जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के एसईसी-बायोएक्सएक्सएस माप मैक्रोमॉलिक्यूल्स और उनके परिसरों की समाधान संरचना का निर्धारण करने के लिए एक मानक दृष्टिकोण हैं। यहां, हम एसईसी-बायोएक्सएक्सएस डेटा का विश्लेषण दो प्रकार के आमतौर पर सामना करने वाले एसईसी निशान-क्रोमोग्राम के साथ पूरी तरह से हल और आंशिक रूप से हल की गई चोटियों से करते हैं। हम स्कैटर और बायोक्सटास रॉ का उपयोग करके विश्लेषण और विखेष को प्रदर्शित करते हैं।
BioSAXS एक लोकप्रिय तकनीक है जिसका उपयोग आणविक और संरचनात्मक जीव विज्ञान में समाधान संरचना, कण आकार और आकार, सतह से मात्रा अनुपात और मैक्रोमॉलिक्यूलिक्स और मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों के अनुरूप परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। संरचनात्मक मॉडलिंग के लिए एक उच्च गुणवत्ता वाले एसएक्सएस डेटासेट मोनोडिस्पर्स, सजातीय नमूनों से होना चाहिए और यह अक्सर केवल इनलाइन क्रोमेटोग्राफी और तत्काल एसएक्सएस माप के संयोजन से पहुंच जाता है। सबसे अधिक, आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग नमूनों को अलग करने और संदूषकों और एकत्रीकरण को ब्याज के कण से बाहर करने के लिए किया जाता है, जिससे एसएक्सएस माप एक प्रोटीन प्रजातियों के एक अच्छी तरह से हल क्रोमेट्रोग्राफिक चोटी से बनाया जा सकता है। फिर भी, कुछ मामलों में, यहां तक कि इनलाइन शुद्धिकरण मोनोडिस्पर्स नमूनों की गारंटी नहीं है, या तो क्योंकि कई घटक आकार में एक दूसरे के बहुत करीब हैं या बाध्यकारी परिवर्तन के माध्यम से प्रेरित आकार में परिवर्तन कथित एल्यूशन समय को बदल देते हैं। इन मामलों में, अलग-अलग घटकों के आदर्शीकृत एसेक्स घटता प्राप्त करने के लिए मिश्रण के एसएक्सएस डेटा को विघटित करना संभव हो सकता है। यहां, हम दिखाते हैं कि यह कैसे हासिल किया जाता है और एसईसी-एसएक्सएस डेटा का व्यावहारिक विश्लेषण आदर्श और कठिन नमूनों पर किया जाता है। विशेष रूप से, हम वैक्सिनिया E9 डीएनए पॉलीमरेज एक्सोन्यूलेस माइनस म्यूटेंट का एसईसी-एसएक्सएस विश्लेषण दिखाते हैं।
जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स बहुत छोटे होते हैं जिन्हें सबसे अच्छे हल्के माइक्रोस्कोप के साथ भी देखा जाता है। उनकी संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए वर्तमान तरीकों में आम तौर पर एक ही समय में समान अणुओं की विशाल संख्या पर प्रोटीन या माप को क्रिस्टलाइज करना शामिल है। जबकि क्रिस्टलोग्राफी परमाणु स्तर पर जानकारी प्रदान करती है, यह एक कृत्रिम नमूना वातावरण का प्रतिनिधित्व करती है, यह देखते हुए कि अधिकांश मैक्रोमॉलिक्यूल्स को कोशिका में क्रिस्टलीय रूप में प्रस्तुत नहीं किया जाता है। पिछले कुछ वर्षों के दौरान क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने बड़े मैक्रोमॉलिक्यूल्स/मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स के समान उच्च-संकल्प संरचनाओं को वितरित किया, लेकिन हालांकि नमूने शारीरिक स्थिति के करीब हैं, वे अभी भी जमे हुए हैं, इसलिए स्थिर और स्थिर हैं । जैव-छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (BioSAXS) मैक्रोमॉल्यूल का एक संरचनात्मक माप प्रदान करता है, उन स्थितियों में जो जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक हैं। इस राज्य को नैनोमीटर पैमाने पर निर्धारित कम रिज़ॉल्यूशन 3-डी आकार के रूप में कल्पना की जा सकती है और समाधान में मैक्रोमॉल्यूल के पूरे अनुरूप स्थान को कैप्चर करता है। BioSAXS प्रयोग ओलिगोमेरिक स्थिति, डोमेन और जटिल व्यवस्थाओं के साथ-साथ डोमेन1,2,3के बीच लचीलेपन का कुशलतापूर्वक आकलन करते हैं। विधि सटीक है, ज्यादातर गैर विनाशकारी और आमतौर पर नमूना तैयारी और समय की केवल एक न्यूनतम की आवश्यकता होती है। हालांकि, डेटा की सबसे अच्छी व्याख्या के लिए, नमूनों को मोनोडिस्पर्स की आवश्यकता है। यह चुनौतीपूर्ण है; जैविक अणु अक्सर संदूषण, खराब शुद्धि और एकत्रीकरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, उदाहरण के लिए फ्रीज विगलन4से । तत्काल एसएक्सएस माप के बाद इनलाइन क्रोमेटोग्राफी का विकास इन प्रभावों को कम करने में मदद करता है। आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी नमूनों को आकार से अलग करती है इस प्रकार अधिकांश संदूषकों और एकत्रीकरण5,6, 7,8, 9,10को छोड़कर । हालांकि, कुछ मामलों में एसईसी-एसएक्सएस भी मोनोडिस्पर्स नमूने का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त नहीं है, क्योंकि मिश्रण में ऐसे घटक हो सकते हैं जो आकार में बहुत करीब हैं या उनके भौतिक गुण या उनकी तेज गतिशीलता एसईसी यूवी ट्रेस में अतिव्यापी चोटियों का कारण बनती है। इन मामलों में, प्राप्त एसएक्सएस डेटा के सॉफ्टवेयर आधारित विखेपन कदम से व्यक्तिगतघटक5,11,12का एक आदर्शीकृत सैक्स वक्र हो सकता है। एक उदाहरण के रूप में, प्रोटोकॉल सेक्शन 2 में, हम डीएनए के साथ जटिल में वैक्सिनिया ई9 डीएनए पॉलीमरेज एक्सोन्यूलेस माइनस म्यूटेंट (ई 9 एक्सोमाइनस)के मानक एसईसी-एसएक्सएस विश्लेषण दिखाते हैं। वैक्सिनिया पॉक्सविरिडी के मॉडल जीव का प्रतिनिधित्व करता है, जो कई रोगजनकों वाला परिवार है, उदाहरण के लिए मानव चेचक वायरस। पॉलीमरेज को जैव रासायनिक दृष्टिकोणों में डीएनए को कसकर बांधने के लिए दिखाया गया था, परिसर की संरचना के साथ हाल ही में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी13द्वारा हल किया गया था।
अधिकांश सिंक्रोट्रॉन सुविधाएं एक स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन प्रदान करेंगी जो डेटा सामान्यीकरण और एकीकरण का प्रदर्शन करेगी जो अनसंट्रैक्टेड फ्रेम का एक सेट का उत्पादन करेगी। लेकिन इस पांडुलिपि में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग प्रयोगशाला स्रोत के साथ भी किया जा सकता है बशर्ते एसईसी-सैक्सएस किया जाए। इसके अलावा, अतिरिक्त स्वचालन उपलब्ध हो सकता है जो विकिरण-क्षतिग्रस्त फ्रेम को अस्वीकार करेगा और बफर घटाव14करेगा। हम बताएंगे कि प्री-प्रोसेस्ड डेटा पर प्राथमिक डेटा विश्लेषण कैसे किया जाए और सेक्शन 2 में सबसे अधिक उपलब्ध डेटा बनाया जाए।
सेक्शन 3 में, हम एसईसी-एसएक्सएस डेटा को डिकोवोल्यूट करने और घटता का कुशलतापूर्वक विश्लेषण करने के तरीके दिखाते हैं। जबकि गॉसियन पीक डिकोवोल्यूशन जैसे कई डिकोवोोल्यूशन विधियां हैं, जिन्हें यूएस-सोमो15 में लागू किया गया है और गिनीयर अनुकूलित अधिकतम संभावना विधि, डेला सॉफ्टवेयर16में लागू की गई है, इन्हें आम तौर पर पीक आकार12के लिए एक मॉडल की आवश्यकता होती है। हम जिन व्यक्तिगत चोटियों की जांच कर रहे हैं, उनका परिमित आकार विकसित कारक विश्लेषण (ईएफए) के उपयोग को एकवचन मूल्य अपघटन (एसवीडी) के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है, जो चरम आकार पर निर्भर किए बिना या प्रोफ़ाइल5,11को बिखरने के बिना ओवरलैपिंग चोटियों को अलग करने के लिए। एक सैक्सएस-विशिष्ट कार्यान्वयन बायोक्सटास रॉ17में पाया जा सकता है। ईएफए का उपयोग सबसे पहले क्रोमेटोग्राफी डेटा पर किया गया था जब 2D डायोड सरणी डेटा ने मैट्रिस को प्रतिधारण समय और तरंगदैर्ध्य डेटा18के खिलाफ अवशोषण से गठन करने की अनुमति दी थी। जहां ईएफए एक्सेल है कि यह विलक्षण मूल्यों के उभरते चरित्र पर केंद्रित है, वे नए घटकों की उपस्थिति के साथ कैसे बदलते हैं, चेतावनी के साथ कि अधिग्रहण10में एक अंतर्निहित आदेश है। सौभाग्य से, एसईसी-एसएक्सएस डेटा संगठित 2D डेटा सरणी में सभी आवश्यक आदेश प्राप्त अधिग्रहण डेटा प्रदान करता है, जो ईएफए तकनीक को अच्छी तरह से उधार देता है।
सेक्शन 4 में, हम बफर-बैकग्राउंड घटाया एसएक्सएस वक्र से मॉडल-स्वतंत्र एसएक्सएस विश्लेषण की मूल बातें प्रदर्शित करेंगे। मॉडल-स्वतंत्र विश्लेषण कण के त्रिज्या–जाइरेशन (आरजी), वॉल्यूम-ऑफ-सहसंबंध (कुलपति), पोरोड वॉल्यूम (वीपी), और पोरोड-डेबी एक्सपोनेंट (पीई) को निर्धारित करता है। विश्लेषण आयामहीन Kratkyसाजिश2,4,19के माध्यम से कॉम्पैक्टनेस या लचीलेपन के मामले में कण की थर्मोडायनामिक स्थिति का अर्ध-मात्रात्मक आकलन प्रदान करता है।
अंत में, एसएक्सएस डेटा को पारस्परिक अंतरिक्ष इकाइयों में मापा जाता है और हम बताएंगे कि जोड़ी-दूरी, पी (आर), वितरण समारोह को ठीक करने के लिए एसएक्सएस डेटा को वास्तविक स्थान पर कैसे बदलना है। पी (आर) वितरण कण के भीतर पाया सभी दूरी का सेट है और कण के अधिकतम आयाम, डीअधिकतमभी शामिल है । चूंकि यह एक थर्मोडायनामिक माप है, इसलिए पी (आर) वितरण कणों के अनुरूप अंतरिक्ष द्वारा कब्जा किए गए भौतिक स्थान का प्रतिनिधित्व करता है। एक एसएक्सएस डेटासेट का उचित विश्लेषण समाधान-राज्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जो क्रिस्टलोग्राफी और क्रायो-ईएम से उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी प्रदान करता है।
एसएक्सएस प्रयोग शुरू करने से पहले मोनोडिस्पर्स नमूना होना वांछित है, लेकिन वास्तव में, कई डेटा संग्रह इसे संतुष्ट नहीं करते हैं और ज्यादातर मामलों में इनलाइन क्रोमेटोग्राफी-एसईसी के साथ माप को जोड़कर सुधारा जाना चाहिए। हालांकि, यहां तक कि नमूने की शुद्धि और डेटा अधिग्रहण के बीच समय की कमी की गारंटी नहीं है। सबसे अधिक, यह प्रयोगों पर लागू होता है जहां घटक आकार में बहुत करीब होते हैं या उनके भौतिक गुणों को अलग करने के लिए या तेजी से गतिशीलता से ग्रस्त होते हैं। यहां, हमने एक प्रोटोकॉल प्रदान किया है जो विकसित कारक विश्लेषण के साथ एकल मूल्य अपघटन के साथ अपने अनबाउंडफॉर्म से DNAbound E9 exoऋण के प्रभाव को दूर करने के लिए एक मोनोडिस्पर्स बिखरने वाली प्रोफ़ाइल बना रहा है जिसे हम तब सैक्स पैकेज स्कैटर IV के साथ विश्लेषण करने में सक्षम थे।
एसईसी-एसएक्सएस डेटा के ईएफए के साथ एसवीडी एसएक्सएस डेटा को डिकोवोल्यूट करने और विश्लेषण में सुधार करने के लिए विकसित बहुत शक्तिशाली तरीके हैं, लेकिन उनकी सीमाएं हैं। उन्हें एसईसी-एसएक्सएस के बफर बेसलाइन में शोर या बहाव की आवश्यकता होती है। इसमें नमूना लोड होने से पहले अतिरिक्त कॉलम संतुलन (बफर के आधार पर 3 से अधिक कॉलम वॉल्यूम का उपयोग करना बेहतर) शामिल हो सकता है। हालांकि, सबसे महत्वपूर्ण कदम विलक्षण मूल्यों की संख्या और उपयोग किए गए डेटा की सीमा का विकल्प है, क्योंकि यह बहुत ही सटीकता को प्रभावित करेगा। यही कारण है कि परिणामों को अपने दम पर नहीं लिया जाना चाहिए, लेकिन जैविक व्याख्या के लिए विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन (एयूसी) या बहु-कोण-लेजर-लाइट-स्कैटरिंग (मॉल) जैसी तकनीकों का उपयोग करके आगे विश्लेषण किया जाना चाहिए।
स्कैटर IV एक नया, सॉफ्टवेयर पैकेज है, जो एक सहज यूजर इंटरफेस के साथ अनुसंधान और औद्योगिक उपयोग के लिए मुफ्त है जो गैर-विशेषज्ञों को भी अपने डेटा का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। स्कैटर IV में कई नई विशेषताएं हैं जो एसईसी-सैक्स डेटा के विश्लेषण को बेहतर बनाने में मदद करती हैं, जैसे सिग्नल प्लॉट से जुड़ा हीट मैप, फ्रेम चयन की पसंद के साथ अधिक सटीकता को सक्षम करता है। प्राथमिक डेटा विश्लेषण में, गिनीयर पीक विश्लेषण और पी (आर) विश्लेषण से जुड़े क्रॉस-सत्यापन भूखंड सॉफ्टवेयर में एक एकीकृत समस्या निवारण क्षमता प्रदान करते हैं।
यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि प्राथमिक डेटा विश्लेषण के लिए कई अन्य कार्यक्रमों का उपयोग किया जा सकता है; इनमें एक ही बुनियादी विशेषताएं होती हैं और बायोक्सटास रॉ17 एटीएसएएस पैकेज24 और यूएस-सोमो15 जैसे नियमित रूप से अपडेट किए जाते हैं।
लेकिन भले ही एसएक्सएस पैकेज का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जाता है, प्रमुख सीमाएं आम हैं: नमूना तैयारी, संग्रह और विश्लेषण से पहले। E9 exoमाइनस उदाहरण में दिखाया गया है, यह शोर अनुपात के लिए संकेत में सुधार देखने के लिए और आरजी डीअधिकतम एक मोनोडिस्पर्स नमूने के साथ जुड़े में कमी के साथ स्पष्ट है । यह ज्ञात उच्च-संकल्प संरचनाओं के साथ फिटिंग या मॉडलिंग जैसे डेटा के आगे प्रसंस्करण में बहुत सहायता करेगा।
The authors have nothing to disclose.
हम फ्रांसीसी अनुदान REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 से परियोजना के लिए वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं और सेवा डी सैंटे डेस आर्मेस और डेलेग्नेशन Générale डालना l’Armement से अनुसंधान अनुदान के द्वारा। हम एसएक्सएस बीम समय के लिए ईएसआरएफ के आभारी हैं। इस काम ने ग्रेनोबल निर्देश-एरिक सेंटर (आईएसबीजी) के प्लेटफार्मों का उपयोग किया; एफआरएसबी (एएनआर-10-आईएनबीएस-05-02) और जीआरएएल द्वारा समर्थित स्ट्रक्चरल बायोलॉजी (पीएसबी) के लिए ग्रेनोबल पार्टनरशिप के भीतर यूएमएस 3518 सीएनआरएस-सीईए-यूगा-ईएमबीएल, विश्वविद्यालय ग्रेनोबल आल्प्स ग्रेजुएट स्कूल (इकोलेस यूनीवर्सिटेयर्स डी रेचेचे) सीबीएच-यूरो-जीएस (एएनआर-17-यूआरई-0003) के भीतर वित्त पोषित। आईबीएस ग्रेनोबल के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान (IRIG, सीईए) में एकीकरण को स्वीकार करता है । हम वित्तीय और वैज्ञानिक समर्थन के लिए Wim पी बर्मीस्टर और फादरएडेरिक इसेनी को धन्यवाद देते हैं और हम उनकी मदद के लिए और बायोक्सटास रॉ के विकास के लिए एपीएस में बायोकैट से डॉ जेसी हॉपकिंस को भी धन्यवाद देते हैं।
Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |