Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Модель Мембранная платформа для восстановления митохондриальной динамики мембран

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61620
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Chemistry, University of Akron, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

Summary

Митохондриальный синтез является важной гомеостатической реакцией, лежащей в основе митохондриальной динамики. Описана здесь система восстановления in vitro для изучения митохондриального синтеза внутренней мембраны, которая может решить мембранные привязывания, стыковки, гемифузии и открытия пор. Обсуждается универсальность этого подхода при изучении клеточных мембранных систем.

Abstract

Митохондриальная динамика имеет важное значение для различных функций органеллы и клеточных реакций. Переполненная, пространственно сложная митохондриальная мембрана является сложной средой для различения регуляторных факторов. Экспериментальный контроль белковых и липидных компонентов может помочь ответить на конкретные вопросы регулирования. Тем не менее, количественное манипулирование этими факторами является сложной задачей в клеточном анализе. Для исследования молекулярного механизма синтеза внутренней мембраны митохондрий мы внедрили платформу экстракорпорального восстановления, которая имитирует липидную среду митохондриальной внутренней мембраны. Здесь мы описываем подробные шаги по подготовке липидных билейеров и восстановлению митохондриальных мембранных белков. Платформа позволила количественно провести анализ промежуточных элементов в митохондриальном синтезе внутренней мембраны и кинетики для отдельных переходов. Этот протокол описывает изготовление билейеров с асимметричным липидным составом и описывает общие соображения для восстановления трансмембранных белков в мягкий билейер. Метод может быть применен для изучения других мембранных систем.

Introduction

Мембранная разобщенизация является отличительной чертой эукариотическихклеток 1 (рисунок 1A). Биологические мембраны все чаще признаются как более чем двумерный растворитель, и рассматриваются как окружающая среда, играющая важную роль в регулировании функции белка и макромолекулярногокомплекса сборки 2,,3. Родные липиды лиганды, которые регулируют активность мембранногобелка 3,4. Мембранная пространственная организация и способность мембран быть скульптурные в различные формы являются важными физическими свойствами для выбора новыхфункций 3,,5.

Модель мембранных платформ – это биомиметические системы, которые могут помочь нам понять структуру клеточных мембран, динамикуи функцию6,7,,8. Модельные мембраны обычно состоят из липидной смеси четко определенного состава, с определенными биофизическими свойствами (жесткость, толщина и эластичность). В сочетании с флуоресценцией изображения, модели мембранных платформ позволяют количественныйанализ структуры мембраны ифункции9 ,10,11. Липидный bilayer стратегии восстановления были использованы для изучения SNARE-опосредованноеслияние мембраны 9,10, ДНК-опосредованное слияниемембраны 12, ивирусный синтез 11,13. Преимуществом таких методов является возможность получения кинетической информации для промежуточных шагов, предшествующих наблюдаемому событиюреакции 14.

Плазменная мембрана была тщательно изучена с использованием модельных мембран. Билайеры с разделением липидной фазы были разработаны для изучения структур липидного плота, важных в клеточнойсигнализации11,15,,16. Микропаттернные липидные планарныебилейеры 17,18 были использованы для исследования организации клеточных рецепторов. Полимерные или гелеобразующие мембраны используются в качестве биомиметических систем для изучения мембранно-цитоскелетной организации, секционирования мембранного белка во время сигнализации клеток и миграции в контактыклеток-клеток 19.

Искусственные мембранные системы также применяются для изучения подклеточных органелл20. Органеллы имеют характерные морфологии, которые создают различные подсреду. Одним из примеров является эндоплазмическая сеть reticulum (ER). При восстановлении стикулонов в липосомы образуются трубчатые мембранные структуры со свойствами, похожими на клеточныйER. Добавление атластина, белка синтеза ER, может вызвать липидные трубоубийки из липосом, чтобы сформировать сеть20. Это один из примеров того, как протеолипосомы могут обеспечить функциональное понимание органеллы морфологии и динамики.

Митохондриальный синтез мембран и деление имеют важное значение для здоровьямитохондриальной популяции 22,,23,,24,,25. Набор динамин семьи GTPases катализирует митохондрии мембраны слияния. Mfn 1/2 катализает слияние внешней мембраны. Opa1 опосредует синтез внутреннеймембраны 26 (рисунок 1B). Opa1 имеет две формы: длинная форма (l-Opa1), трансмембранная, закрепленная на митохондриальной внутренней мембране, и «растворимая» короткая форма (s-Opa1), присутствуют в интермембранном пространстве. Соотношение двух форм Opa1 регулируется активностью двух протеаз, Oma1 и Yme1L27,,28,,29,,30. Важные вопросы в регулировании Opa1 включают в себя: как две формы Opa1, (короткий и длинный) посредником мембраны слиянияи их нормативного взаимодействия 28,29,31,32,33.

Здесь мы описываем стратегию восстановления, успешно применяемую для исследования митохондриального синтеза внутренней мембраны, которая прояснил роль l- и s-Opa1 во внутреннем мембранном синтезе. Мы разработали платформу, имитирующую митохондриальную внутреннюю мембрану с использованием полимерно-привязанного липидного билейера и 200 нм униламелларов. Преимущества полимерного троса под липидным билейером включают в себя следующее. Во-первых, он сохраняет восстановленный трансмембрановый белок, который в противном случае может быть нарушен близостью к стеклянной горке34. Во-вторых, он служит толстым слоем воды между липидным билейером и стеклянным субстратом, что облегчает изучениепор открытия 9,и в-третьих, вязко-вязкостатический характер полимера PEG позволяет мембранной кривизныизменения 35. Мы использовали трехцветную флуоресценцию для характеристики шагов в мембранном синтезе(рисунок 1C-F).

Figure 1
Рисунок 1: Мониторинг синтеза митохондриальных мембран.
(A)Органеллы являются клеточными мембранами отсеков. (B)Последовательные шаги митохондриального синтеза мембран. Слияние внешней мембраны митохондрий катализуется Mfn1 и/или Mfn2, в то время как синтез внутренней мембраны опосредован Opa1. (C-F) Схема платформы восстановления in vitro для изучения митохондриального синтеза мембран. Платформа включает в себя две части: протеолипосому и полимерно-привязанный липидный бислой, оба с восстановленным l-Opa1. Флуоресцентные этикетки, в том числе два различных флуоресцентных мембранных красителя и маркер содержимого, помогают различать шаги во время мембранного синтеза. Два мембранных маркера (Cy5-PE (красный) и TexasRed PE (оранжевый) делают пару FRET, которая может сообщать о близкой мембранной стыковке. Диффузия TexasRed-PE, которая маркирует протеолипосому, является показателем демиксирования липидов (гемифузии). Выпуск содержимого контролируется путем dequenching кальцина сигнала (показано зеленым цветом). Панели A и B созданы с использованием Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Protocol

1. Приготовление липидных смесей

  1. Подготовка раствора липидного бульона путем растворения 1,2-диолеоила-sn-glycero-3фосфохолина (DOPC), 1-пальмитоила-2-олеойла-сн-глицеро-3-фосфатаноламина (POPE), L-З-фосфатилинолита (Liver PI), кардиолипина, и 1,2-диолеоил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-метокси (полиэтиленгликоль)-2000 ( 18:1 PEG2000 PE) в хлороформ при концентрации 25 мг/мл. Растворите флуоресцентный краситель-конъюгированный липид (TexasRed DHPE и Cy5 DOPE) хлороформ при концентрации 1 мг/мл. Храните липидный раствор во флаконах янтаря с хлороформостойким вкладышем, дополнительно запечатанным полиэтиленовой лентой. Раствор можно хранить при -20 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев.
  2. Сделать решения A и B.
    1. Смешайте липиды для приготовления раствора А (окончательная концентрация 1 мг/мл), который содержит DOPC (52,8 моль%), POPE (20 мол), Liver PI (7 мол%) и кардиолипин (20 моль%), и 0,2 мол% фторфора.
    2. Сделать раствор B (окончательная концентрация 1 мг/мл), содержащий DOPC (47,8 моль%), POPE (20 мол), ИП печени (7 моль%), кардиолипин (20 мол%) и DOPE-PEG2000 (5 моль%), и 0,2 мол% фторфора.
    3. Создайте липидную смесь, добавив рассчитанный объем раствора хранения в янтарные флаконы с помощью стеклянного шприца. Матч окончательный объем, добавив дополнительный хлороформ во флаконы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для FCS (флуоресценция корреляции спектроскопии), уменьшить соотношение красителя конъюгированных липидов до 0,002 мол% и заменить остальные DOPC.

2. Изготовление липидных билейеров

  1. Выпекать микроскоп крышка стеклянные слайды при температуре 520 градусов по Цельсию в течение 30 мин. После выпечки, охладить крышку слайды до комнатной температуры.
  2. Взвесить около 10 г гидроксида натрия и добавить в 500 мл метанола при перемешивании. Перемешать в течение 2 ч, продолжать добавлять гидроксид натрия в растворе, пока осадки начинают показывать. Убедитесь в том, чтобы носить соответствующие СИЗ в течение всего процесса.
  3. Очистите стеклянные горки в 10% растворе додецита сульфата натрия; метанол, насыщенный гидроксидом натрия; и 50 мМ соляной кислоты, последовательно (ванна sonication под каждым условием в течение 30 мин). Очистите стеклянную горку в ультрапурной воде в течение 10 минут между каждым условием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя настоятельно рекомендуется использовать свежие решения для подготовки стеклянных слайдов, каждое решение может быть повторно использовано до 5x или в течение 1 месяца, в зависимости от того, что приходит первым. Убедитесь в том, чтобы перемешать-смешать решение перед каждым использованием.
  4. Храните очищенное стекло крышки, запечатанное в растворе HCl до 2 недель, чтобы обеспечить хорошее качество bilayer. Если они хранятся в ультрапурной воде, используйте горки в течение недели.
  5. Очистите политетрафтороэтилен корыта системы погружения Лангмуир-Блоджетт с использованием хлороформа и ультрапурной воды до тех пор, пока на корыте не будет наблюдаться смачивание. Спрей хлороформ на поверхности корыта, тщательно протрите целлюлозой салфетки 3x. Промыть ультрачистой водой и удалить воду с помощью всасывания. Повторите 3x.
  6. Обложка поверхности корыта с чистой ультрачистой водой.
  7. Возьмите 2 куска поверхностного стекла крышки из раствора очистки или ультрачистой воды, и промыть стеклянную горку с ультрачистой водой для приблизительно 30 с.
  8. Поместите крышку стекла в спину к спине образом. Используйте зажим субстрата, чтобы держать стеклянные горки. Погрузите стеклянную горку под поверхностью воды, вручную нажав кнопку "погружение вниз" на программное обеспечение управления Langmuir.
  9. Нулевой баланс пленки, тщательно распространяя решение B капля за каплей на воздушно-водном интерфейсе(рисунок 2A). Убедитесь, что липиды распространяются только на воздушно-водном интерфейсе, без хлороформных и липидных капель, опускающихся на дно поверхности политетрафторэтилена.  Неспособность обеспечить это создаст липидный "канал" и предотвратить образование монослой.
  10. Прекратите добавлять липиды до считывания баланса пленки около 15-20 мН/м, подождите 10-15 мин. Инициировать барьер контроллер изменить площадь поверхности, нажав "начать эксперименты", пока фильм баланс считывания до 37 мН/м. Держите давление в течение 20-30 мин(рисунок 2B).
  11. Поднимите стекло крышки со скоростью 22 мм/мин при сохранении поверхностного натяжения на уровне 37 мН/м. Липидный монослой с полимерной привязкой будет перенесен из интерфейса воздушной воды на поверхность крышки стекла через процесс погружения Blodgett(рисунок 2C). Это образует нижнюю листовку липидного билейера.
  12. Очистите воздушно-водный интерфейс путем всасывания, промойте корыто ультрачистой водой.
  13. Перед использованием очистите стеклянную горку с одним околодецом (например, слайд Шефера) с использованием хлороформа, этанола и ультрачистой воды. Установите чистую стеклянную горку на корыто с ультрачистой водой под слоем воды. Убедитесь, что колодец обращен к интерфейсу воздушной воды и залить свежей ультрачистой водой до тех пор, пока стеклянная горка не будет полностью покрыта. Повторите шаг 2.8.
  14. Держите крышку стекла с липидным монослой от шага 2.4 с помощью чашки всасывания кремния (убедитесь, что монослойная сторона находится вдали от присоски), осторожно нажмите липидный монослой к интерфейсу воздушной воды, удерживайте крышку стекла для 2-3 с на интерфейсе, а затем нажмите крышку стекла против слайда (рисунок 2D). Возьмите слайд с крышкой слайда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Липидный билейзер будет проходить на поверхности крышки стекла, обращенной к зажатой области между двумя слайдами(рисунок 2E).
  15. Возьмите крышку стекла с билейером в эпифлюоресценции микроскопа. Изображение липидного билейера. Если наблюдается однородное распределение липидового красителя, фотоблей небольшой площади билейера на 30 с, выключите источник света на 30 с-1 мин., затем изображение снова наблюдать восстановление. Липидный билейтер покажет восстановление флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мембраны с дефектами или плохим восстановлением флуоресценции не должны использоваться для дальнейших экспериментов.

Figure 2
Рисунок 2: Шаги в создании полимерно-привязанного липидного билейера.
Шаги принятия липидных билейеров с использованием Langmuir-Blodgett погружения (A-C) и Лангмуир-Шефер передачи (D) методы. (E)Окончательный "сэндвич", содержащий липидный билейзер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

3. Восстановление белка в полимерно-привязанный липидный билейзер

  1. Приготовьте хрустальную тарелку, содержащую ультрачистую воду. Приготовьте чистое кольцо изображения микроскопа и поместите под блюдо.
  2. Погрузите "сэндвич" слайда Шефера и крышку стекла, содержащего липидный двуслой под водой, аккуратно разделите слайд Шефера и накройте стеклом, удерживайте крышку стеклянной горки снизу, вдали от стороны билейера, перенесите крышку стекла в кольцо изображения, закройте кольцо изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крышка стекла с липидным билейером всегда в воде, и кольцо хорошо запечатаны.
  3. Замените ультрапурную воду в кольце изображения буфером Bis-Tris NaCl, убедитесь, что липидный билейзер не подвергается воздействию пузырьков воздуха. Добавьте 1.1 x 10-9 M n-Octyl-d-Glucopyranoside к липидной билейзеру. Немедленно добавьте смесь 1.2 x 10-9 M DDM и 1.3 x 10-12 расплавленного очищенного l-Opa136 в кольцо изображения. Инкубационный образец на скамейке шейкер на низкой скорости в течение 2 ч (Рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Моющие средства могут варьироваться в зависимости от белка, который будет восстановлен.
  4. Распределите 30 мг шариков смолы SM-2 в 3 мл буфера Bis-Tris и встряхните перед нанесением. Используйте пластиковую пипетку, чтобы добавить 5'10 йл из SM-2 Смолы шарики для изображения кольцо, инкубировать в течение 10 минут, удалить смолы бисера путем полоскания. Окончательный объем буфера в кольце изображения составляет 1,5 мл.

Figure 3
Рисунок 3: Процедура воссоздания l-Opa1 в полимерно-привязанный липидный билейер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

