ここで示されているのは、標準化された体外血球ループモデルのプロトコルです。このモデルは、輸血チューブまたは血管ステントのヘモ適合性を試験することを可能にする ISO (国際標準化機構) 標準 10993-4 に準拠する。
本研究では、ポリ塩化ビニル(PVC)製の5mmの内径5mmのチューブのヘモ適合性を、PVCチューブ内に配置された未コーティングのPVCチューブ、ラテックスチューブ、および血管内用途用のステントと比較した。血溶性の評価は、ISO規格10993-4で推奨される体外血力学的ループモデルを用いて行った。チューブは同じ長さのセグメントに切断され、スプライスの隙間を避けてループを形成するために閉じ、人間の血液で満たされ、37°Cの水浴中で3時間回転した。その後、全血球数の分析のためにチューブ内の血液を採取し、血糖分解(遊離血血漿ヘモグロビン)、補体系(sC5b-9)、凝固系(フィブリノペプチドA)、および白血球活性化(多形核エラスターゼ、腫瘍壊死因子およびインターロイキン-6)を採取した。宿主細胞活性化は、血小板活性化、白血球インテグリン状態および単球血小板凝集体のフローサイトメトリーを用いて決定した。不正確なループ閉鎖の効果をX線マイクロトモグラフィーと走査電子顕微鏡で調べ、スプライスで血栓形成を示した。ラテックス管は、血漿および細胞成分の両方の最も強い活性化を示し、血統性が悪いことを示し、続いてステント群およびコーティングされていないPVCチューブを示した。コーティングされたPVCチューブは、血小板活性化状態の有意な減少を示さなかったが、非コーティングされたPVCチューブと比較して補数および凝固カスケードの増加を示した。ループモデル自体は細胞や可溶性因子の活性化に至らず、溶血レベルは低かった。従って、提示されたインビトロ血行ループモデルは、機械的な力による血液成分の過剰な活性化を回避し、ドナー血液と血管医療装置との間のインビトロ相互作用を調査する方法として機能する。
医療機器のヘモ適合性試験は、体外膜酸素化のための血管ステントや灌流管などの新しいデバイスの開発において重要なステップです。今日まで、動物モデルは、ヒトでの実装前に医療機器をテストするための手順を最終決定するための標準的なツールと考えられています。したがって、動物の調査を最小限に抑えるためにさらに役立つ代替インビトロモデルを見つける必要があります。そこで今回の研究では、小型の体外血力学的ループモデルを検討しました。この提示方法の目的は、ISO 10993-4規格に従って医療機器のインビトロ血液適合性をテストすることです。
ISO 10993-4 標準は、血液検体1で調査される臨床パラメータの標準化されたセットを記述します。簡単に言えば、これらは血栓症(血小板凝集およびカウント)、凝固(線維素ペプチドA、FPA)、血液学的分析(全血球数)、血糖分解指数(遊離血漿ヘモグロビン)および補体系(末端補体複合体、sC5b9)である。しかしながら、好中球多形核エラスターゼ(PMN)、インターロイキン6(IL-6)および腫瘍壊死因子-α(TNF)などの追加マーカーは、白血球の活性化状態を反映する測定についても考慮することができる。血漿中に存在する循環細胞遊離タンパク質を定量化し、サンドイッチ型結合免疫吸着測定法(ELISA)は、従来の最も信頼性の高い方法2,3を表す。同様に、宿主細胞の表現型および活性化状態(例えば、白血球)は、単一細胞懸濁液を提供する分子の細胞表面発現を検出することによって定量することができる。これは、蛍光標識された特異的抗体が標的細胞表面分子4に結合するフローサイトメトリー(FACS)によって基づく。走査型電子顕微鏡法(SEM)は、ISO 10993-4規格1による被試験材料上の血栓形成を決定するためにも推奨される。この方法は、X線マイクロトモグラフィー(μCT)を用いて補いることができ、血栓の構造解析を行う例えば、その厚さ、サイズ及び局在化を3Dレンダリング画像5に含む。
この体外血力学的モデルを使用する背後にある根拠は、原発性止血球または白血球に関与する血小板などの血液成分の基本的な生理学的ダイナミクスと、異なるタイプの血管デバイスとの相互作用を理解することによって、最良のパフォーマンスと互換性のある医療機器をスクリーニングすることです。このようなインビトロシステムは、動物実験の必要性を減らすため、非常に要求されています。
ここで提示されたループモデルは、これらの要求を満たしています。このモデルは、血.B血栓の生産のために1958年にチャンドラーによって最初に記述され、したがって、チャンドラーループモデル6とも呼ばれる。これまでこのモデルは、医療機器7、8、9、10、11、12、13、14の血液生体適合性を調べる一連の実験と修正に使用されてきました。それは部分的に血液で満たされ、再凝固可能なループに形作られるポリマー管から成っている。これらのループは、温度制御された水浴で回転し、その出血性の影響を伴う血管流動条件をシミュレートします。ポンプ駆動モデルや、ループ内部の機械的なボールバルブを使用してポリマー管内の血流を誘導するモデルなどの代替方法は、すでに15,16に記載されている。しかし、ここで提示される方法の全体的な利点は、血液細胞およびタンパク質に適用される機械的な力が低く、血化を避け、血液とコネクタの間に接触がなく、流れの乱流および血液成分の活性化につながる可能性があることである。ループ内の主な活性化因子は、試験材料自体と内部に閉じ込められている空気です。これは、たとえ血液空気界面がタンパク質変性17を導くことができる場合でも、測定誤差の原因を最小限に抑え、高い再現性を提供するのに役立ちます。長さやサイズ制限のないチューブ材やステント径の品種を調べて、長さや内径の異なるチューブの使用を可能にすることも可能です。また、不正確なループ閉鎖や未被覆チューブ表面への曝露に対する宿主のヘモコンパチリティも調査可能である。この体外血力学的ループモデルの他の同様の医療用途は、第一相I臨床試験の前に、または第一相I臨床試験の前に、または個々の薬物安全性スクリーニング中に免疫療法(薬物)と血液成分との相互作用を研究するためにも使用することができること、またはさらなる実験18、19、20で使用することができる血栓物質の生成のためにも使用することができる。
本研究では、灌流管および/またはステントの血相溶性を試験するための詳細なプロトコルについて説明する。ここで、コーティングされていないPVCチューブとコーティングされたPVCチューブとの比較(ヘプPVC:ヘパリンコーティング、ポリPVC:生理活性ポリマーによるコーティング)。血小板の活性化が低下したが、非被覆チューブと比較して両方の被覆チューブに対して凝固系(FPA)の活性化が高いことが判明した。ここで使用されるhepPVCチューブは、血栓抵抗性21 を作るために共有結合ヘパリンで修飾され、すでに異なるパラメータ22を最適化し、特徴付けるためにループモデルで採用されている。本研究で用いられるポリPVCチューブは、体外輸血の臨床現場で使用される市販のチューブであり、血栓原性23を低下させるためにヘパリンポリマーでコーティングされている。時には、臨床用途においてもコーティングされていないPVCチューブが使用される。そこで、血小板、凝固系、IL-6、TNF、PMNエラスターゼなどの可溶性因子の過剰活性化を示す正の対照群としてラテックスチューブを含めた。不正確なループ閉鎖がシミュレートされた場合、血栓形成に気付いた。これは、ベースライン条件と比較して、凝固および補体系ならびに白血球および血小板の活性化につながった。さらに、ここで使用したステント材料(ベアメタルニチノールステント、炭素含浸されたポリテトラフルオロエチレンで覆われた)への血液接触は、PMNエラスターゼの点で高血小板および白血球活性化につながった。全体として、提示されたモデルは、赤血球(RBC)の血化が明らかであったラテックスチューブを除いて、ベースラインまたは静的条件に匹敵するため、試験された血管デバイスのいずれにも血球化を誘発しなかった。さらに、これらの灌流管は、イメージングまたは構造学のいずれかによって調べることができます。組織学的評価は実現可能かもしれないが、我々は主にELISAとフローサイトメトリーに焦点を当ててこれらの実験を行い、それによって多くの実験室で提示されたモデルに基づいて実験を実施する可能性を可能にした。従って、この方法は、ISO 10993-4規格の勧告に従って血管医療装置の血中生体適合性を試験する実現可能な方法を表す。さらに、この方法は、血液と材料との相互作用が流れ条件下でテストされるべきときはいつでも使用することができ、in vivo条件を模倣する。
この研究は、提示された体外血力学的ループモデルがISO 10993-4標準に従って医療機器のインビトロ血液適合性をテストするための信頼できる方法を提供することを示している。
プロトコルの重要なステップには、血液の描画と血液でチューブを満たすことが含まれます, 過剰な真空または攪拌は、取り扱い手順によって活性化から血液成分を防ぐために避けるべきです.さらに、補体および凝固系の活性化は、サンプルを室温に長期間保つことによって改変できるため、プラズマサンプルを直ちに凍結し、解凍後に氷の上に保管することが非常に重要です。
このモデルは他のインビトロモデルと比較するとメリットとデメリットの両方を有するため、実験の設計時にはいくつかの要因を考慮する必要があります。
まず、ループは、様々な実験の設定に合わせて長さと直径を変更することができます。セットアップが様々な内径の対照的な管を含む場合、直径の差が異なるせん断力をもたらすことを念頭に置いておくべきであり、それによって凝固および補体カスケード7に影響を与える。第2に、この実験では回転数を30rpmに設定した。これは、約25cm/sの血流をもたらし、これはヒト冠動脈バイパス移植片25における血流速度に匹敵する。ループの回転によって生成されるひずみ速度は、細胞および無細胞タンパク質を含む血液成分の生化学的カスケードを開始する主要なパラメータである。しかし、血液は非ニュートン流体であるため、歪み率は管の曲率、それぞれループ10に閉じた管の長さによっても影響を受ける。回転速度またはループサイズが変更されるたびに、歪み速度と回転速度の相関が線形ではないことを考慮することが重要です。回転速度とひずみ速度の間の相関は今日まで十分に調べられていないし、さらなる研究は、これらの特定のパラメータ10、26、27を調査するために必要とされる。ただし、層境界層のモデルに基づいて、与えられたチューブ径は5mm、回転速度は25cm/s、 壁せん断応力(WSS)の大まかな推定値は、血液密度が1060 kg*m-3と推定され、キネチの粘度が0.0025 pascal*s28に設定されている場合、チューブの壁までの距離1,00-0,01mmの2.20-22.00パスカルの間の値を示します。興味深いことに、ヒト冠動脈の湾曲における流動態のより詳細な計算解析は、血液30の速度、密度および粘度に関するほぼ同等のパラメータで11.33から16.77パスカルまでの範囲のWSS値を示した。
この制限のほかに、提示されたループモデルは、血圧を少ないシステムであり、すなわちヒト血管系の血管内血圧比を模倣しない。
次の重要な制限は、血液がループ内の空気と接触し、追加の干渉をもたらすことです。このような血液空気接触は、チューブのガス透過性と血液でそれらを満たしている間のループ内の空気の保持を含む2つのパラメータによって影響を受けます。すべてのチューブ材料は、チューブ内のガス濃度の大幅な変化につながる可能性のある特定のガス透過性を有します。一部の著者は、血液成分の活性化に対するガス透過性の結果効果が不明のままであると述べているが、血液凝固器の機能はpHシフトに対して高感度であることが知られているが、これはCO2拡散32、33、34によって引き起こされ得る。ここでは、体外血液灌流の臨床シナリオに匹敵する、室内空気状態下での輸血管の生体適合性を試験した。提示されたモデルの将来の改善のために、モデル全体をCO2インキュベーターでインキュベーションし、インキュベーション前後に血液pH検証を行うことは、このモデルをさらに標準化するのに役立つかもしれない。
また、ループ内部の血液空気界面は、血漿タンパク質および血液35、36の細胞分画の活性化につながる可能性がある。チューブ内の空気のないローラーポンプ駆動装置は、血液空気インターフェースの問題を回避することができるが、それらは確かにここで提示されたループモデルと比較してヘモグロビンの有意な上昇レベルを有する血液細胞への損傷を誘発し、血漿中のヘモグロビンは、ELISA16で試験された分析物の感受性を妨げる可能性がある。この研究では、ループモデル自体の血中分解効果は、ヘパリンコーティングされたPVCチューブなどの生体適合性材料を使用しながら、最小限のままであることを示しています。したがって、モデルは、一方では、ポンプ駆動モデルに比べて過度の細胞損傷を引き起こすことはないが、一方で、血液空気接触による血漿タンパク質を誘導する。注目すべきは、van Oeverenら.は、ループ内の空気を避けるボールバルブベースのループモデルを開発した。ここで提示されたループモデルに代わるこの有望な代替手段は、血液空気インターフェースの問題を克服する可能性があるが、ここで提示されたモデルと比較して、ボールバルブベースのループモデルに対する血小板付着は依然として高い。
スタティックコントロールに関しては、ガラス自体が凝固システム37の強力な活性化剤であることが示されたことに注目する。しかし、提示されたセットアップでは、ガラスビーカー中のインキュベーション(静電気制御)は、血液を引き出した直後のベースラインレベルと比較して、凝固系の過剰な宿主細胞活性化または活性化を招かなかった。結論として、静的制御が高レベルの活性化を示す場合は、例えばポリプロピレンチューブを使用すると役に立つかもしれません。
ループベースかポンプ駆動モデルかにかかわらず、これらのin vitroモデルは、主に理想的な血液接触表面である無傷の内皮によって寄与される本物の生物学的相互作用を完全に欠いている。この問題の背後にある根拠は、ステントのような医療機器がテストされている場合、内皮の存在下での血液成分との相互作用の間に、活性化および血漿タンパク質の観点から異なる結果を与える可能性がある場合により明らかである。これは、循環系を模倣するすべてのインビトロシステムの大きな欠点であると宣言しています。したがって、この問題を克服するために、完全に内皮で覆われた新しいマイクロ流体システムは大きな関心を集めていますが、ここで提示されるループモデルと比較して、彼らはまだより小さな血液量と最小限の流量38、39に対応するために制限されています
従って、チャンドラーループモデルは、心臓血管研究の分野における血管医療機器の血液生体適合性に関する標準化された試験を行うための堅牢なモデルであると結論づけている。
The authors have nothing to disclose.
著者たちは、エレナ・デンクス氏の技術支援に感謝しています。
5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
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Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 – 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 – 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 – 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 – 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |