此处介绍的是标准化体外血流动力学循环模型的协议。此模型允许测试灌注管或血管支架的血相容性是否符合 ISO(国际标准化组织)标准 10993-4。
本研究将内径为5毫米的聚氯乙烯(PVC)和涂覆不同生物活性联结物的管的血相容性与PVC管内未涂覆的PVC管、乳胶管和血管内应用支架进行比较。使用 ISO 标准 10993-4 推荐的体外血动力循环模型对血容度进行评估。管子被切成相同长度的片段并闭合成环,避免在接头上出现任何间隙,然后充满人血,在37°C的水浴中旋转3小时。此后,采集管内血液,用于分析全血细胞计数、血解(自由血浆血红蛋白)、补血系统(sC5b-9)、凝血系统(纤维蛋白肽A)和白细胞活化(多态核弹性酶、肿瘤坏死因子因子和白细胞-6)。使用流细胞学确定细胞活化、白细胞整流蛋白状态和单细胞血小板聚合。用X射线显微断层扫描和扫描电子显微镜检查了不准确的环闭效应,显示拼接时形成血栓。乳胶管显示血液血浆和细胞成分的活化能力最强,表明血相容性差,其次是支架组和未涂覆的PVC管。涂层PVC管未显示血小板活化状态显著下降,但与未涂覆PVC管相比,补和凝固级联增加。循环模型本身没有导致细胞或可溶性因子的激活,溶血水平较低。因此,提出的体外血液动力学循环模型避免了机械力过度激活血液成分,并作为一种研究供体血液和血管医疗设备之间体外相互作用的方法。
医疗器械的血相容性测试是开发血管支架或灌注管等用于体外膜氧合的新设备的关键步骤。直到今天,动物模型还被视为标准工具,在医疗器械在人类实施之前完成医疗器械测试程序。从今以后,有必要寻找替代体外模型,进一步有助于最大限度地减少对动物的调查。因此,在这项研究中,我们探索了一个微型体外血热动力学循环模型。该方法的目标是按照ISO 10993-4标准测试医疗器械的体外血液相容性。
ISO 10993-4 标准描述了要对血液样本 1 进行调查的标准化临床参数集。简言之,这些是血栓形成(血小板聚集和计数)、凝血(纤维蛋白肽A、FPA)、血液学分析(全血细胞计数)、造血指数(自由血浆血红蛋白)和补血系统(终端补充复合体,sC5b9)。然而,其他标记,如嗜中性粒细胞多形态核弹性酶(PMN),白细胞间6(IL-6)和肿瘤坏死因子- alpha(TNF)反映白细胞的激活状态,也可以考虑测量。为了确定和量化血浆中存在的循环细胞自由蛋白,三明治酶链接免疫吸附剂测定(ELISA)代表了一种传统和最可靠的方法2,3。同样,通过流式细胞学(FACS)检测分子的细胞表面表达(基于单细胞悬浮的读数,其中荧光标记的特定抗体与靶细胞表面分子4结合),可以量化宿主细胞(如白细胞)的表型和活化状态。也建议扫描电子显微镜 (SEM) 以确定 ISO 10993-4 标准 1 的测试材料上的血栓形成。此方法可以辅以 X 射线显微断层扫描 (μCT),对血栓进行结构分析,例如,在 3D 渲染图像5中,其厚度、大小和定位。
使用这种体外血流动力学模型的理由是,通过了解血液成分(如血小板)的基本生理动力学,以及它们与不同类型的血管装置的相互作用,来筛选性能最佳和相容的医疗器械。这种体外系统是高度要求的,因为它们减少了对动物研究的要求。
此处介绍的循环模型满足了这些要求。这个模型最初由 A.B钱德勒在1958年描述为血血栓的生产,因此,也被称为钱德勒循环模型6。到目前为止,该模型已被用于一系列的实验和修改,以调查医疗器械7,8,9,10,11,12,13,14的血液生物相容性。它由聚合物管组成,部分充满血液,形成可回收的回路。这些回路在温度控制的水浴中旋转,以模拟血管流动条件及其血液学效应。替代方法,如泵驱动模型或模型,使用机械球阀内的循环,以诱导血液流动内的聚合物管已经描述了15,16。然而,本文提出的方法的整体优势是,应用于血细胞和蛋白质的机械力低,避免血解,并且血液和连接器之间没有接触,这可能导致流动湍流和血液成分的激活。回路内的主要激活因素是测试材料本身和内部捕获的空气。这有助于最大限度地减少测量误差的来源,并提供高可重复性,即使血空界面可导致蛋白质变性17。也可以调查各种管材和支架直径,没有长度或大小限制,从而允许使用不同的长度和内径管。此外,在不准确的环闭和暴露在未涂层管表面的宿主血容也是可能的调查。这种体外血动力循环模型的其他类似医学应用是,它也可用于研究免疫治疗(药物)和血液成分之间的相互作用,无论是临床前开发或个别药物安全筛选之前的第一阶段第一阶段临床试验,或产生血栓材料,可用于进一步实验18,19,20。
本研究描述了测试灌注管和/或支架的血容的详细协议。在这里,无涂层和涂层PVC管(HepPVC:肝素涂层,聚PVC:生物活性聚合物涂层)的比较。血小板的活化降低,但与未涂覆管相比,两种涂层管的凝固系统(FPA)的活化率更高。这里使用的 HepPVC 管经过共价绑定肝素的修改,使其血栓性21, 并且已在循环模型中用于优化和描述不同的参数22。本研究中使用的聚PVC管是用于体外血液灌注临床设置的商用管,并涂有肝素聚合物,以减少其血栓原性23。有时,在临床应用中,甚至使用未涂覆的PVC管。因此,我们包括乳胶管作为正对照组,显示血小板的过度活化,凝固系统和可溶性因素,如IL-6,TNF和PMN弹性酶。模拟不准确的环闭合时,注意到了血栓的形成。与基线条件相比,这导致了凝血和补剂系统以及白细胞和血小板的激活。此外,血液接触这里使用的支架材料(裸金属尼丁醇支架,覆盖碳浸渍扩大聚四氟乙烯)导致更高的血小板和白细胞活化在PMN弹性酶方面。总体而言,所提出的模型没有在任何测试的血管装置中诱导血解,因为它们与基线或静态条件相当,但乳胶管除外,其中红细胞(RBC)血解明显。此外,这些灌注管可以通过成像或组织学检查。虽然组织学评估可能是可行的,但我们主要关注ELISA和流式细胞学来进行这些实验,从而使许多实验室根据本文提出的模型进行实验的敏感性。因此,该方法是按照ISO 10993-4标准的建议,对血管医疗器械的血液生物相容性进行检验的可行方法。此外,当血液和材料之间的相互作用应在流动条件下进行测试时,可以使用这种方法,模仿体内条件。
研究表明,体外血流循环模型为按照ISO 10993-4标准测试医疗器械体外血液相容性提供了可靠的方法。
协议中的关键步骤包括抽血和用血填充管子,其中应避免过多的真空或搅拌,以防止血液成分通过处理程序激活。此外,立即冻结血浆样品并在解冻后将它们留在冰上非常重要,因为通过将样品保持室温较长时间,可以篡改补充和凝固系统活化。
由于与其他体外模型相比,该模型既有优点也有缺点,因此在设计实验时需要考虑几个因素。
首先,循环的长度和直径可以变化,以适应各种实验设置。如果设置包括不同内径的对比管,应记住,直径的差异将导致不同的剪切力,从而影响凝固和补充级联7。其次,在此实验中,转速设置为 30 rpm。这将导致血液流量约25厘米/s,这与人类冠状动脉旁路移植25的血流速度相当。循环旋转产生的应变速率是启动血液成分(包括细胞和无细胞蛋白)的生化级联的主要参数。但由于血液是非牛顿流体,应变率也会受管曲率的影响,分别将闭合到循环10的管的长度。每当旋转速度或回路大小发生变化时,重要的是要考虑应变速率和旋转速度之间的相关性不是线性的。旋转速度和应变速率之间的相关性直到今天才得到充分的检查,需要进一步研究以研究这些特定的参数10,26,27。但是,基于层边界层模型,给定管直径为 5 mm,旋转速度为 25 厘米/s, 对壁剪应力 (WSS) 的粗略估计表明,当血液密度估计为 1060 kg*m-3 且运动粘度设置为 0.0025pascal*s 28、29时,在 2.20-22.00 pascal 之间,与管壁的距离为 1,00-0,01mm。有趣的是,对人类冠状动脉曲率流动力学的更详细的计算分析显示,WSS值范围从11.33到16.77帕斯卡,在血液30的速度、密度和粘度大致相当的参数。
除了这个限制,提出的循环模型是一个压力小的系统,不模仿人体血管系统的血管内血压比。
下一个重要的限制是血液与循环内的空气接触,这会带来额外的干扰。这种血空气接触受到两个参数的影响,包括管的气体渗透性和回路内空气的保留,同时用血液填充它们。每个管材都有一定的气体渗透性,可导致管内气体浓度的显著变化。虽然一些作者指出,气体渗透对血液成分激活的影响仍然不清楚31,但众所周知,血液凝固剂的功能对pH-SHIFT非常敏感,这可能是由CO2扩散32、33、34引起的。在这里,我们测试了室内空气条件下血液灌注管的生物相容性,可与体外血液灌注的临床场景相媲美。对于未来对展示的模型的改进,将整个模型孵化到CO2培养箱中,并在孵化前和孵化后进行血液pH值验证,可能有助于进一步标准化该模型。
此外,回路内的血空气界面可导致血浆蛋白和血液35,36细胞分数的激活。管内无空气的滚筒泵驱动装置可以避免血空气接口问题,但与此处显示的环模型相比,它们肯定会对血红蛋白水平明显升高的血细胞造成损害,血浆中的血红蛋白会干扰ELISA16中测试分析物的灵敏度。在这项研究中,我们已经表明,循环模型本身的解水作用仍然最小,而使用生物相容材料,如肝素涂层PVC管。因此,与泵驱动的模型相比,该模型一方面不会造成过多的细胞损伤,另一方面则是由于血液空气接触而诱导血浆蛋白。值得注意的是,范奥维伦等人开发了一个球阀为基础的循环模型,避免空气在循环内16。这种有希望的替代这里提出的循环模型可以克服血-空气接口的问题,但是,与这里提出的模型相比,血小板粘附性仍然高于球阀为基础的环模型。
关于静态控制,值得注意的是,玻璃本身已被证明是凝固系统37的有力活化剂。然而,在介绍的设置中,在玻璃烧杯中孵育(静态控制)不会导致与直接在抽血后基线水平相比,过度的宿主细胞激活或凝固系统激活。总之,如果静态控制显示高激活水平,则使用聚丙烯管可能会有所帮助。
无论是基于循环的模型还是泵驱动的模型,这些体外模型完全缺乏真正的生物相互作用,而真正的生物相互作用主要是由完整的内皮贡献的,内皮是理想的血液接触表面。当像支架这样的医疗设备正在测试时,这个问题背后的理由更加明显,在内皮的情况下,在激活和血浆蛋白方面,它可能会产生不同的结果。这宣称是所有讨论的体外系统模仿循环系统的主要缺点。因此,为了克服这个问题,完全被内皮覆盖的新微流体系统正获得巨大的兴趣,但与这里介绍的循环模型相比,它们仍然局限于容纳更小的血液量和最小流速38,39
因此,我们得出结论,钱德勒循环模型仍然是心血管研究领域血管医疗器械血液生物相容性标准化测试的稳健模型。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢埃琳娜·登克斯女士的技术援助。
5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
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BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
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Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
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Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
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NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
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PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
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sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
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