Summary
SEC-BioSAXS-mätningar av biologiska makromolekyler är ett standardansats för bestämning av lösningsstruktur hos makromolekyler och deras komplex. Här analyserar vi SEC-BioSAXS data från två typer av vanligt påträffade SEC-spår-kromatogram med helt lösta och delvis lösta toppar. Vi demonstrerar analysen och deconvolutionen med hjälp av scatter och BioXTAS RAW.
Abstract
BioSAXS är en populär teknik som används inom molekylär- och strukturbiologi för att bestämma lösningsstruktur, partikelstorlek och -form, yt-till-volym-förhållande och konformationsförändringar av makromolekyler och makromolekylära komplex. En hög kvalitet SAXS-datauppsättning för strukturell modellering måste vara från monodisperse, homogena prover och detta nås ofta endast genom en kombination av inlinekromatografi och omedelbar SAXS-mätning. Oftast används storleksutesläckningskromatografi för att separera prover och utesluta föroreningar och aggregeringar från den partikel av intresse som gör att SAXS-mätningar kan göras från en väl löst kromatografisk topp av en enda proteinart. Fortfarande, i vissa fall, även inline rening är inte en garanti för monodisperse prover, antingen för att flera komponenter är för nära varandra i storlek eller förändringar i form inducerad genom bindande ändra upplevd elution tid. I dessa fall kan det vara möjligt att dekonvolera SAXS-data av en blandning för att få de idealiserade SAXS kurvor av enskilda komponenter. Här visar vi hur detta uppnås och den praktiska analysen av SEC-SAXS-data utförs på ideala och svåra prover. Specifikt visar vi SEC-SAXS analys av vaccinia E9 DNA polymeras exonuclease minus mutant.
Introduction
Biologiska makromolekyler är för små för att ses även med de bästa ljusmikroskopen. Nuvarande metoder för att bestämma sina strukturer innebär i allmänhet kristallisera protein eller mätningar på stort antal identiska molekyler samtidigt. Medan kristallografi ger information om atomnivå, representerar det en konstgjord provmiljö, med tanke på att de flesta makromolekyler inte presenteras i en kristallin form i cellen. Under de senaste åren cryo-elektronmikroskopi levererade liknande högupplösta strukturer av stora makromolekyler / makromolekylära komplex, men även om proverna är närmare fysiologiskt tillstånd, de är fortfarande frysta, därav orörliga och statiska. Bio-small vinkelröntgenspridning (BioSAXS) ger en strukturell mätning av makromolekylen, under förhållanden som är relevanta för biologi. Detta tillstånd kan visualiseras som en låg upplösning 3D-form bestäms på nanometer skala och fångar hela konformational utrymme av makromolekylen i lösning. BioSAXS experiment bedömer effektivt oligomeriska tillstånd, domän och komplexa arrangemang samt flexibilitet mellandomänerna 1,2,3. Metoden är korrekt, mestadels icke-förstörande och kräver vanligtvis endast ett minimum av provberedning och tid. För bästa tolkning av uppgifterna behöver dock proverna vara monodisperse. Detta är utmanande; biologiska molekyler är ofta mottagliga för föroreningar, dålig rening och aggregering, till exempel från frys upptining4. Utvecklingen av inlinekromatografi följt av omedelbar SAXS-mätning hjälper till att mildra dessa effekter. Storlek-uteslutande kromatografi separerar proverna efter storlek så utesluter de flesta föroreningar och aggregeringar5,6,7,8,9,10. Men i vissa fall även SEC-SAXS är inte tillräcklig för att producera en monodisperse prov, eftersom blandningen kan bestå av komponenter som är för nära i storlek eller deras fysiska egenskaper eller deras snabba dynamik leda till överlappande toppar i SEC UV-spår. I dessa fall kan ett programvarubaserat deconvolution-steg av de erhållna SAXS-data leda till en idealiserad SAXS-kurva för den enskildakomponenten 5,11,12. Som ett exempel, i protokoll avsnitt 2, visar vi standard SEC-SAXS analys av vaccinia E9 DNA-polymeras exonuclease minus mutant (E9 exominus) i komplex med DNA. Vaccinia representerar modellorganismen hos Poxviridae, en familj som innehåller flera patogener, till exempel humant smittkoppsvirus. Polymerasen visade sig binda tätt till DNA i biokemiska metoder, med strukturen av komplexet nyligen löst genom röntgenkristallografi13.
De flesta synkrotronanläggningar kommer att ge en automatiserad databehandlingspipeline som kommer att utföra data normalisering och integration producerar en uppsättning av oskickade ramar. Men det tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript kan också användas med en labbkälla förutsatt att SEC-SAXS utförs. Vidare kan ytterligare automatisering finnas tillgänglig som kommer att avvisa strålningsskadade ramar och utföra bufferten subtraktion14. Vi kommer att visa hur man utför primärdataanalys på förbelagade data och får ut det mesta av tillgängliga data i avsnitt 2.
I avsnitt 3 visar vi hur man dekonvolerar SEC-SAXS-data och analyserar kurvorna effektivt. Medan det finns flera deconvolution metoder såsom Gaussiska topp deconvolution, genomförs i US-SOMO15 och Guinier optimerad maximal sannolikhet metod, genomförs i DELA programvara16, dessa kräver i allmänhet en modell för toppform12. Den ändliga storleken på enskilda toppar vi undersöker tillåter användning av evolverande faktoranalys (EFA), som en förbättrad form av singular värdeförmultning (SVD) för att dekonvolutera överlappande toppar, utan att förlita sig på toppformen eller spridningsprofilen5,11. En SAXS-specifik implementering finns i BioXTAS RAW17. EFA användes först på kromatografidata när 2D-diodmatrisdata tillät att matriser bildades från absorbans mot retentionstid och våglängdsdata18. Där EFA utmärker sig är att det fokuserar på den föränderliga karaktären av singularvärden, hur de förändras med utseendet på nya komponenter, med förbehållet att det finns en inneboende ordning iförvärvet 10. Lyckligtvis ger SEC-SAXS-data alla nödvändiga beställda förvärvsdata i organiserade 2D-datamatriser, utlåning sig fint till EFA-tekniken.
I avsnitt 4 kommer vi att visa grunderna för modelloberoende SAXS-analys från buffert-bakgrund subtraherade SAXS-kurvan. Modelloberoende analys bestämmer partikelns radie-av-gyration (Rg), volym-av-korrelation (Vc), Porod Volym (Vp), och Porod-Debye Exponent (PE). Analysen ger en semi-kvantitativ bedömning av partikelns termodynamiska tillstånd vad gäller kompakthet eller flexibilitet via den dimensionslösa Kratky-tomten2,4,19.
Slutligen, SAXS data mäts i ömsesidiga rymdenheter och vi kommer att visa hur man omvandlar SAXS-data till real-space för att återställa par-avstånd, P(r), fördelningsfunktion. P(r)-fördelningen är uppsättningen av alla avstånd som finns inom partikeln och inkluderar partikelns maximala dimension, dmax. Eftersom detta är en termodynamisk mätning, representerar P(r)-fördelningen det fysiska utrymme som upptas av partiklarnas konformationsutrymme. Korrekt analys av en SAXS-datauppsättning kan ge lösning-tillstånd insikter som kompletterar högupplöst information från kristallografi och cryo-EM.
Protocol
1. Proteinuttryck, rening och SEC-SAXS-mätning baseras på det publicerade protokollet13
- Följ inline SEC-SAXS datainsamlingsprotokoll (Brennich et al.6) i korthet.
- Jämvikt SEC-kolumnen med minst 2 kolumn volymer SEC kör buffert (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl).
- Bered 50 μL prov på E9 exominus vid 8\u201210 mg/mL med 20% molar överskott av ett partiellt dsDNA (TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGCC och GGCTAAACCGCTGTTATCTT). E9 exominusröror med en KD på 12 ± 6 nM (se Tilläggsdata).
- Injicera 50 μL av denna mix på en SEC-kolonn (S200 Öka) inline med flödescellen för SAXS-mätningar vid 0,3 mL/min.
- Samla 1000 ramar vid 1 s exponering vardera.
OBS: På BioSAXS beamline BM29, vid European Synchrotron Facility (ESRF) bearbetas de enskilda ramarna automatiskt och självständigt inom EDNA-ramverket14. Efter datainsamlingen öppnar du ISPyB-databasen20 och under fliken Dataanskaffning tryck på Knappen Gå för att komma åt datamängden och resultaten av den automatiska analysen21.
- Ladda ner data.
2. Primär dataanalys
- Öppna det Java-baserade programmet Punkt IV (se Tabell över material) och utföra en subtraktion i bakgrunden för data om storleksuteslutningskromatografi (SEC).
- Öppna fliken SEC. Dra och släpp de reducerade datafilerna( *.dat) i fönstret "Släpp data nedan". Ställ utdatakatalogen "Out Dir ::" genom att klicka på den blåmärkta Output Dir-knappen.
OBS: Om dina data samlades in i nm-1, en konvertering rutan kommer att behöva kontrolleras (nere till vänster på panelen) när släppa filer i fönstret eller fliken subtraktion. - Redigera de experimentella detaljerna, använd knappen Redigera detaljer och fyll i så många fält som möjligt, dessa inkluderar avsnitt om vilken källa/strållinje som användes för att samla in data, insamlingsparametrarna och provdetaljer. Dessa kommer att sparas med data och gör det möjligt att lättare fylla i "Datainsamlingsparametrar" avsnittet i framtida publikationer.
- Ange exempelnamnet i rutan Spara som. Klicka på TRACE.
OBS: Detta har två effekter. För det första kommer det att skapa en *.sec-fil för data. Detta är en enda textfil som kommer att samla alla experimentella observationer från de separata *.dat filer. Dessutom innehåller *.sec filen den medelvärdesuppsättning av ramar som är buffert-bakgrund, alla ramar som används i medelvärdet samt buffert-bakgrund subtraherade ramar över hela SEC-SAXS experiment. För det andra skapas en signal plot som ritar ramen nummer kontra Integral förhållandet till bakgrunden. Då visas de markerade bildrutor (grå) som var medelvärde för buffertens subtraktion. Poängen för den genomsnittliga bufferten bestäms från hela intervallet av data. Det är dock lämpligt att manuellt välja buffertramarna för medelvärden som en dåligt definierad bakgrund kan uppstå på grund av dåligt ekvilozonerade eller smutsiga kolumner eller kapillärpåväxt22. - Välj buffertramar manuellt. Klicka på Rensa buffertar sedan välja om en buffertregion med vänsterklick-dra, på spårkurvan. Helst bör detta vara en platt region före den ogiltiga volymen av SEK-kolumnen med cirka 100 bildrutor. Klicka på SET BUFFER och sedan Uppdatera för att beräkna *.sec-filen på nytt vilket kan ta några minuter.
- Identifiera en region av intresse (ROI). På signalen tomten, välj regionen av toppen av intresse, med en vänster klicka-dra.
OBS: Detta fyller tre tomter i högerpanelen. De två översta tomterna är kopplade med hårkors som rör sig mellan dem, en andra signal plot (överst till höger) visar endast den ROI valt, med intensiteten i varje ram i blått och motsvarande Rg av varje ram i rött och en motsvarande värme karta nedan, som visar rester för varje ram färgad enligt Durbin-Watson auto-korrelation analys. Regioner med hög likhet är färgade cyan (Durbin-Watson, d = 2) medan olika ramar kommer att följa mörkare blues till pinks och slutligen till röda beroende på hur allvarlig olikheten är (d > 2). Den nedersta ritytan är en subtraherad I kontra q-kurva för den centrala valda ramen (även betecknad med en vertikal linje). Piltangenterna kan användas för att navigera genom de subtraherade bildrutorna. I versus q-plot kommer att visa kvaliteten på de subtraherade bildrutorna från SEC-experimentet. - Markera ramar som ska sammanfogas. Klicka på hårkorset i värmekartan tomt att välja delmängd av ramar som kommer att användas för sammanslagning. Hårkorset kommer att identifiera ett triangulärt område av övervägande cyan som faller till den nedre högra sidan av hårkorset. Använd ett musklick för att ange dessa ramar som markerade och framhäva bildrutorna i motsvarande område i Signal-observationsområdet ovanför. Dessa ramar bör helst belysa en region med en stabil Rg.
OBS: Efter behov zoomar du in på värmekartan med ett vänsterklick dra och zooma ut med ett vänsterklicka svepa åt höger. - När nöjd med de markerade ramarna klicka på KOPPLA. Detta kommer att slå samman de subtraherade bildrutorna och presentera dem i fliken ANALYS.
- Öppna fliken SEC. Dra och släpp de reducerade datafilerna( *.dat) i fönstret "Släpp data nedan". Ställ utdatakatalogen "Out Dir ::" genom att klicka på den blåmärkta Output Dir-knappen.
3. Delegering av uppgifter
- Öppna deconvolution-programmet (t.ex., BioXTAS Raw 2.0.0).
- I deconvolution-programmet läser du in datauppsättningen, under fliken Filer, i Kontrollpanelen, använder foldether-symbol för att leta upp data eller kopiera och klistra in platsen i adressfältet.
OBS: Kontrollera att mappen innehåller endast den råa * .dat filer och inga bearbetade eller genomsnittliga datafiler. - Markera alla * .dat filer, tryck på Plot Series-knappen, en tomt av integrerad intensitet kontra ramnummer kommer att dras i "Serie Plot".
- På Kontrollpanelen välj fliken Serie och klicka sedan för att markera kurvan. Öppna upp popup-fönstret LC Analysis med hjälp av knappen vid basen av kontrollpanelen. Detta fönster ger tillgång till flera alternativ, till exempel välja varierande molekyltyper (protein eller RNA). Det gör det också möjligt för användaren att välja buffertregionen för tomten. I första instansen klicka på Auto; detta ska välja en lämplig buffertregion.
OBS: Om detta misslyckas, möjligen på grund av en instabil baslinje, sedan "Lägg till region" för att optimera buffertregionen. Detta fyller i buffertrutan med en mindre ruta i vilken man manuellt kan lägga till de ramnummer som ska användas för bufferten. Alternativt klickar du på "Plocka" för att ge möjlighet att välja ett område på tomten. Leta upp området, vänsterklicka en gång för startpositionen, flytta markören till nästa position och vänsterklicka igen. Det kan vara nödvändigt att lägga till fler än en buffertplats. Klicka på Ange buffert så kommer kurvorna att subtraheras och Rg beräknas över SEC-toppen. Om en popup-ruta visas klickar du på OK. - För att starta Evolving Factor Analysis (EFA) högerklickar du på den markerade filen längst ned i Kontrollpanelen och välj sedan Efa från menyn.
- Kontrollera att ett popup-fönster öppnas vilket visar datamängdens (SVD) enda värde-nedbrytning(SVD). I rutan kontroller, markera rutan Använd ramar så att hela toppområdet för att deconvolute täcks i intensitetsritningen. Handlingen "Singular Values" , överst till höger, visar intensiteten hos singularvärdena (separata toppar/arter) över baslinjen.
OBS: Antalet punkter som förekommer ovanför baslinjen representerar antalet förekommer spridningsarter. Med förbehållet att det är den relativa storleken på singularvärdet till det platta området/baslinjen som är viktigt. - Om du vill hjälpa till att validera antalet enstaka värden använder du det nedersta Autokorrelations plot. Detta visar höger och vänster enda korrelationsvektorer. Klicka på Nästa.
OBS: Dessa representerar i huvudsak spridnings- eller koncentrationsprofiler för vektorn i lösningen. Där den absoluta storleken representerar vektorns betydelse. En betydande komponent kommer att ha en autokorrelation nära 1 (en tumregel cutoff är >0.6\u20120.7). RAW beräknar hjälpsamt detta och visas i #Significant SVs-rutan, nere till vänster, men du kan ändra detta om det behövs. Om det finns flera enstaka värden (t.ex. 4+) kan det vara nödvändigt att titta på bara 2 eller 3 av komponenterna bara, ändra intervallet för de data som används. Ju lägre antal komponenter desto lättare efa-analysen kommer att vara men till kostnaden för att använda mindre data. I komplex situation, där vänster och höger singular vektorer, som bör vara liknande, inte matchar minska den betydande SV antal och minska antalet ramar som används tills vänster och höger singular vektorer är liknande. - Kontrollera att EFA beräknas genom att generera observationsområden i riktningarna framåt och bakåt för varje vektor. Dessa tomter visar när komponenter startar (framåt plot) och avsluta (bakåt plot) lösningsprofilen för den valda SEC-SAXS data. RAW försöker identifiera dessa intervall; ändra dessa med hjälp av pilarna bredvid räknarna så att varje cirkel är i början av en böjningspunkt stiger från eller faller till baslinjen. Klicka på Nästa.
OBS: Den sista etappen av EFA förvandlar SVD-vektorerna tillbaka till spridningskurvor. Till vänster om fönstret ritas de tidigare definierade intervallen upptill. Dessa intervall är de begränsningar för att definiera var att rotera singular vektorer tillbaka till spridning kurvor. Höger handpanelen visar dessa motsvarande spridningskurvan profiler, för varje separerad topp. En tomt för koncentrationen av varje topp, som bör vara representativ för eluering profiler och en tomt för medelvärdet fel viktade chi2. Chi2-observationsområdet mäter deconvolution-datamängden till den ursprungliga datauppsättningen. Helst kommer detta att vara platt, men spikar kan ofta ses. - Försök att minska eller eliminera spikar genom att ändra Kontrollerna av komponentområde, först identifiera ungefär vilken ram som motsvarar spike (från chi2 plot) och sedan, i Range Controls, vilken komponent som innehåller denna ram (det kan vara mer än en), med hjälp av pilarna, flytta upp eller ner motsvarande intervall.
OBS: Detta bör ge ett svar, öka eller minska spiken. Om spike ramen var närvarande i mer än en komponent då lite trial and error mellan varje komponent kan vara nödvändigt. - När ett minimum chi2 har uppnåtts, utföra en valideringskontroll genom att klicka tillbaka, visas föregående fönster att tillåta verifiera om de ändringar som gjorts har drastiskt ändrat den ursprungliga EFA tomter. Om de fortfarande ser giltiga ut klickar du på Nästa. Klicka på Spara EFA-data för att spara tomterna och sedan klicka på Klar; för att stänga EFA-fönstret.
OBS: En andra validering är att klicka av kryssrutan bredvid varje komponentområde, i sin tur. Dessa ger en positiv koncentrationsbegränsning till varje komponent och stänga av kommer att kontrollera om dessa avsevärt påverkar datamängden. Om ingen förändring ses i koncentrationen tomt då uppgifterna är giltiga.
- Kontrollera att ett popup-fönster öppnas vilket visar datamängdens (SVD) enda värde-nedbrytning(SVD). I rutan kontroller, markera rutan Använd ramar så att hela toppområdet för att deconvolute täcks i intensitetsritningen. Handlingen "Singular Values" , överst till höger, visar intensiteten hos singularvärdena (separata toppar/arter) över baslinjen.
- Tillbaka i RAW-fönstret klickar du på fliken Profiler på Kontrollpanelen för att visa kurvorna och i fliken Manipulation på Kontrollpanelen, manipulera kurvorna ytterligare eller spara kurvorna som *.dat-filer genom att högerklicka på filen och välja spara markerad fil(er) på menyn dyker upp. Spara filen. Använd Scatter IV för vidare analys.
OBS: Ytterligare information och instruktioner om deconvolution och EFA BioXTAS RAW finns på https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/
4. Bestäm SAXS-egenskaper
OBS: En fördjupad handledning för SAXS-bestämning finns Bioisis.net. Här visar vi en grundläggande steg för steg-metod, som framhäver de mest användbara knapparna i Scatter.
- I fliken ScatterANALYS trycker du på G-knappen för det manuella analysverktyget Guinier, till höger om varje provfil. Den tomt som öppnas visar ln[I(q)] kontra q2 i den översta rutan och motsvarande rester i den nedersta rutan. Lägg till eller ta bort punkter så att resterna inte har en "leende" eller "rynka pannan" funktionen. De valda uppgifterna i Guinier-passningen bör inte överskrida den maximala gränsen för Q X RG på 1,3.
- Tryck på knappen Normaliserad Kratky; tomten som dyker upp ger en semi-kvantitativ bedömning av makromolekylens strukturella tillstånd, normaliserade för massa och koncentration.
OBS: Hårkorset utse Guinier-Kratky punkt på (√3, 1,1)19. Ett kompakt, sfäriskt protein kommer att visa en enda topp med det maximala värdet vid Guinier-Kratky-punkten. En egen störd eller cylindrisk biopolymer skulle ha ett maximum större än hårkorset och skulle inte minska. Ett protein som hade både vikta domäner och långa långsträckta ostrukturerade regioner kan innebära med en ökad maximal genom hårkorset men skulle också visa en uppenbar minskande trend vid högre q x Rg. - Klicka på Vc-knappen (Volume-of-correlation), som tar upp två tomter, den totala spridda intensiteten och ett integrerat område av den totala spridda intensiteten som en funktion av q. Observationsriterna används som en snabbreferens för att validera spridningskurvans kvalitet.
OBS: Den totala spridda intensiteten är känslig för I(0) och om detta inte har mätts korrekt då tomten inte kommer att visa en kontinuerlig linje. Den integrerade områdesyta, helst, bör visa en sigmoidal linje med en utsträckt platå för varje SAXS kurva. Om det finns buffert-mismatch/subtraktion, kommer aggregering eller interpartikelinterferens i provet en skarp lutning att observeras vid högre q-värden. - Tryck på knappen Flexibilitet för att starta flexibilitetsanalysen. Detta kommer att öppna ett fönster med fyra paneler och ett reglage längst ner. Varje öppnad panel visar en tomt som utnyttjar en makt-lag relation som finns mellan kompakt och långsträckt / flexibel biopolymerer23. Om du vill använda flyttar du reglaget längst ned i rutan från höger till vänster med vänster musknapp nedtryckt. Fortsätt att röra dig långsamt till vänster tills en platå i en av tomterna nås.
OBS: Om platån ses i Porod-Debye tomt, då provet är kompakt i naturen, vilket bör vara förenligt med en enda topp vid Guinier-Kratky punkt i en normaliserad Kratky tomt. Om platån nås först i Kratky-Debye tomten då provet är troligen långsträckt eller flexibel. Om SIBYLS-observationsområdet är först att platå, då provet troligen innehåller områden av både kompakthet och flexibilitet, en partikel med blandade tillstånd. Teorin för denna flexibilitetsrelation med Porod-Debye-lagen tas utsökt upp i Rambo, et al.23 - Klicka på Volym. Volymbestämning bör utföras omedelbart efter flexibilitetsanalysen uppifrån. När den öppnas efter flexibilitetsanalysen genereras en pop up med ytterligare tre grafer. I det nedre, vänstra hörnet porod-Debye tomten minns där man lämnade reglaget från flexibilitet tomt, som visar det planade området.
- Beräkna partikelns volym genom att flytta start- och ändpunkterna med hjälp av pilknapparna eller typen i rutorna, så att den blå linjen på tomten passar den platåerade regionen. För ett opartiskt resultat, rester i övre högra Porod-Debye exponent power-law passform, bör visa något mönster.
- Tryck på fliken P(r). Real-space-fördelningen finns i den vänstra panelen och spridningskurvan för provet i den högra panelen. Målet är att skapa en reell-utrymme representation av provet från det ömsesidiga utrymmet SAXS kurva. Helst kommer fördelningen kurvan vara slät med inga vågor närvarande och bör bara försiktigt kyssa x-axeln.
OBS: Instrumentets uppmätta q-intervall kanske inte är helt användbart på grund av dålig buffertmatchning, aggregering, strålningsskador, suboptimala exponeringstider och låga partikelkoncentrationer. P(r)-bestämningssteget kommer att i grunden bestämma det användbara qmin- och qmax-intervallet för SAXS-datamängden och det bör vara detta dataområde som används för eventuell efterföljande modellering eller montering.- Högerklicka på provets namn klicka sedan på Sök DMAX för att öppna ett nytt fönster. Gränser för dmax är förinställda med den föreslagna qmax (maximal datapunkter som används), nedre och övre dmax-gränser och en lägre och övre alfapoäng. Tre modeller kan väljas (L1-norm, Legendre och Moore) och användning av bakgrund ingår. Lämna dessa oförändrade i första hand.
- Tryck på Start-knappen. En sammansatt fördelning skapas i den vänstra panelen med den föreslagna dmax och alpha nivå skrivet under. Om detta ser acceptabelt sedan stänga fönstret och återgå till P (r) fliken. Den ömsesidiga utrymme tomt kommer att ha beskurits för att matcha den föreslagna qmax.
- Välj modell Moore, klicka på Bakgrund och ställ sedan alfanivån och dmax till de föreslagna värdena från popup-rutan. Tryck på förfina-knappen. En korsvalideringsrit kommer att dyka upp som visar om några punkter måste avvisas, markerade i rött. Om det bara finns några få punkter avvisas och fördelningen ser bra ut då modellen är bra.
OBS: Korsvalideringsriten kommer att belysa regioner av de data som är inkonsekventa med den fastställda P(r)-fördelningen. Om den avvisade regionen är huvudsakligen i låg-q-regionen, som är regionen nära y-axeln, föreslår detta sannolikt en dmax som är för kort, förekomst av aggregering eller högre ordnings oligomerare. Det belyser en inkonsekvens mellan den högre och lägre upplösningen information. Här bör dmax och qmin (ökande startvärde) justeras med hjälp av en manuell, trial-and-error-metod. Om den avvisade regionen i huvudsak beser sig i hög q-regionen kan detta på samma sätt tyda på ett problem med subtraktionen i bakgrunden eller att signalen är för svag för att på ett meningsfullt sätt förklaras av den fastställda P(r)-fördelningen. I så fall bör qmax trunkeras (minskande slut) tills inga ytterligare data avvisas. Helst bör avvisade punkter fördelas slumpmässigt och utgör mindre än 5 % av de användbara uppgifterna. En korrekt definierad qmin, qmax och "dmax" kommer att producera en jämn fördelning där dmax kyssar x-axeln. Dock inte öka detta värde så mycket att det helt tar bort Guinier regionen. Denna punkt hittas enkelt genom att markera rutan q x l(q) (till vänster om panelen ovanför tabellen). Spridningskurvan ersätts av "Total Scattered Intensity plot", på denna kurva alla punkter innan max böjningen är en del av Guinier-regionen. Efter att ha tagit bort punkter försöka igen för att öka /minska "dmax" och sedan förfina en gång till. Om problem kvarstår, särskilt när många punkter avvisas från början av valideringskurvan, tyder detta starkt på att data inte är idealiska för strukturell modellering.
- Om du vill skriva ut en rapport navigerar du tillbaka till fliken Analys, vänsterklickar för att markera exemplet och högerklicka sedan på exempelnamnet och flytta till Skapa rapport från enstaka datamängd i menyn. En textruta öppnas för att tillåta att kommentarer läggs till. Ett PDF-dokument tas fram som visar alla siffror och värden som genereras.
Representative Results
Fördelen med att använda deconvolution över klassisk ram urval13 är att ta bort påverkan av arter på varandra, producerar en monodisperse spridning signal. Detta följs också ofta med en bättre signal till brusförhållande. När E9 exominus är bunden till DNA och körs med hjälp av SEC-SAXS observeras två toppar (bild 1). Den första, stora toppen (ungefär bildrutor 420\u2012475) är E9 exominus-DNA-komplexet det andra (ungefär bildrutor 475\u2012540), det obundna tillståndet (se Tilläggsdata: Bild 2). Medan den klassiska metoden att välja ramar ger en stabil Rg av komplexet i den första toppen (se Kompletterande Data: Figur 3), den andra toppen är tydligt samman och Rg över tomten visar att den andra toppen av intresse inte har en stabil Rg, på grund av korstopp förorening. Endast 5 bildrutor kunde användas som visade en halvstabil Rg, när de subtraherades gav de en Rg = 36,3 Å (Figur 2, grön). När topparna deconvoluted med hjälp av EFA motsvarande kurvan för den andra toppen (Figur 2, blå) var överlagrad med den ursprungliga och visade en tydlig minskning av signal till buller, och en lägre Rg, 34,1 Å spelades in. Kratky plot (Figur 3) visar komplexet med deconvoluted topp (blå) är mer klotformig. Detta bekräftas av P(r)-kurvan (figur 4) som ger en dmax 108,5 Å för deconvoluted kurvan (blå) medan den icke-deconvoluted är mer avlång med en dmax 120 Å (grön), detta beror troligtvis på heterogenitet som härrör från den obundna E9 exominus.
Bild 1: Signaltomt av E9 exominus ensam och med DNA i komplex.
Den övre panelen visar en tomt av integralförhållandet till bakgrunden för varje bildruta i en SEC-SAXS-körning (ljusblå). De röda punkterna visar Rg vid varje bildruta över toppen. Den nedre panelen visar motsvarande värme karta som visar rester för varje ram färgade enligt Durbin-Watson auto-korrelation analys, regioner med hög likhet är färgade cyan medan olika ramar följa mörkare blues till pinks och slutligen till rött beroende på svårighetsgraden av olikhet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Tomt på intensitet kontra spridningsvektor.
En överlagring av de subtraherade SAXS-datan bildar E9 exominus . I gröna 5-ramar (ram 517\u2012522) medelvärdet och subtraheras från ett område med halvstabila Rg och i blått den representativa spridningskurvan som härrör från EFA-deconvolutionen av SEC-SAXS-toppen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Dimensionslös Kratkykurva.
Överlagring av deconvoluted (blå) och icke-deconvoluted (grön) Kratky kurva visar E9 exominus är klotformig. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: P(r)-kurva.
Överlagringen av de deconvoluted (blå) och icke-deconvoluted (grön) kurvor för E9 exominus. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Data. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen
Discussion
Det är önskat att ha en monodisperse prov innan du startar ett SAXS experiment, men i verkligheten, många datainsamlingar inte uppfyller detta och måste förbättras genom att kombinera mätningen med inline kromatografi-SEK i de flesta fall. Men även bristen på tid mellan rening och datainhämtning monodispersity av provet är inte garanterat. Vanligast gäller detta experiment där komponenter är för nära i storlek eller i sina fysiska egenskaper för att separeras eller är benägna att snabb dynamik. Här har vi lämnat ett protokoll som kombinerar ett värde nedbrytning med utvecklande faktor analys för att ta bort påverkan av DNAbound E9 exominus från dess obundna skapa en monodisperse spridning profil som vi sedan kunde analysera med SAXS paketet Scatter IV.
SVD med EFA av SEC-SAXS-data är mycket kraftfulla metoder som utvecklats för att dekonvolera SAXS-data och förbättra analysen, men de har begränsningar. De kräver att buller eller avdrift i bufferten baslinjen för SEC-SAXS hålls till ett minimum. Detta kan innebära extra kolumn jämvikt (bättre att använda mer än 3 kolumn volymer, beroende på buffert) innan prov lastning. Det mest kritiska steget är dock valet av antalet singularvärden och det dataintervall som används, eftersom detta i hög grad kommer att påverka deconvolutionens riktighet. Det är av denna anledning som resultaten inte bör tas på egen hand utan ytterligare analyseras med hjälp av tekniker som analytiska ultracentrifugering (AUC) eller multi-vinkel-laser-ljus-spridning (MALLS) för biologisk tolkning.
Scatter IV är ett nytt, programpaket, gratis för forskning och industriell användning med ett intuitivt användargränssnitt som gör att även icke-experter kan analysera sina data. Scatter IV har flera nya funktioner som bidrar till att förbättra analysen av SEC-SAXS-data, till exempel värmekartan kopplad till signaltomten, vilket möjliggör större noggrannhet med val av val av ram. I primära dataanalys, Guinier Peak analys och korsvalidering tomten i samband med P(r) analys erbjuder en integrerad felsökning förmåga i programvaran.
Det bör nämnas att många andra program kan användas för primärdataanalys; dessa innehåller samma grundläggande funktioner och uppdateras också regelbundet såsom BioXTAS RAW17 ATSAS paket24 och US-SOMO15 för att nämna några.
Men oavsett vilket SAXS-paket som används för analys, är de stora begränsningarna vanliga: provberedningen, före insamling och analys. I E9 exominus exempel visas, är det tydligt att se förbättringen av förhållandet signal till brus och med en minskning av Rg den dmax i samband med en monodisperse prov. Detta kommer i hög grad att bidra till ytterligare behandling av uppgifterna såsom montering eller modellering med kända högupplösta strukturer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner det ekonomiska stödet till projektet från det franska bidraget REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 och genom forskningsanslag från Service de Santé des Armées och Délégation Générale pour l'Armement. Vi är tacksamma mot ESRF för SAXS-stråltiden. Detta arbete använde plattformarna av Grenobleen Instruera-ERIC centrerar (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) inom Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), med stöd av FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) och GRAL, finansieras inom universitetet Grenoble Alpes forskarskola (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS erkänner integrationen i det tvärvetenskapliga forskningsinstitutet i Grenoble (IRIG, CEA). Vi tackar Wim P. Burmeister och Frédéric Iseni för ekonomiskt och vetenskapligt stöd och vi tackar även Dr Jesse Hopkins från BioCAT vid APS för hans hjälp och för att utveckla BioXTAS RAW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |
References
- Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).
- Brosey, C. A., Tainer, J. A. Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).
- Gräwert, M., Svergun, D. A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS). The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).
- Meisburger, S. P., et al. Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).
- Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Scientific reports. 5, (2015).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).
- Ryan, T. M., et al. An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis. Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).
- Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbühler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations. Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).
- Maeder, M., Neuhold, Y. M. Practical Data Analysis in Chemistry. , Elsevier. Burlington. http://www.123library.org/book_details/?id=35069 (2007).
- Tarbouriech, N., et al. The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).
- Brookes, E., Rocco, M. Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite. European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).
- Malaby, A. W., et al. Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).
- Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).
- Maeder, M. Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).
- Durand, D., et al. NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers. Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).
- Kirby, N., et al. Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).
- Rambo, R. P., Tainer, J. A. Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law. Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).
- Franke, D., et al. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
