Summary
Ekzozom uygulaması ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp için ortaya çıkan bir araçtır. Mekanistik çalışmalar için CB-SC adı verilen yeni tanımlanmış kök hücrelerden ekzozomları izole etmek için yüksek saflıkta bir ekzozom izolasyon protokolü uyguluyoruz. Ayrıca insan monositleri ile CB-SC kaynaklı ekzozomlar, fenotipik farklı makrofajlar içine farklılaşmayol eşkültür.
Abstract
Kök Hücre Eğitimcisi (SCE) tedavisi tip 1 diyabet ve diğer otoimmün hastalıkların tedavisinde yeni bir klinik yaklaşımdır. SCE tedavisi izole hastanın kan mononükleer hücreleri (örneğin, lenfositler ve monositler) bir aferez makinesi aracılığıyla dolaşır, eş-kültürler hastanın kan mononükleer hücreleri yapışık kordon kanı kaynaklı kök hücreleri ile (CB-SC) SCE cihaz, ve daha sonra hastanın kan bu "eğitimli" bağışıklık hücreleri döndürür. Ekzozomlar tüm biyosıvı ve hücre kültürü ortamlarında bulunan 30\u2012150 nm arasında nano boyutlu ekstrasellüler veziküllerdir. SCE tedavisinin altında yatan moleküler mekanizmaları daha fazla araştırmak ve CB-SC'den salınan ekzozomların hareketlerini belirlemek için, CB-SC ile tedavi sırasında hangi hücrelerin bu ekzozomları fagositize olduğunu araştırıyoruz. Dio-SC kaynaklı ekzozomları insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile birlikte örerek, CB-SC türetilmiş ekzozomların ağırlıklı olarak insan CD14-pozitif monositler tarafından alındığını ve monositlerin tip 2 makrofajlara (M2) farklılaşmasına yol açarak, mil benzeri morfolojisi ve M2 ile ilişkili yüzey lerinin ifadesinin alındığını bulduk. Burada CB-SC kaynaklı ekzozomların izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol ve CB-SC kaynaklı ekzozomların insan monositleri ile birlikte kültürü ve M2 farklılaşmasının izlenmesi için protokol saklı yız.
Introduction
Kordon kanı kök hücreleri (CB-SC) insan kordon kanı ndan tanımlanan kök hücrelerin benzersiz türüdür ve mezenkimal kök hücreler (MSC) ve hematopoetik kök hücreler (HSC)1gibi kök hücrelerin diğer bilinen tiplerinden ayırt edilir. Bağışıklık modülasyonu ve sıkıca Petri yemekleri yüzeyine uymak için yeteneklerini kendi benzersiz özellikleri dayanarak, biz klinik çalışmalarda Kök Hücre Eğitimci (SCE) tedavisi olarak belirlenen yeni bir teknoloji geliştirdi2,3. SCE tedavisi sırasında hastanın periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) toplanır ve bir hücre ayırıcısı aracılığıyla dolaşıma sokularak yapışık CB-SC in vitro ile birlikte kültürlenir. Bu "eğitimli" hücreler (CB-SC-tedavi PBMC) daha sonra kapalı döngü sistemi içinde hastanın dolaşımına döndürülür. Klinik çalışmalar zaten tip 1 diyabet (T1D)2,4 ve alopesi areata (AA)5dahil olmak üzere otoimmün hastalıkların tedavisi için SCE tedavisinin klinik güvenlik ve etkinliğini göstermiştir .
Ekzozomlar çapları 30\u2012150 nm arasında değişen nano tanecikleri bir aile ve tüm biyoakışkan ve hücre kültürü medya6var. Ekzozomlar lipidler, mRNA'lar, proteinler ve mikroRNA'lar (miRNA) dahil olmak üzere birçok biyoaktif molekülle zenginleşir ve hücre-hücre iletişiminde önemli bir rol oynarlar. Geç, ekzozomlar kliniklerde tedavi potansiyelleri nedeniyle araştırmacılar ve ilaç şirketleri için daha cazip hale gelmiştir7,8,9. Son zamanlarda, bizim mekanistik çalışmalar CB-SC yayımlanan ekzozomlar SCE tedavisinin bağışıklık modülasyonu katkıda gösterdi10.
Burada, CB-SC'de serbest bırakılan ekzozomlar tarafından monositleri hedefleyen SCE tedavisinin mekanizmasını araştırmak için protokolü açıklıyoruz. İlk olarak, CB-SC'den serbest bırakılan ekzozomlar ultrasantrifüj yöntemleri kullanılarak CB-SC kaynaklı klimalı ortamdan izole edildi ve akış sitometrisi, western blot (WB) ve dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulandı. İkinci olarak, CB-SC türetilmiş ekzozomlar yeşil floresan lipophilic boya ile etiketlendi: Dio. Üçüncü olarak, akış sitometrisi ile PBMC'nin farklı alt popülasyonlarında Dio etiketli CB-SC türetilmiş ekzozomların pozitif yüzdelerini incelemek için PBMC ile birlikte kültürlendiler. Bu protokol, kök hücrelerin immün modülasyonunun altında yatan ekzozomların eylemini incelemek için rehberlik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Hackensack Meridian Health Discovery and Innovation Merkezi'ndeki kurumsal insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip eder. İnsan buffy ceket kan birimleri New York Kan Merkezi (New York, NY) satın alındı. İnsan göbek kordon kan üniteleri sağlıklı donörlerden toplandı ve Cryo-Cell International kan bankasından (Oldsmar, FL) satın alındı. Hem New York Kan Merkezi hem de Cryo-Cell kan toplama ve dağıtımları için tüm akreditasyonları, IRB onayı ve bağışçılardan imzalı Onay Formları ile almıştır.
1. Hücre kültürü ve CB-SC kaynaklı klimalı ortamın hazırlanması
- 20 mL'den fazla yoğunluk gradyan ortamının (γ = 1,077) üzerinde kordon kanının(Malzeme Tablosu)50 mL konik bir tüpe aktarılması.
- 1.690 x g 20 dakika 20 °C'de frensiz sallanan kova rotorunda santrifüj.
- Mononükleer hücre tabakasını (buffy coat) yeni bir 50 mL konik tüpe dikkatlice aktarın. Konik tüpü fosfat tamponlu salin (PBS) ile 40 mL doldurun. 20 °C'de 10 dk için 751 x g pelet hücrelerine karıştırın ve santrifüj.
- Supernatant atın ve hücre peletine 15 mL ACK lysis tamponu(Malzeme Tablosu)ekleyin. Pipetleme yoluyla hücreleri yeniden askıya alın. Sonra oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
NOT: Bu adım kırmızı kan hücrelerini temizler. - Konik tüpü 25 mL PBS ile doldurun. 5 dk için 751 x g santrifüj ve peletli mononükleer hücreleri elde etmek için supernatant atın.
- Kalan lysis tamponu çıkarmak için 40 mL PBS ile 2x yıkayın.
- Hücreleri pelet için 5 dk için 751 x g santrifüj.
- Tüp başına 10 mL kimyasal tanımlı serumiçermeyen ortam(Malzeme Tablosu)ile süpernatant ve yeniden askıya kordon kanı mononükleer hücreleri atın.
- Kordon kanı mononükleer hücreleri tek bir tüple birleştirin.
- 1,5 mL'lik bir tüpte 20°L hücre süspansiyonu alın ve %0,4 trippan mavi çözeltisi(Malzeme Tablosu)ile karıştırın.
- Oda slaytına yükleyin ve hücre numarasını ve hücre canlılığını otomatik bir hücre sayacı yla ölçün.
NOT: Hücre konsantrasyonu 1 x 107 hücre/mL'nin üzerindeyse hücre süspansiyonu 1:10'da seyreltilir. - 150 mm x 15 mm Petri kaplarında tohum mononükleer hücreler 1 x 106 hücre/mL, kimyasal tanımlı serumsuz hücre kültürü ortasında 25 mL/çanak.
- CB-SC %80'den fazla bir araya ulaşana kadar 10\u201214 gün boyunca %8 CO2 koşullarında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Supernatant atın ve Petri çanak başına PBS 15 mL ile yıkayın; sonra, PBS kaldırın.
NOT: CB-SC Petri yemeklerine sıkıca bağlanır. - Adımı 1.14'e iki kez tekrarlayın.
- Petri kabı başına 25 mL kimyasal tanımlı serum suz orta ekleyin.
- 3\u20124 gün boyunca %8 CO2 koşullarında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- CB-SC kaynaklı klimalı ortamı 50 mL konik tüpler halinde toplayın.
2. CB-SC karakterizasyonu
- CB-SC'yi 10 mL PBS bazlı hücre ayırma tamponunu 5 mL pipet ucuyla yukarı ve aşağı borulandırarak ayırın(Malzeme Tablosu).
- Pelet hücrelerine 5 dakika için 1.690 x g'de santrifüj ve 200 μL PBS'de yeniden askıya alın.
- Boyama hazırlama kiti(Tablo Malzemeler)ile hücre içi boyama için hücreleri onarmak ve permeabilize.
- Numune başına 5 μL Fc bloker(Malzeme Tablosu)ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Fc bloker antikorlar ile boyama zaman non-spesifik bağlanma inhibe. - CD34, CD45, SOX2, OCT3,CD270 ve Galectin 9 dahil olmak üzere floresan konjuge fare anti-insan monoklonal antikorlar ekleyin 25 μg/mL(Tablo Malzemeler) hücrelerin 100 μL hacmi. Işık koruması ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka.
- Boyama sonra, pelet hücreleri için 10 dakika için 751 x g 1 mL PBS ve santrifüj ile hücreleri yıkayın.
- 200 μL PBS ile hücreleri yeniden askıya alın ve 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Cb-SC ile ilişkili belirli belirteçlerin ifadesini doğrulamak için akış sitometrisi gerçekleştirin.
3. CB-SC kaynaklı ekzozomların izolasyonu
- 1.18 adımdan toplanan şartlı orta yı 300 x g'de 4 °C'de 10 dk. Supernatant'ı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
- 4 °C'de 20 dk için 2.000 x g'de 3.1 adımdan toplanan süpernatantsan. Supernatant'ı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
- 4 °C'de 30 dk için 10.000 x g'de 3.2 adımdan toplanan süpernatantsan. Supernatant'ı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
NOT: Sabit açı rotor, hücre peletlerinin tüpün yan tarafına çökeltmek için kullanılır. Kapağın yan tarafını işaretleyin ve peletin beklendiği yere bir daire çizin. - 0,22 μm filtre(Malzeme Tablosu)ile 3.3 adımdan toplanan filtre süpernatitleri.
- Her 10 kDa santrifüj filtre ünitesine 15 mL ortam aktarın(Malzeme Tablosu).
- Konsantre ekzozom ortamı izole etmek için 30 dk için 4.000 x g santrifüj.
- Konsantre ekzozomları ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, 4 °C'de 80 dk için 100.000 x g pelet ekzozomları.
- Supernatant atın ve PBS 10 mL pelet ekzozomları yeniden askıya.
- Exosomes pelet toplamak için 4 °C'de 80 dakika için 100.000 x g santrifüj.
- Ekzozomlar peletini 200 μL PBS'de yukarı ve aşağı borular oluşturarak yeniden askıya alın.
4. CB-SC kaynaklı ekzozomların karakterizasyonu
- Bicinchoninic asit testi (BCA) kiti ile ekzozom preparatının toplam protein konsantrasyonunun ölçülmesi
- Pipet 10 μL her albumin standart ve izole ekzozom örnek adım 3.10 çoğaltılmış bir 96-iyi plaka içine hazırlanan.
- BCA kitinden çalışan reaktifin 200 μL'sini her kuyuya ekleyin. 10 s için plaka shaker iyice plaka içeriğini karıştırın.
NOT: Çalışma reaktifi (WR): 1 parçalı reaktif B ile 50 parçalı reaktif A. - Plakaları folyo ile kaplayın ve 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
- Tabakları oda sıcaklığına (RT) kadar soğutun.
- Örnek emiciliği bir plaka okuyucu aracılığıyla 562 nm'de ölçün.
- Akış sitometrisi için ekzozomların hazırlanması ve boyanması
- Toplam 100 μL'lik PBS hacminde 3.10 adımda hazırlanan CB-SC türetilmiş ekzozomların 25 g'ına 20 μL anti-insan CD63 manyetik boncuk (4,5 μm boyutunda)(Malzeme Tablosu)ekleyerek ekzozomları yakalayın.
- Tüpü bir gecede (18\u201222 saat) 4 °C'de 800 rpm'de çalkalayın.
- Tüpü 300 x g'de 30 s'de santrifüj edin ve tüpün altındaki numuneyi toplayın.
- 300 μL izolasyon tamponu ekleyin (%0.1 büyükbaş serum albumini (BSA) PBS'de) ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.
NOT: Bu adım boncuk bağlı ekzozomları yıkıyor. - Tüpü 1 dk (Malzeme Tablosu) için bir mıknatıs standına yerleştirin ve supernatant'ı atın.
- Adımları 4.2.4\u20124.2.5'i yineleyin.
- 400 μL izolasyon tamponu ile boncuk la bağlı ekzozomları yeniden askıya alın.
- Aliquot 100 μL boncuk bağlı ekzozomlar her tüp için.
- Her akış tüpüne CD63 boncuk la yakalanan ekzozomlarla floresan konjuge antikorlar (sırasıyla 25 g/mL'de CD9-FITC, CD81-PE ve CD63-FITC) ekleyin.
NOT: Isotype uyumlu IgGs negatif kontroller olarak hizmet vermektedir. - 800 rpm de shaker ışık koruması ile oda sıcaklığında 45 dakika kuluçka.
- Adımları 4.2.4\u20124.2.5'i yineleyin.
- 200 μL izolasyon tamponunda boncukla bağlı ekzozomları yeniden askıya alın ve 5 mL akış tüpüne aktarın.
- Tüpleri akış sitometresinin örnek atlıkarıncasına yerleştirin.
- Ekzozom testi için protokolü açın.
- Numuneyi akış sitometresi ile otomatik olarak çalıştırın.
- Batı lekeile ekzozom tespiti
NOT: Batı lekeiyi kurulmuş bir yöntemdir ve biz yöntemin kendisi ayrıntılarına girmez.- 100 μL RIPA tamponu, pipet 20x ile 3.10 adımdan CB-SC türetilmiş ekzozomların peletlerini lyse, ardından 5 dakika boyunca buzüzerine yerleştirin.
- Ekzozom daki lizomun protein konsantrasyonunun BCA kiti ile ölçülmesi ve her kuyu başına 25 μg protein yükleyin.
- Proteinleri jel elektroforez ile 150 V'de 40 dk olarak ayırın.
- Proteini poliviniliden florür (PVDF) membranına yarı kuru transfer yöntemi ile aktarın11.
- 30 dakika boyunca% 5 yağsız süt ile membran blok.
- 2 μg/mL anti-insan Alix(Malzeme Tablosu)ve 1 μg/mL anti-insan Calnexin antikorları(Malzeme Tablosu)ile kuluçka.
- Proteini dijital görüntüleme sistemi ile kemilüminesans ile tespit edin.
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile ekzozom doğrulama
- 1 mL PBS'de 10 μg CB-SC türetilmiş ekzozom numunesini seyreltin.
- Seyreltilmiş numunenin 1 mL'sini tek kullanımlık yarı mikro cuvette(Malzeme Tablosu) aktarın.
- Cuvette'yi DLS aletine yerleştirin. Tüm numune monitörü için kırılma indisi (RI) 1,39 olarak ayarlayın.
- Numuneleri 25 °C'de çalıştırın ve ortalama boyut dağılımı elde etmek için kesir başına üç ölçüm elde edin.
- İletim elektron mikroskobu ile ekzozom doğrulama (TEM)
- 300 örgü bakır ızgaralar12 (Malzeme Tablosu)üzerinde Coat formvar .
- Bakır ızgaralar üzerinde buharlaşan karbon ek tabaka ile formvar güçlendirmek12.
NOT: Böyle bir kaplama yaklaşımı numune desteği için mükemmeldir. - 10 μL ekzozom numunesini ızgaralara yükleyin ve hava kurumaya bırakın.
- 5 dakika boyunca uranyl asetat ile negatif leke örnekleri.
- DI suyu ile üç kez yıkayın ve hava-kuru maya bırakın.
- TEM kapsamındaki örnekleri gözlemleyin ve fotoğraflatın. Hızlanma gerilimini 200 kV ve nokta boyutunu 2'ye ayarlayın.
5. PBMC'nin farklı alt popülasyonları tarafından alınan Diyo-etiketli CB-SC türetilmiş ekzozomları ölçün
-
Yeşil floresan lipophilic boya Dio ile Etiket CB-SC kaynaklı ekzozomlar
- 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 100 μg CB-SC türetilmiş ekzozomları (adım 3.10'da hazırlanır) aktarın.
- PBS ile seyreltilmiş numune 5 mL.'ye kadar.
- Çalışma konsantrasyonu 5 μM ulaşana kadar yeşil floresan lipophilic boya Dio(Malzeme Tablosu)ekleyin.
- Işıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka.
- Numuneyi ultracentrifuge tüpüne aktarın.
- Pelet Dio etiketli CB-SC türetilmiş ekzozomlar için 80 dk için 100.000 x g santrifüj.
- PBS'nin 200 μL'sinde etiketli ekzozomları yeniden askıya alın.
-
İnsan PBMC hazırlanması
- 20 mL'lik insan buffy coat'u(Malzeme Tablosu)20 mL'nin üzerinde yoğunluk gradyan ortamına (γ = 1,077) 50 mL konik bir boruya aktarın.
- 1.2 ile 1.11 adımlarını yineleyin.
- Doku ile tedavi edilmeyen hidrofobik 24 kuyulu bir plakaya (1 mL/kuyu) 1 x 106 PBMC aktarın.
NOT: Monositlerin yapışmasını önlemek için doku ile tedavi edilmeyen bir plaka kullanılmıştır.
-
PBMC ile ortak kültür Dio etiketli ekzozomlar
- Adım 5.1.7'de hazırlanan 40 μL Dio etiketli CB-SC türetilmiş ekzozomları 200 μL pipet kullanarak 24 kuyulu bir plakada bulunan her PBMC kuyuya aktarın. Kontrol kuyuları için aynı pbs hacmini ekleyin.
- 10x pipetleme ile karıştırın. 4 saat kuluçka.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Hoechst 33342 ile 200 μL ekzozom ile işlenmiş PBMC ve etiket toplayın.
- Oda sıcaklığında 10 dk için 300 x g santrifüj. Supernatant atın ve PBS 100 μL hücre pelet yeniden askıya.
- Hücreleri mikroskop slaytlarına monte edin.
- Mikroskop kullanarak Hoechst 33342 etiketli PBMC ile Dio etiketli CB-SC kaynaklı ekzozomların etkileşimini gözlemleyin ve fotoğrafleyin.
- Kalan hücreleri adım 5.3.3'ten 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Santrifüj 300 x g için 10 dk 4 °C'de. Supernatant atın ve PBS 200 μL hücre pelet yeniden askıya.
- Numune başına 5 μL Fc bloker ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka.
- PBMC'yi lekelemek için antikor (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 ve CD56 25 μg/mL)(Malzeme Tablosu)ekleyin.
NOT: Isotype uyumlu IgGs negatif kontroller olarak hizmet vermektedir. - Işık koruması ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka.
- Hücreleri peletlemek için 1 mL PBS ve santrifüj 300 x g için 10 dakika 4 °C'de ekleyin.
- 200 μL PBS ile hücreleri yeniden askıya alın. Propidium iyodür 5 μL ekleyin.
- PBMC'nin farklı alt popülasyonundaki Dio etiketli ekzozom alım düzeyini değerlendirmek için akış sitometrisini kullanın.
6. CB-SC türetilmiş ekzozomların monositler üzerindeki eylemini inceleyin
- İzolasyon insan CD14-pozitif monositler
- 15 mL'lik bir tüpe 3 x 107 insan PBMC aktarın.
- Santrifüj 300 x g için 10 dk 4 °C'de.
- Ayırma sütununa(Malzeme Tablosu)mıknatıs ayırıcıya (Malzeme Tablosuna)yerleştirin.
- Ayırma kolonlarını 2 mL soğuk çalışan tampon ile üç kez yıkayın(Malzeme Tablosu).
- 300 μL soğuk PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. 60 μL CD14 mikroboncuk ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- 6 mL soğuk PBS ekleyin. Santrifüj 300 x g için 10 dk 4 °C'de.
- 500 μL'lik soğuk çalışan tamponda peletlenmiş hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücreleri ayırma sütununa aktarın (adım 6.14'te hazırlanır) ve geçmelerine izin verin.
- Ayırma sütununa yıkama başına 2 mL çalışan tampon ile üç kez yıkayın. Kolonmıknatıs ayırıcısından kaldırın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: 15 mL'lik tüp, CD14-pozitif monositlerin oda sıcaklığında tüpe yapışması nedeniyle buz üzerine konulmalıdır. - 2 mL soğuk çalışan tamponu sütunun üstüne aktarın ve CD14-pozitif hücreleri 15 mL tüpe ayırın.
- CD14-pozitif hücreleri peletlemek için 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- 2 mL soğuk kimyasal tanımlı serum içermeyen ortam(Malzeme Tablosu)ile hücreleri yeniden askıya alın.
- 50 μL'lik hücreyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 20 dk için Krome Turuncu konjuge anti-insan CD14 mAb(Malzeme Tablosu)10 μL ile leke.
NOT: Isotype uyumlu IgGs negatif kontroller olarak hizmet vermektedir. - Hücrelere 1 mL PBS ekleyin. Pelet hücrelerine 10 dk için 300 x g santrifüj.
- 200 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve 5 mL'lik bir tüpe aktarın. CD14-pozitif monositlerin saflığını akış sitometrisi ile belirleyin.
- Monositlerin CB-SC türetilmiş ekzozomlarla tedavisi
- Doku kültürü ile tedavi edilen 6 kuyulu plakada (2 mL/kuyu) kimyasal tanımlı serumsuz kültür ortamına(Malzeme Tablosu)sahip 1 x 106 saflaştırılmış monosit.
- 37 °C'de %5 CO2'ninaltında 2 saat kuluçka .
- 1 mL pipet ile supernatant atın. 37 °C önceden ısıtılmış kimyasal tanımlı serumiçermeyen kültür ortamının(Malzeme Tablosu)2 mL'sini hafifçe ekleyin.
NOT: Monositler 2 saat içinde tabağa yapıştırıldı. Yüzen hücreler ölü veya diğer hücre kontaminasyonları olarak tanımlandı. - Adım 3.10'dan izole edilmiş 80 μg CB-SC türetilmiş ekzozomları toplam hacmi 2 mL olan 6 kuyulu bir plakadaki monosit kültürlere ekleyin.
NOT: Kontrol kuyularına aynı hacimPBS eklendi. - 3\u20124 gün boyunca %5 CO2'nin altında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Hücre morfolojisini 200× büyütme(Malzeme Tablosu)ile ters bir mikroskop kullanarak fotoğrafla.
- 1 mL pipet ucu ile PBS tabanlı hücre dissosinasyon tamponunun 1 mL'sinde yukarı ve aşağı boru takarak hücreleri ayırın.
- Kalan bağlı hücreleri bir hücre kazıyıcı aracılığıyla hasat edin.
NOT: Primer monositler veya farklılaştırılmış makrofajlar sıkıca bağlandığından, bazı hücreler dissosiasyon tamponu ile tedaviden sonra dibe yapışmış olarak kalır. Bu nedenle, bu hücreler bir hücre kazıyıcı ile hasat edilir. - 5 dakika için 1.690 x g hücreleri toplayın. 200 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın.
- Spesifik olmayan bağlamayı engellemek için 5 μL Fc bloker (25 g/mL) ekleyin.
- Hücrelere antikor (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ve CD209 25 μg/mL, Malzeme Tablosu)ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka.
NOT: Isotype uyumlu IgGs negatif kontrol olarak hizmet - Hücrelere 1 mL PBS ekleyin ve 10 dk için 300 x g santrifüj. Supernatant atın ve PBS 200 μL ile yeniden askıya.
- Numune başına 5 μL propidium iyodür ekleyin (200 μL) ve hücreleri yeni bir 5 mL akış tüpüne aktarın.
- Akış sitometrisini gerçekleştirin ve CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ve CD209 ifadelerinin düzeylerini değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başlangıçta CB-SC'nin fenotip ve saflığı lökosit ortak antijen CD45, ES hücreye özgü transkripsiyon faktörleri OCT3/4 ve SOX2 gibi CB-SC ile ilişkili belirteçlerle akış sitometrisi ile incelendi. CB-SC yüksek düzeyde CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 ve galectin 9 ekspresyonu gösterir, ancak CD34'ün ifadesi yoktur(Şekil 1A). Akış sitometri analizi, CD9, CD81 ve CD63 gibi ekzozomspesifik belirteçlerin EKSPRESYONUNU DOĞRULADI (Şekil 1B). Ekzozomların morfolojisi ve boyut dağılımı 79.38 ± 20.07 nm boyutlarıile TEM ve DLS(Şekil 1C,D)ile karakterize edildi. Batı leke daha ekzozom ilişkili marker Alix ifade kanıtladı, ER ilişkili marker Calnexin ifadesi olmadan (Şekil 1E).
PBMC Dio etiketli CB-SC-Exo ile tedavi edildi. Mikroskopi gözlemi, Dio etiketli CB-SC-Exo'nun PBMC ile doğrudan etkileşimini göstermiştir(Şekil 2A). Hangi hücre popülasyonunun Dio etiketli CB-SC-Exo ile etkileştiğini daha iyi tanımlamak için, farklı hücre bölmeleri T hücreleri için CD3, myeloid dendritik hücreler için CD11c (DC), monositler için CD14, B hücreleri için CD19 ve NK hücreleri için CD56 gibi hücreye özgü belirteçlerle kaplandı(Şekil 2B). 4 saat inkübasyondan sonra, akış sitometrisi farklı ortanca floresan yoğunluğunda (MFI) diyo-pozitif ekzozomlarda görüntülenen farklı kan hücresi kompartımanlarının(Şekil 2C)olduğunu göstermiştir. Özellikle, monositler dio-pozitif CB-SC-Exo'nun diğer bağışıklık hücrelerine göre daha yüksek ortanca floresan yoğunluğu(Şekil 2C)sergilenerek, monositlerin öncelikle CB-SC kaynaklı ekzozomlar tarafından hedef lendirildiği vurgulanmıştır.
CB-SC kaynaklı ekzozomların monositler üzerindeki doğrudan etkilerini araştırmak için saflaştırılmış CD14+ monositler 3 gün boyunca CB-SC kaynaklı ekzozomlarla birlikte kültürlendi. Ekzozomda tedavi edilen monosit, mil benzeri morfolojilere başarılı bir şekilde ayrılır (Şekil 3A). Daha sonra CB-SC-Exo'nun işlenmiş veya tedavi edilmeyen monositlerinin fenotipleri test edilmiştir ve CD163, CD206, CD209 gibi M2 ilişkili belirteçlerin ifadeleri ekzozom ile tedavi edilen grup arasında belirgin olarak artırıldı(Şekil 3B, kırmızı histogram). M-CSF + IL-4 tarafından oluşturulan konvansiyonel M2 makrofajları ile karşılaştırıldığında, CB-SC-Exo-treated monositler, önemli bir fark olmadan CD163, CD206, CD209 gibi M2 ile ilişkili belirteçlerin benzer düzeylerini ifade eder(Şekil 3C). Bu nedenle veriler, monositlerin CB-SC kaynaklı ekzozomlarla tedaviden sonra M2 fenotip ile makrofajlara farklılaştığını göstermektedir.
Şekil 1: CB-SC kaynaklı ekzozomların karakterizasyonu. (A) CB-SC'nin henotypik karakterizasyonu, CD45, OCT35, OCT3/4, SOX2, CD270 ve Galectin-9'un yüksek ekspresyonu, CD34'ün ifadesi yoktur. (B) CB-SC kaynaklı ekzozomlarda ekzozomla ilişkili belirteçlerin (CD63, CD9, CD81) ifadeleri. İzotip uyumlu IgG'ler akış sitometrisi (gri histogram) için kontrol görevi yaptı. (C) CB-SC kaynaklı ekzozomların iletim elektron mikroskobu (TEM) görüntüsü. (D) Dynamitic Light Saçılma (DLS) kullanılarak CB-SC'den türetilmiş ekzozomların boyut dağılımı. (E) Batı lekeleri CB-SC türetilmiş ekzozomların ekzozozomspesifik belirteci Alix'i gösterdiğini, ancak endoplazmik retikulum (ER) ilişkili marker Calnexin için negatif olduğunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CB-SC kaynaklı ekzozomların pbmc'nin farklı popülasyonları ile etkileşimi. (A) Dio etiketli CB-SC-Exo (yeşil) ile PBMC (mavi, Hoechst 33342 ile nükleer boyama) Nikon Eclipse Ti2 mikroskobu nis-elements yazılım sürümü 5.11.02 ile fotoğraflandı, yüksek büyütme ile Dio etiketli ekzozomlar dağılımıgösteren (yeşil) PBMC hücrelerinde co-kuluçka sonra 4 h 5% CO2 doku kültürü tedavi 24-iyi plaka. n = 2 olarak an. (B) PBMC'deki farklı alt popülasyonlar için hücreye özgü yüzey belirteçleri ile akış sitometri analizi için gating stratejisi, T hücreleri için CD3, monositler için CD14, B hücreleri için CD19, NK hücreleri için CD56 ve DC'ler için CD11c dahil. (C) Farklı PBMC alt popülasyonları arasında Dio etiketli ekzozomun (Örneğin, T hücreleri, Monositler, B hücreleri, NK hücreleri, Dc'ler) farklı ortanca floresan yoğunluğunu (MFI) görüntüleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CB-SC kaynaklı ekzozomların monositler üzerindeki etkileri. (A) CB-SC türetilmiş ekzozomlarla tedavi edildikten sonra monositlerin mil benzeri hücrelere morfolojik değişimi. (B) CD163, CD206 ve CD209 (kırmızı çizgi) gibi CB-SC türetilmiş ekzozomlarla tedaviden sonra M2-ilişkilendirme belirteçlerinin ekspresyonunun düzeyini yukarı düzenlenir. İşlenmemiş monositler (yeşil hat) kontrol olarak görev yaptı. İzotip uyumlu IgG'ler negatif kontroller (gri çizgi) olarak görev yaptı. (C) Konvansiyonel M2 makrofajları ile CB-SC-Exo kaynaklı M2 makrofajları arasında fenotipik karşılaştırma. Geleneksel M2 makrofajları üretmek için saflaştırılmış CD14+ monositler 37 °C'de 50 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF), 7 gün boyunca %5 CO2 koşulları ile tedavi edildi ve ardından 10 ng/mL IL-4 ile gecetedavisi yapıldı. CD14 dahil olmak üzere M2 ilişkili işaretçiler. CD80, CD86, CD163, CD206 ve CD209 akış sitometrisi ile değerlendirildi. İzotip uyumlu immünglobulin G (IgG) kontrol görevi vermektedir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur; N = 3 olarak an. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekzozomların uygulanması klinik tanı, ilaç gelişmeleri ve rejeneratif tıp için ortaya çıkan bir alandır. Burada CB-SC türetilmiş ekzozomların hazırlanması ve insan monositlerinin farklılaşması üzerine ekzozomların fonksiyonel çalışması ile ilgili ayrıntılı bir protokol saklıyız. Mevcut protokol, fonksiyonel CB-SC türetilmiş ekzozomların sıralı santrifüj ve yüksek saflıkta ultrasantrifüj ile izole olduğunu ve monositler üzerinde immün modülasyon sergilediğini göstermiştir.
Diğer konvansiyonel protokollerle karşılaştırıldığında, ultrafiltrasyon, diğer hücre dışı veziküllerden (EVs) farklı moleküler ağırlık ve dışlama boyutlarına bağlı olarak, farklı hücre veya ortamdan ekzozomların izole edilmesi ve saflaştırılması için kurulmuş bir yaklaşımdır. Ultrafiltrasyon izolasyonu ultrasantrifüj bazlı ayırmadan daha fazla zaman kazandırırken, büyük boyutlarda veziküllerde yapısal hasara neden olabilir. Ekzozomlar da polietilen glikol tarafından toplanabilir (PEG) düşük maliyetle aracılı yağış, Bu yöntem protein kontaminasyonları nedeniyle ekzozom saflık riskleri rağmen13,14. Bu nedenle, mevcut protokol yüksek saflıkta ekzozomlar üretmek için uygun maliyetli oldu. CB-SC türetilmiş ekzozomların immün modülasyonlarına dayanarak10, CB-SC kaynaklı ekzozomların karakterizasyonu klinik uygulamalardan önce CB-SC ile Kök Hücre Eğitimci'nin gücünü değerlendirmek için değerli bir biyomarker sunabilir.
Makrofajlar viral ve bakteriyel enfeksiyonlara karşı profesyonel antijen sunan hücrelerdir, çeşitli biyolojik fonksiyonlar ve heterojeniteler ile. Yüzey belirteçleri ve bağışıklık fonksiyonu farklılıklarına bağlı olarak, makrofajlar iki alt popülasyonile sınıflandırılır: tip 1 makrofajlar (M1, inflamasyona neden olan konvansiyonel makrofajlar) ve tip 2 makrofajlar (M2, anti-inflamasyon gösteren)15. Bu çalışmada, arınmış insan monositlerinin CB-SC türetilmiş ekzozomlarla tedaviden sonra tip 2 makrofajlara farklılaştırıldığı ve anti-inflamasyon fenotip10'usergilediği saptandı. CB-SC türetilmiş ekzozom itfalı monositler uzatılmış morfolojiyi sergilediler ve Sitokinler M-CSF + IL-4 kullanılarak üretilen geleneksel M2 makrofajları gibi benzer fenotip ile M2 ile ilişkili yüzey belirteçlerini (örneğin, CD163, CD206 ve CD209) ifade ettiler. Monositlerin bu tür fenotibik değişiklikler tip 1 diyabet ve diğer otoimmün hastalıkların tedavisinde CB-SC bağışıklık modülasyonu altında yatan yeni mekanizma vurgulamak. SCE tedavisi sırasında hastaların bağışıklık hücreleri cb-SC ile yaklaşık 8\u20129 saat kültürlüdür. SCE-tedavi monositler CB-SC türetilmiş ekzozomları vücuda geri taşıdı, bu da M2 farklılaşmasına ve immün toleransin indüksiyonunun genişlemesine katkıda bulundu, SCE tedavisi ile tedavi sonrası klinik sonuçların iyileşmesine yol açtı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Zhao Tianhe Kök Hücre Biyoteknoloji A.Ş. Dr Zhao kurucusu Kök Hücre Eğitimci teknolojisinin bir mucit. Diğer tüm yazarların sunulan çalışmayla ilgili olabilecek hiçbir mali çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Biz Hackensack UMC Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteği için Bay Poddar ve Bay Ludwig için müteşekkiriz. Biz İngilizce düzenleme için Laura Zhao için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
