Summary
قياسات SEC-BioSAXS للجزيئات الحيوية البيولوجية هي نهج قياسي لتحديد هيكل الحل للجزيئات الكبيرة ومجمعاتها. هنا، نقوم بتحليل بيانات SEC-BioSAXS من نوعين من آثار SEC التي تمت مواجهتها عادةً - الكروماتوجرامات ذات القمم التي تم حلها بالكامل وتم حلها جزئيًا. نحن نبرهن على التحليل وفك الفولت باستخدام مبعثر وBioXTAS RAW.
Abstract
BioSAXS هي تقنية شائعة تستخدم في البيولوجيا الجزيئية والهيكلية لتحديد بنية الحل وحجم الجسيمات وشكلها ونسبة السطح إلى الحجم والتغيرات التكينية للجزيئات الكبيرة والمجمعات الجزيئية. يجب أن تكون مجموعة بيانات SAXS عالية الجودة للهندسة الهيكلية من عينات أحادية اللون ومتجانسة ، وغالبًا ما يتم الوصول إلى هذا فقط عن طريق مزيج من الكروماتوغرافيا المضمن وقياس SAXS الفوري. والأكثر شيوعاً، يستخدم اللوني اقصائي الحجم لفصل العينات واستبعاد الملوثات والتجميعات من الجسيمات ذات الأهمية، مما يسمح بإجراء قياسات SAXS من ذروة الكروماتوغرافية محسومة بشكل جيد من نوع بروتين واحد. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، حتى التنقية المضمنة ليست ضمانة لعينات أحادية الdisdisperse ، إما لأن مكونات متعددة قريبة جدًا من بعضها البعض في الحجم أو تغييرات في الشكل تحدث من خلال وقت التجلي المُلِمِم المُبَرَك. وفي هذه الحالات، قد يكون من الممكن إلغاء بيانات SAXS من الخليط للحصول على منحنيات SAXS المثالية للمكونات الفردية. هنا، نُظهر كيف يتم تحقيق ذلك، ويتم إجراء التحليل العملي لبيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة في SAXS على عينات مثالية وصعبة. على وجه التحديد، نعرض تحليل SEC-SAXS لمولمر الحمض النووي (E9) المتجنح E9 مُسَلِق مُسَوَّر ناقص متحول.
Introduction
الجزيئات الحيوية البيولوجية صغيرة جداً بحيث لا يمكن رؤيتها حتى مع أفضل المجاهر الخفيفة. الأساليب الحالية لتحديد هياكلها تنطوي عموما على بلورة البروتين أو القياسات على أعداد كبيرة من الجزيئات متطابقة في نفس الوقت. بينما البلورية توفر معلومات عن المستوى الذري، فإنه يمثل بيئة العينة الاصطناعية، نظراً لأن معظم الجزيئات الكبيرة لا تقدم في شكل بلوري في الخلية. خلال العامين الماضيين المجهر الإلكترونات cryo تسليم مماثلة هياكل عالية الدقة من الجزيئات الكبيرة / مجمعات الجزيئات الكبيرة، ولكن على الرغم من أن العينات هي أقرب إلى الحالة الفسيولوجية، فهي لا تزال مجمدة، وبالتالي غير متحركة وثابتة. بيولوجيا صغيرة زاوية الأشعة السينية تشتت (BioSAXS) يوفر قياسا هيكليا من الجزيئات ، في الظروف التي هي ذات الصلة البيولوجيا. ويمكن تصور هذه الحالة كشكل منخفض الدقة 3-D يحدد على مقياس نانومتر ويلتقط كامل الفضاء التشكلي من الجزيئات في الحل. تجارب BioSAXS تقيم بكفاءة الدولة القلة ، والمجال والترتيبات المعقدة ، فضلا عن المرونة بين المجالات1،2،3. الطريقة دقيقة، ومعظمها غير مدمرة وعادة ما يتطلب سوى الحد الأدنى من إعداد العينة والوقت. ومع ذلك، للحصول على أفضل تفسير للبيانات، يجب أن تكون العينات أحادية. وهذا أمر صعب؛ وغالبا ما تكون الجزيئات البيولوجية عرضة للتلوث، وضعف تنقية وتجميع، على سبيل المثال من تجميد ذوبان4. ويساعد تطور الكروماتوغرافيا المضمن متبوعاً بقياس SAXS الفوري على التخفيف من هذه الآثار. يفصل اللوني بين الحجم و الاستثناءات العينات حسب الحجم وبالتالي يستبعد معظم الملوثات والتجميعات5و6و7و8و9و10. ومع ذلك، في بعض الحالات، حتى لجنة الأوراق المالية والبورصة-SAXS لا تكفي لإنتاج عينة أحادية، لأن الخليط قد يتكون من مكونات قريبة جداً من حيث الحجم أو خواصها الفيزيائية أو دينامياتها السريعة تؤدي إلى قمم متداخلة في أثر الأشعة فوق البنفسجية لـ SEC. في هذه الحالات، قد يؤدي خطوة deconvolution المستندة إلى البرامج من بيانات SAXS التي تم الحصول عليها إلى منحنى SAXS مثالي مكونفردي 5و11و12. على سبيل المثال، في قسم البروتوكول 2، نعرض تحليل SEC-SAXS القياسي لمولمرات الحمض النووي vaccinia E9 exonuclease ناقص متحولة (E9 exoناقص)في معقدة مع الحمض النووي. يمثل Vaccinia الكائن الحي النموذجي لـ Poxviridae ، وهي عائلة تحتوي على العديد من مسببات الأمراض ، على سبيل المثال فيروس الجدري البشري. وقد تبين أن البوليميراز يرتبط بإحكام إلى الحمض النووي في النهج الكيميائية الحيوية، مع هيكل مجمع حلها مؤخرا من قبل التصوير البلوري بالأشعة السينية13.
وسيوفر معظم مرافق السنكروترون خط أنابيب معالجة البيانات الآلي الذي سيقوم بتطبيع البيانات والتكامل لإنتاج مجموعة من الإطارات غير المubted. لكن النهج الموصوف في هذه المخطوطة يمكن استخدامه أيضاً مع مصدر مختبر شريطة أن يتم تنفيذ لجنة الأوراق المالية والبورصة SAXS. علاوة على ذلك، قد تتوفر أتمتة إضافية التي سوف ترفض الإطارات التالفة الإشعاع وتنفيذ الطرحالعازلة 14. وسوف نعرض كيفية إجراء تحليل أولي للبيانات التي تم تجهيزها مسبقاً والاستفادة القصوى من البيانات المتاحة في القسم 2.
في القسم 3، نعرض كيفية إلغاء بيانات SEC-SAXS وتحليل المنحنيات بكفاءة. في حين أن هناك العديد من أساليب فك الاحتقان مثل فك الاستئصال ذروة غاوسي، نفذت في الولايات المتحدة-سومو15 وغوييه الأمثل طريقة الاحتمال الأقصى، التي نفذت في برنامج DELA16، وهذه تتطلب عموما نموذجا لشكل الذروة12. حجم محدود من القمم الفردية التي نحقق فيها يسمح باستخدام تحليل عامل متطور (EFA)، كشكل محسن من قيمة المفرد التحلل (SVD) لdeonvolute قمم المتداخلة، دون الاعتماد على شكل الذروة أو تشتت الملف5،11. ويمكن الاطلاع على تطبيق SAXS محددة في BioXTAS الخام17. وقد استخدم التعليم للجميع لأول مرة على بيانات الكروماتوغرافيا عندما سمحت بيانات صفيف ثنائي ثنائي 2D بتكوين المصفوفات من الامتصاص مقابل وقت الاحتفاظ ببيانات الطول الموجي18. حيث تتفوق التعليم للجميع هو أنه يركز على الطابع المتطور للقيم المفردة ، وكيف تتغير مع ظهور مكونات جديدة ، مع التحذير من أن هناك ترتيبًا متأصلًا في الاستحواذ10. لحسن الحظ ، لجنة الأوراق المالية والبورصة - SAXS البيانات توفر جميع البيانات اللازمة المطلوبة في نظم 2D البيانات الصفائف ، الإقراض نفسه بشكل جيد لتقنية التعليم للجميع.
في القسم 4، سوف نبرهن على أساسيات تحليل SAXS المستقل من منحنى SAXS الخاص بالنموذج من منحنى SAXS المطروح من المخزن المؤقت. يحدد التحليل المستقل للنموذج نصف قطر الجيوحد (Rg) وحجم الارتباط (Vc) وحجم Porod (Vp) وPorod-Debye Exponent (PE). التحليل يوفر تقييما شبه كمي للجسيمات في حالة الديناميكا الحرارية من حيث الإحكام أو المرونة عبر مؤامرة كراتكي الأبعاد2,4,19.
وأخيراً، تُقاس بيانات SAXS بوحدات فضائية متبادلة، وسنبين كيفية تحويل بيانات SAXS إلى مساحة حقيقية لاستعادة وظيفة التوزيع بين الزوجين والمسافة P(r). توزيع P(r) هو مجموعة من جميع المسافات الموجودة داخل الجسيمات ويشمل أقصى البعد للجسيمات، دماكس. وبما أن هذا القياس هو قياس دينامي حراري، فإن توزيع P(r) يمثل المساحة الفيزيائية التي يشغلها الفضاء التكتّني للجسيمات. يمكن أن يوفر التحليل السليم لمجموعة بيانات SAXS رؤى الحالة الحل التي تكمل المعلومات عالية الدقة من البلورات و cryo-EM.
Protocol
1. ويستند التعبير البروتين، وتنقية وقياس لجنة الأوراق المالية والبورصة-SAXS على البروتوكول المنشور13
- اتبع بروتوكول جمع البيانات مضمنة لجنة الأوراق المالية والبورصة SAXS (Brennich وآخرون6)باختصار.
- اكويبيل العمود SEC مع ما لا يقل عن 2 وحدات التخزين العمود من SEC تشغيل العازلة (20 mM تريس-HCl، 7.5، 100 mM NaCl).
- إعداد 50 ميكرولتر من عينة من E9 exoناقص في 8\u201210 ملغم / مل مع 20٪ من 20٪ من االضروس dsDNA الجزئية (TCAGGAAGATAACAGCGGGGTAGTAGCC وGGCTAAACCGCTGTTATCTT). E9 exoناقص يربط معD K من 12 ± 6 nM (انظر البيانات التكميلية).
- حقن 50 ميكرولتر من هذا المزيج على عمود SEC (زيادة S200) مضمنة مع خلية التدفق لقياسات SAXS عند 0.3 مل /دقيقة.
- جمع 1000 لقطة في 1 ق التعرض لكل من.
ملاحظة: على خط شعاع بي إم29 في مرفق السنكروترون الأوروبي (ESRF) تتم معالجة الإطارات الفردية تلقائيا وبشكل مستقل ضمن إطار EDNA14. بعد جمع البيانات، افتح قاعدة بيانات ISPyB20 وتحت علامة التبويب الحصول على البيانات اضغط على زر "الذهاب" للوصول إلى مجموعة البيانات ونتائج التحليل التلقائي21.
- قم بتنزيل البيانات.
2 - التحليل الأولي للبيانات
- افتح البرنامج المستند إلى Java مبعثر IV (راجع جدول المواد) وإجراء طرح الخلفية لبيانات اللوني استبعاد الحجم (SEC).
- افتح علامة التبويب SEC. سحب وإسقاط ملفات البيانات المخفضة (*.dat) في إطار "إسقاط البيانات أدناه". تعيين دليل الإخراج "خارج Dir ::" بالنقر فوق الزر "إخراج Dir" المسمى باللون الأزرق.
ملاحظة: إذا تم تجميع البيانات الخاصة بك في نانومتر-1،يجب أن يتم التحقق من مربع تحويل (أسفل يسار اللوحة) عند إسقاط الملفات في الإطار أو علامة التبويب الطرح. - تحرير التفاصيل التجريبية ، واستخدام تحرير تفاصيل زر وملء العديد من الحقول ممكن ، وهذه تشمل المقاطع التي المصدر / beamline تم استخدامها لجمع البيانات ، والمعلمات جمع وتفاصيل العينة. وسيتم حفظ هذه البيانات مع والسماح لملء بسهولة أكبر قسم "المعلمات جمع البيانات" في المنشورات المقبلة.
- أدخل اسم النموذج في المربع حفظ كـ. انقر على TRACE.
ملاحظة: هذا له تأثيرين. أولاً، فإنه سيتم إنشاء ملف *.sec للبيانات. هذا هو ملف نصي واحد الذي سيقوم بتجميع كافة الملاحظات التجريبية من ملفات .dat *منفصلة. بالإضافة إلى ذلك، يحتوي الملف *.sec على مجموعة متوسطة من الإطارات التي هي خلفية المخزن المؤقت، كافة الإطارات المستخدمة في المتوسط وكذلك الإطارات التي طرحت خلفية المخزن المؤقت عبر تجربة SEC-SAXS بأكملها. ثانيا، يتم إنشاء رسم إشارة الذي يرسم رقم الإطار مقابل نسبة التكامل إلى الخلفية. يعرض هذا الإطارات المحددة (الرمادي) التي تم حسابها للطرح المخزن المؤقت. يتم تحديد نقاط المخزن المؤقت المتوسط من نطاق البيانات بأكمله. ومع ذلك، فمن المستحسن أن تختار يدويا الإطارات العازلة لمتوسط كخلفية غير محددة قد تحدث بسبب ضعف الأعمدة أو القذرة أو شعرية22. - حدد إطارات المخزن المؤقت يدوياً. انقر فوق مسح المخازن المؤقتة ثم إعادة تحديد منطقة المخزن المؤقت مع سحب انقر الأيسر على منحنى التتبع. من الناحية المثالية، يجب أن تكون هذه منطقة مسطحة قبل حجم الفراغ من عمود SEC إطارات 100 تقريباً. انقر فوق SET BUFFER ثم تحديث لإعادة حساب الملف *.sec الذي قد يستغرق بضع دقائق.
- تحديد منطقة ذات أهمية (ROI). على الرسم إشارة، حدد المنطقة من ذروة الفائدة، مع اليسار انقر على السحب.
ملاحظة: هذا يملأ ثلاثة قطع في اللوحة اليمنى. وترتبط أعلى اثنين من المؤامرات مع مرمى تتحرك بينهما، مؤامرة إشارة ثانية (أعلى اليمين) يظهر فقط ROI المحدد، مع كثافة كل إطار باللون الأزرق وrg المقابلة من كل إطار باللون الأحمر وخريطة الحرارة المقابلة أدناه، وتبين المخلفات لكل إطار ملون وفقا لتحليل Durbin واتسون الارتباط التلقائي. المناطق ذات التشابه العالي هي اللون السماوي (دوربين واتسون، د = 2) في حين أن إطارات متباينة ستتبع كآبة أغمق إلى الوردي وأخيرا إلى الحمر اعتمادا على شدة الاختلاف (د > 2). المؤامرة السفلية هي ط طرح مقابل منحنى س للإطار المحدد المركزي (أيضا المشار إليها بخط عمودي). يمكن استخدام مفاتيح الأسهم للتنقل عبر الإطارات المطروحة. سوف I مقابل Q مؤامرة شرح نوعية الأطر المطروحة من تجربة لجنة الأوراق المالية والبورصة. - حدد الإطارات التي تريد دمجها. انقر على مرمى في مؤامرة خريطة الحرارة لتحديد مجموعة فرعية من الإطارات التي سيتم استخدامها لدمج. ستحدد مرمى الانسال منطقة مثلثة ذات سماوي في الغالب تقع على الجانب السفلي الأيمن من مرمى النيران. استخدم نقرة بالماوس لتعيين هذه الإطارات كما تم تحديدها وتسليط الضوء على الإطارات في المنطقة المقابلة من الرسم إشارة أعلاه. وينبغي لهذه الإطارات من الناحية المثالية تسليط الضوء على منطقة ذات Rg مستقرة.
ملاحظة: حسب الحاجة، قم بالتكبير على الخريطة الحرارية مع سحب ثم تصغير بالنقر الأيسر مع النقر على اليسار. - عندما تكون راضية عن الإطارات المحددة انقر فوق MERGE. سيؤدي هذا إلى دمج الإطارات المطروحة وتقديمها في علامة التبويب ANALYSIS.
- افتح علامة التبويب SEC. سحب وإسقاط ملفات البيانات المخفضة (*.dat) في إطار "إسقاط البيانات أدناه". تعيين دليل الإخراج "خارج Dir ::" بالنقر فوق الزر "إخراج Dir" المسمى باللون الأزرق.
3. البيانات تفكيك
- افتح برنامج إزالة الفول (مثل BioXTAS Raw 2.0.0).
- في برنامج إلغاء الفُنَد، قم بتحميل مجموعة البيانات، ضمن علامة التبويب "ملفات"، في لوحة التحكم،استخدم رمز طي لتحديد موقع البيانات أو نسخ الموقع ولصقه في شريط العناوين.
ملاحظة: تأكد من أن المجلد يحتوي على ملفات .dat raw فقط و لا تتم معالجتها أو متوسط ملفات البيانات. - تسليط الضوء على جميع الملفات * .dat ، اضغط على زر سلسلة مؤامرة ، مؤامرة من كثافة متكاملة مقابل عدد الإطار سيتم رسمها في "مؤامرة سلسلة".
- في لوحة التحكم حدد علامة التبويب سلسلة ثم انقر فوق لتمييز المنحنى. افتح نافذة LC Analysis المنبثقة باستخدام الزر الموجود في قاعدة لوحة التحكم. هذه النافذة تتيح الوصول إلى عدة خيارات، مثل اختيار أنواع مختلفة من الجزيئات (البروتين أو RNA). كما يسمح للمستخدم بتحديد المنطقة العازلة للمؤامرة. في المثيل الأول انقر فوق تلقائي؛ يجب أن يحدد هذا منطقة عازلة مناسبة.
ملاحظة: إذا فشل هذا، ربما بسبب خط أساس غير مستقر ثم "إضافة منطقة" لتحسين المنطقة العازلة. هذا تعبئة مربع المخزن المؤقت مع مربع أصغر حيث يمكن إضافة أرقام الإطار لاستخدام المخزن المؤقت يدوياً. بدلا من ذلك، انقر فوق "اختيار" لإعطاء خيار اختيار منطقة على قطعة الأرض. حدد موقع المنطقة، وانقر على اليسار مرة واحدة للحصول على موضع البدء، ثم حرك المؤشر إلى الموضع التالي وانقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى. قد يكون من الضروري إضافة أكثر من موقع المخزن المؤقت. انقر فوق تعيين المخزن المؤقت وسيتم طرح المنحنيات ويتم حساب Rg عبر ذروة SEC. في حالة ظهور مربع منبثق، انقر فوق موافق. - لبدء تحليل العامل المتطور (EFA)، انقر بزر الماوس الأيمن على الملف المميز في الجزء السفلي من لوحة التحكم ثم حدد الجميع من القائمة.
- تحقق من فتح إطار منبثق يعرض تحليل القيمة المفردة (SVD) لمجموعة البيانات. في مربع عناصر التحكم، حدد المربع استخدام الإطارات بحيث يتم تغطية منطقة الذروة بأكملها إلى deconvolute في مخطط الكثافة. تُظهر "القيم المفردة" التي تظهر أعلى اليمين شدة القيم المفردة (قمم/أنواع منفصلة) فوق خط الأساس.
ملاحظة: يمثل عدد النقاط الموجودة فوق خط الأساس عدد الأنواع المبعثرة الموجودة. مع التحذير من أن المهم هو الأهمية المقدار النسبي للقيمة المفردة للمنطقة المسطحة/خط الأساس. - للمساعدة في التحقق من صحة عدد القيم المفردة، استخدم مخطط التصحيح التلقائي السفلي. وهذا يدل على اليمين واليسار واحد ارتباط ناقلات. انقر فوق التالي.
ملاحظة: هذه تمثل بشكل أساسي التشتت أو تركيز التشكيلات للمتجه في الحل. حيث يمثل الحجم المطلق أهمية المتجه. سيكون مكون هام على اتواسترياً بالقرب من 1 (قاعدة قطع الإبهام هي >0.6\u20120.7). RAW بحساب هذا بشكل مفيد ويظهر في مربع #Significant SVs، أسفل اليسار، على الرغم من أنه يمكنك تغيير هذا إذا لزم الأمر. إذا كان هناك عدة قيم مفردة (مثل 4+)، قد يكون من الضروري النظر إلى 2 أو 3 فقط من المكونات فقط، وتغيير نطاق البيانات المستخدمة. كلما انخفض عدد المكونات كلما كان تحليل التعليم للجميع أسهل ولكن على حساب استخدام بيانات أقل. في الوضع المعقد، حيث ناقلات المفرد اليمين واليسار، والتي ينبغي أن تكون مماثلة، لا تتطابق مع تقليل عدد SV كبيرة وتقليل عدد الإطارات المستخدمة حتى ناقلات المفرد اليسار واليمين متشابهة. - تأكد من أن التعليم للجميع يحسب عن طريق توليد قطع في الاتجاهين الأمامي والخلفي لكل متجه. تظهر هذه المؤامرات عند بدء تشغيل المكونات (مؤامرة إلى الأمام) والخروج (إلى الوراء مؤامرة) ملف تعريف الحل للبيانات SEC-SAXS المحددة. يحاول RAW تحديد هذه النطاقات; تغيير هذه باستخدام الأسهم بجانب العدادات بحيث كل دائرة في بداية نقطة انقلاب ترتفع من أو هبوط إلى خط الأساس. انقر فوق التالي.
ملاحظة: المرحلة الأخيرة من EFA تحويل المتجهات SVD مرة أخرى إلى منحنيات التشتت. على يسار الإطار، يتم رسم النطاقات المعرفة مسبقاً في الأعلى. هذه النطاقات هي القيود التي يجب تحديد مكان تدوير المتجهات المفردة مرة أخرى في منحنيات التشتت. لوحة اليد اليمنى يظهر هذه الملامح المنحنية التشتت المقابلة، لكل ذروة فصل. مؤامرة لتركيز كل قمة، التي ينبغي أن يكون ممثل لمحات elution ومؤامرة لخطأ متوسط المرجح تشي2. مؤامرة تشي2 هو قياس مجموعة بيانات deconvolution لمجموعة البيانات الأصلية. من الناحية المثالية ، سيكون هذا مسطحًا ، ولكن يمكن رؤية المسامير في كثير من الأحيان. - محاولة للحد أو القضاء على المسامير عن طريق تغيير عناصر المدى المكون، أولا تحديد ما يقرب من الإطار الذي يتوافق مع ارتفاع (من مؤامرة تشي2) ومن ثم ، في المدى عناصر ، الذي يحتوي على عنصر هذا الإطار (يمكن أن يكون أكثر من واحد) ، وذلك باستخدام الأسهم ، والتحرك صعودا أو لأسفل في النطاق المقابل.
ملاحظة: يجب أن ينتج هذا استجابة زيادة أو تقليل الارتفاع. إذا كان إطار spike موجودًا في أكثر من مكون واحد، فقد يكون من الضروري إجراء تجربة صغيرة وخطأ بين كل مكون. - عندما تم تحقيق الحد الأدنى تشي2، وإجراء التحقق من صحة عن طريق النقر فوق ،ويبدو أن النافذة السابقة للسماح للتحقق إذا كانت التغييرات التي تم إجراؤها قد تغيرت بشكل كبير المؤامرات EFA الأصلي. إذا كانت لا تزال تبدو صالحة، انقر فوق التالي. انقر فوق حفظ بيانات التعليم للجميع لحفظ المؤامرات ثم انقر فوق تم; لإغلاق نافذة EFA.
ملاحظة: التحقق من صحة ثاني هو النقر فوق إيقاف مربع الاختيار بجوار كل نطاق مكون، بدوره. وتوفر هذه القيود تركيز إيجابي لكل مكون وإيقاف والتحقق مما إذا كانت هذه تؤثر تأثيراً كبيراً على مجموعة البيانات. إذا لم ينظر إلى أي تغيير في مؤامرة التركيز ثم البيانات صالحة.
- تحقق من فتح إطار منبثق يعرض تحليل القيمة المفردة (SVD) لمجموعة البيانات. في مربع عناصر التحكم، حدد المربع استخدام الإطارات بحيث يتم تغطية منطقة الذروة بأكملها إلى deconvolute في مخطط الكثافة. تُظهر "القيم المفردة" التي تظهر أعلى اليمين شدة القيم المفردة (قمم/أنواع منفصلة) فوق خط الأساس.
- مرة أخرى في إطار RAW، انقر فوق علامة التبويب "ملفات التعريف" في لوحة التحكم لعرض المنحنيات وفي علامة التبويب "معالجة" في لوحة التحكم،ومعالجة المنحنيات بشكل أكبر أو حفظ المنحنيات كـ * .dat الملفات بالنقر بزر الماوس الأيمن على الملف وتحديد حفظ الملفات المحددة من القائمة المنبثقة. حفظ الملف. استخدام مبعثر الرابع لمزيد من التحليل.
ملاحظة: تم العثور على مزيد من المعلومات والتعليمات حول فك الفولتية وEFA BioXTAS RAW في https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/
4. تحديد خصائص SAXS
ملاحظة: تم العثور على برنامج تعليمي متعمق لتحديد SAXS في Bioisis.net. هنا نعرض نهج خطوة بخطوة أساسية، وتسليط الضوء على الأزرار الأكثر فائدة في مبعثر.
- في علامة التبويب تحليل مبعثر، اضغط على الزر G لأداة التحليل Guinier اليدوية، إلى يمين كل ملف عينة. يعرض الرسم الذي يفتح ln/I(q)مقابل q2 في المربع العلوي والبقايا المقابلة في المربع السفلي. إضافة أو إزالة نقاط بحيث لا يكون للمخلفات "ابتسامة" أو "عبوس" ميزة. يجب ألا تتجاوز البيانات المحددة في ملاءمة Guinier الحد الأقصى q x Rg 1.3.
- اضغط على زر كراتكي المُطَيَّر؛ المؤامرة التي تظهر يوفر تقييما شبه كمي للدولة الهيكلية للجزئي ، تطبيع للكتلة والتركيز.
ملاحظة: تحدد التهكات نقطة Guinier-Kratky عند (√3, 1.1)19. سوف بروتين مضغوط كروي تظهر ذروة واحدة مع القيمة القصوى في نقطة Guinier-Kratky. ومن شأن اضطراب جوهري أو البولومير الحيوي الأسطواني يكون الحد الأقصى أكبر من مرمى ولن ينخفض. البروتين الذي كان كل من المجالات مطوية والمناطق الطويلة غير منظم ممدود قد تقدم مع زيادة الحد الأقصى من خلال مرمى ولكن من شأنه أن يظهر أيضا اتجاها تناقص واضح في أعلى q x Rg. - انقر على زر Vc (حجم الارتباط) ، الذي يجلب اثنين من المؤامرات ، وكثافة مجموع متناثرة ومنطقة متكاملة من كثافة مجموع متناثرة وظيفة من ف. وتستخدم المؤامرات كمرجع سريع للتحقق من جودة منحنى التشتت.
ملاحظة: كثافة إجمالية مبعثرة حساسة إلى I(0) وإذا لم يتم قياس هذا بشكل صحيح ثم لن تظهر الرسم خط مستمر. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تظهر المنطقة المتكاملة خطًا سينيًا مع هضبة ممتدة لكل منحنى SAXS. إذا كان هناك عدم تطابق/طرح المخزن المؤقت، فإن التجميع أو التداخل بين الجسيمات في العينة سوف يُلاحظ انحدار حاد عند قيم q أعلى. - اضغط على زر المرونة لبدء تحليل المرونة. هذا سيفتح نافذة مع أربع لوحات وشريط تمرير في الجزء السفلي. كل لوحة فتح يظهر مؤامرة استغلال علاقة السلطة القانون الذي يوجد بين المدمجة وممدود / مرنة biopolymers23. لاستخدامها، حرك شريط التمرير في أسفل المربع من اليمين إلى اليسار مع الضغط على زر الماوس الأيسر. استمر في التحرك ببطء إلى اليسار حتى يتم الوصول إلى هضبة في واحدة من المؤامرات.
ملاحظة: إذا كان ينظر إلى الهضبة في مؤامرة Porod-Debye، ثم العينة هي مدمجة في الطبيعة، والتي ينبغي أن تكون متسقة مع ذروة واحدة في نقطة Guinier-Kratky في مؤامرة قراكي تطبيع. إذا تم التوصل إلى الهضبة الأولى في مؤامرة Kratky-Debye ثم العينة هو الأكثر احتمالا ممدود أو مرنة. إذا كان مؤامرة SIBYLS هو أولا إلى الهضبة، ثم عينة على الأرجح يحتوي على مناطق من كل من الإحكام والمرونة، وهو الجسيمات مع حالات مختلطة. إن نظرية علاقة المرونة هذه مع قانون بورود - ديبي تعالج بشكل رائع في رامبو، وآخرون23 - انقر على حجم. وينبغي أن يتم تحديد حجم مباشرة بعد تحليل المرونة من فوق. عند فتح بعد تحليل المرونة، يتم إنشاء نافذة منبثقة مع ثلاثة رسوم بيانية أخرى. في الجزء السفلي ، في الزاوية اليسرى مؤامرة Porod-Debye يتذكر حيث ترك واحد المنزلق من مؤامرة المرونة ، والتي تبين المنطقة الهضبة.
- لحساب حجم الجسيمات، حرك نقطة النهاية والبداية باستخدام أزرار الأسهم أو اكتب في المربعات، بحيث يكون الخط الأزرق على قطعة الأرض يناسب المنطقة الهضبة. للحصول على نتيجة غير متحيزة، يجب أن تظهر بقايا في أعلى اليمين Porod-Debye أس قانون السلطة تناسب، أي نمط.
- اضغط على علامة التبويب P(r). توزيع المساحة الحقيقية في اللوحة اليسرى ومنحنى التشتت للعينة في اللوحة اليمنى. والهدف من ذلك هو خلق تمثيل الفضاء الحقيقي للعينة من منحنى SAXS الفضاء المتبادل. من الناحية المثالية، سوف يكون منحنى التوزيع على نحو سلس مع عدم وجود موجات وينبغي فقط تقبيل بلطف محور س.
ملاحظة: قد لا يكون نطاق q المقاس للأداة قابلاً للاستخدام بالكامل بسبب ضعف مطابقة العازلة، والتجميع، وتلف الإشعاع، وأوقات التعرض دون المستوى الأمثل، وانخفاض تركيزات الجسيمات. سوف تحدد خطوة تحديد P(r) بشكل أساسي مدىq min و qالأقصى للاستخداملمجموعة بيانات SAXS ويجب أن يكون هذا النطاق من البيانات التي يتم استخدامها لأي النمذجة اللاحقة أو التركيب.- انقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم النموذج ثم انقر فوق Find DMAX لفتح نافذة جديدة. حدودلدود ماكس هي قبل تعيين معالحد الأقصى q المقترحة (أقصى نقاط البيانات المستخدمة)، الحدالأقصى د السفلي والعلوي ودرجة ألفا السفلى والعلوي. ويمكن اختيار ثلاثة نماذج (L1 - القاعدة ، ليجندير ومور) واستخدام الخلفية المدرجة. اترك هذه دون تغيير في المقام الأول.
- اضغط على الزر ابدأ. يتم إنشاء توزيع مركب في اللوحة اليسرى معالحد الأقصى d المقترحة و مستوى ألفا مكتوبة تحتها. إذا كان هذا يبدو مقبولا ثم إغلاق الإطار والعودة إلى علامة التبويب P(r). سوف يكون قد تم اقتصاص مؤامرة الفضاء المتبادلة لتتناسب معالحد الأقصىq المقترحة .
- اختيار نموذج مور، انقر على خلفية ثم تعيين مستوى ألفاوماكس د إلى القيم المقترحة من مربع المنبثقة. اضغط على زر تحسين. سوف تظهر مؤامرة التحقق من صحة الـ Cross-validation إذا كان يجب رفض أي نقاط، وتتميز باللون الأحمر. إذا كان هناك فقط عدد قليل من النقاط المرفوضة والتوزيع تبدو جيدة ثم نموذج جيد.
