Mitokondriell fusion är en viktig homeostatisk reaktion underliggande mitokondriell dynamik. Beskrivs här är en in vitro reconstitution system för att studera mitokondriellt inre-membran fusion som kan lösa membran tjudra, dockning, hemifusion och poröppning. Mångsidigheten hos detta tillvägagångssätt i utforska cellmembran system diskuteras.
Mitokondriell dynamik är avgörande för organellens olika funktioner och cellulära svar. Det trånga, rumsligt komplexa, mitokondriella membranet är en utmanande miljö för att skilja regleringsfaktorer. Experimentell kontroll av protein och lipidkomponenter kan hjälpa till att svara på specifika frågor om reglering. Ändå är kvantitativ manipulation av dessa faktorer utmanande i cellulära analyser. För att undersöka den molekylära mekanismen för mitokondrier inre-membran fusion, introducerade vi en in vitro reconstitution plattform som härmar lipid miljön av mitokondriellt inre-membran. Här beskriver vi detaljerade steg för att förbereda lipid bilayers och rekonstituering mitokondriellt membran proteiner. Plattformen tillät analys av intermediärer i mitokondriellt inre membran fusion, och kinetiken för enskilda övergångar, på ett kvantitativt sätt. Detta protokoll beskriver fabricering av bilayers med asymmetrisk lipid sammansättning och beskriver allmänna överväganden för rekonstituering transmembrane proteiner i en dämpad bilayer. Metoden kan tillämpas för att studera andra membransystem.
Membranfackinföring är ett kännetecken för eukaryotaceller 1 (Bild 1A). Biologiska membran är alltmer erkända som mer än en tvådimensionell lösningsmedel, och betraktas som en miljö spelar kritiska roller i regleringen av proteinfunktion och makromolekylära komplexa församling2,3. Inhemska lipider är ligander som reglerar membranproteinaktivitet3,4. Membran rumslig organisation och förmåga membran som ska skulpteras i olika former är viktiga fysiska egenskaper för att välja nya funktioner3,5.
Modell membran plattformar är biomimetiska system som kan hjälpa oss att förstå cellulära membran struktur, dynamik, ochfunktion 6,7,8. Modellmembran omfattar vanligtvis en lipidblandning av väldefinierad sammansättning, med definierade biofysiska egenskaper (styvhet, tjocklek och elasticitet). Kopplade till fluorescens avbildning, modell membran plattformar möjliggör kvantitativ analys av membranstrukturoch funktion 9,10,11. Lipid bilayer reconstitution strategier har använts för att studera SNARE-medierad membran fusion9,10, DNA-medierad membran fusion12, och viral fusion11,13. En fördel med sådana metoder är potentialen att få kinetisk information för mellansteg som föregår en observerbar reaktionshändelse14.
Plasmamembranet har studerats ingående med hjälp av modellmembran. Bilayers med lipid fas separation har utvecklats för att studera lipid flottor strukturer viktigt i cellulär signalering11,15,16. Micropatterned lipid planar bilayers17,18 har använts för att undersöka organisationen av cellreceptorer. Polymer eller gel-stödda membran har använts som biomimetiska system för att studera membran-cytoskelett organisationen, membran protein partitionering under cellsignalering, och migration vid cell-cell kontakter19.
Artificiella membransystem tillämpas också för att studera subcellulära organeller20. Organeller har karakteristiska morfologier som skapar distinkta sub-miljöer. Nätverket endoplasmatiskt nät för nät för nät (ER) är ett exempel. Vid rekonstitution av retikuloner till liposomer bildas rörformiga membranstrukturer med egenskaper som liknar den cellulära ER21. Tillsats av atlastin, ett ER fusion protein, kan inducera lipid tubuli från liposomer att bilda ett nätverk20. Detta är ett exempel på hur proteoliposomer kan ge funktionell insikt i organellemorfologi och dynamik.
