Mitokondriel fusion er en vigtig hjemostatisk reaktion underliggende mitokondrielle dynamik. Beskrevet her er en in vitro rekonstitution system til at studere mitokondrielle indre membran fusion, der kan løse membran tøjring, docking, hemifusion, og pore åbning. Alsidigheden i denne tilgang til at udforske cellemembransystemer diskuteres.
Mitokondriel dynamik er afgørende for organellets forskellige funktioner og cellulære reaktioner. Den overfyldte, rumligt komplekse, mitokondrielle membran er et udfordrende miljø for at skelne lovgivningsmæssige faktorer. Eksperimentel kontrol af protein- og lipidkomponenter kan hjælpe med at besvare specifikke spørgsmål om regulering. Endnu, kvantitativ manipulation af disse faktorer er udfordrende i cellulære analyser. For at undersøge den molekylære mekanisme mitokondrier indre membran fusion, introducerede vi en in vitro rekonstitution platform, der efterligner lipid miljøet af mitokondrielle indre membran. Her beskriver vi detaljerede trin til forberedelse af lipidtlagere og rekonstituerende mitokondrielle membranproteiner. Platformen tillod analyse af mellemprodukter i mitokondriel indre membran fusion, og kinetik for individuelle overgange, på en kvantitativ måde. Denne protokol beskriver fremstillingen af tolags med asymmetrisk lipid sammensætning og beskriver generelle overvejelser for rekonstituering transmembrane proteiner i en polstret tolags. Metoden kan anvendes til undersøgelse af andre membransystemer.
Membranindrætning er kendetegnende for eukaryoteceller 1 (Figur 1A). Biologiske membraner anerkendes i stigende grad som mere end et todimensionelt opløsningsmiddel og betragtes som et miljø, der spiller en afgørende rolle i reguleringen af proteinfunktionen og det makromolekylærekompleks 2,3. Native lipider er ligander, der regulerer membran protein aktivitet3,,4. Membran rumlig organisation og evnen af membraner til at blive formet i forskellige former er vigtige fysiske egenskaber for at vælge nye funktioner3,5.
Modelmembranplatforme er biomimetiske systemer, der kan hjælpe os med at forstå cellulære membranstruktur, dynamik ogfunktion 6,,7,,8. Modelmembraner består typisk af en lipidblanding af veldefineret sammensætning med definerede biofysiske egenskaber (stivhed, tykkelse og elasticitet). Koblet til fluorescensbilleddannelse giver modelmembranplatforme mulighed for kvantitativ analyse afmembranstrukturog funktion 9,10,11. Lipid tolags rekonstitutionsstrategier er blevet brugt til at studere SNARE-medieret membranfusion9,10, DNA-medieret membranfusion12og viral fusion11,13. En fordel ved sådanne metoder er muligheden for at indhente kinetiske oplysninger om mellemliggende trin forud for en observerbar reaktionshændelse14.
Plasmamembranen er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af modelmembraner. Bilayers med lipid fase adskillelse er blevet udviklet til at studere lipid flåde strukturer vigtigt i cellulære signalering11,,15,16. Micropatterned lipid planar toayers17,,18 er blevet brugt til at undersøge organiseringen af cellereceptorer. Polymer eller gel-støttede membraner er blevet brugt som biomimetiske systemer til at studere membran-cytoskeleton organisation, membran protein partitionering under celle signalering, og migration på celle-celle kontakter19.
Der anvendes også kunstige membransystemer til undersøgelse af delcellulære organeller20. Organeller har karakteristiske morfologier, der skaber forskellige undermiljøer. Endoplasmic reticulum (ER) netværk er et eksempel. Ved rekonstituering af reticulons i liposomer dannes rørformede membranstrukturer med egenskaber svarende til den cellulære ER21. Tilsætning af atlastin, en ER fusion protein, kan fremkalde lipid tubuli fra liposomer til at danne et netværk20. Dette er et eksempel på, hvordan proteoliposomer kan give funktionel indsigt i organelle morfologi og dynamik.
Mitokondriel membranfusion og fission er afgørende for mitokondrielle befolkningssundhed 22,23,24,25. Et sæt af dynamin familie GTPases katalyzes mitokondrier membran fusion. Mfn 1/2 katalyserer ydre membranfusion. Opa1 formidler indre membranfusion26 (Figur 1B). Opa1 har to former: en lang form (l-Opa1), transmembran-forankret til mitokondriel indre membran, og en ‘opløselig’ kort form (s-Opa1), til stede i intermembrane rummet. Forholdet mellem de to Opa1-formularer reguleres af to proteaser, Oma1 og Yme1L27,28,29,30. Vigtige spørgsmål i Opa1-forordningen omfatter: hvordan de to former for Opa1 , (kort og lang) mægle membran fusion og deres lovgivningsmæssige samspil28,29,31,32,33.
Her beskriver vi en rekonstitutionsstrategi med succes anvendt til at undersøge mitokondriel indre membran fusion, der præciserede roller l- og s-Opa1 i indre membran fusion. Vi udviklede en platform, der efterligner mitokondriel indre membran ved hjælp af en polymer-tøjret lipid tolags og 200 nm unilamellar vesikler. Fordelene ved en polymer tøjr under lipid tolags omfatter følgende. For det første bevarer det rekonstituerede transmembrane protein, som ellers ville blive forstyrret af nærheden til glasslide34. For det andet, det tjener et tykt vandlag mellem lipid tolags og glas substrat, som letter undersøgelser af pore åbning9, og for det tredje den viskoelastiske karakter af PEG polymer tillader membran krumning ændringer35. Vi brugte tre-farve fluorescens billeddannelse til at karakterisere trin i membran fusion(Figur 1C-F).
Figur 1: Overvågning af mitokondriel membranfusion.
(A) Organelles er cellulære membran rum. BB) Sekventielle trin af mitokondriel membranfusion. Fusion af den ydre membran af mitokondrier er katalyseret af Mfn1 og / eller Mfn2, mens indre membran fusion er medieret af Opa1. (C-F) Skematisk af in vitro rekonstitution platform til at studere mitokondrielle membran fusion. Platformen indeholder to dele: en proteoliposom og en polymer-tøjret lipid toayer, begge med rekonstitueret l-Opa1. Fluorescerende etiketter, herunder to forskellige fluorescerende membranfarvestoffer og en indholdsmarkør, hjælper med at skelne trin under membranfusion. De to membranmarkører (Cy5-PE (rød) og TexasRed PE (orange) gør en FRET par, som kan rapportere om tæt membran docking. Diffusion af TexasRed-PE, der etiketter proteoliposom er en indikator for lipid demixing (hemifusion). Indholdsudgivelse overvåges ved afklukning af calceinsignalet (vist med grønt). Paneler A og B oprettet ved hjælp af Biorender. Klik her for at se en større version af dette tal.
In vitro modelmembransystemer kan beskrive komplekse membranprocesser under veldefinerede forhold. Disse systemer kan skelne mellem minimale komponenter , der er nødvendige for komplekse molekylære processertil at afsløre molekylære mekanismer6,15,20,38. For membran proteiner, liposomer og planar understøttet tolags er fælles rekonstitutionssystemer. I modsætning til solid-støttede lipid tolags, polymer pude mellem substrat og understøttet membran i polymer-tøjrede tolagser giver fri mobilitet af store membran proteiner, og transmembran-proteiner til diffuse og samle frit34. Disse funktioner hjalp os med at undersøge kinetik af mitokondrier indre membran fusion36.
Vi har udarbejdet en polymer-tøjret lipid toayer ved hjælp af Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB / LS) teknikker. Dette giver os mulighed for at forberede en tolags med asymmetriske lipid komponenter. Cellulære membraner har asymmetrisk folder sammensætning, og LB / LS tilgang giver mulighed for undersøgelse af sådanne tolagser. Med Schaefer overførsel, kan et helt glas substrat være dækket af en lipid tolags. Det er afgørende at forberede en ren overflade til tolags forberedelse. Derudover kræver det øvelse at udføre en Schaefer-overførsel korrekt. Mislykket Schaefer overførsel kan skabe uønskede fejl i en lipid tolags. I denne protokol gælder det tryk, der føjes til filmbalancen, for en tolags, der indeholder 20% kardiolipin. For tolagsapparater med andre komponenter henvises til overfladetrykområdets isotherm for nøglekomponenterne. En alternativ metode er Langmuir-Blodgett/ vesicle fusion (LB / VF) metode, hvor den nederste lipid monolag overføres fra luft-vand interface af en Langmuir trug på et rent substrat, derefter liposomer sikring til toppen af den understøttede lipid monolayer og danne den endelige tolags39. Rekonstituering af membranproteiner ved hjælp af LB/VF-metoden er mere ligetil end LB/LS, da rekonstitution kan udføres gennem fusion af proteoliposomer. Men vesicle fusion kræver tilsætning af overskydende liposomer, som kan komplicere studiet af membran begivenheder afhængig af koncentration-afhængige protein-protein interaktioner.
En vellykket rekonstituering af transmembrane proteiner i både polymer-tøjret lipid tolags og liposomer i en foretrukken funktionel orientering er vigtig, men vanskelig at håndhæve. Der er behov for eksperimentelle kontroller for at tage højde for dette. For polymer-tøjret lipid tolags, er det også vigtigt at opretholde integriteten af lipid tolags under rekonstitution. Belægningskoncentrationer skal holdes relativt lave for at forhindre opløsning af lipidtlagen, men høj nok til at forhindre denaturering af protein af interesse37,40. Den metode, der er beskrevet her, er ideel til rekonstituering af membranproteiner til enkeltmolekyleundersøgelser, men er ikke nødvendigvis skalerbar til større undersøgelser. Overfladeaktivt valg er en anden vigtig overvejelse. Ofte er det overfladeaktive stof, der anvendes til rensning og opbevaring, et godt udgangspunkt. Den maksimale koncentration af overfladeaktivt stof er normalt ~ 200 gange mindre af CMC36, i en række, hvor det overfladeaktive stof opretholder protein stabilitet og forhindrer protein aggregering, samtidig med at integriteten afmembran 36. Cocktails, der indeholder 2 eller 3 overfladeaktive stoffer, kan komme i betragtning. For rekonstituering i liposomer er en lav koncentration af overfladeaktivt stof ikke nødvendig. Koncentrationer af overfladeaktive stoffer under CMC er dog at foretrække for at opretholde en ensartet størrelse og morfologifordeling for liposomerne. For at forhindre lækage af farvestof er det nødvendigt at dialyze mod en farvestofholdig buffer.
I modsætning til liposom-baserede fusionsanalyser giver den platform, vi etablerede, en tilgang til at undersøge kinetik i hvert trin af membranfusion. Denne metode giver mulighed for at studere transmembrane fusionsproteiner under næroprindelige forhold. Model membran platforme kan anvendes til at studere membran protein samling og oligomerisering, membran “sculpting”, og protein-lipid interaktioner af proteiner i subcellulære miljøer, ligesom mitokondrielle indre membran. Denne metode giver også mulighed for udforskning af vigtige fysiologiske forhold i membran-protein samspil, såsom tolags sammensætning asymmetri. Rollen som en vigtig mitokondriellipid, kardiolipin, i tolagsegenskaberne for både liposomer og polymerstøttede tolagser er endnu ikke defineret. Egenskaber såsom ioniske styrke, membrantykkelse, membranstivhed, membrankrumning og membranelastik-viskositetsegenskaber kan alle påvirke proteiners evne til at samle sig i specifikke funktionelle tilstande. Fremtidige undersøgelser kreativt anvende model membran systemer har potentiale til at afdække nye aspekter af membran protein organisation og funktion.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender støtte fra Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award og generøs støtte fra Institut for Molekylær Biologi på Massachusetts General Hospital.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |