-definierade serum fria medium (Tabell of Materials).
- Överför 50 μL celler till ett 1,5 mL-rör.
- Fläck med 10 μL av Krome Orange-konjugerad anti-human CD14 mAb (Tabell of Materials) för 20 min.
OBS: Isotype-matchade IgGs fungerar som negativa kontroller. - Lägg till 1 mL PBS till cellerna. Centrifugera vid 300 x g i 10 min till pelletsceller.
- Åter suspendera celler i 200 μL PBS och överför den till ett 5 mL-rör. Bestäm renheten hos CD14-positiva monocyter genom flödescytometri.
- Behandling av monocyter med CB-SC-härledda exosomer
- Frö 1 x 106 renade monocyter med kemiskt definierat serumfritt odlingsmedium (Table of Materials) i vävnadskulturbehandlad 6-brunnsplatta (2 mL/brunn).
- Inkubera i 2 h vid 37 °C under 5 % CO2.
- Kassera supernatanten med 1 mL-pipett. Tillsätt 2 mL på 37 °C förvrevt kemiskt definierat serumfrittodlingsmedium( Tabell över material ) försiktigt.
OBS: Monocyter var vidhäftade med plattan inom 2 h. Flytande celler identifierades som döda eller andra cell kontaminationer. - Tillsätt 80 μg CB-SC-härledda exosomer isolerade från steg 3.10 till monocytekulturer i en 6-brunnsplatta med total volym på 2 mL.
OBS: Samma volym PBS lades till kontroll brunnar. - Inkubera vid 37 °C under 5 % CO2 i 3\u20124 dagar.
- Fotografera cellmorfologin med hjälp av ett inverterat mikroskop i 200× förstoring (Table of Materials).
- Lossa celler genom pipettering upp och ner i 1 mL av en PBS-baserad cell dissociation buffert med 1 mL pipett spets.
- Skörda de återstående bifogade cellerna via en cellskrapa.
OBS: Eftersom primära monocyter eller differentierade makrofager fäster tätt, förblir vissa celler fastsatte sig i botten efter behandlingen med dissociationsbuffert. Därför skördas dessa celler med en cellskrapa. - Samla celler på 1,690 x g i 5 min. Åter suspendera celler i 200 μL PBS.
- Tillsätt 5 μL fc-blockerare (25 μg/mL) för att blockera icke-specifik bindning.
- Lägg till antikroppar (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 och CD209 vid 25 μg/mL, Tabell of Materials) till celler. Inkubera i 30 min i rumstemperatur.
OBS: Isotype-matchade IgGs fungera som negativ kontroll - Tillsätt 1 mL PBS till celler och centrifug vid 300 x g i 10 min. Kassera supernatanten och dra in igen med 200 μL PBS.
- Tillsätt 5 μL propidium-iodid per prov (200 μL) och överför celler till ett nytt 5 mL-flödesrör.
- Utför flödescytometrin och utvärdera nivåerna av CD14-, CD80-, CD86-, CD163-, CD206- och CD209-uttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inledningsvis var fenotyp och renhet av CB-SC undersöktes av flöde cytometri med CB-SC-associerade markörer såsom leukocyte gemensamma antigen CD45, ES cell-specifika transkriptionsfaktorer OCT3/4 och SOX2. CB-SC-visning av höga halter av CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 och galectin 9-uttryck, men inget uttryck för CD34 (Bild 1A). Flödescytometrianalys bekräftade uttrycket av exosome-specifika markörer inklusive CD9, CD81, och CD63 var på CB-SC-härledda exosomer (Figur 1B). Morfologi och storlek fördelning av exosomer kännetecknades av TEM och DLS (Figur 1C,D), med storleken på 79,38 ± 20,07 nm. Western blot bevisade vidare uttrycket av exosome-associerade markör Alix, utan uttryck för ER-associerade markörEn Calnexin (Figur 1E).
PBMC behandlades med Dio-märkt CB-SC-Exo. Mikroskopobservationen visade den direkta interaktionen mellan Dio-märkt CB-SC-Exo med PBMC (figur 2A). För att bättre definiera vilken cellpopulation som samverkade med de Dio-märkta CB-SC-Exo, var olika cellfack gated med cellspecifika markörer som CD3 för T-celler, CD11c för myeloisk dendritiska celler (DC), CD14 för monocyter, CD19 för B-celler och CD56 för NK-celler (Bild 2B). Efter en inkubation för 4 timmar visade flödescytometri att olika delar av blodceller som visas vid olika medianfluorescensintensitet (MFI) av Diopositiva exosomer (figur 2C). Noterbart, monocyter uppvisade högre median fluorescens intensitet av Dio-positiva CB-SC-Exo än de andra immunceller (Figur 2C), belyser att monocyter var främst riktade av CB-SC-härledda exosomes.
För att utforska de direkta effekterna av CB-SC-härledda exosomer på monocyter, var de renade CD14+ monocyterna co-odlade med CB-SC-härledda exosomer i 3 dagar. Den exosomebehandlade monocyten differentierade framgångsrikt till spindelliknande morfologier (Figur 3A). Därefter fenotyper av CB-SC-Exo behandlade eller obehandlade monocyter testades, avslöjar uttrycken av M2-associerade markörer inklusive CD163, CD206, CD209 var markant ökat bland den exosome-behandlade gruppen (Figur 3B, röd histogram). Jämföra med de konventionella M2-makrofager som genereras av M-CSF + IL-4, UTTRYCKTE CB-SC-Exo-behandlade monocyter liknande nivåer av M2-associerade markörer som CD163, CD206, CD209, utan några signifikanta skillnader (Figur 3C). Därför visar uppgifterna att monocyter differentiera till makrofager med M2 fenotyp efter behandlingen med CB-SC-härledda exosomer.
Bild 1: Karakterisering av CB-SC-härledda exosomer. (A) Fenotypisk karakterisering av CB-SC, högt uttryck av CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 och Galectin-9, inget uttryck för CD34. (B) Uttryck för exosom-associerade markörer (CD63, CD9, CD81) på CB-SC-härledda exosomer. Isotype-matchade IgGs tjänade som kontroller för flödescytometri (grått histogram). (C) TEM-avbildning (Transmission Electron Microscopy) av de CB-SC-härledda exosomerna. (D) Storleksfördelning av CB-SC-härledda exosomer med hjälp av Dynamitisk ljusspridning (DLS). (E) Western blots visar att CB-SC-härledda exosomer visar exosome-specifika markören Alix, men negativ för endoplasmatiska reticulum (ER)-associerade markör Calnexin. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Interaktion mellan CB-SC-härledda exosomer med olika populationer av PBMC. (A) Samspelet mellan Dio-märkt CB-SC-Exo (grön) med PBMC (blå, kärnfärgning med Hoechst 33342) fotograferades med Nikon Eclipse Ti2 mikroskop med NIS-Elements programversion 5.11.02, med en hög förstoring som visar fördelningen av Dio-märkta exosomer (grön) i PBMC-cellerna efter co-inkubationen för 4 h 5% CO2 i den icke-vävnadskulturbehandlade 24-brunnsplattan. n = 2. (B) Gating strategi för flödescytometrianalys med cellspecifika ytmarkörer för olika subpopulationer i PBMC, inklusive CD3 för T-celler, CD14 för monocyter, CD19 för B-celler, CD56 för NK-celler och CD11c för DCs. (C) Visa olika medianfluorescensintensitet (MFI) av Dio-märkt exosome bland olika PBMC-subpopulationer (t.ex., T-celler, monocyter, B-celler, NK-celler, DCs). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Effekter av CB-SC-härledda exosomer på monocyter. (A) Morfologisk förändring av monocyter till de spindelliknande cellerna efter behandling med CB-SC-härledda exosomer. (B) Upp-reglerad nivån på M2-associerade markörer uttryck efter behandlingen med CB-SC-härledda exosomer, såsom CD163, CD206, och CD209 (röd linje). Obehandlade monocyter (grön linje) fungerade som kontroll. Isotype-matchade IgGs fungerade som negativa kontroller (grå linje). (C) Fenotypisk jämförelse mellan konventionella M2-makrofager och de CB-SC-Exo-inducerade M2-makrofager. För att generera de konventionella M2 makrofager, de renade CD14+ monocyterna behandlades med 50 ng/mL macrophage koloni-stimulerande faktor (M-CSF) vid 37 °C, 5% CO2 villkor för 7 dagar, och följt av den natten behandling med 10 ng/mL IL-4. M2-associerade markörer inklusive CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 och CD209 utvärderades av flödescytometri. Isotyp-matchade immunglobulin G (IgG) fungera som kontroll. Uppgifterna presenteras som medelvärde för ± SD; N = 3. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillämpning av exosomer är ett framväxande fält för klinisk diagnos, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Här presenterar vi ett utförligt protokoll angående beredning av CB-SC-härledda exosomer och den funktionella studie av exosomer på differentiering av mänskliga monocyter. Det nuvarande protokollet visat att funktionella CB-SC-härledda exosomer är isolerade genom sekventiell centrifugering och ultracentrifugeringen med hög renhet och uppvisar immunmoduleringen på monocyter.
Jämfört med andra konventionella protokoll är ultrafiltrering en etablerad metod för isolering och rening av exosomer från olika celler eller medier, baserat på de molekylvikt och uteslutningsstorlekar som skiljer sig från andra extracellulära vesiklar (EVs). Medan ultrafiltrering isolering är mer tidsbesparande än den ultracentrifugering-baserade separation, Det kan orsaka strukturella skador på vesiklar vid stora storlekar. Exosomer kan också samlas in genom polyetylenglykol (PEG)-medierad nederbörd till låg kostnad, även om denna metod riskerar exosomen renhet på grund av proteinföroreningar13,14. Därför var det nuvarande protokollet kostnadseffektivt att producera exosomer vid hög renhet. Baserat på immun modulationer av CB-SC-härledda exosomer10,karakterisering av CB-SC-härledda exosomer kan erbjuda en värdefull biomarkör för att utvärdera styrkan av Stem Cell Educator med CB-SC innan kliniska tillämpningar.
Makrofager är professionella antigen-presenterande celler mot virus- och bakterieinfektioner, med varierande biologiska funktioner och heterogeniteter. Baserat på deras skillnader i ytmarkörer och immunfunktion kategoriseras makrofager med två subpopulationer: typ 1 makrofager (M1, konventionella makrofager som orsakar inflammation) och typ 2 makrofager (M2, som uppvisar anti-inflammation)15. Denna studie fastställde att renade humanmonocyter differentierades till makrofager av typ 2 efter behandlingen med CB-SC-härledda exosomer, som uppvisade en anti-inflammation fenotyp10. CB-SC-härledda exosombehandlade monocyter uppvisade den avlånga morfologin och uttryckte de M2-associerade ytmarkörerna (t.ex., CD163, CD206 och CD209), med den liknande fenotypen som de konventionella M2-makrofager som genereras med hjälp av cytokiner M-CSF + IL-4. Sådana fenotypiska förändringar av monocyter belysa den nya mekanismen bakom immunmodulering av CB-SC för behandling av typ 1 diabetes och andra autoimmuna sjukdomar. Under SCE terapin, patienternas immunceller var co-odlade med CB-SC för runt 8\u20129 h. De SCE-behandlade monocyterna bar tillbaka de CB-SC-härledda exosomerna in i kroppen, vilket bidrog till M2-differentieringen och expansionen av induktion av immuntolerans, vilket ledde till förbättring av kliniska resultat efter behandlingen med SCE-terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Zhao är en av grundarna av Tianhe Stem Cell Bioteknik Inc. Dr Zhao är en uppfinnare av Stem Cell Educator teknik. Alla andra författare har inga ekonomiska intressen som kan vara relevanta för det inlämnade verket.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Mr Poddar och Mr Ludwig för generöst stöd via Hackensack UMC Foundation. Vi uppskattar Laura Zhao för engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