Mitokondriellt membran fusion och fission är avgörande för hälsan hos den mitokondriella befolkningen22,23,24,25. En uppsättning dynamin familj GTPases katalyserar mitokondrierna membran fusion. Mfn 1/2 katalyserar yttre membran fusion. Opa1 förmedlar inre-membranfusion26 (Bild 1B). Opa1 har två former: en lång form (l-Opa1), transmembran-förankrad i mitokondriellt inre-membran, och en ‘löslig’ kortform (s-Opa1), som finns i intermembrane utrymmet. Förhållandet mellan de två Opa1-formerna regleras av aktiviteten hos två proteaser, Oma1 och Yme1L27,28,29,30. Viktiga frågor i Opa1-förordningen är: hur de två formerna av Opa1, (kort och lång) medla membran fusion och deras reglerande samspel28,29,31,32,33.
Här beskriver vi en reconstitution strategi framgångsrikt tillämpas för att undersöka mitokondriellt inre-membran fusion som klargjorde rollerna för l- och s-Opa1 i inre-membran fusion. Vi utvecklade en plattform härma mitokondriellt inre-membran med hjälp av en polymer-bundna lipid bilayer och 200 nm unilamellar vesiklar. Fördelarna med en polymer tjuder under lipid bilayer inkluderar följande. Först bevarar det det rekonstituerade transmembranproteinet, som annars skulle kunna störas av närheten till glasglaset34. För det andra, det tjänar ett tjockt vattenskikt mellan lipid bilayer och glas substrat, som underlättar studier av poröppning9, och för det tredje den viskoelastiska karaktär PEG polymer tillåter membran krökning förändringar35. Vi använde tre-färg fluorescens avbildning för att karakterisera steg i membran fusion (Figur 1C-F).
Bild 1: Övervakning av mitokondriell membranfusion.
(A) Organeller är cellulära membranfack. (B) Sekventiella steg av mitokondriell membran fusion. Fusion av det yttre membranet i mitokondrier katalysas av Mfn1 och/eller Mfn2, medan innermembranfusion förmedlas av Opa1. (C-F) Schematisk av in vitro reconstitution plattformen för att studera mitokondriellt membran fusion. Plattformen innehåller två delar: en proteoliposom och en polymer-bundna lipidbilayer, båda med rekonstituerad l-Opa1. Fluorescerande etiketter, inklusive två olika fluorescerande membranfärgämnen och en innehållsmarkör, hjälper till att skilja steg under membranfusion. De två membranmarkörerna (Cy5-PE (röd) och TexasRed PE (orange) gör ett FRET-par, som kan rapportera om stängningsmembran dockning. Diffusion av TexasRed-PE att etiketter proteoliposome är en indikator på lipid demixing (hemifusion). Innehållsutgåvan övervakas genom att calceinsignalen (visas i grönt) avskrider. Panel A och B som skapats med hjälp av Biorender. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
In vitro-modell-membransystem kan beskriva komplexa membranprocesser under väldefinierade förhållanden. Dessa system kan skilja minimala komponenter som är nödvändiga för komplexa molekylära processer för att avslöjamolekylära mekanismer 6,15,20,38. För membranproteiner är liposomer och planarstödda bilayers vanliga rekonstitueringssystem. I motsats till solid-stödda lipidbilayers, polymeren kudden mellan substratet och stöds membran i polymer-bundna bilayers tillåter fri rörlighet av stora membranproteiner, och transmembran-proteiner att diffusa och montera fritt34. Dessa funktioner hjälpte oss att undersöka kinetik mitokondrierna inre membran fusion36.
Vi förberedde en polymer-bundna lipid bilayer med Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB / LS) tekniker. Detta gör det möjligt för oss att förbereda en bilayer med asymmetriska lipidkomponenter. Cellulära membran har asymmetrisk bibroschyr sammansättning, och LB / LS-metoden tillåter studier av sådana bilayers. Med Schaefer överföring kan ett helt glas substrat täckas av en lipid bilayer. Det är avgörande att förbereda en ren yta för bilayer förberedelse. Dessutom krävs det övning för att utföra en Schaefer-överföring korrekt. Misslyckad Schaefer överföring kan skapa oönskade defekter i en lipid bilayer. I detta protokoll är trycket som läggs till filmbalansen tillämpligt för ett bilager som innehåller 20 % kardilipin. För bilager med andra komponenter, se de centrala komponenternas yttryck-areaisoterm. En alternativ metod är Langmuir-Blodgett/vesicle fusion (LB/VF) metod, där botten lipid monolayer överförs från luft-vatten gränssnittet för en Langmuir tråg på ett rent substrat, sedan liposomer säkring till toppen av den stödda lipid monolayer och bildar den slutliga bilayer39. Rekonstitution av membranproteiner med LB/VF-metoden är mer okomplicerad än LB/LS, eftersom rekonstitution kan utföras genom fusion av proteoliposomer. Vesikelfusion kräver dock tillsats av överskott av liposomer, vilket kan komplicera studien av membranhändelser beroende av koncentrationsberoende protein-protein interaktioner.
Den framgångsrika rekonstituering av transmembrane proteiner i både polymer-bundna lipid bilayers och liposomer i en föredragen funktionell orientering är viktigt, men svåra att genomdriva. Det behövs experimentella kontroller för att ta hänsyn till detta. För polymer-bundna lipid bilayers, är det också viktigt att upprätthålla integriteten hos lipid bilayer under rekonstituering. Tensidkoncentrationer måste hållas relativt låga för att förhindra upplösning av lipidbilayer, men tillräckligt hög för att förhindra denaturering av det protein av intresse37,40. Den metod som beskrivs här är idealisk för rekonstituering av membranproteiner för enmolekylstudier men är inte nödvändigtvis skalbar för större studier. Ytaktiva val är en annan viktig faktor. Ofta är det ytaktivasmedel som används för rening och lagring en bra utgångspunkt. Den maximala koncentrationen av ytaktivt är vanligtvis ~200 gånger mindre av CMC36, i ett intervall där ytaktiva ämnen upprätthåller proteinstabilitet och förhindrar proteinaggregering, samtidigt som integriteten hosmembran 36. Cocktails som innehåller 2 eller 3 ytaktiva ämnen kan övervägas. För reconstitution till liposomer är en låg koncentration av ytaktivt medel inte nödvändigt. Däremot är halter av surfaktant under CMC att föredra för att bibehålla enhetlig storlek och morfologifördelning för liposomerna. För att förhindra läckage av innehåll färgämne, är det nödvändigt att dialyze mot en färgämnehaltig buffert.
I motsats till liposombaserad fusionsanalys ger plattformen som vi etablerat ett tillvägagångssätt för att undersöka kinetiken i varje steg i membranfusion. Denna metod ger möjlighet att studera transmembrane fusion proteiner under nära-infödda förhållanden. Modell membran plattformar kan tillämpas för att studera membran protein montering och oligomerization, membran “skulptera”, och protein-lipid interaktioner av proteiner i subcellulära miljöer, som den mitokondriella inre-membran. Denna metod möjliggör också utforskning av viktiga fysiologiska förhållanden i membran-protein samspelet, såsom bilayer sammansättning asymmetri. Rollen av en nyckel mitokondriellt lipid, cardiolipin, i bilayer egenskaper både liposomer och polymer-stödda bilayers återstår att definiera. Egenskaper såsom joniska styrka, membran tjocklek, membran styvhet, membran krökning, och membran elastisk-viskositet egenskaper alla kan påverka förmågan hos proteiner att montering i specifika funktionella tillstånd. Framtida studier kreativt tillämpa modell membransystem har potential att avslöja nya aspekter av membran protein organisation och funktion.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner stödet från Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award och generöst stöd från Institutionen för molekylärbiologi vid Massachusetts General Hospital.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |