Summary
Biyolojik makromoleküllerin SEC-BioSAXS ölçümleri makromoleküllerin ve komplekslerinin çözelti yapısını belirlemek için standart bir yaklaşımdır. Burada, sec-BioSAXS verilerini, tamamen çözülmüş ve kısmen çözülmüş zirvelere sahip, sık karşılaşılan iki tür SEC izlerinden analiz ediyoruz. Biz dağılım ve BioXTAS RAW kullanarak analiz ve dekonvolution göstermek.
Abstract
BioSAXS, moleküler ve yapısal biyolojide çözelti yapısını, parçacık boyutunu ve şeklini, yüzey-hacim oranını ve makromoleküllerin ve makromoleküler komplekslerin konformasyonel değişimlerini belirlemek için kullanılan popüler bir tekniktir. Yapısal modelleme için yüksek kaliteli SAXS veri seti monodisperse, homojen örneklerden olmalıdır ve bu genellikle sadece sıralı kromatografi ve hemen SAXS ölçümü kombinasyonu ile ulaşılır. En yaygın olarak, boyut dışlama kromatografisi örnekleri ayırmak ve kirleticimaddeleri ve toplamaları ilgi parçacığından dışlamak için kullanılır ve bu da Tek bir protein türünün iyi çözülmüş kromatografik zirvesinden SAXS ölçümlerinin yapılmasını sağlar. Yine de, bazı durumlarda, hatta sıralı arınma monodisperse örneklerinin garantisi değildir, çünkü birden fazla bileşen boyut olarak birbirine çok yakın dır ya da algılanan elution süresini değiştirme yoluyla oluşan şekil değişiklikleri. Bu gibi durumlarda, tek tek bileşenlerin idealize Edilmiş SAXS eğrilerini elde etmek için karışımın SAXS verilerini deconvolute etmek mümkün olabilir. Burada bunun nasıl sağlandığını ve SEC-SAXS verilerinin pratik analizinin ideal ve zor numuneler üzerinde gerçekleştirilgösterdiğini gösteriyoruz. Özellikle, vaccinia E9 DNA polimeraz ekonukleaz eksi mutant SEC-SAXS analizini gösteriyoruz.
Introduction
Biyolojik makromoleküller en iyi ışık mikroskoplarıyla bile görülemeyecek kadar küçüktür. Yapılarını belirlemek için kullanılan mevcut yöntemler genellikle proteinin kristalize olmasını veya aynı anda çok sayıda özdeş molekül üzerinde ölçüm yapmayı içerir. Kristalografi atomik seviye hakkında bilgi sağlarken, makromoleküllerin çoğunun hücrede kristal bir formda sunulmadığı göz önüne alındığında yapay bir örnek ortamı temsil eder. Son birkaç yıl boyunca kriyo-elektron mikroskobu büyük makromoleküllerin / makromoleküler komplekslerin benzer yüksek çözünürlüklü yapılarını teslim etti, ancak örnekler fizyolojik duruma daha yakın olmasına rağmen, hala donmuş, dolayısıyla hareketsiz ve statiktir. Biyo-küçük açı X-ışını saçılma (BioSAXS) biyoloji ile ilgili koşullarda makromolekülün yapısal bir ölçüm sağlar. Bu durum nanometre ölçeğinde belirlenen düşük çözünürlüklü 3-B şekil olarak görselleştirilebilir ve çözeltideki makromolekülün tüm konformasyonal alanını yakalar. BioSAXS deneyleri verimli oligomerik durum, etki alanı ve karmaşık düzenlemeler yanı sıra etki alanları1,2,3arasındaki esnekliği değerlendirmek . Yöntem, çoğunlukla tahribatsız, doğru ve genellikle örnek hazırlanması ve zaman sadece en az gerektirir. Ancak, verilerin en iyi şekilde yorumlanması için, örneklerin monodisperse olması gerekir. Bu zor bir iştir; biyolojik moleküller genellikle kontaminasyonlara, kötü saflaştırma ve toplama yatkındır, örneğin donma çözülme4. Hemen SAXS ölçümü sonrasında sıralı kromatografinin geliştirilmesi bu etkilerin hafifletilemesine yardımcı olur. Boyut dışlama kromatografisi örnekleri boyuta göre ayırır ve böylece en çok kirletici madde ve toplama5,6,7,8,9,10hariç tutulur. Ancak, bazı durumlarda, hatta SEC-SAXS monodisperse örnek üretmek için yeterli değildir, karışım boyutu çok yakın bileşenler den oluşabilir veya fiziksel özellikleri veya hızlı dinamikleri SEC UV iz örtüşen zirvelere yol açabilir. Bu gibi durumlarda, elde edilen SAXS verilerinin yazılım tabanlı bir dekonvolution adımı tek tek bileşen5,11,12'ninidealize edilmiş SAXS eğrisine yol açabilir. Örnek olarak, protokol bölüm 2'de, vaccinia E9 DNA polimeraz eksonekleaz eksi mutant (E9 exoeksi)DNA ile kompleks standart SEC-SAXS analizini gösteriyoruz. Vaccinia Poxviridae model organizma temsil eder, çeşitli patojenler içeren bir aile, örneğin insan çiçek virüsü. Polimeraz biyokimyasal yaklaşımlardna sıkıca bağlamak için gösterilmiştir, karmaşık yapısı ile son zamanlarda X-ışını kristalografisi ile çözüldü13.
Çoğu senkron tesisleri, bir dizi alttan çıkarılmış çerçeve üreterek veri normalleştirme ve tümleştirme gerçekleştirecek otomatik bir veri işleme ardışık hattı sağlar. Ancak bu el yazmasında açıklanan yaklaşım, SEC-SAXS'ın gerçekleştirilmesi koşuluyla bir laboratuvar kaynağıile de kullanılabilir. Ayrıca, radyasyondan zarar görmüş çerçeveleri reddedecek ve tampon çıkarma14'ünicrasını sağlayacak ek otomasyon kullanılabilir. Önceden işlenmiş veriler üzerinde birincil veri çözümlemesi nasıl yapılacağını ve bölüm 2'deki mevcut verilerden en iyi şekilde nasıl çıkarılabiliyoruz.
Bölüm 3'te, SEC-SAXS verilerinin nasıl deconvolute yapılacağını ve eğrileri verimli bir şekilde nasıl analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Abd-SOMO15 ve Guinier optimize maksimum olasılık yöntemi, DELA yazılımı16uygulanan uygulanan Gaussian pik dekonvolution gibi çeşitli dekonvolution yöntemleri olsa da, bu genellikle tepe şekli 12 için bir model gerektirir12. Biz araştırıyoruz bireysel zirvelerin sonlu boyutu gelişen faktör analizi (EFA), tekil değer ayrışması gelişmiş bir formu olarak (SVD) tepe şekli veya saçılma profili5,11güvenmeden çakışan zirveleri deconvolute sağlar. BioXTAS RAW17'deSAXS'a özel bir uygulama bulunabilir. EFA ilk olarak kromatografi verilerinde 2D diyot dizilimi verilerinin bekletme süresine ve dalga boyu verilerine karşı absorbanstan matrislerin oluşmasına izin verdiğinde kullanılmıştır18. EFA'nın öne çıktığı nokta, tekil değerlerin gelişen karakterine odaklanmasıdır, yeni bileşenlerin görünümüyle nasıl değiştiklerine, satın alma10'dadoğal bir düzen olduğu ihtarına bağlıdır. Neyse ki, SEC-SAXS verileri organize 2B veri dizilerinde gerekli tüm sipariş edinimi verilerini sağlayarak, kendisini EFA tekniğine güzelbir şekilde ödünç vermektedir.
Bölüm 4'te, arabellek arka planı çıkarılan SAXS eğrisinden modelden bağımsız SAXS analizinin temellerini göstereceğiz. Modelden bağımsız analiz, parçacığın girdap yarıçapını (Rg), korelasyon hacmini (Vc), Porod Hacimli (Vp) ve Porod-Debye Üslerini (PE) belirler. Analiz boyutsuz Kratky arsa2,4,19ile kompaktlık veya esneklik açısından parçacık termodinamik durumunun yarı kantitatif bir değerlendirme sağlar.
Son olarak, SAXS verileri karşılıklı uzay birimlerinde ölçülür ve saxs verilerini çift uzaklık, P(r), dağıtım işlevini kurtarmak için gerçek uzaya nasıl dönüştürebileceğimizi göstereceğiz. P(r)-dağılım parçacık içinde bulunan tüm mesafeler kümesidir ve parçacığın maksimum boyutu, dmaxiçerir. Bu termodinamik bir ölçüm olduğundan, P(r)-dağılımı parçacıkların konformasyonel alanının işgal ettiği fiziksel alanı temsil eder. Bir SAXS veri setinin doğru analizi, kristalografi ve kriyo-EM'den gelen yüksek çözünürlüklü bilgileri tamamlayan çözüm durumu öngörüleri sağlayabilir.
Protocol
1. Protein ekspresyonu, saflaştırma ve SEC-SAXS ölçümü yayınlanan protokol13'e dayanmaktadır.
- Satır içi SEC-SAXS veri toplama protokolünü (Brennich ve ark.6)kısaca izleyin.
- SEC sütununu en az 2 sütun luk SEC çalışma arabelleği (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) ile dengeleyin.
- 8\u201210 mg/mL'de 50 μL E9 exoeksi numunesini parsiyel dsDNA 'nın %20 molar fazlalığı ile hazırlayın (TCAGGAAGATAACAACAGCGGTTTAGCC ve GGCTAAACCGCTGTTATTT). E9 exoeksi 12 ± 6 nM KD ile bağlanır (Ek Verilerebakın).
- 0,3 mL/dk'da SAXS ölçümleri için akış hücresi ile bu karışımın 50 μL'sini bir SEC sütununa (S200 Artış) enjekte edin.
- Her biri 1 s pozlama da 1000 kare toplayın.
NOT: BioSAXS ışın hattı BM29'da, Avrupa Senkrotron Tesisi'nde (ESRF) tek tek çerçeveler EDNA çerçevesi14içinde otomatik ve bağımsız olarak işlenir. Veri toplama dan sonra, ISPyB veritabanı20'yi açın ve Veri toplama sekmesinin altında veri kümesine ve otomatik analiz sonuçlarına erişmek için Git düğmesine basın21.
- Verileri indirin.
2. Birincil veri analizi
- Java tabanlı programı açın Dağılım IV (bkz. Malzeme Tablosu) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) verileri için bir arka plan çıkarma gerçekleştirin.
- SEC sekmesini açın. Azaltılmış veri dosyalarını(*.dat)"Verileri Aşağıdaki Bırak" penceresine sürükleyin ve bırakın. Mavi etiketli Output Dir düğmesini tıklatarak çıktı dizini "Out Dir ::" olarak ayarlayın.
NOT: Verileriniz nm-1'detoplandıysa, pencereye veya çıkarma sekmesine dosya bırakırken bir dönüşüm kutusunun (panelin sol altta) işaretedilmesi gerekir. - Deneysel ayrıntıları düzenleyin, Ayrıntıları Düzenle düğmesini kullanın ve mümkün olduğunca çok alanı doldurun, bunlar veri toplamak için kaynak/ışın çizgisinin kullanıldığı bölümleri, toplama parametrelerini ve örnek ayrıntıları içerir. Bunlar verilerle birlikte kaydedilir ve gelecekteki yayınlarda "Veri toplama parametreleri" bölümünü daha kolay doldurmaya olanak sağlar.
- Kaydet kutusuna örnek adı girin. TRACE'etıklayın.
NOT: Bunun iki etkisi vardır. İlk olarak, veriler için bir *.sec dosyası oluşturur. Bu ayrı * .dat dosyaları tüm deneysel gözlemler harmanlayacak tek bir metin dosyasıdır. Buna ek olarak, *.sec dosyası arabellek arka planı olan ortalama çerçeve kümesini, ortalama da kullanılan tüm çerçeveleri ve tüm SEC-SAXS denemesi boyunca arabellek arka planı çıkarılan çerçeveleri içerir. İkinci olarak, çerçeve numarasını arka plana integral oranına göre çizen bir sinyal çizimi oluşturulur. Bu, arabellek çıkarma için ortalama olarak seçili kareleri (gri) gösterir. Ortalama arabellek için puan veri tüm aralığından belirlenir. Ancak, kötü tanımlanmış bir arka plan kötü dengelenmiş veya kirli sütunlar veya kapiller kirlenme22nedeniyle oluşabilir gibi ortalama için tampon çerçeveleri manuel olarak seçmek için tavsiye edilir. - Arabellek çerçevelerini el ile seçin. Arabellekleri Temizle'yi tıklatın ve ardından izleme eğrisinde sol tıklamayla bir arabellek bölgesini yeniden seçin. İdeal olarak, bu yaklaşık 100 kare SEC sütunun geçersiz hacmi önce düz bir bölge olmalıdır. BIRKAÇ dakika sürebilir *.sec dosyasını yeniden hesaplamak için BUFFER'ı AYARLA ve sonra Güncelleştir'i tıklatın.
- İlgi çekici bir bölge (YG) belirleyin. Sinyal çiziminde, sol tıklamayla ilginin doruğundaki bölgeyi seçin.
NOT: Bu, sağ panelde üç çizim ilerler. Üst iki arsalar aralarında hareket crosshairs ile bağlantılıdır, ikinci bir sinyal arsa (sağ üst) sadece Seçilen Yatırım Getirisi gösterir, mavi her çerçevenin yoğunluğu ve kırmızı her çerçevenin ilgili Rg ve aşağıdaki karşılık gelen ısı haritası, Durbin-Watson otomatik korelasyon analizine göre renkli her kare için artıkları gösteren. Benzerlik gösteren bölgeler renkli siyan (Durbin-Watson, d = 2) iken, farklı çerçeveler farklı lıkların şiddetine bağlı olarak koyu mavileri pembelere ve son olarak da kırmızılara kadar takip edecektir (d > 2). Alt çizim, seçilen merkezi çerçeve için çıkarılan I karşı q eğrisidir (dikey bir çizgiyle de gösterilir). Ok tuşları çıkarılan çerçeveler arasında gezinmek için kullanılabilir. I karşı q çizimi, SEC deneyinden çıkarılan çerçevelerin kalitesini gösterir. - Birleştirmek için çerçeveleri seçin. Birleştirme için kullanılacak çerçevelerin alt kümesini seçmek için ısı haritası çizimindeki artı işaretine tıklayın. Artı işareti, hedef in sağ alt tarafına düşen ağırlıklı olarak siyan üçgen bir alanı tanımlar. Bu kareleri seçili olarak ayarlamak ve yukarıdaki Sinyal çiziminin ilgili alanındaki çerçeveleri vurgulamak için fare tıklaması kullanın. Bu çerçeveler ideal olarak kararlı bir Rg ile bir bölge vurgulamak gerekir.
NOT: Gerektiğinde, ısı haritasını sol tıklatarak yakınlaştırın ve sağa sola kaydırarak uzaklaştırın. - Seçili karelerle memnun olduklarında BİrLEŞTİr'itıklatın. Bu, çıkarılan çerçeveleri birleştirir ve BUNLARı ANALYSIS sekmesinde sunar.
- SEC sekmesini açın. Azaltılmış veri dosyalarını(*.dat)"Verileri Aşağıdaki Bırak" penceresine sürükleyin ve bırakın. Mavi etiketli Output Dir düğmesini tıklatarak çıktı dizini "Out Dir ::" olarak ayarlayın.
3. Veri deconvolution
- Deconvolution programını açın (örn. BioXTAS Raw 2.0.0).
- Deconvolution programında, veri kümesini, Dosyalar sekmesi nin altında, Denetim Masası'ndayükleyin, verileri bulmak veya konumu adres çubuğuna kopyalayıp yapıştırmak için katrevi sembolünü kullanın.
NOT: Klasörün yalnızca ham *.dat dosyalarını içerdiğinden ve işlenmiş veya ortalama veri dosyaları içermediğinden emin olun. - Tüm *.dat dosyalarını vurgulayın, Plot Series düğmesine basın, kare sayısına karşı tümleşik yoğunluklu bir çizim "Seri Çizimi"nde çizilecektir.
- Denetim Masası'nda Seri sekmesini seçin ve ardından eğriyi vurgulamak için tıklatın. Kontrol panelinin tabanındaki düğmeyi kullanarak LC Analysis açılır penceresini açın. Bu pencere, değişen molekül türlerini (protein veya RNA) seçmek gibi çeşitli seçeneklere erişim sağlar. Ayrıca, kullanıcının çizim için arabellek bölgesini seçmesine de olanak tanır. İlk etapta Otomatik'i tıklatın; bu uygun bir arabellek bölgesi seçmelidir.
NOT: Bu, büyük olasılıkla kararsız bir taban çizgisi nedeniyle başarısız olursa, arabellek bölgesini en iyi duruma getirmek için "Bölge Ekle" olur. Bu, arabellek için kullanılacak çerçeve numaralarını el ile ekleyebileceği daha küçük bir kutuyla Arabellek kutusunu doldurur. Alternatif olarak, arsa üzerinde bir alan seçme seçeneği vermek için "Seç" seçeneğini tıklatın. Alanı bulun, başlangıç konumu için bir kez sol tıklatın, imleci bir sonraki konuma taşıyın ve tekrar sol tıklatın. Birden fazla arabellek konumu eklemek gerekebilir. Arabelleği Ayarla'yı tıklatın ve eğriler çıkarılır ve RG SEC zirvesi boyunca hesaplanır. Açılır pencere kutusu görünüyorsa, Tamam'ıtıklatın. - Gelişen Faktör Analizi'ni (EFA) başlatmak için, en alttaki vurgulanan dosyaya sağ tıklayın Kontrol Paneli ve sonra seçin Efa menüden.
- Veri kümesinin tek değer ayrışmasını (SVD) gösteren bir açılır pencerenin açılıp açılmadığını denetleyin. Denetimler kutusunda, deconvolute için tüm tepe alanı yoğunluk çizimi kaplı olacak şekilde Çerçeveler kullanın kutusunu işaretleyin. Sağ üstteki "Tekil Değerler" çizimi, taban çizgisinin üzerindeki tekil değerlerin (ayrı zirveler/türler) yoğunluğunu gösterir.
NOT: Taban çizgisinin üzerinde bulunan nokta sayısı, mevcut saçılma türlerinin sayısını temsil eder. Bu uyarı ile önemli olan düz alan / taban çizgisi için tekil değeri göreli büyüklüğüdür. - Tek değer sayısını doğrulamaya yardımcı olmak için, alttaki AutoCorrelation çizimini kullanın. Bu, sağ ve sol tek korelasyon vektörlerini gösterir. İleri'yitıklatın.
NOT: Bunlar temelde çözeltideki vektör için dağılım veya konsantrasyon profillerini temsil eder. Mutlak boyutun vektörün önemini temsil ettiği yer. Önemli bir bileşen 1'e yakın bir otokorelasyona sahip olacaktır (başparmak kesme kuralı >0.6\u20120.7'dir). RAW bunu yararlı bir şekilde hesaplar ve gerekirse bunu değiştirebilirsiniz, ancak sol alttaki #Significant SVs kutusunda gösterilir. Birden fazla tek değer (örn. 4+) varsa, kullanılan verilerin aralığını değiştirerek yalnızca bileşenlerin yalnızca 2 veya 3'üne bakmak gerekebilir. Bileşenlerin sayısı ne kadar düşükolursa, EFA çözümlemesi de o kadar kolay olur, ancak daha az veri kullanma pahasına. Benzer olması gereken sol ve sağ tekil vektörlerin anlamlı SV sayısını azaltmaması ve sol ve sağ tekil vektörler benzer olana kadar kullanılan kare sayısını azaltması karmaşık bir durumda. - EFA'nın her vektör için ileri ve geri yönde çizimler oluşturarak hesaplanıp hesaplanmadığını denetleyin. Bu çizimler, bileşenlerin seçili SEC-SAXS verilerinin çözüm profilini başlattığını (ileri çizim) ve çıkış (geriye doğru çizim) gösterir. RAW bu aralıkları tanımlamaya çalışır; sayaçların yanındaki okları kullanarak bunları değiştirin, böylece her daire taban çizgisinden yükselen veya taban çizgisine düşen bir çekim noktasının başlangıcındadır. İleri'yitıklatın.
NOT: EFA'nın son aşaması SVD vektörlerini saçılma eğrilerine geri döndürer. Pencerenin solunda, daha önce tanımlanan aralıklar en üstte çizilir. Bu aralıklar, tekil vektörlerin saçılma eğrilerine geri döndürülecek yeri tanımlamak için gereken kısıtlamalardır. Sağ el paneli, ayrılan her tepe noktası için bu karşılık gelen saçılma eğrisi profillerini gösterir. Her tepekonsantrasyonu için bir arsa, bu elution profilleri ve ortalama hata ağırlıklı chi2için bir arsa temsilcisi olmalıdır . Chi2 çizimi, deconvolution veri kümesini orijinal veri kümesine göre ölçüyor. İdeal olarak, bu düz olacak, ancak sivri sık sık görülebilir. - Bileşen Aralığı Denetimlerideğiştirerek ani artışları azaltmaya veya ortadan kaldırmaya çalışın, önce hangi çerçevenin başak (chi2 çiziminden) karşılık geldiğini belirleyin ve ardından, hangi bileşenin bu çerçeveyi içerdiği (birden fazla olabilir), okları kullanarak ilgili aralığı yukarı veya aşağı taşıyın.
NOT: Bu, artış veya başak azalan bir yanıt üretmelidir. Başak çerçevesi birden fazla bileşende mevcutsa, her bileşen arasında küçük bir deneme ve hata gerekebilir. - En az chi2 elde edildiğinde, geritıklayarak bir doğrulama denetimi gerçekleştirin , yapılan değişikliklerin orijinal EFA çizimlerini büyük ölçüde değiştirip değiştirmediğini doğrulamaya izin veren önceki pencere görüntülenir. Hala geçerli görünüyorlarsa, İleri'yitıklatın. Çizimleri kaydetmek için EFA Verilerini Kaydet'i tıklatın ve ardından Bitti'yitıklatın; EFA penceresini kapatmak için.
NOT: İkinci bir doğrulama, sırayla her bileşen aralığının yanındaki onay kutusunu kapatmaktır. Bunlar her bileşen için pozitif bir konsantrasyon kısıtlaması sağlar ve kapatma, bunların veri kümesini önemli ölçüde etkileyip etkilemediğini denetler. Konsantrasyon çiziminde herhangi bir değişiklik görülmüyorsa, veriler geçerli olur.
- Veri kümesinin tek değer ayrışmasını (SVD) gösteren bir açılır pencerenin açılıp açılmadığını denetleyin. Denetimler kutusunda, deconvolute için tüm tepe alanı yoğunluk çizimi kaplı olacak şekilde Çerçeveler kullanın kutusunu işaretleyin. Sağ üstteki "Tekil Değerler" çizimi, taban çizgisinin üzerindeki tekil değerlerin (ayrı zirveler/türler) yoğunluğunu gösterir.
- RAW penceresinde, eğrileri görüntülemek için Denetim Masası'ndaki Profiller sekmesini ve Denetim Masası'nın Manipülasyon sekmesini tıklatın, eğrileri daha fazla değiştirin veya dosyaya sağ tıklayarak ve menüden seçili dosyayı(lar) kaydet'i seçerek eğrileri *.dat dosyaları olarak kaydedin. Dosyayı kaydedin. Daha fazla analiz için Scatter IV'i kullanın.
NOT: Deconvolution ve EFA BioXTAS RAW hakkında daha fazla bilgi ve talimatlar https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/
4. SAXS özelliklerini belirleme
NOT: Bioisis.net'da SAXS tayini için ayrıntılı bir öğretici bulunur. Burada, Scatter'teki en kullanışlı düğmeleri vurgulayarak adım adım yaklaşımla temel bir adım gösteriyoruz.
- Scatter ANALYSIS sekmesinde, her örnek dosyanın sağındaki manuel Guinier çözümleme aracı için G düğmesine basın. Açılan çizim, üst kutudaki q2'ye karşılık ln[I(q) ve alt kutudaki karşılık gelen artıkları gösterir. Artıkların "gülümseme" veya "kaş çatma" özelliği ne olacak gibi noktalar ekleyin veya kaldırın. Guinier uyumunda seçilen veriler maksimum q x Rg limitini 1.3'ü aşmamalıdır.
- Normalleştirilmiş Kratky düğmesine basın; ortaya çıkan çizim, makromolekülün kütle ve konsantrasyon için normalleştirilmiş yapısal durumunun yarı nicel bir değerlendirmesini sağlar.
NOT: Artı işareti Guinier-Kratky noktasını (√3, 1.1)19olarak belirtir. Kompakt, küresel protein Guinier-Kratky noktasında maksimum değeri ile tek bir tepe gösterecektir. Bir özünde düzensiz veya silindirik biyopolimer artı daha büyük bir maksimum olurdu ve azalma olmaz. Hem katlanmış etki alanları ve uzun uzatılmış yapılandırılmamış bölgelere sahip bir protein, artı işareti ile maksimum artışla ortaya çıkabilir, hem de daha yüksek q x Rg'de belirgin bir düşüş eğilimi gösterebilir. - İki çizimi, toplam dağınık yoğunluğu ve toplam dağınık yoğunluğun tümleşik alanını q işlevi olarak ortaya çıkaran Vc düğmesine (Korelasyon Hacmi) tıklayın. Çizimler, saçılma eğrisinin kalitesini doğrulamak için hızlı bir başvuru olarak kullanılır.
NOT: Toplam dağınık yoğunluk I(0) duyarlıdır ve bu doğru ölçülmemişse, çizim sürekli bir çizgi göstermez. Entegre alan arsa, ideal olarak, her SAXS eğrisi için genişletilmiş bir plato ile bir sigmoidal çizgi göstermelidir. Örnekte arabellek uyuşmazlığı/çıkarma varsa, toplama veya ara parçacık paraziti daha yüksek q-değerlerinde keskin bir eğim gözlenir. - Esneklik çözümlemesi başlatmak için Esneklik düğmesine basın. Bu dört panel ve alt kısmında bir kaydırıcı ile bir pencere alacaktır. Her açılan panel kompakt ve uzun / esnek biyopolimerler23arasında var olan bir güç-hukuk ilişkisi istismar bir arsa gösterir. Kullanmak için, sol fare düğmesine basıldığında kutunun altındaki kaydırıcıyı sağdan sola doğru hareket ettirin. Arsalardan birinde bir plato ulaşılana kadar yavaşça sola doğru hareket edin.
NOT: Plato Porod-Debye arsa görülürse, o zaman örnek normalleştirilmiş kratky arsa Guinier-Kratky noktada tek bir tepe ile tutarlı olmalıdır doğada kompakt. Plato kratky-Debye arsa ilk ulaşılırsa o zaman örnek büyük olasılıkla uzatılmış veya esnek. SIBYLS çizimi ilk platoya ise, örnek büyük olasılıkla hem kompaktlık hem de esneklik alanları içerir, karışık durumları olan bir parçacık. Porod-Debye Yasası ile bu esneklik ilişkisi için teori zarif Rambo, ve ark23 ele alınmıştır - Birim'etıklayın. Birim belirleme, yukarıdan esneklik analizinden hemen sonra yapılmalıdır. Esneklik çözümlemesi sonrasında açıldığında, üç grafik daha içeren bir açılır pencere oluşturulur. Alt köşede, sol köşede Porod-Debye arsa nerede bir esneklik arsa kaydırıcı sol hatırlar, platolu alanı gösteren.
- Parçacığın hacmini hesaplamak için, ok düğmelerini kullanarak başlangıç ve bitiş noktalarını hareket ettirin veya çizimdeki mavi çizgi yaylalı bölgeye sığacak şekilde kutulara yazın. Tarafsız bir sonuç için, sağ üst Porod-Debyent üst güç yasası uygun artıkları, hiçbir desen göstermelidir.
- P(r) sekmesine basın. Gerçek alan dağılımı sol panelde ve sağ paneldeki örnek için saçılma eğrisindedir. Amaç, karşılıklı alan SAXS eğrisinden örneğin gerçek alan temsilini oluşturmaktır. İdeal olarak, dağıtım eğrisi hiçbir dalga mevcut pürüzsüz olacak ve sadece yavaşça x-ekseni öpmek gerekir.
NOT: Cihazın ölçülen q-aralığı, kötü tampon eşleştirmesi, toplama, radyasyon hasarı, alt-optimal maruz kalma süreleri ve düşük partikül konsantrasyonları nedeniyle tamamen kullanılamayabilir. P(r)-tayini adımı, SAXS veri setinin kullanılabilir qmin ve qmax aralığını temelden belirleyecek ve sonraki modelleme veya montaj için kullanılan bu veri aralığı olmalıdır.- Örnek adı sağ tıklatın sonra yeni bir pencere açmak için DMAX'ı Bul'u tıklatın. Dmax limitleri önerilen qmax (maksimal veri noktaları), alt ve üst dmax limitleri ve alt ve üst alfa skoru ile önceden ayarlanır. Üç model (L1-norm, Legendre ve Moore) ve arka plan kullanımı dahil seçilebilir. İlk etapta bu değişmeden bırakın.
- Başlat düğmesine basın. Sol panelde önerilen dmax ve alfa düzeyi nin altında yazılı bir bileşik dağılım oluşturulur. Bu kabul edilebilir görünüyorsa, pencereyi kapatın ve P(r) sekmesine dönün. Karşılıklı uzay arsa önerilen qmaxmaç için kırpılmış olacak .
- Model Mooreseçin , Arka Plan tıklayın ve sonra açılır kutusundan önerilen değerlere alfa düzeyi ve dmax ayarlayın. İncele düğmesine basın. Herhangi bir noktanın reddedilmesi, kırmızı ile işaretlenmiş olması durumunda bir çapraz doğrulama çizimi açılır. Reddedilen sadece birkaç nokta varsa ve dağıtım iyi görünüyorsa, model iyidir.
NOT: Çapraz doğrulama çizimi, belirlenen P(r)-dağılımıyla tutarsız olan verilerin bölgelerini vurgular. Reddedilen bölge esas olarak düşük q bölgesinde, yani y eksenine yakın bölgede yse, bu büyük olasılıkla çok kısa bir dmax, toplama veya daha yüksek sıra lı oligomerlerin varlığını göstermektedir. Daha yüksek ve daha düşük çözünürlükteki bilgiler arasındaki tutarsızlığı vurgular. Burada, dmax ve qmin (artan başlangıç değeri) manuel, deneme-yanılma yaklaşımı kullanılarak ayarlanmalıdır. Benzer şekilde, reddedilen bölge esas olarak yüksek q bölgesindeyse, bu arka plan çıkarmayla ilgili bir soruna işaret edebilir veya sinyalin belirlenen P(r)-dağılımı yla anlamlı bir şekilde açıklanamayacak kadar zayıf olduğunu gösterebilir. Bu durumda, ek veri reddedilene kadar qmax kesilir (azalan sonu) gerekir. İdeal olarak, reddedilen puanlar rasgele dağıtılmalı ve kullanılabilir verilerin %5'inden azını oluşturuyorolmalıdır. Düzgün tanımlanmış qmin, qmax ve "dmax" dmax x eksenini öptüğü düzgün bir dağılım üretecektir. Ancak, tamamen Guinier bölge kaldırır bu değeri çok artma. Bu nokta q x l(q) kutusunu işaretleyerek (masanın üzerindeki panelin solunda) kolayca bulunur. Saçılma eğrisi "Toplam Dağınık Yoğunluk çizimi" ile değiştirilir, bu eğride maksimum çekim guinier bölgesinin bir parçası olmadan önce tüm noktalar yer alır. Noktaları çıkardıktan sonra "dmax" artırmak /azaltmak ve sonra bir kez daha rafine tekrar deneyin. Sorunlar devam ederse, özellikle doğrulama eğrisinin başından itibaren birçok nokta reddediliyorsa, bu veriler yapısal modelleme için ideal olmadığını güçlü bir şekilde gösterir.
- Bir rapor yazdırmak için, Analiz sekmesine geri gidin, örneği vurgulamak için sol tıklatın, ardından örnek adına sağ tıklayın ve menüdeki tek veri kümesinden rapor oluştur'a taşıyın. Yorumların eklenmesine izin vermek için bir metin kutusu açılır. Oluşturulan tüm rakamları ve değerleri gösteren bir PDF belgesi oluşturulur.
Representative Results
Klasik çerçeve seçimi13 üzerinde deconvolution kullanmanın avantajı, tek dağılımlı bir saçılma sinyali üreterek türlerin birbirleri üzerindeki etkisini ortadan kaldırmaktır. Bu da genellikle gürültü oranı daha iyi bir sinyal ile takip edilir. E9 exoeksi DNA'ya bağlandığında ve SEC-SAXS kullanılarak çalıştırıldığında iki tepe gözlenir(Şekil 1). Birinci, büyük tepe (yaklaşık kare 420\u2012475) E9 exoeksi-DNA kompleksi ikinci (yaklaşık kareler 475\u2012540), bağlanmamış durumdur (Bkz. Ek Veriler: Şekil 2). Çerçeve leri seçmenin klasik yaklaşımı kompleksin ilk tepenoktasında istikrarlı bir Rg sağlarken (bkz. Ek Veri: Şekil 3),ikinci tepe açıkça birleştirilir ve çizim boyunca Rg, ikinci ilgi zirvesinin çapraz tepe kontaminasyonnedeniyle istikrarlı bir Rg'ye sahip olmadığını gösterir. Sadece 5 kare bir yarı kararlı Rg gösterdi, onlar bir Rg = 36.3 ş(Şekil 2, yeşil) verdi çıkarıldığında kullanılabilir. Zirveler EFA kullanılarak dekonvoluted edildiğinde ikinci tepe için karşılık gelen eğri(Şekil 2, mavi) orijinal ile kaplanmış ve gürültü sinyali net bir azalma gösterdi ve daha düşük bir Rg, 34.1 şkaydedildi. Kratky arsa(Şekil 3) deconvoluted tepe (mavi) ile karmaşık gösterir daha küresel. Bu p (r) eğrisi tarafından doğrulanır(Şekil 4) hangi bir dmax verir 108.5 şdeconvoluted eğrisi için (mavi) olmayan dmax 120 ş(yeşil) ile daha uzun iken, bu büyük olasılıkla bağlı olmayan E9 exoeksikaynaklanan heterojenite nedeniyle .
Şekil 1: E9 exoeksi sinyal çizimi tek başına ve karmaşık DNA ile.
Üst panel, SEC-SAXS çalışmasının (açık mavi) her karesi için arka plana integral oranının bir çizimini gösterir. Kırmızı noktalar, zirvenin üzerindeki her karede Rg'yi gösterir. Alt panel, Durbin-Watson otomatik korelasyon analizine göre renkli her kare için artıkları gösteren karşılık gelen ısı haritasını gösterir, yüksek benzerlik bölgeleri renkli siyan renkli ise farklı çerçeveler pembeler için koyu mavi leri takip ederken ve son olarak da farklılığın şiddetine bağlı olarak kırmızıya kadar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yoğunluk ve dağılım vektörünün çizimi.
Çıkarılan SAXS verilerinin bir bindirmesi E9 exoeksi'yi oluşturur. Yeşil 5 kare (çerçeve 517\u 2012522) ortalama ve yarı kararlı Rg bir alandan çıkarılır ve mavi temsili saçılma eğrisi SEC-SAXS tepe EFA deconvolution türetilen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Boyutsuz Kratky eğrisi.
E9 exoeksi gösteren dekonvoluted (mavi) ve dekonvoluted olmayan (yeşil) Kratky eğrisinin yer kaplaması küresel dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: P(r) eğrisi.
E9 exoeksiiçin deconvoluted (mavi) ve dekonvoluted olmayan (yeşil) eğrilerin bindirme . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Veriler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız
Discussion
Bir SAXS deneyine başlamadan önce monodisperse numuneye sahip olmak istenir, ancak gerçekte birçok veri toplama sı bunu karşılamaz ve çoğu durumda ölçüyü sıralı kromatografi-SEC ile birleştirerek geliştirilmelidir. Ancak, numunenin saflaştırılması ve veri toplama monodispersitliği arasındaki zaman sıkıntısı bile garanti edilmez. En yaygın olarak, bu, bileşenlerin boyut olarak çok yakın olduğu veya fiziksel özelliklerinin ayrılamayacağı veya hızlı dinamiklere yatkın olduğu denemeler için geçerlidir. Burada, dnabound E9 exoeksisinin sınırsız formundan etkisini ortadan kaldırmak için tek değer ayrışmasını gelişen faktör analiziyle birleştiren bir protokol sağladık ve daha sonra SAXS paketi Scatter IV ile analiz edebildiğimiz bir monodisperse saçılma profili oluşturduk.
SEC-SAXS verilerinin EFA ile SVD savolute SAXS verileri deconvolute ve analiz geliştirmek için geliştirilen çok güçlü yöntemler, ancak sınırlamalar var. Sec-SAXS'ın tampon taban çizgisindeki gürültü veya sürüklenme nin minimumda tutulmasını gerektirir. Bu, örnek yüklemeden önce ekstra sütun dengelemesi (arabelleğe bağlı olarak 3 sütundan daha fazla birim kullanmak daha iyi) içerebilir. Ancak, en kritik adım tekil değerlerin sayısının seçimi ve kullanılan veri aralığıdır, çünkü bu dekonvolutionun doğruluğunu büyük ölçüde etkileyecektir. Bu nedenle sonuçlar kendi başlarına alınmamalı, biyolojik yorumlama için analitik ultracentrifugation (AUC) veya çok açılı lazer-ışık saçılımı (MALLS) gibi teknikler kullanılarak daha fazla analiz edilmelidir.
Scatter IV, uzman olmayanların bile verilerini analiz etmelerine olanak tanıyan sezgisel bir kullanıcı arabirimi ile araştırma ve endüstriyel kullanım için ücretsiz yeni bir yazılım paketidir. Scatter IV, sinyal çizimine bağlı ısı haritası gibi SEC-SAXS verilerinin analizini geliştirmeye yardımcı olan birkaç yeni özelliğe sahiptir ve çerçeve seçiminde daha fazla doğruluk sağlar. Birincil veri analizinde, Guinier Peak analizi ve P(r) analiziyle ilişkili çapraz doğrulama çizimi yazılımda entegre bir sorun giderme yeteneği sunar.
Birincil veri analizi için başka birçok programın kullanılabileceğini belirtmek gerekir; bunlar aynı temel özellikleri içerir ve bioxtas RAW17 ATSAS paketi24 ve US-SOMO15 gibi düzenli olarak güncellenmektedir.
Ancak analiz için hangi SAXS paketinin kullanıldığına bakılmaksızın, temel sınırlamalar yaygındır: toplama ve analizden önce numune hazırlama. Gösterilen E9 eknoeksi örneğinde, sinyalin gürültü oranına doğru iyileşmesini ve Rg'deki bir azalmayla monodisperse numuneyle ilişkili dmax'i görmek açıktır. Bu büyük ölçüde bilinen yüksek çözünürlüklü yapılar ile uydurma veya modelleme gibi verilerin daha fazla işlenmesine yardımcı olacaktır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Fransız hibe REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 ve Service de Santé des Armées ve Délégation Générale pour l'Armement araştırma hibe tarafından proje için mali destek kabul ediyoruz. Biz SAXS ışın süresi için ESRF müteşekkiriz. Bu çalışma Grenoble Instruct-ERIC merkezi (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB) içinde, FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) ve GRAL tarafından desteklenen, University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0000) bünyesinde finanse edilmektedir. IBS, Grenoble Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü'ne (IRIG, CEA) entegre olduğunu kabul eder. Wim P. Burmeister ve Frédéric Iseni'ye finansal ve bilimsel destek için teşekkür ediyor ve biocat'ten Dr. Jesse Hopkins'e yardımları ve BioXTAS RAW'ı geliştirmeleri için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |
References
- Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).
- Brosey, C. A., Tainer, J. A. Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).
- Gräwert, M., Svergun, D. A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS). The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).
- Meisburger, S. P., et al. Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).
- Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).
- Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).
- Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Scientific reports. 5, (2015).
- David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).
- Ryan, T. M., et al. An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis. Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).
- Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbühler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations. Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).
- Maeder, M., Neuhold, Y. M. Practical Data Analysis in Chemistry. , Elsevier. Burlington. http://www.123library.org/book_details/?id=35069 (2007).
- Tarbouriech, N., et al. The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding. Nature Communications. 8 (1), (2017).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).
- Brookes, E., Rocco, M. Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite. European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).
- Malaby, A. W., et al. Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).
- Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).
- Maeder, M. Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).
- Durand, D., et al. NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers. Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).
- De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).
- Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).
- Kirby, N., et al. Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).
- Rambo, R. P., Tainer, J. A. Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law. Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).
- Franke, D., et al. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
