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Cancer Research

ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण का उपयोग करके अव्यवस्थित ओंकोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के संरचना-फ़ंक्शन संबंधों का मानचित्रण

Published: June 27, 2020 doi: 10.3791/61564
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,3, 1,4
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Abigail Wexner Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 2Molecular, Cellular, and Developmental Biology Program, The Ohio State University, 3Division of Pediatric Hematology/Oncology/Blood & Marrow Transplant, The Ohio State University, 4Department of Pediatrics, The Ohio State University

Summary

आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त डोमेन ऑन्कोजेनिक फ्यूजन ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन प्रोटीनों को चिकित्सीय रूप से लक्षित करने के लिए, इन डोमेन द्वारा नियोजित नियामक तंत्रों की अधिक विस्तृत समझ की आवश्यकता है। यहां, हम ईविंग सारकोमा में आंतरिक रूप से अव्यवस्थित ईडब्ल्यूएस डोमेन की महत्वपूर्ण संरचनात्मक विशेषताओं को मैप करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उपयोग करते हैं।

Abstract

कई कैंसर गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन की विशेषता है जिसके परिणामस्वरूप ऑन्कोजेनिक फ्यूजन ट्रांसक्रिप्शन कारकों की अभिव्यक्ति होती है। आमतौर पर, इन प्रोटीनों में एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन (IDD) होता है जो किसी अन्य प्रोटीन के डीएनए-बाध्यकारी डोमेन (डीबीडी) के साथ जुड़ा हुआ होता है और द्रोह को बढ़ावा देने के लिए व्यापक प्रतिलेखन परिवर्तन आर्केस्ट्रा करता है। ये संलयन अक्सर उनके कारण होने वाले कैंसर में एकमात्र आवर्ती जीनोमिक विचलन होते हैं, जिससे वे आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य बन जाते हैं। हालांकि, ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों को लक्षित करने के लिए मशीनी भूमिका की बेहतर समझ की आवश्यकता होती है जो कम जटिलता, IDDs अपने कार्य में खेलते हैं। ईडब्ल्यूएसआर1 का एन-टर्मिनल डोमेन ईडब्ल्यूएस/एफएलआई, ईडब्ल्यूएस/एटीएफ और ईडब्ल्यूएस/डब्ल्यूटी1 सहित विभिन्न प्रकार के ऑन्कोजेनिक फ्यूजन ट्रांसक्रिप्शन कारकों में शामिल एक आइडी है । यहां, हम ईविंग सारकोमा में ईडब्ल्यूएस/फ्लाई के प्रतिलेखन कार्य के लिए महत्वपूर्ण ईडब्ल्यूएस डोमेन की संरचनात्मक विशेषताओं की जांच करने के लिए आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग करते हैं। ईविंग सारकोमा कोशिकाओं से अंतर्जात संलयन की पहली shRNA-मध्यस्थता कमी ईडब्ल्यूएस-उत्परिवर्ती निर्माण की एक किस्म की एक्टोपिक अभिव्यक्ति के साथ बनती है। फिर आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग ईडब्ल्यूएस डोमेन में म्यूटेशन से जुड़े कार्यात्मक घाटे को चित्रित करने के लिए इन संरचनाओं को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। ईडब्ल्यूएस/फ्लाई डीएनए बाइंडिंग रूपांकनों, और जीनोमिक स्थानीयकरण के बारे में पहले प्रकाशित जानकारी के साथ ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषणों को एकीकृत करके, साथ ही क्षमता को बदलने के लिए कार्यात्मक परखें, हम ओन्कोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण ईडब्ल्यूएस/फ्लाई लक्ष्य जीन के एक उपन्यास सेट को परिभाषित करने में सक्षम थे। यह पेपर ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन के संरचना-कार्य संबंधों को मैप करने के लिए एक विधि के रूप में आरएनए-अनुक्रमण के उपयोग को दर्शाता है।

Introduction

कैंसर के एक सबसेट, जिसमें बचपन और किशोरावस्था के कई घातक लोग शामिल हैं, क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन की विशेषता हैजो1, 2,3,4,5,6पर उपन्यास संलयन उत्पन्न करते हैं। परिणामस्वरूप संलयन प्रोटीन अक्सर ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के रूप में कार्य करते हैं, ट्यूमरजीनेसिस7,8को बढ़ावा देने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में व्यापक परिवर्तन करते हैं। इन ट्रांसलोकेशन वाले कैंसर में आमतौर पर एक अन्यथा शांत उत्परिवर्तनीय परिदृश्य होता है, जिसमें पाथोनोमोनिक फ्यूजन4,9से अलग कुछ आवर्ती जीनोमिक विपथन होते हैं। जैसे, सीधे फ्यूजन प्रोटीन को लक्षित करना इन बीमारियों में एक आकर्षक चिकित्सीय रणनीति है। हालांकि, इन ऑनकोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों में आमतौर पर कम जटिलता, आंतरिक रूप से अव्यवस्थित, प्रतिलेखन रूप से सक्रिय डोमेन होता है जो डीएनए-बाध्यकारी डोमेन (डीबीडी)10, 11,12,13,14के साथ जुड़ा हुआ है। इन प्रोटीनों के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन (आईडीडी) और डीबीडी दोनों पारंपरिक औषधीय दृष्टिकोणों के साथ लक्षित करना मुश्किल साबित हुआ है। उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों के विकास, इसलिए, जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए इन संलयन द्वारा नियोजित तंत्रों की अधिक विस्तृत आणविक समझ की आवश्यकता होती है।

EWSR1 के एन टर्मिनल IDD भाग आमतौर पर कैंसर में एक DBD के लिए जुड़ा हुआ है, ईविंग सारकोमा में EWS/FLI सहित, ईडब्ल्यूएस/WT1 फैलाना छोटे दौर सेल ट्यूमर में, और EWS/ATF1 नरम भागों के स्पष्ट सेल सारकोमा में10। इनमें से प्रत्येक फ्यूजन में ईडब्ल्यूएस आइडी की यंत्रवादी भूमिका को अधूरा समझ में आता है। ईडब्ल्यूएस/ईटीएस परिवार, विशेष रूप से ईडब्ल्यूएस/एफएलआई, आज तक सबसे कार्यात्मक रूप से विशेषता है । ईडब्ल्यूएस/फ्ली जीनोम-व्यापी एपिजेनेटिक और ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का समन्वय करता है जिससे हजारों जीन 7 , 11,15,16की सक्रियता और दमनहोताहै । अध्ययनों से पता चला है कि आइडी ट्रांसक्रिप्शनल सह-सक्रियकों (जैसे पी 300, डब्ल्यूडीआर 5, और बीएएफ परिसर) की भर्ती के साथ-साथ सह-दमनकर्ताओं (जैसे न्यूआरडी परिसर)11,15,17की भर्ती के लिए महत्वपूर्ण है। FLI1 के सी-टर्मिनल भाग के लिए ईडब्ल्यूएस आईडीडी का संलयन FLI1 के ईटीएस डीबीडी को उपन्यास डीएनए-बाध्यकारी विशिष्टता प्रदान करता है, जैसे कि संलयन ओनकोप्रोटीन (ईडब्ल्यूएस/फ्लाई) आमसहमति 18,19,20के अलावा जीनोम के दोहराव जीजीए-माइक्रोसेटेलाइट क्षेत्रों को बांधता है। सह-सक्रियक भर्ती समारोह के साथ संयुक्त, ईडब्ल्यूएस/एफएलआई की यह आकस्मिक डीएनए-बाध्यकारी गतिविधि जीजीएए-माइक्रोसेटेलाइट्स डिस्टल में ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट्स (टीएसएस) ("एन्हांसर-लाइक" माइक्रोसेटेलाइट्स) और डी नोवो एन्हांसर गठन को बढ़ावा देती है। जीजीए-माइक्रोसेटेलाइट्स पर ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देने के लिए आरएनए पॉलीमरेज II को टीएसएस ("प्रमोटर की तरह" माइक्रोसेटेलाइट्स)11,15,16,21में ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देनेकेलिए भर्ती करता है ।

एक साथ लिया, इन आंकड़ों ने हमें यह परिकल्पना करने के लिए नेतृत्व किया कि ईडब्ल्यूएस डोमेन के भीतर असतत तत्व विभिन्न प्रकार के ईडब्ल्यूएस/फ्लाई बाध्यकारी साइटों में अलग-अलग सह-नियामकों की भर्ती में योगदान देते हैं। हालांकि, ईडब्ल्यूएस/एफएलआई के ईडब्ल्यूएस भाग के भीतर इन तत्वों को समझदार करना, और वे कैसे कार्य करते हैं, डोमेन की अत्यधिक दोहराव और अव्यवस्थित प्रकृति से बाधित किया गया है । यहां हम ईडब्ल्यूएस आईडीडी में इन तत्वों को कार्यात्मक रूप से मैप करने के लिए ईविंग सारकोमा कोशिकाओं में पहले से प्रकाशित नॉकडाउन-बचाव प्रणाली का उपयोग करते हैं। इस प्रणाली में ईडब्ल्यूएस/फ्लाई FLI FLI 1 जीन के 3'यूटीआर को लक्षित करने वाले एक श्र्ना का उपयोग करके समाप्त हो जाता है, और अभिव्यक्ति को अलग-अलग ईडब्ल्यूएस/फ्लाई उत्परिवर्ती सीडीएनए के साथ बचाया जाता है जिसमें 3'यूटीआर7,17,22की कमी होती है। इन प्रयोगों ईडब्ल्यूएस IDD और महत्वपूर्ण oncogeniclite रिपोर्टर निर्माण, कॉलोनी गठन परख, और ईडब्ल्यूएस/FLI सक्रिय और दमित जीन7,17,22 के सक्रियण सहित के बीच संरचना समारोह संबंध नक्शा करने के लिए विभिन्न विलोपन के साथ निर्माण पर ध्यान केंद्रित . हालांकि, इन अध्ययनों को ईडब्ल्यूएस/FLI में ईडब्ल्यूएस IDD के भीतर असतत उप-डोमेन खोजने में विफल रहा है जो या तो सक्रियण या दमन के लिए विशिष्ट रूप से महत्वपूर्ण हैं । सभी परीक्षण किए गए निर्माण या तो विशिष्ट लक्ष्य जीन को सक्रिय और दबाने में सक्षम थे, जिससे कुशल कॉलोनी गठन होता है, या किसी भी ईडब्ल्यूएस/फ्ली लक्ष्य जीन को विनियमित करने में असमर्थ होता है, जिससे कॉलोनीगठन 7, 17,22का नुकसान होता है।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को व्यापक रूप से अपनाने से सक्षम ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण आमतौर पर स्क्रीनिंग या वर्णनात्मक अध्ययनों के संदर्भ में दो स्थितियों में जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षरों की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके बजाय हम ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर फ़ंक्शन में आईडीडी के योगदान की विशेषता के लिए आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-एसईक्यू) का उपयोग करके जीनोम-व्यापी अभिव्यक्ति डेटा को कैप्चर करने की क्षमता का लाभ उठाना चाहते थे। इस मामले में आरएनए-एसईक्यू को ईडब्ल्यूएस डोमेन के संरचना-कार्य संबंधों का पता लगाने के लिए नॉकडाउन-बचाव प्रणाली के साथ जोड़ा गया है। यह दृष्टिकोण अन्य संलयन प्रतिलेखन कारकों पर लागू होता है, जिसमें खराब समझे जाने वाले कार्य के साथ अन्य ईडब्ल्यूएस फ्यूजन या वाइल्डटाइप ट्रांसक्रिप्शन कारक शामिल हैं, और कार्यात्मक मानचित्रण अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य परखों पर कई फायदे हैं, जैसे रिपोर्टर परख या लक्षित क्यूआरटी-पीसीआर। इनमें प्रासंगिक क्रोमेटिन संदर्भ में कार्य के संरचनात्मक निर्धारकों का परीक्षण करना, एक परख में कई प्रकार के प्रतिक्रिया तत्वों का परीक्षण करने की क्षमता (यानी, सक्रिय और दमित, जीजीएए-माइक्रोसेटेलाइट और गैर-माइक्रोसेटेलाइट, आदि) शामिल हैं, और परिणामस्वरूप आंशिक कार्य का बेहतर पता लगाने की क्षमता शामिल है।

इस दृष्टिकोण का सफल कार्यान्वयन एक सेल-आधारित प्रणाली पर निर्भर करता है जो ब्याज के फेनोटाइप को कैप्चर करता है (इस मामले में ए 673 कोशिकाओं के साथ shRNA-मध्यस्थता ईडब्ल्यूएस/फ्ली कमी), और उत्परिवर्ती का एक पैनल सेल-आधारित प्रणाली के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर में निर्माण करता है (इस मामले में, विभिन्न 3x-फ्लैग-टैग ईडब्ल्यूएस/फ्ली म्यूटेंट के साथ एलएमएससीवी-हाइग्रो को रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन द्वारा वितरित किया जाएगा। या तो CRISPR आधारित कमी निर्माण, shRNA आधारित कमी निर्माण, और सीडीएनए अभिव्यक्ति के वायरल लेनदेन के लिए स्थिर सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त चयन के साथ निर्माण क्षणिक परिवर्तन पर सिफारिश की है । परिणामों की डाउनस्ट्रीम व्याख्या को तब मजबूत किया जाता है जब ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा को ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर और अन्य फेनोटाइपिक रीडआउट के स्थानीयकरण से संबंधित अन्य डेटा के साथ जोड़ा जा सकता है जहां उपलब्ध है।

इस पेपर में, हम ईडब्ल्यूएस/फ्ली14के डीएएफ उत्परिवर्ती की गतिविधि की विशेषता के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करते हैं। डीएएफ उत्परिवर्ती ईडब्ल्यूएस/एफएलआई 14 के ईडब्ल्यूएस आइडी के दोहराव वाले क्षेत्रों में एलनिन म्यूटेशन के लिए17टायरोसिन है । इस विशेष ईडब्ल्यूएस उत्परिवर्ती को पहले सूचित किया गया था और एटीएफ1 डीबीडी14से जुड़े होने पर रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करने में असमर्थ है । हालांकि, प्रारंभिक क्यूआरटी-पीसीआर डेटा ने सुझाव दिया कि यह उत्परिवर्ती ईडब्ल्यूएस/फ्ली लक्ष्य एनआर0बी123के प्रतिलेखन को सक्रिय करने में सक्षम था । यहां वर्णित ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोण ने डीएएफ उत्परिवर्ती के आंशिक कार्य का सफल पता लगाने में सक्षम बनाया। ईडब्ल्यूएस/फ्लाई बाइंडिंग और रिकग्निशन रूपांकनों के बारे में जानकारी के साथ इन ट्रांसक्रिप्टॉमिक डेटा को बांधकर हम आगे बताते हैं कि डीएएफ उत्परिवर्ती जीजीएए-माइक्रोसेटेललाइट में कार्य को बरकरार रखता है। ये परिणाम डीएएफ को पहले आंशिक रूप से कार्यात्मक ईडब्ल्यूएस/फ्ली म्यूटेंट के रूप में पहचानते हैं और गैर-माइक्रोसेटेलीलाइट जीन पर हाइलाइट फ़ंक्शन को ऑन्कोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण (जैसा कि23रिपोर्ट किया गया है) । यह ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के कार्य में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस ट्रांसक्रिप्टॉमिक संरचना-फ़ंक्शन मैपिंग दृष्टिकोण की शक्ति को दर्शाता है।

Protocol

1. निर्माण के इन विट्रो पैनल की स्थापना

नोट: यह चरण विश्लेषण किए जाने वाले विशिष्ट प्रोटीन के आधार पर भिन्न होगा।

  1. कमी और अभिव्यक्ति के लिए वायरस के aliquots तैयार आवश्यक के रूप में निर्माण।
    1. वायरल ट्रांसडक्शन के लिए आवश्यक प्रत्येक निर्माण के लिए 3-5 x 106 HEK293-EBNA या HEK293T कोशिकाओं के साथ एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान बीज। चलो कोशिकाओं Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (DMEM) में रात भर पालन 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन/ग्लूटामाइन (पी/एस/क्यू), और ०.३ मिलीग्राम/एमएल G418 के साथ पूरक ।
      नोट: HEK293-EBNA और HEK293T कोशिकाओं को वायरल उत्पादन के लिए अनुशंसित किया जाता है क्योंकि वे विकसित करने में आसान होते हैं, उच्च ट्रांसफेक्शन दक्षता होती है, और एपिसोमल प्लाज्मिड्स से पुनः संयोजन प्रोटीन को कुशलतापूर्वक व्यक्त करती है। कोशिकाओं को 50-70% के बीच होना चाहिए ट्रांसफैक्शन के दिन।
    2. प्रत्येक वायरल ट्रांसडक्शन निर्माण के लिए एक ट्रांसफेक्शन मिश्रण तैयार करें। कम सीरम मीडिया के 2 एमएल को 90 माइक्रोन ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के साथ मिलाएं।
      नोट: प्री-वार्मिंग कम सीरम मीडिया की सिफारिश की है।
    3. एक वायरल पैकेजिंग प्लाज्मिड (जैसे, गैग-पोल), वायरल लिफाफा प्लाज्मिड (जैसे, वीएसवी-जी) में से प्रत्येक को 10 माइक्रोन जोड़ें, और या तो CRISPR-आधारित कमी, श्राणा-आधारित कमी, या सीडीएनए अभिव्यक्ति निर्माण (जैसे, pMKO या pMSCV) को ट्रांसफेक्शन मिश्रण में शामिल करें। कोमल पिपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. ट्रांसफेक्शन मिक्स को कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक बैठने दें। ऊतक संस्कृति व्यंजनों से HEK293-EBNA विकास मीडिया निकालें और 10% FBS, पी/एस/क्यू, और 10 मीटर सोडियम pyruvate के साथ पूरक 3 mL DMEM जोड़ें । प्रत्येक डिश में 2 एमएल ट्रांसफेक्शन मिक्स ड्रॉपवाइज डालें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक इनक्यूबेटर में रात भर ट्रांसफैक्शन मीडिया में बैठने दें।
    5. अगले सुबह 10% एफबीएस, पी/एस/क्यू सप्लीमेंट, और 10 एमएम सोडियम पायरुवेट के साथ डीएमईएम मीडिया की 20 एमएल जोड़ें । इसमें कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. अगली सुबह, 5 एमएल वायरल संग्रह मीडिया (VCM) (DMEM 10% गर्मी निष्क्रिय FBS, पी/एस/क्यू, और 20 mM HEPES के साथ पूरक के साथ मीडिया की जगह) ।
    7. 4 घंटे के बाद, प्लेटों से वीसीएम एकत्र करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर 50 एमएल शंकु नली में स्टोर करें। ताजा वीसीएम के 5 एमएल के साथ बदलें।
    8. 4 घंटे के बाद, एक ही 50 एमएल शंकु नली में प्लेटों से वीसीएम एकत्र करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर स्टोर करें। रात भर संग्रह के लिए ताजा वीसीएम के 8 एमएल के साथ बदलें।
    9. सुबह 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर 50 एमएल शंकु नली में प्लेटों और स्टोर से वीसीएम इकट्ठा करें। ताजा वीसीएम के 5 एमएल के साथ बदलें।
    10. 4 घंटे के बाद, प्लेटों से वीसीएम एकत्र करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर 50 एमएल शंकु नली में स्टोर करें। ताजा वीसीएम के 5 एमएल के साथ बदलें। 4 घंटे के बाद, प्लेटों से वीसीएम एकत्र करें और 50 एमएल शंकु नली में जोड़ें।
    11. 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से छानने के बाद 50 एमएल ट्यूब से क्रायोट्यूब (2 एमएल प्रति एलिकोट) में एलिकोट संग्रह। उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरल एलिकोट्स स्टोर करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, और वायरल aliquots उपयोग के लिए तैयार होने तक संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में उचित घनत्व पर बीज कोशिकाओं। लक्ष्य 50% संगम। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखकर रात भर पालन करने दें जिसमें 5% सीओ2होता है ।
    नोट: A673 कोशिकाओं के लिए यह 10% एफबीएस, पी/एस/क्यू पूरकता, और 10 m सोडियम pyruvate के साथ DMEM मीडिया के 10 मिलीएल में 5 x 106 कोशिकाओं है । इन शर्तों का इस्तेमाल किया कोशिकाओं की वृद्धि दर के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  3. ब्याज के अंतर्जात कारक को कम करना। यदि कोशिकाओं को ब्याज के अंतर्जात प्रोटीन की आवश्यकता नहीं है, तो 1.4 कदम के लिए आगे बढ़ें।
    1. श्राणो या CRISPR के लेनदेन के लिए गल वायरल aliquot ब्याज के प्रोटीन को लक्षित निर्माण। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में फ्रोजन एलिकोट्स को जल्दी से पिघलाएं।
    2. प्रत्येक वायरल एलिकोट में 8 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन का 2.5 माइक्रोन जोड़ें और कोमल पिपटिंग द्वारा मिलाएं। कोशिकाओं की प्लेटों से मीडिया निकालें और धीरे से थाली के किनारे पाइपिंग द्वारा 10 सेमी प्लेट में वायरल aliquot जोड़ें । वायरल एलिकोट के 2 एमएल फैलाने के लिए प्लेट को रॉक करें।
    3. 2 घंटे के लिए टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। प्लेट के किसी भी क्षेत्र को सूखने से रोकने के लिए हर 30 मिनट में प्लेट को रॉक करें।
    4. 8 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन के 5 माइक्रोन के साथ 10% एफबीएस, पी/एस/क्यू सप्लीमेंट और 10 एमएम सोडियम पायरुवेट के साथ डीएमईएम मीडिया के 5 एमएल जोड़ें । कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करने दें।
    5. सुबह में कोशिकाओं और एक चयन अभिकर्षक के साथ पूरक मीडिया में मार्ग कोशिकाओं से मीडिया को हटा दें । कोशिकाओं को पासिंग करते समय, उन्हें 48-72 घंटे के लिए बढ़ने और 50% तक पहुंचने की अनुमति देने के तरीके से बीज करें।
      नोट: PSRP-iEF-2 के साथ A673 कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को 1:5 विभाजन में वरीयता प्राप्त है और 2 μg/mL puromycin के साथ ७२ घंटे के लिए चुना जाता है ।
  4. ट्रांसड्यूस सीडीएनए अभिव्यक्ति का निर्माण करता है।
    1. 50-70% संकुचन की पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं की जांच करें।
    2. सीडीएनए निर्माण (एस) ब्याज के लेनदेन के लिए वायरल एलिकोट (1) गल। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में फ्रोजन एलिकोट्स को जल्दी से पिघलाएं। प्रत्येक वायरल एलिकोट में 8 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन का 2.5 माइक्रोन जोड़ें और धीरे-धीरे पिपटिंग करके मिलाएं।
    3. प्लेटेड कोशिकाओं से मीडिया निकालें और धीरे से प्लेट के किनारे पाइपिंग द्वारा 10 सेमी प्लेट में वायरल aliquot जोड़ें । वायरल एलिकोट के 2 एमएल फैलाने के लिए प्लेट को रॉक करें।
    4. 2 घंटे के लिए टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। प्लेट के किसी भी क्षेत्र को सूखने से रोकने के लिए हर 30 मिनट में प्लेट को रॉक करें।
    5. 8 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन के 5 माइक्रोन के साथ 10% एफबीएस, पी/एस/क्यू सप्लीमेंट और 10 एमएम सोडियम पायरुवेट के साथ डीएमईएम मीडिया के 5 एमएल जोड़ें । कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करने दें।
    6. सुबह में कोशिकाओं और मार्ग कोशिकाओं से डबल चयन मीडिया में मीडिया को हटा दें। सीडीएनए निर्माण के दोहरे चयन और अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए 7-10 दिनों के लिए आवश्यकतानुसार बढ़ें और मार्ग कोशिकाएं।
      नोट: इस मार्ग के इस विभाजन के लिए विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। PSRP-iEF-2 और एक PMSCV-hygro निर्माण के साथ A673 कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को 2 μg/mL puromycin और १०० μg/mL hygromycin में बंटवारे के बिना पारित कर रहे हैं ।

2. कोशिकाओं को इकट्ठा करें, निर्माणों की अभिव्यक्ति को मान्य करें, और सहसंबद्ध फेनोटाइपिक परखें स्थापित करें

  1. डबल चयन के 7-10 दिनों के बाद 15 एमएल शंकु नली में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। एक हीमोसाइटोमीटर के साथ एकत्र कोशिकाओं की गिनती। अलीकोट ने आरएनए-अनुक्रमण के लिए कोशिकाओं को एकत्र किया और सीडीएनए निर्माणों की अभिव्यक्ति को मान्य किया।
    नोट: जांच के तहत अनुसंधान प्रश्न के लिए आवश्यक किसी भी सहसंबद्ध फेनोटाइपिक परख स्थापित करें। कॉलोनी बनाने परख एक सहसंबंधित फेनोटाइपिक परख का एक उदाहरण है कि यहां उपयोग किया जाता है ।
    1. आरएनए-अनुक्रमण के लिए 5 x10 5 और 1 x10 6 कोशिकाओं और प्रोटीन निकालने के लिए 2 x 106 कोशिकाओं के बीच लीजिए। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली कोशिकाओं और सुपरनैंट को हटा दें।
    2. 1 एमएल ठंडे पीबीएस के साथ गोली धोएं। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली और सुपरनैंट निकालें। तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज छर्रों और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. शेष कोशिकाओं के साथ किसी भी सहरक्षा परख स्थापित करें।
      नोट: प्रोटोकॉल -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत एकत्र नमूनों के साथ यहां रोका जा सकता है।
  2. ब्याज के प्रोटीन के नॉकआउट (यदि उपयोग किया जाता है) और निर्माण के पैनल की अभिव्यक्ति को मान्य करें।
    1. बर्फ पर प्रोटीन निकालने के लिए गल सेल छर्रों। बर्फ ठंड में Resuspend कोशिकाओं 500 μL परमाणु निष्कर्षण बफर (20 mM HEPES पीएच 7.9, 140 mm NaCl, 10% ग्लाइसरोल, 1.5 mM MgCl2,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% IGEPAL) प्रोटीज अवरोधक के साथ। इसे बर्फ पर 5 मिनट तक बैठने दें।
    2. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली नाभिक और सुपरनैंट निकालें। प्रोटीज अवरोधक के साथ 500 माइक्रोन आइस कोल्ड न्यूक्लियर एक्सट्रैक्ट बफर (20 एमएम एचईपीईपी पीएच 7.9, 140 mm NaCl, 10% ग्लाइसरोल, 1.5 m MgCl2,1 m M EDTA, 1 m M DTT, 1% IGEPAL) में नाभिक धोएं।
    3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली नाभिक और सुपरनैंट को हटा दें। प्रोटीज अवरोधक के साथ 200 माइक्रोन कोल्ड रिपा बफर में रिस्स्पेंड नाभिक (पैलेट आकार के अनुसार रिपा बफर की मात्रा को समायोजित करें। यह हर 15 मिनट जोरदार भंवर के साथ 45-60 मिनट के लिए बर्फ पर बैठते हैं ।
    4. 45-60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली सेल मलबे। सुपरनैंट रखें और एक ताजा ठंडी ट्यूब में स्थानांतरित करें
    5. 5 मिनट के लिए 1x लोडिंग बफर के साथ प्रोटीन के 5-10 माइक्रोग्राम उबलते द्वारा SDS-PAGE इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए नमूने तैयार करें । ब्याज के प्रोटीन के लिए आवश्यक के रूप में एक SDS-पेज जेल चलाएं।
    6. ब्याज के प्रोटीन के लिए आवश्यक नाइट्रोसेल्यूलोज या पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें। अंतर्जात प्रोटीन (यदि उपयोग किया जाता है) और सीडीएनए निर्माण की एक्टोपिक अभिव्यक्ति के नॉकआउट की पुष्टि करने के लिए उपयुक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ब्लॉक, और दाग।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  3. आरएनए निकालें। आरएनए की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें।
    1. बर्फ पर गल सेल छर्रों। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिलिका स्पिन-कॉलम आधारित निष्कर्षण किट का उपयोग करके कुल आरएनए निकालें।
    2. संक्षेप में, किट से लाइसिस बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को लाइसे करें। या तो 30-60 सेकंड के लिए >13000 आरपीएम पर एक संक्षिप्त स्पिन के साथ एक सिलिका स्पिन-कॉलम पर lysate लागू करें या 30-60 सेकंड के लिए >13000 आरपीएम पर एक संक्षिप्त स्पिन के साथ एक gDNA हटाने कॉलम के लिए lysate लागू करके gDNA हटा दें ।
    3. यदि एक सिलिका स्पिन-कॉलम पर सीधे लागू किया गया था तो ऑन-कॉलम डीएनए पाचन करें। यदि जीडीएनए हटाने के कॉलम का उपयोग कर रहे हैं, तो 30-60 एस के लिए >13000 आरपीएम पर एक संक्षिप्त स्पिन के साथ सिलिका-स्पिन कॉलम पर एल्यूएट लागू करें।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कॉलम पर आरएनए धोएं। एल्यूशन बफर के 30 माइक्रोन में एल्यूट आरएनए।
    5. फ्लोरोमीटर, या किसी अन्य तुलनीय उपकरण का उपयोग करके आरएनए की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें। सुनिश्चित करें कि 260/280 अनुपात 2 के करीब है और अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत करने के लिए आरएनए के कम से २.५ माइक्रोन हैं ।
      नोट: जैसा कि प्रतिकृति एकत्र की जाती है, प्रत्येक दोहराने को एक ही आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के साथ संसाधित किया जाना चाहिए।
    6. क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा यदि आवश्यक हो तो ब्याज के प्रोटीन के स्थिर नॉकआउट की पुष्टि करने के लिए आरएनए के एक छोटे से एलिकोट का उपयोग करें। शेष आरएनए नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. जब तक आरएनए के 3-4 पूर्ण सेट एकत्र नहीं किए गए हैं, तब तक चरण 1-2 दोहराकर जैविक प्रतिकृति एकत्र करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक दोहराने सीडीएनए निर्माण की पर्याप्त अभिव्यक्ति और अंतर्जात प्रोटीन (यदि उपयोग किया जाता है) की स्थिर नॉकआउट प्रदर्शित करता है।

3. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण

  1. 50 मिलियन 150 बेस पेयर (बीपी) पेयर्ड एंड रीड के लक्ष्य के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच का उपयोग करके निकाले गए आरएनए सबमिट करें। नमूनों को प्रोसेस करने की सुविधा के निर्देशों का पालन करें। पॉली-एडेनेलेटेड आरएनए और स्ट्रैंड-स्पेसिफिक सीक्वेंसिंग के लिए चुनें।

4. संरेखण और ट्रांसक्रिप्ट गिनती पाइपलाइन

नोट: इस प्रोटोकॉल में माना गया है कि नमूना प्रस्तुत करने और प्रसंस्करण के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए युग्मित FASTQ फ़ाइलों का एक सेट वापस कर दिया जाता है। इन फ़ाइलों को अक्सर "फास्टक्यू.gz" के प्रत्यय के साथ संकुचित किया जाता है। इन फास्टक्यू फाइलों के आगे विश्लेषण के लिए लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम चलाने वाली उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग (एचपीसी) सुविधा तक पहुंच की आवश्यकता होगी।

  1. फ़ाइलों को स्थानांतरित करें
    1. PuTTY के साथ एचपीसी पर्यावरण के लिए एक टर्मिनल खोलें। "परियोजना" नामक विश्लेषण के लिए एक निर्देशिका बनाएं।
    2. "path_to/परियोजना" निर्देशिका पर नेविगेट करें और संकुचित कच्चे fastq के लिए एक नई निर्देशिका बनाएं.gz "fastq" नामक फ़ाइलें । "छंटनी" नामक एक निर्देशिका भी बनाएं। यह चित्रा S1A-Cमें दिखाया गया है ।
    3. संकुचित कच्चे fastq.gz फ़ाइलों को स्थानीय भंडारण से "path_to/परियोजना/fastq/" निर्देशिका में WinSCP या इसी तरह के कार्यक्रम का उपयोग करके स्थानांतरित करें । चेक करें कि प्रत्येक नमूने के लिए एक "R1" और एक "R2" फ़ाइल है जैसा कि चित्रा S1Bमें दिखाया गया है।
    4. वैकल्पिक: यदि आवश्यक हो, तो TrimGalore स्थापित करें। लिनक्स में पथ पर्यावरण चर में trim_galore निष्पादित फ़ाइल युक्त निर्देशिका सेट करें।
      नोट: कम गुणवत्ता वाले पढ़ता है और एडाप्टर TrimGalore के साथ छंटनी कर रहे हैं । Trimगोर https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore पर उपलब्ध है।
    5. वैकल्पिक: डाउनलोड किए गए सॉफ्टवेयर पैकेजों के लिए निर्देशिका पर नेविगेट करें (यानी "path_to/सॉफ्टवेयर")। कमांड "कर्ल-fsSL https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/archive/ [संस्करण] .tar.gz-ओ trim_galore-[संस्करण] .tar.gz का उपयोग कर नवीनतम TrimGalore पैकेज डाउनलोड करें ।
    6. वैकल्पिक: तारकोल.gz फ़ाइल को खोलें। "टार-xvzf trim_galore-[version_number] .tar.gz" आदेश का उपयोग करें।
    7. वैकल्पिक: TrimGalore एक्जीक्यूटिव बनाएं। कमांड "chmod a+ x path_to/सॉफ्टवेयर/TrimGalore-[संस्करण]/trim_galore" का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि यह नई निर्देशिका पथ में है । आदेश का उपयोग करें "निर्यात PATH=path_to/सॉफ्टवेयर/TrimGalore-[संस्करण]: $PATH" ।
    8. path_to/परियोजना/फास्टक्यू/पर नेविगेट करें । इमेजन S1Cमें दिखाए गए कमांड का उपयोग करके फास्टक्यू.gz फाइलों से कम गुणवत्ता वाले रीड को ट्रिम करने के लिए TrimGalore का उपयोग करें।
      नोट: इस आदेश के लिए अतिरिक्त झंडे प्रासंगिक हो सकते हैं और यहां पाए जा सकते हैं: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore/blob/master/Docs/
      Trim_Galore_User_Guide.एमडी
    9. छंटनी की गई फास्टक्यू.gz फाइलों की जांच path_to/परियोजना/छंटनी की गई निर्देशिका में । सुनिश्चित करें कि उन्हें sample1_R1_val_1.fq.gz और sample1_R2_val_2.fq कहा जाता है.gz
  2. स्टार के साथ छंटनी की FASTQ फ़ाइलों को संरेखित करें और ट्रांसक्रिप्ट मायने रखती है उत्पन्न करें।
    नोट: स्टार https://github.com/alexdobin/STAR पर उपलब्ध है)
    1. वैकल्पिक: स्टार संस्करण 2.6 या बाद में इंस्टॉल करें। रास्ते में क्रियांवित स्टार सेट करें।
    2. वैकल्पिक: डाउनलोड किए गए सॉफ्टवेयर पैकेजों के लिए निर्देशिका पर नेविगेट करें (यानी "path_to/सॉफ्टवेयर")।
    3. वैकल्पिक: कमांड "कर्ल-एसएलओ https://github.com/alexdobin/STAR/archive/ [संस्करण] .tar.gz" का उपयोग करके स्टार पैकेज डाउनलोड करें। तारकोल.gz फ़ाइल को खोलें।
    4. वैकल्पिक: कमांड "टार-एक्सजेडएफ [संस्करण] .tar.gz" का उपयोग करें। स्टार को एक्जीक्यूटिव बनाएं। कमांड "chmod a+ x path_to/सॉफ्टवेयर/स्टार-[संस्करण]/बिन" का उपयोग करें ।
    5. वैकल्पिक: सुनिश्चित करें कि यह नई निर्देशिका रास्ते में है । कमांड "एक्सपोर्ट पाथ =path_to/सॉफ्टवेयर/स्टार-[version_number]/बिन/linux_x86_64_static:$PATH" का इस्तेमाल करें ।
      नोट: स्टार मैनुअल पर उपलब्ध है: (https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf) ।
    6. सुनिश्चित करें कि स्टार के साथ उपयोग करने के लिए जीनोम इंडेक्स है। इसे path_to/परियोजना/निर्देशिका से अलग निर्देशिका में रखें । यदि कोई सूचकांक पहले पूर्व प्रयोगों के लिए उत्पन्न किया गया था, तो उसका उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से यदि यहां उपलब्ध है तो एक उपयुक्त पूर्व-जनित सूचकांक का उपयोग करें: http://refgenomes.databio.org/। अन्यथा, स्टार मैनुअल में निर्देशों का उपयोग करके "स्टार-रनमोड जीनोमजेनरेट" कमांड का उपयोग करके एक नए सूचकांक का निर्माण करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के शेष के लिए स्टार सूचकांक के लिए पथ "path_to/STAR_index" के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
    7. path_to/परियोजना/निर्देशिका पर नेविगेट करें । एक नई निर्देशिका "STAR_output" कहा जाता है के रूप में चित्रा S1Dमें दिखाया गया है ।
    8. path_to/परियोजना/छंटनी/निर्देशिका पर नेविगेट करें । छंटनी की गई फास्टक्यू.gz फ़ाइलों को संरेखित करने के लिए स्टार चलाने के लिए चित्रा S1D में दिखाए गए आदेश का उपयोग करें।
      नोट: यह कदम सबसे अधिक गणना गहन है और संरेखण के कार्य के लिए नामित कई धागे (यानी >16) के साथ एचपीसी क्लस्टर पर इसे करने की सिफारिश की जाती है। नमूनों और उपलब्ध कम्प्यूटेशनल संसाधनों की संख्या के आधार पर यह कदम कई दिनों के लिए कई घंटे लग सकते हैं ।
    9. अगले चरणों के लिए आवश्यक आउटपुट का पता लगाएं जिसमें निम्नलिखित स्थान पर प्रति ट्रांसक्रिप्ट गिनती शामिल हैं: path_to/परियोजना/STAR_output/sampleN_ReadsPerGene.out.tab ।
      नोट: ReadsPerGene.out.tab फ़ाइल कॉलम में 1 सुविधा गिना जा रहा है के बारे में जानकारी रखती है । कॉलम 2 अनस्ट्रंडेड रीड काउंट रखती है, कॉलम 3 आगे फंसे पढ़ने की गिनती रखती है, और कॉलम 4 रिवर्स फंसे पढ़ें मायने रखता है रखती है । इस फ़ाइल की पहली चार पंक्तियों में गठबंधन के बारे में जानकारी होगी जो एक भी जीन के अनुरूप नहीं थी। इस प्रोटोकॉल के लिए बिना स्ट्रेंड रीड काउंट की आवश्यकता होती है।
    10. प्रत्येक नमूने के लिए कॉलम 1 और 2 के लिए पंक्ति 5 और नीचे से डेटा संकलित करने के लिए एचपीसी वातावरण में RStudio (बेहतर) या आर का उपयोग करें । आर में "परियोजना" के लिए कार्य निर्देशिका सेट करें ।
    11. प्रत्येक ReadsPerGene.out.tab फ़ाइल में पढ़ें आंकड़ा S2Aमें आदेश का उपयोग कर । पहले कॉलम के लिए, डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग की आसानी के लिए "एनसेम्बल जीन आईडी" कॉलम में "" से पहले केवल पात्रों को लें।
    12. सभी नमूनों से फिगर S2Bमें कमांड का उपयोग करके "टोस्टट्स" नामक डेटाफ्रेम में संकलित मायने रखता है। "write.table" कमांड का उपयोग करके sample_counts.txt, यदि वांछित हो तो, फ़ाइल .txt सीमित टैब के रूप में कच्चे गिनती डेटा की इस नई तालिका को सहेजें।
      नोट: Ensembl जीन आईडी का आदेश नमूनों में हर ReadsPerGene.out.tab फ़ाइल के लिए एक ही है ।

5. अंतर अभिव्यक्ति और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण

  1. ComBat के साथ नमूनों के बीच बैच प्रभाव के लिए सामान्य।
    नोट: दो संभावित चर हैं जो जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तनों की व्याख्या करते हैं, पहला निर्माण किया जाता है (यानी नमूना) और दूसरा समय (यानी बैच) के माध्यम से कोशिकाओं के पारित होने से जुड़े बाहरी कारक हैं। आर-पैकेज कॉम्बैट के साथ बैच-टू-बैच भिन्नता के लिए नमूनों को सामान्य बनाने के लिए एक कदम की सिफारिश की जाती है।
    1. यदि आवश्यक हो तो स्थापित करें और स्वा, डीसेक्यू2, एनोटेशनडीबीआई, ओआरजी के लिए पुस्तकालयों को लोड करें। Hs.eg.db, pheatmap, RColorBrewer, genefilter, काहिरा, ggplot2, ggbiplot, rgl, और reshape2 के रूप में चित्रा S2Cमें दिखाया गया है । स्थापना के लिए, प्रत्येक पैकेज के लिए प्रलेखन के अनुसार "इंस्टॉल.पैकेज" कमांड या बायोकंडक्टर का उपयोग करें।
    2. पहले केवल उन जीन है कि प्रति पढ़ने के लिए कम से एक गिनती है डेटा फिल्टर । इस नई तालिका को फ़िल्टरिंग को निरूपित करने के लिए सहेजें जैसा कि चित्रा S2Dमें देखा गया है।
      नोट: अक्सर, कई जीन बहुत कम या कोई पढ़ा मायने रखता है होगा ।
    3. बैच सामान्यीकरण के लिए एक दूसरी तालिका तैयार करें जिसे "वार्स" कहा जाता है जैसा कि चित्रा S2Eमें दिखाया गया है। प्रत्येक नमूने के अद्वितीय नामों के लिए पंक्ति के नाम सेट करें। कॉलम के नाम "नमूना", "बैच", और "निर्माण" में सेट करें।
    4. सभी नमूनों को 1 से एन तक "नमूना" कॉलम में एक अद्वितीय संख्या असाइन करें, एन नमूनों की संख्या के साथ। "बैच" कॉलम में सभी नमूनों को बैच नंबर असाइन करें जैसे कि कंडीशन-a_1 और कंडीशन-b_1 दोनों 1 सौंपे जाते हैं, और कंडीशन-a_2 और कंडीशन-b_2 दोनों 2 सौंपे जाते हैं । "निर्माण" कॉलम में सभी नमूनों के लिए सभी शर्त पदनाम असाइन करें जैसे कि हालत-एक नमूने सभी "ए" और शर्त-बी नमूने सभी "बी" हैं।
    5. बैच वेरिएबल को भी परिभाषित करें, और कॉम्बा के लिए एक विशिष्ट शून्य मॉडल मैट्रिक्स जैसा कि चित्रा S2Fमें दिखाया गया है। चित्रा S2Fमें परिभाषित आदेश के साथ ComBat चलाएं ।
  2. इसके अलावा निकटतम पूर्णांक को गोल करके डेटा को क्यूरेट करें। इसके अलावा एक नकारात्मक मूल्य के साथ जीन को हटा दें। चित्रा S3Aमें दिखाए गए आदेशों का उपयोग करें ।
    नोट: बैच सामान्यीकरण के उत्पादन गैर पूर्णांक पढ़ा मायने रखता है और नकारात्मक मूल्यों के साथ कुछ जीन होगा । यह कदम आवश्यक है क्योंकि डाउनस्ट्रीम अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण नकारात्मक पठन गणनाओं का समर्थन नहीं करता है।
  3. DESeq2 का उपयोग करके प्रत्येक निर्माण के लिए अंतर अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को परिभाषित करें।
    1. डेटा S3Bमें दिखाए गए DESeq2 के लिए प्रयोग डिजाइन इनपुट करें। DESeqDataSet (dds) का निर्माण DESeqDataSetFromMatrix समारोह का उपयोग करके, आकार कारकों का अनुमान है, और DESEq2 चलाते हैं, जैसा कि चित्रा S3Bमें दिखाया गया है।
      नोट: यह जरूरी है कि "शर्त" के लिए दर्ज कॉलम डेटा गिनती मैट्रिक्स में कॉलम के रूप में एक ही क्रम में है ।
    2. विश्लेषण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, डीसेक्यू2 द्वारा उपयोग किए जाने वाले रलॉग-सामान्यीकृत गिनती को निकालें जैसा कि चित्रा S3Bमें दिखाया गया है।
      नोट: विश्लेषण के दौरान, DESeq2 एक "नियमित लॉग के साथ मायने रखता है," rlog, परिवर्तन के लिए नमूना-कम मायने रखता है (कम जानकारी) के साथ जीन के लिए नमूना मतभेदों को सिकोड़ने के लिए नमूने भर में उच्च गिनती के साथ जीन में अंतर को बनाए रखने के लिए (उच्च जानकारी) ।
    3. DESeq2 के परिणामों से प्रत्येक ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के लिए परिणाम निकालते समय, फिगर S3Cमें दिखाए गए नॉकडाउन स्थिति या बेसलाइन खाली वेक्टर के संदर्भ में जोड़ीवार तुलना करें। इन परिणामों को एचजीएनसी जीन प्रतीकों के साथ और संशोधित करें जैसा कि चित्रा S3Dमें दिखाया गया है ।
    4. जैसा कि चित्रा S3Eमें देखा गया है, DESeq2 परिणामों से डेटा निकालें। Ensembl जीन आईडी, एचजीएनसी प्रतीक, आधार मतलब अभिव्यक्ति, और लॉग2फोल्डचेंज और कच्चे और समायोजित पी मूल्यों के साथ सभी निर्माणों के लिए अंतर अभिव्यक्ति डेटा के साथ एक ही फ़ाइल के रूप में निर्यात करें।
      नोट: 0.05 < समायोजित पी-वैल्यू का उपयोग करना अंतर अभिव्यक्ति के लिए अनुशंसित कटऑफ है।
    5. सफल बैच सामान्यीकरण और अंतर-नमूना समानता का आकलन करें। आंकड़े S4A-Bमें दिखाए गए कोड का उपयोग करके रलॉग सामान्यीकृत गिनती का उपयोग करके पीसीए और नमूना-से-नमूना दूरी भूखंडों के साथ नमूना क्लस्टरिंग की जांच करें ।
  4. चित्रा S4C में कोड का उपयोग कर ज्वालामुखी भूखंडों उत्पन्न करने के लिए अंतर अभिव्यक्ति प्रोफाइल का उपयोग करें। निर्माण ों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का मूल्यांकन करें।
  5. विभिन्न निर्माणों के लिए अद्वितीय जीन हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए रलॉग सामान्यीकृत मायने रखता है और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग का उपयोग करें। चित्रा S4Dमें दिखाए गए कोड का उपयोग करें ।
    1. मैट्रिक्स में सभी निर्माणों में 1000 सबसे चर जीन निकालें। इन जीनों के आधार पर अपने नमूनों के अपर्यवेक्षित पदानुक्रमित क्लस्टरिंग करने के लिए जईमैप का उपयोग करें।
    2. ब्याज के डेंड्रोग्राम समूहों के किस स्तर पर दिखाई देते हैं, यह तय करके डेंड्रोग्राम से ब्याज के समूहों को निकालें। उस स्तर पर समूहों की संख्या के बराबर "कश्मीर" सेट करें। यह निर्धारित करने के लिए क्लस्टर द्वारा ऑर्डर किए गए हीटमैप को फिर से लें कि कौन से क्लस्टर ब्याज के हैं जैसा कि चित्रा S5में दिखाया गया है।
    3. तालिका S1में प्रदर्शित प्रत्येक क्लस्टर से जुड़े जीन की सूची का निर्यात करें। ब्याज के समूहों में जीन निर्धारित करने के लिए इस जानकारी का उपयोग करें।
  6. पहचाने गए जीन के विभिन्न समूहों के लिए जैविक भूमिकाओं की पहचान करें और कक्षाओं के बीच तुलना करें। यह विभिन्न प्रकार के बायोइन्फॉर्मेटिक्स टूल का उपयोग करके किया जा सकता है। ToppGene24 यहां प्रयोग किया जाता है और स्वतंत्र रूप से ऑनलाइन उपलब्ध है ।
    नोट: वहां कई मुफ्त उपकरण है जो सिर्फ जीन की एक सूची की आवश्यकता के लिए कॉपी और एक वेबसाइट पर एक क्षेत्र में पेस्ट कर रहे हैं । जांच के तहत अनुसंधान प्रश्नों के लिए सबसे उपयुक्त विश्लेषणात्मक उपकरण चुनें।
  7. वैकल्पिक रूप से, यदि जीनोमिक बाध्यकारी के बारे में डेटा उपलब्ध है जो ब्याज के प्रतिलेखन कारक के लिए ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट को चलाता है, तो उत्परिवर्ती कार्य का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न बाध्यकारी तत्वों से जुड़े जीन पर ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया की तुलना करें।

6. प्रासंगिक फेनोटाइप्स के साथ तुलना

  1. उत्पन्न ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल डेटा के साथ सहरक्षक फेनोटाइप की तुलना करें और उचित के रूप में व्याख्या करें।

Representative Results

प्रारंभिक क्यूआरटी-पीसीआर डेटा ने सुझाव दिया कि ईडब्ल्यूएस/एफएलआई उत्परिवर्ती नामक डीएएफ, ईडब्ल्यूएस के दोहराव और अव्यवस्थित क्षेत्र में एलनिन म्यूटेशन के लिए विशिष्ट टायरोसिन के साथ, ईडब्ल्यूएस/फ्ली लक्ष्य जीन को सक्रिय करने की क्षमता बनाए रखा, लेकिन महत्वपूर्ण लक्ष्य जीन23को दबाने में विफल रहा । ईडब्ल्यूएस डोमेन और ईडब्ल्यूएस/फ्ली फ़ंक्शन में इन अवशेषों के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझने के लिए, चित्रा 1 में ऊपर वर्णित और उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। A673 ईविंग सारकोमा कोशिकाओं को FLI1के 3'यूटीआर को लक्षित करने वाले एक श्रर्ना के साथ वायरल रूप से स्थानांतरित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप अंतर्जात ईडब्ल्यूएस/फ्लाई की कमी हो गई थी। चयन के चार दिनों के बाद, ईडब्ल्यूएस/फ्लाई फ़ंक्शन को विभिन्न 3XFLAG-टैग ईडब्ल्यूएस/फ्लाई म्यूटेंट निर्माणों के वायरल ट्रांसडक्शन के साथ बचाया गया, जिसमें खाली वेक्टर को कोई बचाव के लिए नियंत्रण के रूप में नहीं दिया गया । ईडब्ल्यूएस डोमेन की कमी वाले एक गैर-कार्यात्मक उत्परिवर्ती, जिसे 322 कहा जाता है, को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और वाइल्ड-टाइप ईडब्ल्यूएस/फ्लाई, जिसे डब्ल्यूटीईएफ कहा जाता है, को सकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 2A)के रूप में इस्तेमाल किया गया था। डीएएफ का उपयोग परीक्षण निर्माण के रूप में किया गया था, हालांकि वांछित होने पर एक से अधिक परीक्षण निर्माण का उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं को एक अतिरिक्त 10 दिनों के लिए चुना गया था निर्माण अभिव्यक्ति को स्थिर करने की अनुमति और फिर आरएनए के लिए एकत्र (एक gDNA हटाने कदम के साथ), प्रोटीन और कॉलोनी परख बनाने । चार प्रतिकृति एकत्र किए गए और प्रतिनिधि क्यूआरटी-पीसीआर और पश्चिमी दाग प्रभावी नॉकडाउन और बचाव दिखा चित्रा 2बी-डीमें दिखाए गए हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डीएएफ-बचाए गए कोशिकाएं चित्रा 2Eमें दिखाए गए उपनिवेशों को बनाने में विफल रहीं, जो बिगड़ा ऑन्कोजेनिक परिवर्तन का सुझाव देते हैं।

दोहराने सत्यापन और फेनोटाइपिक परख के पूरा होने के बाद, आरएनए को पुस्तकालय की तैयारी के लिए राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में जीनोमिक मेडिसिन के लिए संस्थान में प्रस्तुत किया गया था और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ ~५०,०००,० १५०-बीपी पेय-एंड एकत्र पढ़ता है । डेटा फास्टक्यू.gz फाइलों के रूप में वापस कर दिया गया था। कम गुणवत्ता वाले पढ़ता है TrimGalore के साथ इन फ़ाइलों से छंटनी की गई और स्टार के लिए मानव जीनोम hg19 को पढ़ता है संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और जीन प्रति पढ़ता गिनती । hg19 का उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले ईडब्ल्यूएस/फ्ली के लिए अन्य क्यूरेटेड डेटासेट के साथ अनुकूलता के प्रयोजनों के लिए किया गया था। इन पढ़ें गिनती सभी नमूनों के लिए एक गिनती मैट्रिक्स में संयुक्त थे, जिनमें से पहली 6 पंक्तियों चित्रा 3में दिखाए गए हैं ।

गिनती शुरू में बैच सामान्यीकरण के बिना DESeq2 के माध्यम से चला रहे थे, हालांकि, नमूना से नमूना दूरी के दृश्य निरीक्षण संभावित confounding बैच प्रभाव दिखाया के रूप में चित्रा 4Aमें लाल तीर के साथ प्रकाश डाला दिखाया । यह संभावना संस्कृति में कोशिकाओं के पारित होने और प्रत्येक बैच के प्रसंस्करण में अंतर द्वारा शुरू की गई जैविक परिवर्तनशीलता के कारण पैदा हुई। बैच प्रभावों के लिए सामान्यीकरण कॉम्बा के साथ किया गया था और आम तौर पर इसकी सिफारिश की जाती है। बैच-सामान्यीकृत डेटा के नमूना-से-नमूना दूरी चित्रा 4Bमें दिखाई गई हैं। बैच सामान्यीकरण के बाद, डीसेक्यू2 का उपयोग बेसलाइन के सापेक्ष तीन निर्माणों (डब्ल्यूईएफ, टीए22 और डीएएफ) के लिए ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए किया गया था। ध्यान दें कि जबकि "माता पिता" A673 कोशिकाओं (नकली नॉकडाउन और नकली बचाव, "iLuc" यहां कहा जाता है) अंतर विश्लेषण में शामिल थे, इस प्रयोग के लिए संदर्भ EWS के साथ कोशिकाओं रहे है/ प्रतिलेखन प्रोफ़ाइल आईयूएफ के लिए iLuc नमूने की तुलना करके यहां अंतर्जात प्रोटीन के लिए उत्पन्न किया जा सकता है, और यह समझने में रुचि हो सकती है कि बचाव प्रणाली कैसे काम करती है, लेकिन यह इस विशेष विश्लेषण का लक्ष्य नहीं है। म्यूटेंट के लिए उत्पन्न ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल में आईईएफ के संबंध में सकारात्मक (डब्ल्यूईएफ) और नकारात्मक (Τ22) नियंत्रण शामिल हैं, जैसे कि इन्हें अन्य म्यूटेंट के लिए बेंचमार्क के रूप में कार्य करना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस उदाहरण में सकारात्मक नियंत्रण ने अंतर्जात ईडब्ल्यूएस/फ्लाई के कार्य को पूरी तरह से पुनः प्राप्त नहीं किया जैसा कि कहीं और चर्चा की गईथी 7,23।

चित्रा 5 में प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) से पता चलता है कि डीएएफ का ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल WTEF और 122 के बीच मध्यवर्ती है, जो आंशिक कार्य की पुष्टि करता है। इसके अलावा, नमूनों में १००० सबसे चर जीन के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग से पता चला है कि DAF EWS/FLI लक्ष्य जीन दमन करने में विफल रहा है, और केवल आंशिक रूप से जीन सक्रियण गतिविधि को बनाए रखा के रूप में चित्रा 6A और चित्रा S5में दिखाया गया है । ToppGene विश्लेषण का सुझाव दिया है कि जीन की कक्षाएं है कि डीएएफ सक्रिय कार्यात्मक उन EWS/FLI सक्रिय लक्ष्यों से अलग हैं, जहां DAF गैर कार्यात्मक है(चित्रा 6B)। दिलचस्प बात यह है कि डब्ल्यूटीईएफ द्वारा बचाए गए सक्रिय जीन का कार्य, लेकिन डीएएफ द्वारा नहीं, ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण और क्रोमेटिन नियमन से संबंधित प्रतीत होता है। कॉलोनी गठन परख के परिणामों के आधार पर, इस कोर जीन हस्ताक्षर से जीन आगे EWS/FLI मध्यस्थता oncogenesis में उनकी भूमिका के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए । ईडब्ल्यूएस/फ्ली-मध्यस्थता जीन दमन के महत्व को पहले17बताया गया है ।

यह ज्ञात है कि ईडब्ल्यूएस/फ्ली में जीजीएए - माइक्रोसेटेललाइट रिपीट तत्वों19,22के लिए एक अद्वितीय बाध्यकारी आत्मीयता है और इन तत्वों पर बाध्यकारी 11 ,15,18,20,22,नीचेजीन विनियमन चलाता है । इन माइक्रोसेटेलियों को सक्रियण या दमन से जुड़े होने के रूप में चिह्नित किया गया है, और या तो समीपस्थ (< 5 केबी) टीएसएस या डिस्टल (> 5 केबी) टीएसएस25। इसके अलावा, टीएसएस23के लिए उच्च आत्मीयता (एचए) ईटीएस रूपांकनों प्रोसिवल के साथ ईडब्ल्यूएस/फ्ली-विनियमित जीन हैं । डीएएफ समारोह की विशेषताओं का और विश्लेषण करने के लिए और किस प्रकार के ईडब्ल्यूएस/फ्ली-सक्रिय जीन डीएएफ को बचाने में सक्षम था, इन विभिन्न वर्गों से जुड़े जीनों की अंतर अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था । दिलचस्प बात यह है कि डीएएफ जीजीएए-माइक्रोसेटेलाइट सक्रिय जीन को बचाने में सक्षम था, लेकिन चित्र 7में देखे गए एचए साइट के पास सक्रिय जीन को बचाने में असमर्थ था। जैसा कि पदानुक्रमित क्लस्टरिंग के साथ देखा गया है, डीएएफ आदर्श वर्गों में ईडब्ल्यूएस/फ्लाई-मध्यस्थता दमन को बचाने में विफल रहता है । इन आंकड़ों से पता चलता है कि डीएएफ ईडब्ल्यूएस की पर्याप्त संरचनात्मक विशेषताओं को बरकरार रखता है ताकि जीजीएए-माइक्रोसेटेलाइट्स से टीएसएस के समीपस्थ और डिस्टल दोनों को बांधा जा सके । यह संभावना बरकरार SYGQ डोमेन से उठता है GGAA में EWS/FLI गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है11दोहराता है । इन आंकड़ों से यह भी पता चलता है कि डीएएफ में उत्परिवर्तित विशिष्ट tyrosines महत्वपूर्ण खेलते हैं, लेकिन खराब समझ में आता है, EWS/FLI में भूमिकाओं-HA साइटों से जीन विनियमन मध्यस्थता, साथ ही जीन दमन में, आगे की जांच के एक महत्वपूर्ण क्षेत्र पर प्रकाश डाला ।

Figure 1
चित्रा 1: वर्कफ़्लो। ट्रांसक्रिप्टमिक्स द्वारा संरचना-कार्य मानचित्रण करने के लिए कदम-दर-कदम प्रक्रिया का चित्रण। कोशिकाओं को पहले संरचना-समारोह मानचित्रण के लिए आवश्यक निर्माण के सुइट व्यक्त करने के लिए तैयार किया गया था । अभिव्यक्ति के बाद, कोशिकाओं को आरएनए और प्रोटीन के लिए काटा गया था और सहसंबंधित फेनोटाइप के लिए परख लिया गया था। निर्माणों की अभिव्यक्ति को मान्य किया गया था, और स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति इकट्ठा करने के लिए इस प्रक्रिया को 3-4 बार दोहराया गया था। इसके बाद आरएनए को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के लिए प्रस्तुत किया गया । जब डेटा प्राप्त किया गया था, डेटा गुणवत्ता के लिए छंटनी की थी, गठबंधन, और प्रतिलिपि प्रति गिनती की गणना की गई । बैच प्रभावों को डीसेक्यू 2 का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था और ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर और अंतर अभिव्यक्ति निर्धारित की गई थी। पदानुक्रमित क्लस्टरिंग और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण अन्य -ओमिक्स डेटासेट और विभिन्न मार्ग या कार्यात्मक विश्लेषण को एकीकृत किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: निर्माण अभिव्यक्ति और सहसंबद्ध परख का सत्यापन। (क)इस उदाहरण में परीक्षण किए गए निर्माणों का चित्रण करने वाली योजनाबद्ध । (ख)अंतर्जात ईडब्ल्यूएस/फ्ली के नॉकआउट का सत्यापन और इम्यूनोब्लॉट द्वारा 3X-फ्लैग टैग किए गए निर्माणों की अभिव्यक्ति । (C,D) क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा ईडब्ल्यूएस/फ्लाई(सी)सक्रिय लक्ष्य जीन, एनआर0बी1और(डी)दमित लक्ष्य जीन, टीजीएफबीआर2में निर्माण गतिविधि का सत्यापन। डेटा को मतलब +/-मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । पी-मानों की गणना तुकी के ईमानदार महत्व परीक्षण के साथ की गई थी। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.005 (ई) कॉलोनी से गिना जाता है नरम-आगर परख से निर्मित की गतिविधि को बदलने का आकलन करने के लिए किया जाता है। पी-मानों की गणना तुकी के ईमानदार महत्व परीक्षण के साथ की गई थी। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.005. यह आंकड़ा Theisen, एट अल से अनुकूलित है ।23कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: विश्लेषण के लिए अंतिम मिलान गिनती डेटा। सभी नमूनों को सामान्यीकृत और विश्लेषण करने के लिए जीन गिनती के साथ गिनती फ़ाइल की पहली 6 पंक्तियों का स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: नमूना-से-नमूना दूरी हीटमैप्स। (ए)सैंपल-टू-सैंपल डिस्टेंस प्लॉट में रॉ काउंट डेटा के सैंपल क्लस्टरिंग को दिखाया गया है । नमूने जो बैच द्वारा और नमूने द्वारा क्लस्टरिंग कर रहे हैं लाल तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं। (ख)कॉम्बैट के साथ बैच सामान्यीकरण के बाद नमूना-से-नमूना दूरी प्लॉट। यहां, सभी प्रतिकृति क्लस्टर से नमूने एक साथ, बैच से स्वतंत्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण के परिणाम। (A)सभी नमूनों के लिए उत्पन्न ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षरों की सिद्धांत घटक विश्लेषण (पीसीए) साजिश मजबूत इंट्रा-सैंपल क्लस्टरिंग दिखाती है और यह प्रदर्शित करती है कि डीएएफ सकारात्मक (डब्ल्यूईएफ) और नकारात्मक (टीए22) नियंत्रणों के बीच मध्यवर्ती है। (ख)ज्वालामुखी भूखंडों-लॉग (पी मूल्य) प्रत्येक निर्माण में जीन के लिए log2foldChange के खिलाफ साजिश रची दिखा । 0.05 < समायोजित पी-वैल्यू वाले जीन और |log2 (FoldChange) | > 1 महत्वपूर्ण माना जाता है और लाल रंग में दिखाया जाता है। पैनल 5B Theisen, एट अल से अनुकूलित है ।23कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: जीन वर्गों की पहचान करने के लिए पदानुक्रमित क्लस्टरिंग। (क)सभी निर्माणों में शीर्ष १००० सबसे चर जीन के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग और बेसलाइन, आईईएफ, से पता चलता है कि डीएएफ आंशिक रूप से ईडब्ल्यूएस/फ्लाई-मध्यस्थता जीन सक्रियण को बचाता है । (ख)जीन ऑन्टोलॉजी (आणविक कार्य) के परिणाम टोपजीन के परिणाम ईडब्ल्यूएस/फ्ली-सक्रिय जीन के कार्यात्मक संवर्धन को दिखाते हैं जिन्हें या तो डीएएफ द्वारा बचाया जाता है या नहीं बचाया जाता है । पैनल 6B Theisen, एट अल से अनुकूलित है ।23कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: विभिन्न निर्माणों के लिए विभिन्न ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर प्रतिक्रिया तत्वों का विस्तृत विश्लेषण: (ए)योजनाबद्ध चित्रण डेटा प्रोसेसिंग पैनल (बी) और (सी) उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा प्रोटोसाइल को यहां ट्रांसक्रिप्टोर्मिक प्रोफाइल के साथ अन्य उपलब्ध डेटासेट को शामिल करके। (B,C) प्रत्यक्ष ईडब्ल्यूएस/फ्ली-(बी) सक्रिय और(सी)दमित लक्ष्यों के विभिन्न वर्गों के बचाव को दर्शाने वाला संकलन । जीन शामिल केवल अंतर्जात ईडब्ल्यूएस/FLI द्वारा पता लगाने योग्य अंतर अभिव्यक्ति के साथ उन जीन थे । प्रत्येक पाई चार्ट में, ग्रे जीन के हिस्से को दर्शाया गया है जो निर्माण द्वारा बचाया नहीं जाता है। लाल जीन के हिस्से को दर्शाया गया है कि अलग सक्रिय हैं, और नीले जीन के हिस्से को दर्शाया गया है कि अलग से दमित कर रहे हैं । यह आंकड़ा Theisen, एट अल से अनुकूलित है ।23कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S1: एचपीसी पर्यावरण, ट्रिमिंग और संरेखण के लिए फास्टक्यू.gz फ़ाइलों को लोड करना। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S2: मिलान नमूनों भर में गिनती पढ़ने और ComBat के साथ बैच सामान्यीकरण चल रहा है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S3: DESeq2 रनिंग और अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण के परिणाम निकालने। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S4: उत्पादन का विश्लेषण। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S5: जीन वर्गों की पहचान करने के लिए पदानुक्रमित क्लस्टरिंग: सभी निर्माणों में शीर्ष 1000 सबसे चर जीन के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग और बेसलाइन, आईईएफ, कश्मीर समूहों में क्रमबद्ध। इस उदाहरण में k= 7, लेकिन यह पैरामीटर उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया गया है जैसा कि चित्रा S4Dमें दिखाया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका S1: क्लस्टर एनोटेशन के साथ जीन (एनसेम्बल जीन आईडी) की सूची। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के जैव रासायनिक तंत्र का अध्ययन उनके कारण होने वाली बीमारियों को समझने और नई चिकित्सीय रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। यह गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन के परिणामस्वरूप गुणसूत्र ट्रांसलोकेशन की विशेषता वाले घातक गुणों में विशेष रूप से सच है। इन चिमरिक प्रोटीन में शामिल डोमेन में जंगली प्रकार के प्रोटीन में मौजूद नियामक डोमेन के साथ सार्थक बातचीत की कमी हो सकतीहै, जो संलयन26, 27,28के संदर्भ में संरचना-कार्य जानकारी की व्याख्या करने की क्षमता को जटिल बनासकताहै। इसके अलावा, इनमें से कई ऑनकोजेनिक फ्यूजन कम जटिलता आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त डोमेन10,13,29,30की विशेषता है।

ईडब्ल्यूएस डोमेन इस तरह के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन का एक उदाहरण है जो विभिन्न प्रकार के ऑन्कोजेनिक फ्यूजन10में शामिल है। आंतरिक रूप से अव्यवस्थित और दोहराव प्रकृति ने ईडब्ल्यूएस डोमेन द्वारा नियोजित आणविक तंत्रों को समझने के प्रयासों में रुकावट पैदा की है । संरचना-कार्य की जांच करने के पूर्व प्रयासों ने काफी हद तक रिपोर्टर जीन परख के संदर्भ में या सेल पृष्ठभूमि में विभिन्न म्यूटेंट का उपयोग करने का सहारा लिया है जो प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ को पुनः प्राप्त करने में विफल रहते हैं, या किसी भी संरचनात्मक विविधताओं की कमी है जो सार्थक आंशिक कार्य11,17,25का उत्पादन करते हैं। यहां प्रस्तुत विधि इन मुद्दों को संबोधित करती है । संरचना-फ़ंक्शन मानचित्रण रोग-प्रासंगिक कोशिका संदर्भ में किया जाता है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण देशी क्रोमेटिन की स्थापना में ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है। EWS/FLI के DAF उत्परिवर्ती के विशिष्ट मामले में, DAF को अलग प्रतिक्रिया तत्वों का उपयोग कर रिपोर्टर परख में कम गतिविधि दिखाने की सूचना दी गई थी, लेकिन पूर्ण जीन प्रमोटर के संदर्भ में गतिविधि दिखाने के लिए, या तो एक रिपोर्टर परख में या देशी क्रोमेटिन में, एक दिलचस्प फेनोटाइप23का सुझाव । यहां वर्णित विधि का उपयोग करना अधिक सीधे इस सवाल को हल करता है कि जीनोम में किस प्रकार के नियामक तत्व रोग सेटिंग में सबसे अधिक उत्तरदायी हैं। सभी उम्मीदवार अपने मूल क्रोमेटिन संदर्भ में जीन को एक साथ परीक्षण करके, एक ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोण आंशिक कार्य के साथ निर्माणों की पहचान करने की अधिक संभावना है।

रोग-प्रासंगिक कोशिका पृष्ठभूमि का उपयोग करने की अंतर्निहित ताकत शायद इस तकनीक की सबसे बड़ी सीमा है। सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक इन प्रयोगों के लिए उपयुक्त सेल प्रणाली का चयन है। रोगोग्नोनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के साथ घातक से प्राप्त कई सेल लाइनें आसानी से उस प्रतिलेखन कारक के नॉकआउट को बर्दाश्त नहीं करती हैं, और कई उदाहरणों में, विशेष रूप से बाल चिकित्सा कैंसर के लिए, मूल की असली कोशिका विवादास्पद बनी हुई है और अन्य सेल पृष्ठभूमि में ऑन्कोजीन की अभिव्यक्ति निषेधात्मक रूप से विषाक्त है31,32 . इन मामलों में, यह एक अलग सेल पृष्ठभूमि में प्रयोग करने के लिए उपयोगी हो सकता है, जब तक शोधकर्ता परिणामों की व्याख्या में सावधानी बरतता है और उचित रूप से अधिक रोग-प्रासंगिक कोशिका प्रकार में किसी भी प्रासंगिक निष्कर्षों को मान्य करता है।

ऑन्कोजीन की अभिव्यक्ति के स्थिरता और फेनोटाइपिक परिणामों को सावधानीपूर्वक मान्य करना और सख्त मानदंडों को पूरा करने वाले अनुक्रमण के लिए केवल नमूने प्रस्तुत करना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। यहां, इसमें नॉकडाउन और बचाव की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी दाग शामिल थे, और सकारात्मक नियंत्रण(चित्रा 2)को मान्य करने के लिए ज्ञात लक्ष्य जीन की एक छोटी संख्या की क्यूआरटी-पीसीआर शामिल थी। इसी तरह प्रत्येक बैच के माध्यम से सेल और आरएनए की तैयारी को ध्यान से निष्पादित करके जितना संभव हो उतना बैच परिवर्तनशीलता को कम करना महत्वपूर्ण है।

यहां वर्णित विधि विशेष रूप से शक्तिशाली हो जाती है जब अन्य प्रकार के जीनोमिक डेटा के साथ जोड़ा जाता है जो अध्ययन के तहत ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के जीनोम-वाइड फ़ंक्शन से बात करते हैं। इस प्रकार की संरचना-कार्य विश्लेषण के लिए भविष्य के निर्देशों में प्रतिलेखन कारक के बाध्यकारी और क्रोमेटिन पहुंच में किसी भी प्रेरित परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए ChIP-seq और ATAC-seq शामिल करने के लिए विस्तार होगा । एक सुइट के रूप में, इस प्रकार के डेटा इस बात की ओर इशारा कर सकते हैं कि ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के विभिन्न संरचनात्मक घटक कार्य के विभिन्न पहलुओं में योगदान देते हैं (यानी डीएनए बाध्यकारी बनाम क्रोमेटिन संशोधन बनाम सह-नियामक भर्ती)। कुल मिलाकर, संलयन प्रतिलेखन कारकों के संरचना-कार्य संबंधों को मैप करने के लिए एनजीएस-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करने से इन प्रोटीनों के ऑन्कोजेनिक फ़ंक्शन के जैव रासायनिक निर्धारकों में नई अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकती है। यह उनके कारण और नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सक्षम करने में रोगों के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

Disclosures

SLL के लिए सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य के रूप में हितों के टकराव की घोषणा की और Salarius फार्मास्यूटिकल्स के एक इक्विटी धारक । SLL भी संयुक्त राज्य अमेरिका पेटेंट नहीं पर एक सूचीबद्ध आविष्कारक है । अमेरिका 7,393,253 B2, "ईविंग के सारकोमा के निदान और उपचार के लिए विधियां और रचनाएं," और यूएस 8,557,532, "दवा प्रतिरोधी ईविंग के सारकोमा का निदान और उपचार। यह डेटा और सामग्री साझा करने पर JoVE नीतियों के हमारे पालन में परिवर्तन नहीं करता है ।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रव्यापी बाल अस्पताल में अबीगैल वेक्सनर रिसर्च इंस्टीट्यूट में हाई परफॉर्मेंस कंप्यूटिंग फैसिलिटी ने सपोर्ट किया । इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट [U54 CA231641 से SLL, R01 CA183776 से SLL] द्वारा समर्थित किया गया था; एलेक्स नींबू पानी स्टैंड फाउंडेशन [ईआरटी को युवा अन्वेषक पुरस्कार]; पेलोटोनिया [ईआरटी के लिए फैलोशिप]; और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद सीजे मार्टिन ओवरसीज बायोमेडिकल फैलोशिप [APP1111032 से किप] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wet Lab Reagents
anti-FLI rabbit pAb Abcam ab15289 1:500
anti-lamin B1 rabbit pAb Abcam ab16048 1:2000
Cell-based system for introduction of mutant constructs Determined by cell system used
Cryotubes For viral aliquots
DMEM Corning Cellgro 10-013-CV For viral production
Fetal bovine serum Gibco 16000-044 For viral production
G418 ThermoFisher 10131027 For viral production
HEK293-EBNAs ATCC CRL-10852 For viral production
HEPES Gibco 15630106
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
M2 anti-FLAG mouse mAb Sigma F3165 1:2000
Near IR-secondary antibodies Li-Cor
Optimem Gibco 31985062 For viral production
Penicillin/Streptomycin/Glutamine Gibco 10378-016 For viral production
Polybrene Sigma TR-1003-G For viral transduction
Puromycin Sigma P8833 Stored at 2 mg/mL stock
RNeasy Plus kit Qiagen 74136 Has gDNA removal columns
Selection reagents As dictated by cell system used
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 For viral production
Tissue culture media Determined by cell system used
TransIT-LT1 Mirus MIR 2304 For viral production
Software
Access to HPC environment
AnnotationDbi 1.38.2
Cairo 1.5-10
DESeq2 1.16.1
genefilter 1.58.1
ggbiplot 0.55
ggplot2 3.1.1
org.Hs.eg.db 3.4.1
pheatmap 1.0.12
PuTTY
R 3.4.0
RColorBrewer 1.1-2
reshape2 1.4.3
rgl 0.100.19
R-studio
STAR Version 2.6 or later
sva 3.24.4
TrimGalore!
WinSCP

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References

  1. Miettinen, M., et al. New fusion sarcomas: histopathology and clinical significance of selected entities. Human Pathology. 86, 57-65 (2019).
  2. Knott, M. M. L., et al. Targeting the undruggable: exploiting neomorphic features of fusion oncoproteins in childhood sarcomas for innovative therapies. Cancer and Metastasis Reviews. 38, 625-642 (2019).
  3. Yoshihara, K., et al. The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions. Oncogene. 34, 4845-4854 (2015).
  4. Duesberg, P. H. Cancer genes generated by rare chromosomal rearrangements rather than activation of oncogenes. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 4, 163-175 (1987).
  5. Dupain, C., Harttrampf, A. C., Urbinati, G., Geoerger, B., Massaad-Massade, L. Relevance of Fusion Genes in Pediatric Cancers: Toward Precision Medicine. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 315-326 (2017).
  6. Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7, 233-245 (2007).
  7. Smith, R., et al. Expression profiling of EWS/FLI identifies NKX2.2 as a critical target gene in Ewing's sarcoma. Cancer Cell. 9, 405-416 (2006).
  8. Davicioni, E., et al. Identification of a PAX-FKHR gene expression signature that defines molecular classes and determines the prognosis of alveolar rhabdomyosarcomas. Cancer Research. 66, 6936-6946 (2006).
  9. Gröbner, S. N., et al. The landscape of genomic alterations across childhood cancers. Nature. 555, 321-327 (2018).
  10. Kim, J., Pelletier, J. Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members. Physiological Genomics. 1, 127-138 (1999).
  11. Boulay, G., et al. Cancer-Specific Retargeting of BAF Complexes by a Prion-like Domain. Cell. 171, 163-178 (2017).
  12. Lessnick, S. L., Braun, B. S., Denny, C. T., May, W. A. Multiple domains mediate transformation by the Ewing’s sarcoma EWS/FLI-1 fusion gene. Oncogene. 10, 423-431 (1995).
  13. Leach, B. I., et al. Leukemia fusion target AF9 is an intrinsically disordered transcriptional regulator that recruits multiple partners via coupled folding and binding. Structure. 21, 176-183 (2013).
  14. Ng, K. P., et al. Multiple aromatic side chains within a disordered structure are critical for transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 479-484 (2007).
  15. Riggi, N., et al. EWS-FLI1 Divergent Chromatin Remodeling Mechanisms to Directly Activate or Repress Enhancer Elements in Ewing Sarcoma. Cancer Cell. 26, 668-681 (2014).
  16. Tomazou, E. M., et al. Epigenome Mapping Reveals Distinct Modes of Gene Regulation and Widespread Enhancer Reprogramming by the Oncogenic Fusion Protein EWS-FLI1. Cell Reports. 10, 1082-1095 (2015).
  17. Sankar, S., et al. Mechanism and relevance of EWS/FLI-mediated transcriptional repression in Ewing sarcoma. Oncogene. 32, 5089-5100 (2013).
  18. Gangwal, K., et al. Microsatellites as EWS/FLI response elements in Ewing's sarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105, 10149-10154 (2008).
  19. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent Properties of EWS/FLI Regulation via GGAA Microsatellites in Ewing's Sarcoma. Genes & Cancer. 1, 177-187 (2010).
  20. Guillon, N., et al. The Oncogenic EWS-FLI1 Protein Binds In Vivo GGAA Microsatellite Sequences with Potential Transcriptional Activation Function. PLoS One. 4, 4932 (2009).
  21. Chong, S., et al. Imaging dynamic and selective low-complexity domain interactions that control gene transcription. Science. 361, (2018).
  22. Johnson, K. M., et al. Role for the EWS domain of EWS/FLI in binding GGAA-microsatellites required for Ewing sarcoma anchorage independent growth. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114, 9870-9875 (2017).
  23. Theisen, E. R., et al. Transcriptomic analysis functionally maps the intrinsically disordered domain of EWS/FLI and reveals novel transcriptional dependencies for oncogenesis. Genes & Cancer. 10, 21-38 (2019).
  24. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 37, 305-311 (2009).
  25. Johnson, K. M., Taslim, C., Saund, R. S., Lessnick, S. L. Identification of two types of GGAA-microsatellites and their roles in EWS/FLI binding and gene regulation in Ewing sarcoma. PLOS One. 12, 0186275 (2017).
  26. Kim, P., Ballester, L. Y., Zhao, Z. Domain retention in transcription factor fusion genes and its biological and clinical implications: a pan-cancer study. Oncotarget. 8, 110103-110117 (2017).
  27. de Mendíbil, I. O., Vizmanos, J. L., Novo, F. J. Signatures of Selection in Fusion Transcripts Resulting from Chromosomal Translocations in Human Cancer. PLOS One. 4, 4805 (2009).
  28. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28, 67-74 (2012).
  29. Hegyi, H., Buday, L., Tompa, P. Intrinsic Structural Disorder Confers Cellular Viability on Oncogenic Fusion Proteins. PLoS Computational Biology. 5, 1000552 (2009).
  30. Latysheva, N. S., Babu, M. M. Discovering and understanding oncogenic gene fusions through data intensive computational approaches. Nucleic Acids Research. 44, 4487-4503 (2016).
  31. Deneen, B., Denny, C. T. Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation. Oncogene. 20, 6731-6741 (2001).
  32. Kendall, G. C., et al. PAX3-FOXO1 transgenic zebrafish models identify HES3 as a mediator of rhabdomyosarcoma tumorigenesis. eLife. 7, 33800 (2018).

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कैंसर रिसर्च अंक 160 ट्रांसक्रिप्टोमिक्स आरएनए-सेक़ संरचना-फ़ंक्शन ट्रांसक्रिप्शन कारक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित डोमेन ईडब्ल्यूएस/फ्लाई ईविंग सारकोमा जीन विनियमन
ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण का उपयोग करके अव्यवस्थित ओंकोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के संरचना-फ़ंक्शन संबंधों का मानचित्रण
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Showpnil, I. A., Miller, K. R.,… More

Showpnil, I. A., Miller, K. R., Taslim, C., Pishas, K. I., Lessnick, S. L., Theisen, E. R. Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis. J. Vis. Exp. (160), e61564, doi:10.3791/61564 (2020).

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