Summary

نموذج حلقة الدم في المختبرية للتحقيق في التوافق الهيموسيتوفية وتنشيط الخلية المضيفة للأجهزة الطبية الوعائية

Published: August 21, 2020
doi:

Summary

قدم هنا هو بروتوكول لنموذج حلقة الدموية في المختبرية موحدة. هذا النموذج يسمح لاختبار الهيموفيوتيا من أنابيب الضخ أو الدعامات الوعائية لتكون وفقا لISO (المنظمة الدولية للتوحيد القياسي) 10993-4 القياسية.

Abstract

في هذه الدراسة، تمت مقارنة قابلية الهيموفوبيا من الأنابيب مع القطر الداخلي من 5 ملم مصنوعة من كلوريد البولي فينيل (PVC) والمغلفة مع مختلف الترافقات النشطة بيولوجيا لأنابيب PVC غير المصقول، والأنابيب اللاتكس، ودعامة للتطبيق داخل الأوعية الدموية التي وضعت داخل أنابيب PVC. تم تقييم القدرة على الهيموابل باستخدام نموذج حلقة الدموية في المختبر الذي أوصى به معيار ISO 10993-4. تم قطع الأنابيب إلى شرائح ذات طول متطابقة ومغلقة على شكل حلقات تجنب أي فجوة في لصق، ثم ملأها بدم الإنسان وتناوب في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بعد ذلك ، تم جمع الدم داخل الأنابيب لتحليل تعداد خلايا الدم بالكامل ، انحلال الدم (الهيموغلوبين البلازما المجاني) ، نظام مكمل (sC5b-9) ، نظام التخثر (fibrinopeptide A) ، وتنشيط الكريات البيض (elastase polymorphonuclear ، عامل نخر الورم وinterleukin-6). تم تحديد تنشيط الخلية المضيفة لتنشيط الصفائح الدموية، حالة كريات الدم الكريات البيض والمجاميع الصفيحات أحادية الخلايا باستخدام عملية استئصال الخلايا التدفق. تم فحص تأثير إغلاق الحلقة غير الدقيقة مع التصوير المجهري بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني المسح الضوئي ، الذي أظهر تكوين الخثرة في لصق. وأظهرت أنابيب اللاتكس أقوى تنشيط لكل من مكونات البلازما والخلوية من الدم، مما يشير إلى ضعف الهيموال، تليها مجموعة الدعامات وأنابيب PVC غير المصقولة. لم تظهر أنابيب PVC المغلفة انخفاضًا كبيرًا في حالة تنشيط الصفائح الدموية ، ولكنها أظهرت زيادة في تتالي التكملة والتخثر مقارنةً بأنبوب PVC غير المصقولة. لم يؤدي نموذج الحلقة نفسه إلى تنشيط الخلايا أو العوامل القابلة للذوبان ، وكان مستوى الانحلال منخفضًا. ولذلك، فإن نموذج حلقة الدم في المختبر في المختبر يتجنب التفعيل المفرط لمكونات الدم من قبل القوى الميكانيكية، ويعمل كوسيلة للتحقيق في التفاعلات في المختبر بين الدم المانح والأجهزة الطبية الوعائية.

Introduction

اختبار الهيموابل للأجهزة الطبية هو خطوة حاسمة في تطوير أجهزة جديدة مثل الدعامات الوعائية أو أنابيب النزف لاوكسيجين الغشاء خارجcorporeal. حتى اليوم، تعتبر النماذج الحيوانية كأدوات قياسية لإنهاء إجراءات اختبار الأجهزة الطبية قبل تنفيذها في البشر. ومن الآن فصاعدا، من الضروري إيجاد نماذج بديلة في المختبر تساعد بقدر أكبر في التقليل من التحقيقات المتعلقة بالحيوانات. في هذه الدراسة، ونحن، لذلك، قد استكشفت مصغرة في المختبرية نموذج حلقة الدموية. والهدف من هذه الطريقة المعروضة هو اختبار توافق الدم في المختبر من الأجهزة الطبية وفقا لمعيار ISO 10993-4.

ISO 10993-4 القياسية يصف مجموعات موحدة من المعلمات السريرية التي سيتم التحقيق فيها على عينة الدم1. باختصار، هذه هي تجلط الدم (تجميع الصفائح الدموية وعدد)، والتخثر (الفيبرينوبيبتايد A، FPA)، وتحليل الدم (عدد خلايا الدم الكاملة)، مؤشر الانحلال (الهيموجلوبين البلازما الحرة) ونظام مكمل (محطة تكملة مجمع، sC5b9). ومع ذلك ، يمكن أيضًا حساب علامات إضافية ، مثل العدلات المتعددة الأشكال من elastase (PMN) ، interleukin 6 (IL-6) وعامل نخر الورم – ألفا (TNF) التي تعكس حالة تفعيل الكريات البيض . لتحديد وقياس البروتينات الخالية من الخلايا المتداولة الموجودة في بلازما الدم، ساندويتش enzymatic ربط المناعة المقايسة (ELISA) يمثل طريقة تقليدية وموثوق بها أكثر2،3. وبالمثل، يمكن تحديد نوع ظاهري وحالة التنشيط للخلايا المضيفة (مثل الكريات البيض) عن طريق الكشف عن تعبير سطح الخلية من الجزيئات عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة (FACS) التي توفر قراءات أحادية قائمة على التعليق الخلوي، حيث ترتبط الأجسام المضادة المحددة المسماة بالفلورسنت بجزيئات سطح الخلايا المستهدفة4. كما يوصى بمسح المجهر الإلكتروني (SEM) لتحديد تكوين الخثرة على المواد المختبرة بواسطة معيار ISO 10993-41. يمكن أن تكمل هذه الطريقة مع الأشعة السينية microtomography (μCT)، لإجراء تحليل هيكلي لثرومبوس على سبيل المثال، سمكها، وحجمها وتوطينها في صورة 3D المقدمة5.

الأساس المنطقي وراء استخدام هذا النموذج في المختبر هو فحص أفضل أداء والأجهزة الطبية المتوافقة من خلال فهم الديناميات الفسيولوجية الأساسية لمكونات الدم مثل الصفائح الدموية، التي تشارك في الهيماسيس الأولية أو الكريات البيض وتفاعلها مع أنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية. هذه النظم في المختبر هي المطلوبة للغاية لأنها تقلل من الحاجة إلى الدراسات الحيوانية.

نموذج حلقة المقدمة هنا يفي هذه المطالب. وقد وصفت لأول مرة هذا النموذج من قبل A.B. تشاندلر في عام 1958 لإنتاج الدم thrombi و, ولذلك, كما دعا تشاندلر حلقة نموذج6. حتى الآن، وقد استخدم هذا النموذج في سلسلة من التجارب والتعديلات للتحقيق في التوافق الحيوي للدم من الأجهزة الطبية7،8،9،10،11،12،13،14. وهو يتألف من أنابيب البوليمر، والتي تمتلئ جزئيا مع الدم وشكلت في حلقات إعادة انسداد. تدور هذه الحلقات في حمام مائي يتم التحكم فيه بدرجة حرارة لمحاكاة ظروف تدفق الأوعية الدموية مع تأثيراته النزفية. وقد وصفت بالفعل أساليب بديلة مثل نماذج مضخة مدفوعة أو النماذج التي تستخدم صمامات الكرة الميكانيكية داخل الحلقات للحث على تدفق الدم داخل أنابيب البوليمر15,16. ومع ذلك ، فإن الميزة العامة للطريقة المعروضة هنا هي أن القوة الميكانيكية المطبقة على خلايا الدم والبروتينات منخفضة ، وتجنب الانحلال ، وليس هناك اتصال بين الدم والموصلات ، التي يمكن أن تؤدي إلى اضطرابات التدفق وتنشيط مكونات الدم. العوامل الرئيسية في الحلقة هي مواد الاختبار نفسها والهواء الذي يقع داخله. وهذا يساعد على تقليل مصادر الخطأ في القياس وتقديم قابلية عالية للتكرار، حتى لو كان يمكن أن تؤدي واجهة الدم والهواء إلى17من التكاثات البروتينية . ومن الممكن أيضا للتحقيق في أصناف من مواد الأنابيب وأقطار الدعامة دون قيود على الطول أو الحجم مما يسمح باستخدام أنابيب مختلفة الطول وقطرها الداخلي. وعلاوة على ذلك، مضيف hemocompatibilities على إغلاق حلقة غير دقيقة والتعرض لسطح أنبوب غير المصقول هي أيضا من الممكن التحقيق. تطبيقات طبية أخرى مماثلة من هذا في المختبر في شكل حلقة الدم هو أنه يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة التفاعلات بين العلاج المناعي (المخدرات) ومكونات الدم خلال التنمية قبل السريرية أو فحص سلامة الدواء الفردية قبل أول في الرجل المرحلة الأولى من التجربة السريرية الأولى، أو لتوليد المواد الخثرة التي يمكن استخدامها في مزيد من التجارب18،19،20.

تصف هذه الدراسة بروتوكول مفصل لاختبار الهيموكوكومباتيبيليتات أنابيب الضخ و / أو الدعامات. هنا، المقارنة بين أنابيب PVC غير المصقول والمغلف (hepPVC: طلاء الهيبارين، بولي بي في سي: طلاء مع بوليمر نشط بيولوجيا). تم العثور على تنشيط خفض الصفائح الدموية، ولكن تم العثور على تنشيط أعلى من نظام التخثر (FPA) لكلا الأنابيب المغلفة بالمقارنة مع أنابيب غير المصقول. يتم تعديل أنابيب hepPVC المستخدمة هنا مع الهيبارين ملزمة بشكل متكن لجعلها thromboresistant21 وقد تم بالفعل توظيفها في نموذج حلقة لتحسين وتوصيف معلمات مختلفة22. أنابيب بوليبVC المستخدمة في هذه الدراسة هي أنابيب متاحة تجاريا تستخدم في الإعدادات السريرية من سفك الدم خارجcorporeal ومغلفة مع البوليمر الهيبارين للحد من الجلطات23. في بعض الأحيان، في التطبيقات السريرية حتى تستخدم أنابيب PVC غير المصقول. ولذلك، قمنا بتضمين أنابيب اللاتكس كمجموعة تحكم إيجابية أظهرت التنشيط المفرط للصفائح الدموية، ونظام التخثر، وعوامل قابلة للذوبان مثل IL-6، TNF وPMN elastase. وقد لوحظ تشكيل خثرة عندما تم محاكاة إغلاق حلقة غير دقيقة. أدى هذا إلى تنشيط التخثر ونظام مكمل وكذلك الكريات البيض والصفائح الدموية مقارنة مع الظروف الأساسية. وعلاوة على ذلك، فإن ملامسة الدم للمادة الدعامة المستخدمة هنا (دعامة نيتينول المعدنية العارية، المغطاة ببروتين ثيرافلورو إيثيلين الموسع المشبع بالكربون) أدت إلى زيادة تنشيط الصفائح الدموية والكريات البيض من حيث PMN elastase. وعموما، لم النموذج المقدمة الحث على الانحلال في أي من أجهزة الأوعية الدموية اختبارها كما كانت مماثلة لخط الأساس أو الظروف الثابتة، باستثناء أنابيب اللاتكس، حيث خلايا الدم الحمراء (RBC) الانحلال كان واضحا. وعلاوة على ذلك، يمكن فحص هذه الأنابيب التسريب إما عن طريق التصوير أو عن طريق علم الأنسجة. على الرغم من أن التقييمات النسيجية قد تكون مجدية، ركزنا بشكل رئيسي على ELISA و تدفق قياس الاستئصال الخلوي لإجراء هذه التجارب وبالتالي تمكين جدوى إجراء التجارب على أساس النموذج المعروض هنا للعديد من المختبرات. وبالتالي، فإن هذه الطريقة تمثل طريقة مجدية لاختبار التوافق الحيوي للدم من الأجهزة الطبية الوعائية وفقا لتوصيات معيار ISO 10993-4. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة كلما التفاعل بين الدم والمواد ينبغي اختبارها في ظل ظروف التدفق، محاكاة في الظروف الجسمية.

Protocol

وقد وافقت على هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في مستشفى جامعة ماغديبورغ (الطلب رقم 88/18) وقدمت المواد الموافقة الخطية عن علم قبل إجراء سحب الدم. 1- تحضير مخزون الهيبارين وأخذ عينات من الدم حساب كمية الدم اللازمة للتجارب بأكملها.ملاحظة: تقريبا، مطلوب 5 مل من الدم heparinized لكل جهاز الأوعية الدموية في التكرارات (الحلقات). وبالمثل، مطلوب 5 مل من الدم لكل شرط خط الأساس والساكتة التي يتم الاحتفاظ جانبا في درجة حرارة الغرفة. إعداد محلول مخزون الهيبارين بتركيز 100 وحدة دولية/مل من خلال تخفيف الهيبارين غير المفرّق (على سبيل المثال، Rotexmedia) في المياه الأيونية. استخدام 150 μL من هذا الحل للهبرين من الدم الطازج 10 مل. حساب كمية الدم وكذلك البلازما التي هي اللازمة لعدد خلايا الدم كله, ELISA وFACS المقايسة.ملاحظة: يتم الحصول على القياسات الممثلة في هذه الدراسة من حلقتين تعملان بالتوازي (واحدة مكررة) بحجم دم إجمالي قدره 10 مل. بناء على الكمية المطلوبة من الدم، ملء 10 مل الحقن مع 150 ميكرولتر من محلول مخزون الهيبارين لمنع تخثر الدم مع تركيز هيبارين النهائي من 1.5 وحدة دولية / مل الدم. رسم الدم باستخدام فراشة (حجم: 21 G). ملء المحاقن بلطف شديد لتجنب الانحلال أو تنشيط الخلية بسبب الفراغ المفرط.ملاحظة: يجب الحصول على إذن من اللجنة الأخلاقية المحلية قبل بدء التجارب. الحصول على موافقة مستنيرة من كل متبرع بالدم البشري. تأكد من أن المتبرع بالدم صحي ولا يتناول أي دواء ، خاصةً عدم وجود عوامل مضادة للصفيحات أو أدوية مضادة للالتهابات غير الستيرويدية لمدة 10 أيام على الأقل قبل التجارب. وتجدر الإشارة إلى أن نفس المتبرع يفضل عند مقارنة أنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية لأول مرة كما هو معروض في هذه المخطوطة. ولزيادة تقييم الاختلافات بين الأفراد، يمكن تكرار البروتوكول مع مختلف المانحين. جمع الدم في كوب الزجاج، وتجنب التحريض المفرط. 2. في المختبر الدموية الدموية حلقة الجمعية ملء حمام الماء حتى يصل منسوب المياه إلى مركز وحدة التناوب. تعيين درجة حرارة المياه إلى 37 درجة مئوية. حلقة الجمعية لاختبار مواد أنابيب مختلفة (polyPVC، hepPVC، PVC و اللاتكس) قطع قطعتين 50 سم طويلة من كل مادة أنبوب (القطر الداخلي 5 مم) مع القاطع أنبوب. تأكد من أن سطح القطع مسطح ، لأن هذا مهم بشكل خاص لاغلاق مثالي لالحلقات ذات القطرات الصغيرة بحيث يتدفق الدم دون أي تشويه على حافة المناسب.ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بأكمله الأنابيب التي يبلغ قطرها الداخلي 5 مم. لتسهيل التعامل مع وتجنب تأخير معالجة ما بعد العينة بعد التدوير، تشغيل فقط أربع حلقات (2 مواد في التكرارات) في موازاة ذلك. لتوليد شكل حلقة، سد النهايات المفتوحة للأنابيب في قطعة قصيرة من أنبوب السيليكون تركيب القطر الخارجي للأنبوب التحقيق. استخدام نطاقات التوتر البولي لضمان إغلاق السليم من الحلقات. عند استخدامها لأول مرة، ضبط طول العصابات لتناسب القطر الخارجي لللحلقة عن طريق قطع الفرقة التوتر مع مقص في أطوال المطلوبة وتأمينه مع وجع عزم الدوران 3 مم. تشديد بعناية المسمار قفل موصل الفرقة التوتر تحت التفتيش من نهايات أنبوب. ضبط قوة الإغلاق بحيث لا توجد فجوة بين نهايات الأنبوب. إذا تم تشديد المسمار قفل تماما والتوتر من الفرقة البولي يبدو منخفضا جدا لسد الفجوة بين نهايات أنبوب، وفتح قفل النظام وقطع عدد قليل مم من الفرقة التوتر. كرر هذا، حتى يتم تحقيق إغلاق حلقة دقيقة(الشكل 1A). إذا كانت المواد الأنابيب لينة جدا ويميل إلى الانزلاق داخل عصابات التوتر، وإصلاح حلقة مع الشريط الكهربائي إلى الفرقة التوتر(الشكل 1B, C). إعداد حلقة إضافية من PVC للتحكم في درجة الحرارة مع نفس الأبعاد مثل حلقات الاختبار. تأمين الحلقات في حلقة مهد وحدة دوران خارج حمام الماء. بعد ذلك، نعلق مهد حلقة إلى وحدة دوران داخل حمام الماء (الشكل 1E). تفكيك الفرقة التوتر جزئيا من الحلقات وافصل نهاية واحدة من كل أنبوب لفتح الحلقة. ملء بلطف كل حلقة مع 5 مل من الدم مع ماصة المصلية 5 مل. مزيج الدم بلطف مرتين في كوب الزجاج عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا قبل التحميل في الحلقات. خذ ميزان الحرارة المتاح وضعه داخل حلقة التحكم في درجة الحرارة. إذا كان ميزان الحرارة كبيرًا جدًا ، فقطعه بمقص ليناسب أنابيب أصغر. ملء حلقة مع 5 مل من المياه ديوند في درجة حرارة الغرفة. أغلق الحلقات وتأكد من تركيب الحلقات ونطاقات التوتر والحامل بشكل صحيح. تعيين سرعة دوران إلى 30 جولات في الدقيقة (دورة في الدقيقة) وتدوير ل 3 ساعة. تجميع حلقة لاختبار تأثير إغلاق حلقة غير لائق (الفجوة) إعداد أربع حلقات (polyPVC) كما هو موضح في 2.2. إغلاق اثنين من الحلقات بشكل صحيح مع عصابات التوتر وتجنب أي فجوة بين نهايات أنبوب. بالنسبة للأخرى اثنين من الحلقات سد النهايات المفتوحة في أنبوب أكبر كما هو موضح في 2.2.3، ولكن ترك فجوة من 1-2 ملم بين نهايات الحلقة. لا تستخدم نطاقات التوتر لهذه الحلقات (الشكل 1D). قم بإعداد حلقة تحكم درجة حرارة واحدة كما هو موضح في 2.2.7 و2.2.11. ملء جميع الحلقات بالدم كما هو موضح في 2.2.10. تعيين سرعة دوران إلى 30 دورة في الدقيقة وتدوير ل 3 ساعة. تجميع حلقة لاختبار الدعامات إعداد أربع حلقات كما هو موضح في 2.2 وما يليها.ملاحظة: لتقييم التوافق الحيوي للدم من الدعامات، ينبغي اختبار مادة الأنابيب نفسها لتكون قابلة للتكوابل البيولوجي من أجل منع إخفاء تنشيط الخلية. إذا لم تكن هناك بيانات، يمكن اختبار مادة الأنبوب نفسها كما هو موضح في 2.2. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق النطاق القطر داخل الدعامة (انظر تعليمات الشركة المصنعة) وينبغي أن تناسب القطر الداخلي للمادة أنبوب. فتح اثنين من الحلقات واتخاذ أنبوب من نظام الفرقة التوتر. أدخل الدعامة في منتصف الأنبوب حسب تعليمات الشركة المصنعة. استخدام الحلقات الأخرى اثنين دون الدعامات كتحكم. ملء جميع الحلقات بالدم كما هو موضح في 2.2.10. ضبط سرعة دوران إلى 30 دورة في الدقيقة وتدوير ل 3 ساعة. التحكم في درجة الحرارة في أي وقت خلال مدة وعند توقف دوران، ودرجة حرارة الدم داخل الحلقات هو مبين من قبل ميزان الحرارة داخل حلقة التحكم في درجة الحرارة. لقراءة درجة الحرارة، ووقف دوران وقراءة فورا قبالة درجة الحرارة المشار إليها من قبل ميزان الحرارة. 3. معالجة عينة الدم بعد دوران، والسماح للحلقة الوقوف في الرف لمدة 2 دقيقة في وضع تصاعدي للسماح للدم تتراكم في الجزء السفلي من الحلقات، وتجنب أي سفك في حين فتح الحلقات. فحص الدم اليسار لظروف ثابتة: إذا تم تخثر هذا الدم، يشتبه في نهاية المطاف heparinization غير لائق. في هذه الحالة ، كرر التجربة ويفضل أيضا مع متبرع آخر بالدم. تأخذ بعناية الحلقات من الرف. فتح الموصلات والسماح للتدفق الدم في كوب الزجاج 10 مل. تجمع الدم من الأنابيب التي يتم تشغيلها في التكرارات. اسحب دماء جديدة لتحليل خط الأساس من نفس الجهة المانحة كما هو موضح في 1.5 و 1.6. جمع دم سترات الصوديوم لجمع الدم سيترات الصوديوم، ملء أربعة أنابيب 1.5 مل، كل مع 111 ميكرولتر الصوديوم حل جمعت من أنابيب سيترات الصوديوم، لتوليد تركيز النهائي من 3.2٪ من سترات الصوديوم. ملء كل أنبوب مع 1 مل من الدم من الكؤوس الزجاجية كما هو موضح في 1.6 و 3.3. الحفاظ على الدم في درجة حرارة الغرفة واستخدام هذا الدم لتحليلات FACS كما هو موضح في 12.ملاحظة: لتغيير طول الحلقات ل setups التجريبية مختلفة، خطة aliquots بشكل صحيح استناداً إلى مقدار القياسات التي سيتم إجراؤها. قد يكون من الضروري إنشاء جميع القياسات المطلوبة مع الدم الطازج قبل التجارب الحقيقية لضمان حجم الدم في الحلقات يكفي لجميع القياسات. جمع عينات من حمض الإيثيلين الدييتامينتراستيك (EDTA) عينات الدم والبلازما. من كل كوب زجاجي بالدم (انظر 1.6 و 3.3) نقل 4.5 مل من الدم في أنبوب EDTA 5 مل. ملء اثنين من أنابيب EDTA من كل 10 مل كوب زجاجي بالدم. خلط بلطف الدم والاحتفاظ بها على الجليد. نقل 2 مل من الدم في أنبوب الطرد المركزي قفل 2 مل واستخدام هذا الدم لعدد خلايا الدم وقياس الهيموغلوبين الحرة كما هو موضح في 5. و6. جهاز طرد مركزي الدم المتبقي في 3500 س ز لمدة 20 دقيقة. جمع البلازما بعناية في عظمى في 500 ميكرولتر aliquots وتجميد على الفور في -80 درجة مئوية. 4. مسح المجهر الإلكتروني وصور ميكروتك بعد معالجة عينة الدم، شطف الحلقات الفارغة التي أعدت كما هو موضح في 2.3 مع 10 مل من المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) لكل من. قطع بعناية عينة 1 سم طويلة من كل نهاية كل أنبوب مع مشرط. عينة احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في محلول جلوتارالديهيد 2٪ .تنبيه: يمكن أن يسبب استنشاق أبخرة الألدهيد أعراضًا أنفية مثل سيلان من خام الأنف المستمر وتهيج مجرى الهواء ، والتلامس مع الجلد يسبب التهاب الجلد. يجب التعامل مع ألدهيدس في غطاء الدخان أثناء ارتداء القفازات وثوب الحماية ونظارات السلامة. شطف العينة (3 مرات) مع برنامج تلفزيوني. إعداد 1٪ من محلول تتراوكسيد أوسميوم (OsO4)في المياه deionized وعينة احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.تنبيه: OsO4 هو عامل مؤكسد قوي، يمكن تقليله عن طريق التعرض للضوء. لتجنب التخفيض أثناء التحضير، قم بتخزين OsO4 في زجاجة زجاجية بنية. OsO4 متقلب للغاية ، أبخرةها سامة للعينين والأنف والحنجرة. دائماً العمل تحت الأبخرة غطاء محرك السيارة واستخدام قفازات وحماية الملابس، وضمان أن أي جزء من الجسم يتعرض لOsO4. اتصل بالمبادئ التوجيهية لمؤسستك فيما يتعلق بمعالجة التخلص من النفايات وتخزينها. بشكل عام ، OsO4 قابل لستور لعدة أشهر ، لكنه يحتاج إلى زجاجات زجاجية خاصة مع بطانة تفلون و desiccator ، لأن OsO4 يمكن أن تلون الأسطح الداخلية ومحتويات الثلاجة في وجود أبخرة متسربة. إخراج العينات، ونقلها في أنابيب جديدة للطرد المركزي 15 مل وشطف العينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تحضير سلسلة من الإيثانول بتركيزات متفاوتة (25%، 50%، 75%، 95%، 100%) عينات التجفيف في الإيثانول: احتضان لمدة 20 دقيقة لكل من 25٪ ، 50 ٪ ، 75 ٪ و 90 ٪ و 30 دقيقة في 100 ٪. أخذ عينات من 100٪ الإيثانول والسماح لها الهواء الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. فحص العينات في المجهر الإلكتروني المسح الضوئي في الجهد تسارع 5 كيلوفولت ومع الأشعة السينية μCT الماسح الضوئي. 5. عدد خلايا الدم خذ 2 مل من الدم EDTA التي تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.3 أدخل الأنبوب في محلل أمراض الدم الآلي واتبع تعليمات الشركة المصنعة. 6. قياس الهيموغلوبين الحرة (fHb) في البلازما ذوبان عينة بلازما واحدة من كل حالة تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5. يُحفظ على الجليد بعد الذوبان.ملاحظة: دائماً قم بذوبان عينات البلازما المجمدة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ونقلها على الفور إلى الجليد، التي تحتوي على بعض الماء، لخفض درجة الحرارة. وهذا أمر مهم لتجنب تنشيط مكونات الدم أثناء الذوبان. استخدم كاشف fHb واتبع تعليمات الشركة المصنعة. تجنب التلوث بعد فتح وحماية الكاشف من الضوء المباشر (الشمس، ضوء الأشعة فوق البنفسجية). استخدم مخطط التنقيط (انظر إرشادات الشركة المصنعة) مع تخفيف 1:5. إضافة 1000 μL من كاشف الهيموغلوبين في cuvette 1.6 مل شبه الصغر. استخدم هذا cuvette لتحديد قيمة فارغة. إضافة 1000 μL من كاشف الهيموجلوبين و 250 ميكرولتر من عينة البلازما في آخر cuvette شبه الصغرى. اخلطي المحتويات في كل من الحفّاضات عن طريق مسح الماصة جيداً عن طريق ملء الخليط المتكرر من التفاعل، وحضن على الأقل 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تحديد انقراض (E) العينة ضد كاشف fHb كمكشف فارغ. حساب تركيز fHb (مليمول / لتر) من العينة: E540-E680 x 0.452. 7. قياس FPA ذوبان عينة البلازما من كل شرط تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5 وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد. استخدام FPA إليسا عدة واتبع تعليمات الشركة المصنعة. 8. قياس sC5b9 ذوبان عينة البلازما من كل شرط تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5 وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد. استخدم مجموعة SC5b-9 ELISA واتبع تعليمات الشركة المصنعة. 9. قياس PMN ذوبان عينة البلازما من كل شرط تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5 وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد. استخدم مجموعة PMN-Elastase ELISA واتبع تعليمات الشركة المصنعة. 10. قياس TNF يجب أن تكون مغلفة microplates يوم واحد قبل تشغيل ELISA. للطلاء، إضافة 100 ميكرولتر من التقاط محلول الأجسام المضادة لجميع الآبار، لوحة الختم واحتضان بين عشية وضحاها في 2 درجة مئوية-8 درجة مئوية. ذوبان عينة بلازما واحدة من كل حالة تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5. يُحفظ على الجليد بعد الذوبان. استخدم مجموعة TNF ELISA واتبع إرشادات الشركة المصنعة. 11. قياس IL-6 يجب أن تكون مغلفة microplates مع الأجسام المضادة التقاط يوم واحد قبل التجربة. للطلاء، إضافة 100 μL من التقاط حل الأجسام المضادة لجميع الآبار من microplate المقدمة مع مجموعة، لوحة الختم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ذوبان عينة البلازما من كل حالة تم الحصول عليها كما هو موضح في 3.7.5. وتخزينها على الجليد بعد ذوبان الجليد. استخدم مجموعة IL-6 ELISA واتبع تعليمات الشركة المصنعة.. 12 – تحليلات نظام مراقبة الأصول الميدانية إعداد 500 مل من العازلة FACS عن طريق إضافة 10 مل من مصل عجل الجنين و 2 مل من EDTA حل (0.5 M) إلى 488 مل من 1X PBS. يمكن تخزين المخزن المؤقت FACS لمدة 4 أسابيع عند 4 درجات مئوية. استخدام 100 ميكرولتر من الدم سيترات الصوديوم (انظر 3.6.3) لكل عملية تلطيخ (مجاميع الصفائح الدموية أحادية الكيس (MPA)، تنشيط الصفائح الدموية (السلطة الفلسطينية)، كريات الدم الكريات البيض (LI)). Pipette 100 ميكرولتر من الدم من كل عينة إلى أنبوب FACS 5 مل. من كل عينة، وإعداد 3 أنابيب لتلوين الأجسام المضادة والتسمية مع MPA (مجاميع الصفائح الدموية أحادية الكيس) لوحة، السلطة الفلسطينية (مجاميع الصفائح الدموية) ولوحة LI (الكريات البيض integrin). اخلط باقي العينات 4 في أنبوب واحد 5 مل فاكس. استخدم هذا المزيج لعناصر التحكم غير المطّوعة والمفلورة ناقص واحد (FMO). إعداد 6 أنابيب FACS عن طريق الأنابيب 100 ميكرولتر من الدم عينة مختلطة في كل أنبوب. تسمية 3 أنابيب كما غير المطهية و 3 أنابيب كما FMO-CD41، FMO-CD62P و FMO-CD162. إضافة 100 μL من 4٪ حل شبه شكلي واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.تنبيه: البارفورمالديهايد سام للبشرة والعينين. يمكن أن يسبب تهيج رئوي خطير عند استنشاقه ويمكن أن يؤدي إلى تلف الرئة بعد التعرض لفترات طويلة. وعلاوة على ذلك، فإنه يصنف على أنه مادة مسرطنة وسموم تناسلي. دائما ارتداء القفازات ونظارات السلامة والعمل تحت غطاء محرك الدخان. إضافة 1 مل من العازلة غسل لكل أنبوب والطرد المركزي في 287 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل سوبرنات وكرر خطوة الغسيل مرتين. لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) ، أضف 1 مل من 1x العازلة RBC تحلل العازلة (تمييع 10x RBC تحلل العازلة في المياه deionized) ، مزيج عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا واحتضان لمدة 5 دقائق في RT في الظلام. إعداد الخرز التعويض عن البقع واحد. إلى 1 مل من المخزن المؤقت FACS إضافة 4 قطرات من كل حبات إيجابية وسلبية. دوامة شاملة وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الخرز إلى أنبوب واحد FACS 5 مل. إعداد 4 أنابيب مع الخرز والتسمية كما CD14-FITC، CD41-BV421، CD45-APC و CD62P-PE. إضافة 1 مل من العازلة FACS إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 287 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل عظمى والحفاظ على الجليد. بعد تحلل RBC ، أضف 1 مل من عازلة FACS لكل أنبوب ويغسل كما هو موضح في 12.7. تجاهل مُتفوّك. إعداد كوكتيلات الأجسام المضادة: لوحة MPA: إضافة 4 ميكرولتر من CD45-APC، 4 ميكرولتر من CD14-FITC و4 ميكرولتر من CD41-BV421 إلى 388 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. لوحة السلطة الفلسطينية: إضافة 1.6 ميكرولتر من CD41-BV421 و 12 ميكرولتر من CD62P-PE إلى 386.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. لوحة LI: إضافة 4 ميكرولتر من CD45-APC و 8 ميكرولتر من CD162-BV421 إلى 388 ميكرولتر من مخزن FACS. حافظ على الثلج. إعداد البقع واحد: إضافة 0.5 μL إلى 499.5 ميكرولتر من FACS العازلة لكل من CD14-FITC، CD41-BV421 و CD45-APC. بالنسبة لـ CD62P-PE، أضف 0.3 ميكرولتر إلى 499.7 ميكرولتر من مخزن FACS. حافظ على الثلج. إعداد عناصر التحكم FMO: (i) لوحة MPA (FMO-CD41): أضف 1 ميكرولتر 1 ميكرولتر مضادة CD14-FITC و 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD45-APC إلى 98 ميكرولتر فاكس العازلة. لوحة السلطة الفلسطينية (FMO-CD62P): تضاف 0.4 ميكرولتر من CD41-BV421 إلى 99.6 ميكرولتر من مخزن فاكسات. ‘3’ لوحة LI (FMO-CD162): يضاف 1 ميكرولتر من CD45-APC إلى 99 ميكرولتراً من مخزن احتياطي فاكس. الحفاظ على ضوابط FMO على الجليد. دواتكس كوكتيلات الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولتر من كل كوكتيل الأجسام المضادة كما أعدت في 12.12 إلى كل من الأنابيب ذات العلامات (MPA، السلطة الفلسطينية ولوحة LI) كما هو موضح في 12.3 ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. إبقاء على RT في الظلام. دوامة واحدة وصمة عار تخفيف الأجسام المضادة وإضافة 100 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة وصمة واحدة كما أعدت في 12.13. لكل من الأنابيب المسماة مع الخرز كما هو موضح في 12.7 ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. إبقاء على RT في الظلام. Vortex FMO الأجسام المضادة الكوكتيلات وإضافة 100 ميكرولتر من كل كوكتيل الأجسام المضادة FMO-1 كما أعدت في 12.14. لكل من الأنابيب المسماة (FMO الضوابط) كما هو موضح في 12.5. وخلط بلطف عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. إبقِ في الـ RT في الظلام. احتضان جميع الأنابيب مع جسم مضاد تلطيخ لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. اتخاذ الأنابيب الثلاثة للسيطرة غير الملطخة (انظر 12.4) وبيدية ريسوسيبوسنيد في 250 ميكرولتر من العازلة FACS. حافظ على الثلج. بعد فترة الحضانة، وغسل جميع الأنابيب باستثناء غير المطّط الضوابط مرة واحدة مع العازلة FACS كما هو موضح في 12.7. إعادة بناء بيليه في 250 ميكرولتر من العازلة FACS والحصول على البيانات على مقياس التدفق. استخدام الخلايا غير المُطَوَّتة للإعدادات السلبية وخرز الماوس التعويضي للإعدادات الإيجابية في برنامج FACS. وعلاوة على ذلك، استخدم FMO للسيطرة على استراتيجية الغاء، حيث يتم استخدام FMO-CD41 في لوحة MPA، يتم استخدام FMO-CD62P في لوحة السلطة الفلسطينية ويستخدم FMO-CD162 في لوحة LI. الحصول على ما يقرب من 0.5 × 106 – 0.25 × 106 أحداث لكل أنبوب لـ FACS. حفظ البيانات وتحليلها باستخدام برنامج تحليل (الإصدار 9.9.6).

Representative Results

وقد تم تحليل جميع البيانات المقدمة، باستثناء مخططات FACS، باستخدام برنامج إحصائي. تم تحليل مخططات FACS باستخدام برنامج تدفق القياسات الكيسية. لم يظهر تحليل تعداد خلايا الدم الكاملة أي اختلافات كبيرة فيما يتعلق بالكريات الحمراء بين جميع الحالات المختبرة (الشكل 2). ولكن، خفضت الصفائح الدموية وleukocytes بشكل كبير في مجموعة اللاتكس، مما يشير إلى ضعف التوافق الحيوي للغاية من اللاتكس. وهذا ما يؤكده كذلك زيادة مستويات الهيموغلوبين الحرة في مجموعة اللاتكس، مما يشير إلى أنه باستثناء مجموعة اللاتكس، لم تؤد أي من أجهزة الأوعية الدموية الأخرى أو الظروف إلى انحلال الدم على نطاق واسع(الشكل 2). وعلاوة على ذلك، فإن أنابيب PVC المغلفة، بولي بي في و hepPVC، فضلا عن الدعامة اختبارها لم يؤدي إلى تجلط الدم عن طريق فقدان الصفائح الدموية وleukocyte، في حين أظهرت اللاتكس أعلى فقدان الصفائح الدموية وleukocyte، تليها أنابيب PVC غير المصقول التي أظهرت انخفاض الاتجاه. في حين أن جميع أجهزة الأوعية الدموية اختبارها أدت إلى زيادة تنشيط نظام التخثر (FPA) وعنصر مكمل (sC5b-9)، حلقات hepPVC أظهرت اتجاها لانخفاض مستويات FPA وsC5b-9 عند مقارنتها خصيصا لحلقة بوليبVC(الشكل 3). ومن المثير للاهتمام، أظهرت حلقات PVC والفجوة غير المصقول مستويات أقل من FPA مقارنة بـ polyPVC، على الرغم من عدم الوصول إلى مستوى الأهمية الإحصائية. ومع ذلك، أظهرت حلقات اللاتكس زيادة كبيرة في مستويات FPA بالمقارنة مع خط الأساس والظروف الثابتة. وفقا لجميع تعدادات خلايا الدم، أظهرت حلقات اللاتكس أعلى مستوياتTNF، IL-6 وPMN elastase(الشكل 4)،لتصل إلى مستوى الأهمية الإحصائية بالمقارنة مع بقية المجموعات من حيث TNF و IL-6(الشكل 4A,B)،في حين أن الشروط الثابتة وخطوط الأساس من حيث PMN elastase(الشكل 4C). هذه النتائج تشير إلى تنشيط قوية من الكريات البيض من قبل اللاتكس. كانت مستويات خط الأساس لعلامات التنشيط قابلة للمقارنة دائمًا مع الظروف الثابتة ، مما يشير إلى حدوث هدّان مناسب للدم. ومن المثير للاهتمام، فقد تبين أن الصفائح الدموية و كريات الدم الكريات البيض التهم لفجوة الحلقات الناجمة عن خفضت قليلا فقط مع تنشيط معتدل من نظام التخثر (FPA) و الكريات البيض (PMN elastase)، على الرغم من إغلاق حلقة غير لائق مع الاضطرابات تدفق الناتجة والاتصال بالدم إلى سطح غير المصقول، وقطع تقريبا أدى إلى جلطات مرئية العيانية في splice(الشكل 1F). كانت الجلطات وتوزيعها على سطح العبوة بأكملها واضحًا مع صور μCT و SEM ، في حين لم يتم العثور على جلطة عندما تم إغلاق الحلقات مع جهاز الإغلاق الخارجي مما لا يترك أي فجوة بين نهايات الحلقة (الشكل 5). تحليل التدفق السيتوميتري لخلايا الدم المضيفة التي كانت ملطخة بعلامات محددة من الصفائح الدموية ، CD41 وعلامة تنشيط الصفائح الدموية CD62P ، تظهر في الشكل 6A ، B. هنا، أظهرت أنابيب اللاتكس عالية للغاية كثافة الفلوروس الوسيط (MFI) لCD62P على الصفائح الدموية، تليها الدعامة، في حين أن أنابيب البولي بيVC المغلفة الهيبارين أظهرت الحد الأدنى من التنشيط من الصفائح الدموية التي تصور الملكية المضادة للتخثر من أنابيب بولي بي سي. وعلاوة على ذلك، تم تصنيف الكريات البيض على أساس CD45 وSSC (الجانب المبعثر) الحبوبية القائمة على أساس ‘1’ الحبيبات؛ (ii) وحيدات و (3) الخلايا الليمفاوية (الشكل 7) ، وتم الكشف عن التعبير عن CD162+ integrin على كل مجموعة فرعية من الكريات البيض التي من المعروف أنها تتفاعل مع CD62P على الصفائح الدموية24. ولوحظ أن التعبيرات integrin خفضت بشكل كبير على المحببات والخلايا الليمفاوية في الحلقات اللاتكس. وكانت هذه النتيجة تمشيا مع انخفاض مستويات مجموع ترددات الكريات البيض في الحلقات اللاتكس (الشكل 2). بشكل عام، كانت مستويات integrin أعلى بين أحاديات عندما مقارنة الحبيبات الحبيبية والخلايا الليمفاوية، مما يشير إلى احتمال لتفاعل أحادية مع الصفائح الدموية المنشطة. وفي هذا الصدد، تم تقييم مجاميع الصفائح الدموية أحادية الخلايا أيضا عن طريق تلطيخ خلايا الدم مع CD14 (كما علامة أحادية) وD41 (كما علامة الصفائح الدموية) وفي نهاية المطاف لتحديد الخلايا الإيجابية المزدوجة أي CD14+CD41+MPA (الشكل 8). هنا، لاحظنا أن مجموعة الدعامات أظهرت أعلى مستويات التعبير CD41 على MPA، تليها مجموعة اللاتكس، مما يشير إلى زيادة الميل إلى تشكيل MPA، على الرغم من انخفاض وتيرة أحادية (< 1 %) في حلقات اللاتكس. الشكل 1: نظرة عامة على نموذج حلقة الدموية في المختبر الصناعي وتعديلاته. (A) حلقة لتجربة الفجوة مع نظام إغلاق حلقة خارجية ، وترك أي فجوة في لصق. (B) حلقة مصنوعة من مادة البولي بي سي المغلفة أنبوب PVC والدعامات داخل (السهم). (C)حلقة مصنوعة من أنبوب اللاتكس. (D)حلقة لتجربة الفجوة دون نظام إغلاق حلقة خارجية ترك فجوة بين نهايات أنبوب (السهم). (E)الحلقات وضعت في حلقة مهد داخل حمام الماء ومليئة بالدم. (F) ثركمبوس مما أدى إلى وجود فجوة في لصق (السهم) بعد التناوب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: نتائج عدد خلايا الدم والهيموجلوبين البلازما. (أ) عدد كريات الدم الحمراء. (ب) الصفائح الدموية العد. (F) عدد الكريات البيض. (D) الهيموجلوبين البلازما الحرة. وتشير النتائج إلى ضعف التوافق البيولوجي للماتكس، مما يؤدي إلى الانحلال الانحلالي المفرط. وتقدم البيانات على أنها قيمة متوسطة؛ تشير أشرطة الخطأ SEM. n = 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: نتائج تفعيل نظام التخثر والتكميل. (أ)تفعيل نظام التخثر، تقاس بمستويات فيبرينوبيبتايد A (FPA) (B) مكملة لتنشيط النظام، تقاس بمستويات sC5b-9. في حين أن أنابيب اللاتكس أثارت مستويات مرتفعة كبيرة من FPA، وكان التنشيط تكملة قوية لجميع المواد اختبارها. يتم عرض البيانات على أنها قيمة متوسطة، وتشير أشرطة الخطأ إلى SEM. * p<0.05, n=1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: علامات تنشيط الكريات البيض. (A) الورم معامل نخر ألفا (TNF). (ب) إنترلوكين 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. وتشير النتائج إلى زيادة تنشيط الكريات البيض بسبب ارتفاع مستويات العلامات المحللة، تليها حلقات الدعامة، التي أدت فقط إلى زيادة مستويات PMN Elastase ولكن ليس TNF أو IL-6. يتم عرض البيانات على أنها قيمة متوسطة، وتشير أشرطة الخطأ SEM. * p<0.5; **p<0.01, n=1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تصوير لصق الحلقات. (A) μ الكمبيوتر (μCT) من الحلقات مع إغلاق غير لائق (الفجوة). المناطق الحمراء تشير إلى مواد خثرة. (ب) تقديم الجانب اللمبّر من الأنبوب. يشير التحديد المستطيل إلى منطقة المسح المجهري الإلكتروني (SEM) (C). (D) μCT من الحلقات مع جهاز إغلاق حلقة خارجية ولا توجد فجوة في لصق ، و (E) تقديم وعرض السطح اللمبين. لم يتم العثور على أي مواد خثرة. (F) SEM صورة من اختيار مستطيلة في (E). لم يتم العثور على أي مواد خثرة على سطح القطع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: مؤامرة FACS لتنشيط الصفائح الدموية (CD62P). (أ) ممثل FACS مؤامرة (شرط أساسي) تظهر الدم CD41+ الصفائح الدموية. (B) رسم بياني يوضح حالة تنشيط الصفائح الدموية التي تعكسها شدة الفلور (MFI) المتوسط لأنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية بالمقارنة مع RT الثابتة وظروف خط الأساس. تقدم أشرطة البيانات بيانات من قياسات مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: مؤامرة FACS للتكريس البيض integrin (CD162). (أ) ممثل FACS مؤامرة (شرط أساسي) تظهر الدم CD45+ الكريات البيض والمجموعات الفرعية (B) الرسم البياني يظهر الكريات البيض CD162+ integrin متوسط كثافة الفلور (MFI) من أنواع مختلفة من الأجهزة الوعائية بالمقارنة مع الظروف الثابتة والظروف الأساسية. تقدم أشرطة البيانات بيانات من قياسات مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: مؤامرة FACS للمجاميع أحادية الصفيحات (CD41/CD14). (أ) ممثل FACS مؤامرة (شرط أساسي) تبين الغاء ل monocytes الدم (CD45++ CD14+) ، الصفائح الدموية (CD41+ +) ومجاميع الصفيحات أحادية الخلايا (CD41+/ CD14+) (B) الرسم البياني يظهر CD41+ متوسط شدة الفلوريسنس (MFI) على مجاميع صفيحة أحادية الخلايا لمختلف الأجهزة الوعائية مقارنة بالشروط الثابتة وخطوط الأساس. تقدم أشرطة البيانات بيانات من قياسات مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد أظهرت هذه الدراسة أن قدم في المختبر نموذج حلقة الدمية يقدم طريقة موثوقة لاختبار توافق الدم في المختبر من الأجهزة الطبية وفقا لمعيار ISO 10993-4.

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول سحب الدم وملء الأنابيب بالدم، حيث ينبغي تجنب الفراغ المفرط أو التحريض لمنع مكونات الدم من التنشيط عن طريق إجراء المناولة. وعلاوة على ذلك، من المهم جدا تجميد عينات البلازما على الفور والاحتفاظ بها على الجليد بعد ذوبان الجليد، كما يمكن العبث تنشيط نظام مكمل والتخثر عن طريق الحفاظ على العينات على درجة حرارة الغرفة لفترة أطول.

وبما أن هذا النموذج له مزايا وعيوب بالمقارنة مع نماذج أخرى في المختبر، يجب أن تؤخذ في الاعتبار عدة عوامل أثناء تصميم التجارب.

أولا، يمكن أن تختلف الحلقات في الطول وقطر لتناسب مختلف الاجهزة التجريبية. في حالة الإعداد يتضمن أنابيب متناقضة من أقطار داخلية متفاوتة، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن الاختلافات في القطر سيؤدي إلى قوى القص المختلفة، مما يؤثر على التخثر وتكملة تتالي7. ثانياً، تم تعيين سرعة الدوران إلى 30 دورة في الدقيقة في هذه التجربة. وهذا سيؤدي إلى تدفق الدم من حوالي 25 سم / الثانية، والتي هي مماثلة لسرعة تدفق الدم في الشريان التاجي البشري الطعومالالتفافية 25. معدل السلالة، التي تولدها دوران الحلقات، هو المعلمة الرئيسية التي ستبدأ الشلالات الكيميائية الحيوية من مكونات الدم، بما في ذلك الخلايا والبروتينات الخالية من الخلايا. ولكن كما الدم هو السائل غير نيوتن، وسوف تتأثر أيضا معدل سلالة من قبل انحناء أنبوب، على التوالي طول الأنابيب التي يتم إغلاقها إلى الحلقات10. كلما تم تغيير سرعة دوران أو حجم الحلقة، من المهم أن نعتبر أن العلاقة بين معدل الضغط وسرعة الدوران ليست خطية. لا يتم فحص العلاقة بين سرعة الدوران ومعدل الإجهاد بما فيه الكفاية حتى اليوم ، وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات للتحقيق في هذه المعلمات خاصة10،26،27. ومع ذلك، استنادا إلى نموذج لطبقة الحدود laminar، قطر أنبوب معين من 5 ملم وسرعة دوران 25 سم / ث، وهو تقدير تقريبي من الإجهاد القص الجدار (WSS) تشير إلى القيم بين 2.20-22.00 باسكال لمسافة 1،00-0،01 ملم إلى جدار الأنبوب عندما تقدر كثافة الدم لتكون 1060 كجم * م-3 ويتم تعيين اللزوجة الكينية إلى 0.0025 باسكال * ق28،29. ومن المثير للاهتمام ، أيضا تحليل أكثر تفصيلا الحسابية للديناميات تدفق في انحناء الشرايين التاجية البشرية أظهرت قيم WSS تتراوح بين 11.33 إلى 16.77 باسكال في المعلمات قابلة للمقارنة تقريبا للسرعة والكثافة واللزوجة من الدم30.

بجانب هذا القيد، ونموذج حلقة المعروضة هو نظام ضغط أقل، التي لا تحاكي نسب ضغط الدم داخل الأوعية الدموية من نظام الأوعية الدموية البشرية.

القيد المهم التالي هو أن الدم في اتصال مع الهواء داخل الحلقات ، مما يجلب تدخلات إضافية. ويتأثر مثل هذا الاتصال الدم والهواء من قبل اثنين من المعايير، والتي تشمل نفاذية الغاز من الأنابيب والاحتفاظ الهواء داخل الحلقات أثناء ملء لهم الدم. كل مادة أنبوب تمتلك نفاذية معينة الغاز التي يمكن أن تؤدي إلى تغييرات كبيرة في تركيزات الغاز داخل الأنابيب. في حين أن بعض المؤلفين الدولة أن الأثر الناتج عن نفاذية الغاز على تنشيط مكونات الدم لا يزال غير واضح31، فمن المعروف أن وظيفة تخثر الدم حساس للغاية لتحول درجة الH، التي قد تكون ناجمة عن CO2 نشر32،33،34. هنا، اختبرنا التوافق الحيوي لأنابيب ضخ الدم في ظل ظروف الهواء الداخلي، مقارنة بالسيناريوهات السريرية لضخ الدم خارج الcorporeal. من أجل التحسينات المستقبلية للنموذج المعروض، قد يكون من المفيد احتضان النموذج بأكمله في حاضنة CO2 وإجراء التحقق من صحة حُك الدم قبل الحضانة وبعدها، لزيادة توحيد هذا النموذج.

أيضا، يمكن أن يؤدي واجهة الدم والهواء داخل الحلقات إلى تفعيل بروتينات البلازما وكسور الخلية من الدم35،36. قد تُجنى أجهزة المضخة الدوارة بدون هواء داخل الأنابيب إلى تجنب مسألة واجهة الدم والهواء، ولكنها بالتأكيد تُحدث تلفًا لخلايا الدم ذات مستويات مرتفعة كبيرة من الهيموغلوبين مقارنةً بنموذج حلقة الهيموجلوبين الموجود هنا، ويمكن أن يتداخل الهيموجلوبين في البلازما مع حساسية التحليلات المختبرة في ELISA16. في هذه الدراسة لقد أظهرنا أن تأثير الإنمولي نموذج حلقة نفسها لا يزال الحد الأدنى أثناء استخدام المواد القابلة للبولي كلوريد الفينيل مثل الهيبارين المغلفة أنابيب. وهكذا، فإن النموذج هو، من ناحية، لا تسبب تلف الخلايا المفرطة بالمقارنة مع نماذج مدفوعة مضخة، ولكن من ناحية أخرى في تحفيز بروتينات البلازما بسبب اتصال الهواء في الدم. ملاحظة، وضعت فان Oeveren وآخرون نموذج حلقة القائمة على صمام الكرة تجنب الهواء داخل الحلقات16. هذا البديل الواعد لنموذج حلقة قدم هنا قد التغلب على مشكلة واجهة الدم والهواء، ومع ذلك، بالمقارنة مع النموذج المعروض هنا، والتصاق الصفائح الدموية لا يزال أعلى لنموذج حلقة صمام الكرة القائمة.

فيما يتعلق بالسيطرة الثابتة ، فمن الجدير بالذكر أن الزجاج نفسه قد تبين أن المنشط قوية من نظام coagulatory37. ومع ذلك ، في الإعداد المقدمة ، لم يؤد الحضانة في كوب زجاجي (تحكم ثابت) إلى تنشيط الخلية المضيفة المفرطة أو تنشيط نظام التخثر مقارنة بمستويات خط الأساس مباشرة بعد سحب الدم. في الختام، قد يكون من المفيد استخدام على سبيل المثال أنابيب البولي بروبلين، إذا كان التحكم ثابت يظهر مستويات عالية من التنشيط.

بغض النظر عما إذا كان هو حلقة مقرها أو نموذج مضخة يحركها, هذه النماذج في المختبر تفتقر تماما التفاعلات البيولوجية الأصيلة التي تساهم أساسا من قبل endothelium سليمة, وهو مثالي الدم الاتصال السطح. المنطق وراء هذه المسألة هو أكثر وضوحا عندما يتم اختبار جهاز طبي مثل الدعامة، والتي قد تضفي نتائج مختلفة، من حيث التفعيل وبروينات البلازما، أثناء تفاعلها مع مكونات الدم في وجود endothelium. هذا يعلن أن يكون عيبا رئيسيا لجميع النظم التي نوقشت في المختبر محاكاة نظام الدورة الدموية. ومن ثم، للتغلب على هذه المسألة، وأنظمة microfluidic الجديدة التي يتم تغطيتها تماما مع endothelium تكتسب اهتماما كبيرا، ولكن مع ذلك بالمقارنة مع نموذج حلقة المعروضة هنا، فإنها لا تزال محدودة لاستيعاب كميات أصغر من الدم ومعدلات التدفق الأدنى38،39

وهكذا، نستنتج أن نموذج حلقة تشاندلر يبقى نموذجا قويا لإجراء اختبارات موحدة على التوافق الحيوي للدم من الأجهزة الطبية الوعائية في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويُشَرّ صاحبا البلاغ السيدة إيلينا دينكس على مساعدتها التقنية.

Materials

5 ml tube, K3 EDTA Sarstedt 32332
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set Becton Dickinson BioSciences 552843
APC anti-human CD45 Antibody BioLegend 368512
BD LSR Fortessa II cell analyzer Becton Dickinson 647465
BD Vacutainer Citrate Tubes Becton Dickinson 369714
BD Vacutainer one-use holder Becton Dickinson 364815
BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G Becton Dickinson 367282
Beaker glass ROTILABO short 10 ml Carl Roth GmbH + Co. KG X686.1
Beaker glass ROTILABO short 50 ml Carl Roth GmbH + Co. KG X688.1
Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody BioLegend 328808
Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody BioLegend 303730
Centrifuge ROTINA 420 | 420 R Hettich Zentrifugen 4701 | 4706
Centrifuge tubes, 50 ml Greiner Bio-One GmbH 227261
CHC Super modified, 5mm PVC tubing Corline Sweden 1807-148 Referred to as hepPVC tube
Circular Precision Cutter ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 007-20
Closing Unit (complete with tension bands) ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 008-20
Electric tape Scotch Super 33+ VWR MMMA331933
ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 BioLegend 430504
ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a BioLegend 430204
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray Eppendorf AG 3123000012
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray Eppendorf AG 3123000020
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow Eppendorf AG 3123000047
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue Eppendorf AG 3123000063
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow Eppendorf AG 3123000055
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet Eppendorf AG 3123000071
Ethylenediaminetetraacetic acid solution Sigma-Aldrich 03690-100ML
FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom Corning BV 352052
Fetal bovine serum Gold Plus Bio-Sell FBS.GP.0500
FITC anti-human CD14 Antibody BioLegend 367116
Fluency plus stent 13.5 x 60 mm Angiomed GmbH & Co FVM14060
Free Hemoglobin fHb Reagent Bioanalytics GmbH 004001-0250
Gibco PBS Tablets Thermo Fisher Scientific 18912014
Gloves Vasco Nitril white L B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG 9208437
Gloves Vasco Nitril white M B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG 9208429
Glutaraldehyde 25% aequous solution Sigma Aldrich G6257-100ML
Heparin, 25.000 IE in 5 ml Rotexmedica, Trittau, Germany PZN 3862340
Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit Hölzel Diagnostika abx253234
Kodan tincture forte colourless Schülke & Mayr GmbH 104012
Latex tube, ID 5 mm Laborhandel24 GmbH 305 0507
Loop Stand ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 009-20
Medimex venous tourniquet classic ROESER Medical GmbH 310005
Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex Tecan TEC006418I
Microplate shaker PMS-1000i VWR 444-0041
Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm VWR NALG8703-0508 Referred to as PVC tube
NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer Medical Indicators 2112-20
Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated BioLegend 423501
Osmium tetroxide solution Fisher Scientific 10256970
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
PE anti-human CD16Antibody BioLegend 302008
PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody BioLegend 304906
Pipette controller, pipetus VWR 612-1874
Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 – 5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5186480
Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 – 10µl Th. Geyer GmbH & Co. KG 9409410
Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 – 200µl Th. Geyer GmbH & Co. KG 0030 000.870
Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 – 1000µl blue Th. Geyer GmbH & Co. KG 0030 000.919
PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit Fisher Scientific BMS269
Probe stand ROTILABO combi CARL ROTH K082.1
Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 011-20
RBC Lysis Buffer (10X) BioLegend 420301
Reagent reservoirs VWR 613-1184
Rotation Unit ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 010-20
Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5409320
Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG 5409331
sc5b9 Human ELISA KIT TECOmedicalGroup A029
Scalpel no 10 Fisher Scientific NC9999403
Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG Philips n.a.
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 Carl Roth GmbH + Co. KG X715.1
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 Carl Roth GmbH + Co. KG X714.1
Semi-micro cuvette 1.6 ml Sarstedt 67.746
Serological pipette 10.0 ml Corning BV 4488
Serological pipette, 25.0 ml Corning BV 4489
Serological pipette, 5.0 ml Corning BV 4487
Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm VWR BURK8803-0812
Sprout mini centrifuge Biozym 552034
Stop Solution for TMB Substrate BioLegend 77316
Swabs, sterile Fuhrmann GmbH 32055
Syringe, 10 ml Becton Dickinson 300296
Temperature controlled water basin ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany CLS 020-20
tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics Fisher Scientific 10000730
TMB Substrate Set BioLegend 421101
Trillium PVC tube, 5 mm ID Medtronic 161100107100103 Referred to as polyPVC tube
Tween 20 AppliChem A4974,0250
UV-Vis Spektrometer Lambda 2 Perkin Elmer 33539
Vornado Mini Vortexer Biozym 55BV101-B-E
XN-3000 workstation blood analyzer Sysmex Europe n.a.
μ-CT Phoenix Nanotom S GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany n.a.

References

  1. International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices – Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
  2. Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
  3. Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
  4. Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
  5. Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
  6. Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
  7. Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
  8. Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
  9. Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
  10. Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
  11. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
  12. Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
  13. Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), 355 (2017).
  14. Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
  15. Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
  16. van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
  17. Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
  18. Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
  19. Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
  20. Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
  21. Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
  22. Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
  23. Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
  24. Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
  25. Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
  26. Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
  27. Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
  28. Böswirth, L. . Technische Strömungslehre. 8 edn. , (2010).
  29. Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
  30. Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
  31. Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
  32. Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
  33. Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
  34. Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
  35. Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
  36. Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
  37. Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
  38. Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), 18 (2019).
  39. Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).

Play Video

Cite This Article
Wacker, M., Betke, U., Borucki, K., Hülsmann, J., Awad, G., Varghese, S., Scherner, M., Hansen, M., Wippermann, J., Veluswamy, P. An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices. J. Vis. Exp. (162), e61570, doi:10.3791/61570 (2020).

View Video