ملاحظة: سيتم رسم التحقق من صحة عبر تمييز مناطق البيانات التي لا تتوافق مع تحديد P(r)-التوزيع. إذا كانت المنطقة المرفوضة هي أساسا في المنطقة منخفضة q، أي المنطقة القريبة من محور y، وهذا من المرجح أن يشير إلىالحد الأقصى د قصيرة جدا، وجود تجميع أو أعلى ترتيب oligomers. وهو يبرز عدم الاتساق بين المعلومات ذات الدقة الأعلى وأدنى. هنا، يجب تعديلd الحد الأقصى و qدقيقة (زيادة قيمة البدء) باستخدام نهج يدوي، التجربة والخطأ. وبالمثل، إذا كانت المنطقة المرفوضة تقع أساساً في منطقة q العالية، فقد يشير ذلك إلى وجود مشكلة في طرح الخلفية أو أن الإشارة أضعف من أن تفسر بشكل مفيد من خلال التوزيع المحدد P(r). في هذه الحالة، يجب اقتطاعq الحد الأقصى (نهاية متناقصة) حتى يتم رفض أية بيانات إضافية. من الناحية المثالية ، يجب توزيع النقاط المرفوضة بشكل عشوائي ، وتُمثل أقل من 5٪ من البيانات القابلة للاستخدام. A تعريف صحيح سدقيقة، سماكس و "دماكس"سوف تنتج توزيعا سلسا حيثماكس د القبلات محور س. ومع ذلك، لا تزيد هذه القيمة كثيراً بحيث تزيل منطقة جينييه بالكامل. هذه النقطة يمكن العثور عليها بسهولة عن طريق التحقق من q x l(q) مربع (على يسار لوحة فوق الجدول). يتم استبدال منحنى التشتت من قبل "مجموع مؤامرة كثافة مبعثرة"، على هذا المنحنى جميع النقاط قبل أقصى تصريف هي جزء من منطقة جينييه. بعد إزالة النقاط حاول مرة أخرى لزيادة / إنقاص"د ماكس"ثم صقل مرة أخرى. إذا استمرت المشاكل ، وخصوصا عندما يتم رفض العديد من النقاط من بداية منحنى التحقق من الصحة ، وهذا يشير بقوة البيانات ليست مثالية لنم نمض الهيكلية.
- لطباعة تقرير، انتقل مرة أخرى إلى علامة التبويب تحليل، انقر بزر الماوس الأيمن لتمييز النموذج ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم العينة ثم الانتقال إلى إنشاء تقرير من مجموعة بيانات مفردة في القائمة. يتم فتح مربع نص للسماح بإضافة التعليقات. يتم إنتاج وثيقة PDF توضح جميع الأرقام والقيم التي تم إنشاؤها.
Representative Results
وميزة استخدام فك الفولتولي على اختيار الإطار الكلاسيكي13 هي إزالة تأثير الأنواع على بعضها البعض، مما ينتج إشارة تشتت أحادية. وكثيراً ما يتبع ذلك أيضاً مع إشارة أفضل إلى نسبة الضوضاء. عندما E9exo ناقص هو منضم إلى الحمض النووي وتشغيل باستخدام لجنة الأوراق المالية والبورصة - SAXS ، ويلاحظ اثنين من القمم (الشكل 1). الأولى ، ذروة كبيرة (إطارات تقريبا 420\u2012475) هو E9 exoناقص- مجمع الحمض النووي الثاني (إطارات تقريبا 475\u2012540) ، حالة غير منضم (انظر البيانات التكميلية : الشكل 2). في حين أن النهج الكلاسيكي لاختيار الإطارات يوفر Rg مستقر للمجمع في الذروة الأولى (انظر البيانات التكميلية: الشكل 3)، يتم دمج الذروة الثانية بوضوح ويظهر الـ Rg عبر المؤامرة أن الذروة الثانية من الاهتمام ليس لديها Rg مستقرة ، بسبب التلوث عبر الذروة. يمكن استخدام 5 إطارات فقط التي أظهرت Rg شبه مستقرة، عندما طرح أنها أعطت Rg = 36.3 ه(الشكل 2، الأخضر). عندما تم فك القمم باستخدام EFA منحنى المقابلة للذروة الثانية(الشكل 2، الأزرق) كان متراكبا مع الأصلي وأظهرت انخفاضا واضحا في إشارة إلى الضوضاء، وRg أقل، تم تسجيل 34.1 Å. المؤامرة Kratky (الشكل 3) يظهر المجمع مع ذروة deconvoluted (الأزرق) هو أكثر كروية. وهذا ما أكده منحنى P(r)(الشكل 4)الذي يعطيد كحد أقصى 108.5 Å للمنحنى deconvoluted (الأزرق) في حين أن غير deconvoluted هو أكثر ممدود مع دماكس 120 ه (الأخضر)، وهذا هو الأكثر احتمالا بسبب عدم التجانس الناجمة عن E9 غير منضمناقصexo .
الشكل 1: مؤامرة إشارة E9 exoناقص وحدها ومع الحمض النووي في معقدة.
تعرض اللوحة العلوية رسمًا للنسبة المتكاملة إلى الخلفية لكل إطار من تشغيل SEC-SAXS (أزرق فاتح). تظهر النقاط الحمراء Rg في كل إطار على القمة. لوحة أسفل يظهر الخريطة الحرارية المقابلة التي تبين بقايا كل إطار الملونة وفقا لتحليل Durbin واتسون لصناعة السيارات الارتباط، والمناطق ذات التشابه العالي هي ملونة السماوي في حين إطارات متباينة تتبع قتامة البلوز إلى الوردية وأخيرا إلى الأحمر اعتمادا على شدة الاختلاف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مؤامرة من كثافة مقابل ناقلات التشتت.
تراكب من بيانات SAXS طرحها تشكل E9 exoناقص . في إطارات 5 الأخضر (الإطار 517\u2012522) متوسط وطرحها من منطقة شبه مستقرة Rg وفي الأزرق منحنى التشتت ممثل مشتقة من إلغاء التصنيع في EFA من قمة لجنة الأوراق المالية والبورصة SAXS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنى كراتكي بلا أبعاد.
تراكب منحنى الكراكتي deconvoluted (الأزرق) وغير deconvoluted (الأخضر) تظهر E9 exoناقص هو كروي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: منحنى P (r).
تراكب منحنيات deconvoluted (الأزرق) وغير deconvoluted (الأخضر) لE9 exoناقص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
البيانات التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف
Discussion
من المرغوب فيه أن يكون عينة أحادية قبل بدء تجربة SAXS، ولكن في الواقع، العديد من مجموعات البيانات لا تلبي هذا ويجب تحسينه من خلال الجمع بين القياس مع الكروماتوغرافيا مضمنة -لجنة الأوراق المالية والبورصة في معظم الحالات. ومع ذلك، حتى النقص في الوقت بين تنقية وحيازة البيانات أحادية العينة غير مضمونة. وينطبق ذلك بشكل أكثر شيوعًا على التجارب التي تكون فيها المكونات قريبة جدًا من حيث الحجم أو في خصائصها الفيزيائية بحيث لا يمكن فصلها أو تكون عرضة للديناميكية السريعة. هنا ، قدمنا بروتوكول يجمع بين قيمة واحدة التحلل مع تحليل عامل متطور لإزالة تأثير E9 E9 DNAboundناقص من unbound خلق أحادية التشتت التشكيل الجانبي التي كنا قادرين على تحليل مع حزمة SAXS مبعثر الرابع.
SVD مع EFA من بيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة SAXS هي طرق قوية جدا وضعت لإلغاء البيانات SAXS وتحسين التحليل، ولكن لديهم قيود. وهي تتطلب أن يتم الاحتفاظ بالضوضاء أو الانجراف في خط الأساس العازل لـ SEC-SAXS إلى أدنى حد. قد يتضمن هذا توازن عمود إضافي (أفضل لاستخدام أكثر من 3 وحدات تخزين عمود، اعتماداً على المخزن المؤقت) قبل تحميل العينة. ومع ذلك، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي اختيار عدد القيم المفردة ونطاق البيانات المستخدمة، لأن هذا سيؤثر بشكل كبير على دقة فك الفولت. ولهذا السبب لا ينبغي أن تؤخذ النتائج من تلقاء نفسها ولكن مزيد من التحليل باستخدام تقنيات مثل الطرد التحليلي فائق التركيز (AUC) أو تشتت ضوء الليزر متعدد الزاوية (MALLS) للتفسير البيولوجي.
مبعثر الرابع هو جديد ، حزمة البرمجيات ، مجانا للأبحاث والاستخدام الصناعي مع واجهة مستخدم بديهية التي تسمح حتى غير الخبراء لتحليل بياناتهم. يحتوي Scatter IV على العديد من الميزات الجديدة التي تساعد على تحسين تحليل بيانات SEC-SAXS ، مثل الخريطة الحرارية المرتبطة بمؤامرة الإشارة ، مما يتيح دقة أكبر مع اختيار اختيار الإطار. في تحليل البيانات الأولية، يقدم تحليل "جينييه الذروة" و"مؤامرة التحقق من الصحة عبر" المرتبطة بتحليل P (r) إمكانية متكاملة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في البرنامج.
وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام العديد من البرامج الأخرى لتحليل البيانات الأولية؛ هذه تحتوي على نفس الميزات الأساسية ويتم تحديثها بانتظام مثل BioXTAS RAW17 ATSAS حزمة24 و US-SOMO15 على سبيل المثال لا الحصر.
ولكن بغض النظر عن أي حزمة SAXS تستخدم للتحليل ، فإن القيود الرئيسية شائعة: إعداد العينة ، قبل الجمع والتحليل. في E9exo المثال ناقص هو مبين، فمن الواضح أن نرى التحسن في نسبة الإشارة إلى الضوضاء ومع انخفاض في Rgالحد الأقصى د المرتبطة عينة monodisperse. وهذا سيساعد كثيرا على زيادة معالجة البيانات مثل تركيب أو نمجة مع الهياكل المعروفة عالية الدقة.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونحن نعترف بالدعم المالي للمشروع من المنحة الفرنسية REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 والمنح البحثية من دائرة سانتيه دي أرميز وDélégation Générale pour l'Armement. ونحن ممتنون لESRF لوقت شعاع SAXS. استخدم هذا العمل منصات مركز غرونوبل للتعليم ERIC (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) ضمن شراكة غرونوبل لعلم الأحياء الهيكلي (PSB)، بدعم من FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) وGRAL، بتمويل من جامعة Grenoble Alpes كلية الدراسات العليا (إيكولز Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). يقر IBS بالاندماج في معهد أبحاث غرونوبل متعدد التخصصات (IRIG, CEA). نشكر ويم ب. بورمايستر وFrédéric Iseni على الدعم المالي والعلمي ونشكر أيضًا الدكتور جيسي هوبكنز من BioCAT في APS على مساعدته وتطوير BioXTAS RAW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |
References
- Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).
- Brosey, C. A., Tainer, J. A. Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).
- Gräwert, M., Svergun, D. A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS). The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).
- Meisburger, S. P., et al. Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).
- Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Scientific reports. 5, (2015).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).
- Ryan, T. M., et al. An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis. Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).
- Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbühler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations. Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).
- Maeder, M., Neuhold, Y. M. Practical Data Analysis in Chemistry. , Elsevier. Burlington. http://www.123library.org/book_details/?id=35069 (2007).
- Tarbouriech, N., et al. The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).
- Brookes, E., Rocco, M. Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite. European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).
- Malaby, A. W., et al. Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).
- Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).
- Maeder, M. Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).
- Durand, D., et al. NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers. Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).
- Kirby, N., et al. Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).
- Rambo, R. P., Tainer, J. A. Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law. Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).
- Franke, D., et al. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