4. Подготовка протеолипосом

  1. Приготовьте 1 мг липидной смеси А в растворе хлороформа. Испарить хлороформ под потоком азота в течение 20 мин и держать под вакуумом на ночь и образуют липидную пленку.
  2. Приготовьте 50 мм кальцина, содержащего буфер, растворив 15,56 г кальцеина до 50 мл раствора 1,5 мл NaOH, перемешайте при комнатной температуре до полного растворения кальцеина, доните 12,5 мм Bis-Tris и ультрапурную воду до конечного объема 500 мл. Отрегулируйте рН до 7,5.
  3. Приостановить липидную пленку в кальцеине, содержащей буфер, полностью увлажнить липид, нагревая подвеску при 65 градусов по Цельсию в течение 20 мин. 200 нм липосомы образуются через экструзию с помощью поликарбонатной мембраны.
  4. Добавьте 2 мкг l-Opa1 в 0,5 МКМ DDM до 0,2 мг липосомы и инкубировать при 4 градусов по Цельсию на 1,5 ч. Удалите сурфактант путем диализа с помощью кассеты с диализом 3,5 кДа против 250 мл 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ НаКл и 50 мм кальцина буфера при 4 градусов по Цельсию в одночасье, изменяя буфер в два раза.
  5. Удалите дополнительный кальцеин с помощью столбца ПД-10.

5. Анализ изображений и данных

  1. Приобретайте изображения TIRF с помощью 100-х целей погружения в нефть (N.A 1.4). Используйте 543 нм лазера и 488 нм лазер для анализа TexasRed-PE помечены липосомы и протеолипосомы инкапсулированы кальцином. Используйте лазер 633 нм для анализа Cy5-PE, встроенного в планарный липидный бислой.
  2. Выровнять угол TIRF с помощью липидного билейера для получения максимального излучения. Качество липидного билейера после восстановления наблюдается с использованием 100-х масляной цели при 25 градусах Цельсия. Коэффициент диффузии фосфолипида и восстановленного билейера определяется с помощью FCS с протоколом, описываемым в другомместе 37.
  3. Добавьте 10 л 2 мг/мл протеолипосомы к кольцу изображения и установите на 10 минут перед изображением. GTP, GMPPCP, или GDP добавляются в кольцо реакции с 1 мМм MgCl2 и 1 мМ нуклеотида.
  4. Чтобы определить влияние s-Opa1 в мембранном синтезе, титрат s-Opa1 в протеолипосому/поддерживаемый образец билейера, содержащий l-Opa1, и записывать события синтеза.
  5. Одновременное изображение TexasRed-DHPE и calcein достигается с помощью системы расщепления пучка. Лазеры 488 нм и 543 нм одновременно применяются к образцу в качестве источников возбуждения мучных ламп. Затем излучение света делится с помощью сплиттера луча 560 нм. Затем свет с разделенным излучением фильтруется фильтром 510 нм с пропускной способностью 42 нм и фильтром 609 нм с пропускной способностью 40 нм. Отфильтрованный луч проецируется на две смежные области на чипе камеры.
  6. Флуоресцентные выбросы одновременно регистрируются через 609-эмиссионной фильтр с пропускной способностью 40 нм и 698-эмиссионным фильтром с пропускной способностью 70 нм. Микроскоп система оснащена камерой CMOS поддерживается при -10 градусов по Цельсию.
  7. Идентификация частиц липосом может быть выполнена с помощью алгоритма распознавания частиц на основе гауссийской основе. Распределение частиц и интенсивность анализируются по каналу. Сигнал липидного двухслойного используется в качестве маски для изоляции частиц.

Representative Results

Восстановленный трансмембранный белок свободно рассеивается и однородно распространяется в мембране.

Пример изображения липидного билейзера и его липидной текучести, подтвержденной микроскопией эпифлюоресценции, показан на рисунке 4. Распределение липидов в билейе до и после фотоблейинга показано на рисунке 4A,B. Однородность липидного билейера была визуализирована с помощью эпифлюоресценционного микроскопа до и после восстановления(рисунок 4D,E). l-Opa1 восстановлен в липидном бислойном был подтвержден спектроскопией корреляции флуоресценции (FCS). Мы используем спряженные липиды красителя для оценки липидной диффузивности билейера. Восстановленный Opa1 был помечен с помощью флуоресцентных тегов анти-Opa1 C-терминал антитела. Диффузия липидов билейера измерялась как 1,46 и0,12 мкм 2/с,в то время как коэффициент диффузии двухслойно-восстановленного l-Opa1 составил 0,88 и 0,10мкм 2/с. Интенсивность считывания с кривых FCS указывается 75% l-Opa1 воссоздается в липидный бислой(рисунок 4G,H). Эти результаты свидетельствуют о том, что l-Opa1 свободно рассеивается в полимерно-привязанном липидном бислойном с потенциалом самостоятельной сборки в функциональные комплексы.

Figure 4
Рисунок 4: Распределение липидов и восстановленного белка в мембране модели.
(A-C) Пример изображения липидного билейзера и его липидной текучести, подтвержденной микроскопией эпифлюоресценции. (A)Однородное распределение липидов в билейе до фотоотвержения. (B)Снимок сразу после фотоотчета. (C)Bilayer, изображенный после восстановления флуоресценции, указывает на хорошую липидную текучесть мембраны после восстановления. (D,E) Репрезентативные изображения распределениялипидов до (D), и после ( E ) l-Opa1 восстановление указывают на процесс восстановления не создает дефектов в билей.E Представитель TIRF изображение l-Opa1 помечены Alexa 488 конъюгированных антител (F), показывая однородное распределение Opa1 после восстановления. G. Представитель сырого фотона подсчитывает l-Opa1 сигнал флуоресцентной корреляционные спектроскопии. В контроле, не l-Opa1 был восстановлен в bilayer, в то время как антитела были добавлены и промыть. Диффузия l-Opa1 значительно медленнее, чем липиды в мембране, в соответствии с успешным восстановлением трансмембрана l-Opa1 (H). Шкала бар: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Отбеливание шага флуоресценции показало, что в среднем 2-3 копии l-Opa1 были восстановлены в данной липосоме(рисунок 5A,B). Распределение размеров восстановленных протеолипосом Opa1 было протестировано после восстановления с использованием DLS(рисунок 5C). Восстановление Opa1 в proteoliposomes также было проверено с помощью FCS. Коэффициент диффузии свободных антител составил 164 и 22мкм 2/с; Коэффициент диффузии для липосом, помеченных липидным красителем, составил 2,22 и 0,33мкм 2/с,а коэффициент диффузии для протеолипосом l-Opa1, связанных с помеченным TexasRed анти-Его антителом, составил 2,12 и 0,36мкм 2/с.

Figure 5
Рисунок 5: Изготовление и характеристика протеолипосом.
(A)Шаги в изготовлении протеолипосом с инкапсулированными, закаленными кальцинами. (B)Репрезентативные данные флуоресцентного отбеливания шагов показывают в среднем 2-3 копии l-Opa1, встроенных в липосому. (C)Распределение размеров представителей протеолипосом (красных) без нуклеотида 1 ч после инкубации GTP (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обнаружение мембранного привязывания, демиксирования липидов/гемифузии и открытия пор при флуоресцентной микроскопии.

Мембранное привязывание контролируется путем наблюдения сигнала TexasRed на поверхности липидного бислойного с помощью микроскопии TIRF(рисунок 6A). Мембрана липидов demixing (гемифузия) поведение было проверено через TexasRed как краситель рассеивается из липосом в липидный билейзер. Кальцин dequenching помогает отличить полное образование пор синтеза от только липидного демиксирования. Это позволяет сравнивать условия, при которых частицы заглохли при гемифузии (рис. 6B), и частицами, которые перейти к полномуслиянию (рисунок 6C).

Мембранное привязывание указывается стабильным липидным сигналом от липосом. Расстояние может быть оценено на основе сигнала FRET между этикетками двух мембран36. Сигнал гемифузии не имеет dequenching в сигнале кальцина(рисунок 6B, нижний ряд), но быстрый распад сигнала TexasRed указывает на диффузию красителя в липидный бислой(рисунок 6B верхний ряд). Полное слияние (с открытием поры) имеет как липидный распад, так и выпусксодержимого (рисунок 6C). TexasRed интенсивности и интенсивности кальцина можно отслеживать в зависимости от времени образом, чтобы обеспечить количественные детали для кинетики мембранного синтеза36.

Figure 6
Рисунок 6: Репрезентативные результаты, показывающие привязывание частиц (A, шкала бар 10 мкм), гемифузия (B, шкала бар 0,5 мкм), и слияние (C, шкала бар 0,5 мкм).
(A) Протеолипосомы привязали к Opa1-восстановленный липидный билейлер до добавления GTP. (B)Пример гемифузии. Верхний ряд в B показывает липидный демиксинг (сигнал TexasRed, красный), нижний ряд в B не показывает релиз содержимого (кальцин-сигнал, зеленый) в этих условиях. (C) Репрезентативный след протеоливого сплава с липидным билейером. Выпуск контента можно наблюдать на изображениях в нижнем ряду, показывающих dequenching кальцина (нижний ряд, зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Модель-мембранные системы In vitro могут описывать сложные мембранные процессы в четко определенных условиях. Эти системы могут различать минимальные компоненты, необходимые для сложных молекулярныхпроцессов, чтобы выявитьмолекулярные механизмы 6, 15,,20,,,38. Для мембранных белков липосомы и планарные двуслойные являются распространенными системами восстановления. В отличие от твердо поддерживаемых липидных билейеров, полимерная подушка между субстратом и поддерживаемой мембраной в полимерно-привязанных билейерах позволяет свободно подвижность больших мембранных белков, а трансмембранные белки свободно рассеиватьсяи собирать 34. Эти особенности помогли нам исследовать кинетику митохондрий внутренне-мембранногосинтеза 36.

Мы подготовили полимерно-привязанный липидный билейлер с использованием методов Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). Это позволяет нам подготовить билейер с асимметричными липидными компонентами. Клеточные мембраны имеют асимметричный состав листовок, а подход LB/LS позволяет изучать такие билейеры. При передаче Шефера весь стеклянный субстрат может быть покрыт липидным билейером. Очень важно подготовить чистую поверхность для подготовки билейера. Кроме того, требуется практика для правильного выполнения передачи Шефера. Неудачная передача Шефера может создать нежелательные дефекты в липидном билейзере. В этом протоколе, давление, добавленное к балансу пленки применимо для билейера, содержащего 20% кардиолипин. Для двухслойных с другими компонентами обратитесь к изотерму области поверхностного давления ключевых компонентов. Альтернативным методом является метод лангмуир-Блоджетт/Везикл (LB/VF), при котором нижний липидный монослой переносится из воздушно-водяного интерфейса корыта Лангмуира на чистый субстрат, затем липосомы сливаются с верхней частью поддерживаемого липидного монослой и образуют окончательныйбилейтер 39. Восстановление мембранных белков с использованием метода LB/VF более просто, чем LB/LS, так как восстановление может быть выполнено путем слияния протеолипосом. Однако слияние пузырьков требует добавления избыточных липосом, что может осложнить изучение мембранных явлений, зависящих от концентрациозависимых белково-белковых взаимодействий.

Успешное восстановление трансмембранных белков в полимерно-привязанные липидные билейеры и липосомы в предпочтительной функциональной ориентации имеет важное значение, но трудно обеспечить. Для этого необходимы экспериментальные элементы управления. Для полимерно-привязанных липидных двуслойных, важно также поддерживать целостность липидного билейера во время восстановления. Концентрации сурфактанта должны быть относительно низкими, чтобы предотвратить растворение липидного билейера, но достаточно высоко, чтобы предотвратить денатурациюбелка интереса 37,40. Описанный здесь метод идеально подходит для восстановления мембранных белков для одномекулярных исследований, но не обязательно масштабируем для крупномасштабных исследований. Surfactant выбор является еще одним важным соображением. Часто сурфактант, используемый для очистки и хранения, является хорошей отправной точкой. Максимальная концентрация сурфактанта, как правило, в 200 раз меньше CMC36, в диапазоне, где сурфактант поддерживает стабильность белка и предотвращает агрегацию белка, сохраняя при этом целостностьмембраны 36. Коктейли, содержащие 2 или 3 сурфактантов могут быть рассмотрены. Для восстановления липосомы, низкая концентрация сурфактанта не является необходимым. Тем не менее, концентрации сурфактантов ниже CMC предпочтительнее для поддержания равномерного размера и распределения морфологии для липосом. Чтобы предотвратить утечку содержания красителя, необходимо диализуть против красителя, содержащего буфер.

В отличие от анализа синтеза на основе липосомы, созданная платформой обеспечивает подход к исследованиям кинетики каждого шага мембранного синтеза. Этот метод обеспечивает возможность изучения трансмембранных белков синтеза в почти родных условиях. Модель мембранных платформ может быть применена для изучения сборки мембранного белка и олигомеризации, мембранной «скульптуры» и белково-липидного взаимодействия белков в субклеточных средах, таких как митохондриальная внутренняя мембрана. Этот метод также позволяет изумить важные физиологические условия в мембранно-белковом взаимодействии, такие как асимметрия состава билейера. Роль ключевого митохондриального липида, кардиолипина, в свойствах билейера как липосом, так и полимерных билейеров еще предстоит определить. Такие свойства, как ионная прочность, толщина мембраны, мембранная жесткость, мембранная кривизна и мембранные эластичные свойства, могут влиять на способность белков к сборке в специфические функциональные состояния. Будущие исследования, творчески применяя модель мембранных систем, имеют потенциал, чтобы раскрыть новые аспекты организации и функции мембранного белка.

Disclosures

Ни один.

Acknowledgments

Авторы признают поддержку фонда Чарльза Х. Худа Child Health Research Award и щедрую поддержку со стороны Департамента молекулярной биологии в Массачусетской больнице общего профиля.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) Avanti polar lipid Cat #: 810335C1mg membrane fluorescent markers
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 880130P lipid molecules
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 710335P lipid molecules
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti Polar lipids Cat #: 850375P lipid molecules
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar lipids Cat #: 850757P lipid molecules
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit ThermoFisher Scientific A20181
Amber vial with PTFE liner Fisher scientific 14-955-332 sample vials to keep lipid solutions
Calcein Sigma-Aldrich Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 fluorescent dye
Chloroform Fisher scientific 298-500/ C295-4 Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.
Concavity slide (1 well) Electron Microscopy Science 71878-05 applied as Schaefer Slide
FCS analysis tool Smith Lab, University of Akron software tool
Fiji /ImageJ Fiji SCR_002285 software tool
Fisherbrand Cover Glasses: Circles Fisher scientific 12-545-102 Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M
GTP Disodium salt SIGMA-ALDRICH INC Cat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough Biolin Scientifc KN2002
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 850091P lipid molecules
Mini Extruder Avanti Polar lipids 610020
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace Cat #: D310 25 GM surfactant for reconstitution
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside Anatrace Cat #: O311HA 25 GM surfactant for reconstitution
PC Membranes 0.2μm Avanti Polar Lipids 610006
Rabbit Anti-Opa1 antibody NOVUS BIOLOGICALS Cat #: NBP2-59770 antibody for Opa1 C-terminal detection
Slidebook Intelligent imaging RRID: SCR_014300 software tool
Teflon threaded seal tape Fisher Scientific NC0636085 taflon tape for sample storage
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) ThermoFisher Scientific Cat #: T1395MP membrane fluorescent markers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
  2. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
  3. Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
  4. Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
  5. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  6. Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  7. Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
  8. Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
  9. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
  10. Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
  11. Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
  12. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
  13. Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
  14. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  15. Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
  16. Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
  17. Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
  18. Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
  19. Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
  20. Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
  21. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
  22. Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
  23. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  24. Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
  27. Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
  28. Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
  29. Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
  30. Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
  31. DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
  32. Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
  33. Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
  34. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  35. Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
  36. Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
  37. Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
  38. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
  39. Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
  40. Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 163 митохондриальная внутренняя мембрана Opa1 полимерно-привязанный липидный бислой в пробирке восстановление мембранный синтез микроскопия TIRF
Модель Мембранная платформа для восстановления митохондриальной динамики мембран
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A.,… More

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A., Chao, L. H. A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics. J. Vis. Exp. (163), e61620, doi:10.3791/61620 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter