SEC-BioSAXS-målinger af biologiske makromolekyler er en standardmetode til bestemmelse af opløsningsstrukturen for makromolekyler og deres komplekser. Her analyserer vi SEC-BioSAXS-data fra to typer af almindeligt forekommende SEC-spor – kromatogrammer med fuldt løste og delvist løste toppe. Vi demonstrerer analysen og deconvolution ved hjælp af scatter og BioXTAS RAW.
BioSAXS er en populær teknik, der anvendes i molekylær og strukturel biologi til at bestemme opløsningen struktur, partikelstørrelse og form, overflade-til-volumen forhold og konformationelle ændringer af makromolekyler og makromolekylære komplekser. Et SAXS-datasæt af høj kvalitet til strukturel modellering skal være fra monodisperse, homogene prøver, og dette opnås ofte kun ved en kombination af inline kromatografi og øjeblikkelig SAXS-måling. Oftest anvendes størrelsesudelukkelseskromatografi til at adskille prøver og udelukke forurenende stoffer og aggregering fra den interessepartikel, der gør det muligt at foretage SAXS-målinger fra en velkonfekt kromatografisk top af en enkelt proteinart. Stadig, i nogle tilfælde, selv inline rensning er ikke en garanti for monodisperse prøver, enten fordi flere komponenter er for tæt på hinanden i størrelse eller ændringer i form induceret gennem bindende ændre opfattes elution tid. I disse tilfælde kan det være muligt at dekonstruere SAXS-data for en blanding for at opnå de idealiserede SAXS-kurver for de enkelte komponenter. Her viser vi, hvordan dette opnås, og den praktiske analyse af SEC-SAXS-data udføres på ideelle og vanskelige prøver. Konkret viser vi SEC-SAXS analyse af vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.
Biologiske makromolekyler er for små til at blive set selv med de bedste lysmikroskoper. Nuværende metoder til at bestemme deres strukturer generelt indebærer krystallisering af protein eller målinger på stort antal identiske molekyler på samme tid. Mens krystallografi giver oplysninger om det atomare niveau, det repræsenterer en kunstig prøve miljø, da de fleste makromolekyler ikke præsenteres i en krystallinsk form i cellen. I løbet af de sidste par år kryo-elektron mikroskopi leveret lignende høj opløsning strukturer af store makromolekyler / makromolekylære komplekser, men selv om prøverne er tættere på fysiologiske tilstand, de er stadig frosset, og dermed immobile og statisk. Bio-lille vinkel X-ray spredning (BioSAXS) giver en strukturel måling af makromolekyle, under forhold, der er relevante for biologi. Denne tilstand kan visualiseres som en 3D-figur med lav opløsning, der bestemmes på nanometerskalaen, og indfanger hele makromolekylets kropslige rum i opløsningen. BioSAXS-eksperimenter vurderer effektivt oligomeric state, domæne og komplekse arrangementer samt fleksibilitet mellemdomæner 1,2,3. Metoden er nøjagtig, for det meste ikke-destruktiv og kræver normalt kun et minimum af prøveforberedelse og tid. Men for at få den bedste fortolkning af dataene skal prøverne være monodisperse. Det er en udfordring. biologiske molekyler er ofte modtagelige for forureninger, dårlig rensning og sammenlægning, for eksempel fra fryse optøning4. Udviklingen af inline kromatografi efterfulgt af øjeblikkelig SAXS-måling hjælper med at afbøde disse virkninger. Størrelsesudelukkelseskromatografi adskiller prøverne efter størrelse og udelukker således de fleste forurenende stoffer ogaggregering 5,6,7,8,9,10. I nogle tilfælde er selv SEC-SAXS imidlertid ikke tilstrækkelig til at producere en monodisperseprøve, fordi blandingen kan bestå af komponenter, der er for tæt på, eller deres fysiske egenskaber eller deres hurtige dynamik fører til overlappende toppe i SEC UV-spor. I disse tilfælde kan et softwarebaseret deconvolutiontrin for de opnåede SAXS-data føre til en idealiseret SAXS-kurve for den enkeltekomponent5,11,12. Som et eksempel, i protokol afsnit 2, viser vi standard SEC-SAXS analyse af vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant (E9 exominus) i kompleks med DNA. Vaccinia repræsenterer modelorganismen i Poxviridae, en familie, der indeholder flere patogener, for eksempel den menneskelige kopper virus. Polymerase blev vist sig at binde tæt til DNA i biokemiske tilgange, med strukturen af komplekset for nylig løst ved røntgenkrystallografi13.
De fleste synchrotron-faciliteter giver en automatiseret databehandlingspipeline, der udfører datanalisering og integration, der producerer et sæt ikke-pakkede rammer. Men den fremgangsmåde, der er beskrevet i dette manuskript kunne også bruges med en lab kilde forudsat SEC-SAXS udføres. Desuden kan der være yderligere automatisering til rådighed, som vil afvise strålingsskadede rammer og udføre buffern subtraktion14. Vi vil vise, hvordan du udfører primær dataanalyse på forbearbejdede data og får mest muligt ud af de tilgængelige data i afsnit 2.
I afsnit 3 viser vi, hvordan man deconvoluterer SEC-SAXS-data og analyserer kurverne effektivt. Mens der er flere deconvolution metoder såsom Gaussian peak deconvolution, gennemført i USA-SOMO15 og Guinier optimeret maksimal sandsynlighed metode, der gennemføres i DELA software16, disse generelt kræver en model for peak form12. Den begrænsede størrelse af de enkelte toppe, vi undersøger, gør det muligt at anvende udvikling af faktoranalyser (EFA) som en forbedret form for entalværdi nedbrydning (SVD) til at deconvolute overlappende toppe uden at forlade sig på topformen eller spredningsprofilen5,11. En SAXS-specifik implementering findes i BioXTAS RAW17. EFA blev første gang anvendt på kromatografidata, da 2D-diodearraydata gjorde det muligt at danne matricer ved absorbans mod retentionstid og bølgelængdedata18. Hvor miljømæssige fokusområder excellerer er, at den fokuserer på entalsværdiers udvikling, hvordan de ændrer sig med fremkomsten af nye komponenter, med det forbehold, at der er en iboenderækkefølge i erhvervelsen 10. Heldigvis SEC-SAXS data giver alle de nødvendige bestilte erhvervelse data i organiseret 2D-data arrays, udlån sig pænt til EFA teknik.
I afsnit 4 vil vi demonstrere det grundlæggende i model-uafhængig SAXS analyse fra buffer-baggrund trukket SAXS kurve. Model-uafhængig analyse bestemmer partikelens radius-of-gyration (Rg), volumen-of-korrelation (Vc), Porod Volume (Vp), og Porod-Debye Exponent (PE). Analysen giver en semi-kvantitativ vurdering af partikelens termodynamiske tilstand med hensyn til kompakthed eller fleksibilitet via det dimensionsløse Kratky-plot2,4,19.
Endelig måles SAXS-data i gensidige rumenheder, og vi vil vise, hvordan SAXS-dataene omdannes til real-space for at genoprette pardistancen, P(r), distributionsfunktionen. P(r)-fordelingen er sættet af alle afstande, der findes i partiklen, og omfatter partiklens maksimale dimension, dmax. Da der er en termodynamisk måling, repræsenterer P(r)-fordelingen det fysiske rum, der er optaget af partiklernes kropslige rum. Korrekt analyse af et SAXS-datasæt kan give indsigt i løsningstilstand, der supplerer oplysninger med høj opløsning fra krystallografi og kryo-EM.
Det ønskes at have en monodisperse prøve, før du starter et SAXS-eksperiment, men i virkeligheden opfylder mange dataindsamlinger ikke dette og skal forbedres ved at kombinere målingen med inline kromatografi – SEC i de fleste tilfælde. Selv manglen på tid mellem rensning og dataindsamling monodispersity af prøven er dog ikke garanteret. Dette gælder oftest for eksperimenter, hvor komponenter er for tæt på størrelse eller i deres fysiske egenskaber til at blive adskilt eller er tilbøjelige til hurtig dynamik. Her har vi givet en protokol, der kombinerer enkelt værdi nedbrydning med udvikling faktor analyse for at fjerne indflydelsen af DNAbound E9 exominus fra sin ubundneform skabe en monodisperse spredning profil, som vi dengang var i stand til at analysere med SAXS pakke Scatter IV.
SVD med EFA af SEC-SAXS data er meget effektive metoder udviklet til at deconvolvolute SAXS data og forbedre analysen, men de har begrænsninger. De kræver, at støj eller afdrift i SEC-SAXS’s bufferlinje holdes på et minimum. Dette kan indebære ekstra kolonneeksvilibrering (bedre at bruge mere end 3 kolonnevolumener, afhængigt af bufferen) før prøvebelastning. Men det mest kritiske skridt er valget af antallet af entalværdier og det anvendte dataområde, da dette i høj grad vil påvirke nøjagtigheden af deconvolutionen. Det er grunden til, at resultaterne ikke bør tages på egen hånd, men yderligere analyseres ved hjælp af teknikker såsom analytisk ultracentrifugering (AUC) eller multi-vinkel-laser-lys-spredning (MALLS) for biologisk fortolkning.
Scatter IV er en ny, softwarepakke, gratis til forskning og industriel brug med en intuitiv brugergrænseflade, der giver selv ikke-eksperter til at analysere deres data. Scatter IV har flere nye funktioner, der hjælper med at forbedre analysen af SEC-SAXS data, såsom varme kort knyttet til signalplot, så større nøjagtighed med valg af ramme valg. I primær dataanalyse giver Guinier Peak-analysen og det krydsvalideringsplot, der er knyttet til P(r)-analysen, en integreret fejlfindingsdyrevne i softwaren.
Det skal nævnes, at mange andre programmer kan bruges til primær dataanalyse; disse indeholder de samme grundlæggende funktioner og opdateres også regelmæssigt, såsom BioXTAS RAW17 ATSAS pakke24 og US-SOMO15 for at nævne nogle få.
Men uanset hvilken SAXS-pakke der anvendes til analyse, er de vigtigste begrænsninger almindelige: prøveforberedelsen, før indsamling og analyse. I E9 exominus eksempel vist, er det klart at se en forbedring i signal til støj forhold og med en reduktion i Rg dmax forbundet med en monodisperse prøve. Dette vil i høj grad støtte yderligere behandling af data såsom montering eller modellering med kendte højopløsningsstrukturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender den finansielle støtte til projektet fra det franske tilskud REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 og af forskningsbevillinger fra Service de Santé des Armées og Délégation Générale pour l’Armement. Vi er taknemmelige for ESRF for SAXS stråletid. Dette arbejde brugte platforme grenoble Instruct-ERIC center (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) inden for Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), støttet af FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) og GRAL, finansieret inden for Grenoble Alpes-kandidatskolen (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS anerkender integration i Det Tværfaglige Forskningsinstitut i Grenoble (IRIG, CEA). Vi takker Wim P. Burmeister og Frédéric Iseni for finansiel og videnskabelig støtte, og vi takker også Dr. Jesse Hopkins fra BioCAT på APS for hans hjælp og for at udvikle BioXTAS RAW.
Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |