Summary
Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.
Abstract
Le phénotype cellulaire peut être inversé ou modifié avec différentes méthodes, avec des avantages et des limites spécifiques à chaque technique. Nous décrivons ici une nouvelle stratégie qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Deux étapes principales sont nécessaires. Dans un premier temps, les cellules matures adultes (différenciées en phase terminale) sont exposées à la gomme épigénétique 5-aza-cytidine pour les conduire dans un état pluripotent. Cette partie du protocole a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes épigénétiques contrôlant le devenir et la différenciation cellulaires, et implique l’utilisation du modificateur épigénétique pour effacer l’état différencié cellulaire, puis conduire dans une fenêtre transitoire de haute plasticité.
Dans la deuxième étape, les cellules effacées sont encapsulées dans des micro-bioréacteurs en polytétrafluoroéthylène (PTFE), également connus sous le nom de marbres liquides, pour favoriser le réarrangement cellulaire 3D afin d’étendre et de maintenir de manière stable la haute plasticité acquise. Le PTFE est un composé synthétique hydrophobe non réactif et son utilisation permet la création d’un microenvironnement cellulaire, ce qui ne peut être réalisé dans les systèmes de culture 2D traditionnels. Ce système encourage et stimule le maintien de la pluripotence grâce à des indices liés à la biomécanosension.
Les procédures techniques décrites ici sont des stratégies simples pour permettre l’induction et le maintien d’un état de plasticité élevé dans les cellules somatiques adultes. Le protocole a permis la dérivation de cellules à haute plasticité chez toutes les espèces de mammifères testées. Comme il n’implique pas l’utilisation de la transfection de gènes et qu’il est exempt de vecteurs viraux, il peut représenter une avancée technologique notable pour les applications de médecine translationnelle. En outre, le système de micro-bioréacteur fournit une avancée notable dans la technologie organoïde des cellules souches en recréant in vitro un micro-environnement spécifique qui permet la culture à long terme de cellules à haute plasticité, à savoir en tant que CSE, csi, cellules épigénétiquement effacées et CSM.
Introduction
Au cours des dernières décennies, le concept largement accepté de progression unidirectionnelle vers l’engagement et la différenciation cellulaires a été complètement révisé. Il a été démontré que la spécification cellulaire peut être inversée et qu’une cellule différenciée en phase terminale peut être poussée vers un état permissif moins engagé et plus élevé, en utilisant différentes méthodes.
Parmi les nombreuses méthodes proposées, l’une des plus prometteuses consiste à utiliser des composés chimiques pour induire les cellules dans une pluripotence dite induite chimiquement. Les petites molécules utilisées dans cette approche sont capables d’interagir et de modifier la signature épigénétique d’une cellule mature adulte, évitant ainsi le besoin de tout vecteur transgénique et/ou viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études ont récemment montré qu’il est possible de passer de cellules d’un phénotype à un autre en fournissant des stimuli biochimiques et biologiques spécifiques qui induisent la réactivation des gènes hyperméthylés 11,12,13,14,15. Ces événements de déméthylation permettent la conversion de cellules différenciées en phase terminale en un progéniteur primitif, une cellule multipotente ou une cellule à haute plasticité/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallèlement, de nombreuses études se sont récemment concentrées sur la compréhension des indices liés à la mécanosension et, plus spécifiquement, sur la possibilité d’utiliser des forces mécaniques pour influencer directement la plasticité cellulaire et/ou la différenciation 16,17,18,19. En effet, il a été clairement démontré que la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle clé dans le contrôle du devenir cellulaire. En particulier, les signaux biomécaniques et biophysiques produits par l’ECM régulent directement les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation, influençant le comportement et les fonctions cellulaires20,21. Ces données récentes ont ouvert la voie au développement de nouveaux systèmes de culture 3D qui imitent plus étroitement le microenvironnement cellulaire in vivo, reproduisant des stimuli mécaniques et physiques qui déterminent le comportement cellulaire.
Nous décrivons ici un protocole en deux étapes qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Dans la première étape, les cellules sont incubées avec la molécule déméthylante 5-aza-cytidine (5-aza-CR). Cet agent est capable d’induire une déméthylation globale significative de l’ADN grâce à un effet combiné de l’action 8,10 médiée par la translocation directedix-onze (TET2) et de l’inhibition indirecte des ADN méthyltransférases (DNMT)22,23. Cette étape induit l’élimination des blocs épigénétiques avec une réactivation ultérieure de l’expression génique liée à la pluripotence et, par conséquent, la génération de cellules à haute plasticité 1,2,3,8,10, ci-après dénommées « cellules épigénétiquement effacées ». Dans la deuxième étape, les cellules sont encapsulées dans un système de culture 3D. À cette fin, le composé synthétique hydrophobe non réactif polytétrafluoroéthylène (PTFE; avec une taille de particule de 1 μm) est utilisé comme micro-bioréacteur, ce qui permet la création d’un microenvironnement cellulaire irréalisable grâce à l’utilisation de systèmes de culture 2D traditionnels10. Les particules de poudre de PTFE adhèrent à la surface de la goutte de liquide dans laquelle les cellules sont remises en suspension et isolent le noyau liquide de la surface de support, tout en permettant l’échange de gaz entre le liquide intérieur et l’environnement environnant24. Le « micro-bioréacteur PTFE » ainsi obtenu, également connu sous le nom de « marbre liquide », encourage les cellules à interagir librement les unes avec les autres, favorisant le réarrangement cellulaire 3D 25,26,27, et étend et maintient de manière stable l’état de plasticité élevé acquis grâce à des indices liés à la biomécanosension10.
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Protocol
Toutes les études ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Milan. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publié par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis. L’isolement des cellules humaines d’individus adultes en bonne santé a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Toutes les méthodes de notre étude ont été réalisées conformément aux directives approuvées.
1. Isolement des fibroblastes cutanés
REMARQUE: Toutes les procédures décrites ci-dessous peuvent être appliquées à des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, y compris la souris, le porc et l’homme. Des cellules murines ont été isolées sur des souris mâles âgées de 7 semaines et des tissus cutanés porcins ont été prélevés à l’abattoir local. Des cellules humaines ont été isolées de patients adultes, après consentement éclairé écrit.
- Préparer une solution de gélatine porcine à 0,1%.
- Peser 0,1 g de gélatine porcine et la dissoudre dans 100 mL d’eau. Stériliser la solution de gélatine par autoclavage avant utilisation.
- Enduire la boîte de Petri de 35 mm de gélatine porcine à 0,1% en ajoutant 1,5 mL de la solution préparée. Incuber pendant 2 h à température ambiante.
- Coupez des biopsies cutanées de mammifères (souris, porcins et humains) d’environ 2 à 5 cm de long et placez-les dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco contenant 2% de solution antibiotique antimycotique. Conserver à + 4 °C jusqu’à utilisation.
NOTE: Les prélèvements de biopsie doivent être effectués en accord et après approbation du comité d’éthique, conformément aux lignes directrices établies. - Lavez abondamment les biopsies prélevées trois fois dans du PBS stérile frais contenant 2% de solution antibiotique antimycotique.
- Prélever les biopsies du dernier lavage et les placer dans une boîte de Petri stérile de 100 mm. Utilisez un scalpel stérile pour les couper en morceaux d’environ 2 mm3 .
- À la fin de 2 h d’incubation, retirer l’excès de solution de gélatine de la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.1.2) et, à l’aide d’une pince chirurgicale stérile, placer immédiatement 5 à 6 fragments de peau dans chaque boîte de culture pré-enduite.
- Mouiller les fragments en ajoutant 100 μL de gouttelettes de milieu isolant de fibroblastes (tableau 1) sur chacun d’eux. Culture à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 %.
REMARQUE: Pour empêcher l’évaporation du milieu, placez la boîte de Petri de 35 mm dans une boîte de Petri de 100 mm ou plus contenant de l’eau stérile. Assurez-vous de boucher les deux boîtes de Pétri. - Après 24 h de culture, vérifiez la quantité du milieu dans la boîte de Petri de culture de 35 mm. Si nécessaire, ajoutez 500 μL de milieu d’isolement des fibroblastes pour garder les fragments humides.
- Retirez soigneusement le milieu et rafraîchissez-le au moins tous les 2 jours de culture à l’aide d’une pipette.
- Lorsque les fibroblastes commencent à se développer à partir des fragments de peau placés dans la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.5.) et commencent à former une monocouche cellulaire (généralement 6 jours). Enlever les morceaux de peau à l’aide d’une pince chirurgicale stérile et les cultiver dans 2 mL de milieu isolant fibroblastique.
- Continuer à cultiver la monocouche cellulaire à 37 °C dans un incubateur à 5 % deCO2 jusqu’à 80 % de confluence et rafraîchir le milieu tous les deux jours.
2. Culture de lignées cellulaires primaires de fibroblastes
- Lorsque les fibroblastes atteignent 80% de confluence, retirez soigneusement le milieu d’isolement des fibroblastes et lavez les cellules trois fois avec 3 mL de PBS contenant 1% de solution antibiotique antimycotique.
- Pour le détachement cellulaire, ajouter 600 μL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la boîte de culture et incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min.
- Ajouter 5,4 mL de milieu de culture de fibroblastes pour neutraliser la trypsine lorsque les cellules commencent à se détacher de la boîte de culture (tableau 1).
- Déloger les cellules par pipetage répété et doux. Cellules de plaque dans de nouveaux plats de culture (sans gélatine), en maintenant le rapport de passage entre 1:2 et 1:4 (selon le taux de croissance).
REMARQUE: La centrifugation n’est pas nécessaire. - Maintenir les cellules en culture et changer de milieu tous les 2 jours, jusqu’à ce qu’elles aient atteint 80% de confluence et les passent.
REMARQUE: Propager les fibroblastes deux fois par semaine pour maintenir une croissance vigoureuse.
3. Exposition aux fibroblastes au 5-aza-CR
- Préparer une solution mère fraîche de 1 mM 5-aza-CR.
- Peser 2,44 mg de 5-aza-CR et le dissoudre dans 10 mL de glucose élevé DMEM. Resuspendez la poudre par vortex. Stériliser la solution avec un filtre de 0,22 μm.
REMARQUE: La solution mère de 5-aza-CR doit être préparée immédiatement avant utilisation. - Préparer la solution de travail 5-aza-CR en diluant 1 μL de solution mère 5-aza-CR (3.1.1.) dans 1 mL de milieu de culture de fibroblastes.
REMARQUE: La concentration de la solution de travail 5-aza-CR est de 1 μM 1,2,3,8,9.
- Peser 2,44 mg de 5-aza-CR et le dissoudre dans 10 mL de glucose élevé DMEM. Resuspendez la poudre par vortex. Stériliser la solution avec un filtre de 0,22 μm.
- Trypsiniser les cellules comme décrit précédemment (2.1.-2.3.) et déloger les cellules en les piquant de manière répétée et douce.
- Recueillir la suspension cellulaire et la transférer dans un tube conique.
- Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage sous un microscope optique à température ambiante. Calculer le volume de milieu nécessaire pour remettre en suspension les cellules afin d’obtenir 4 x 104 cellules dans 30 μL de milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.).
REMARQUE: La formule à utiliser dépend du type spécifique de chambre.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 150 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec le milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.). Pour le volume du milieu de culture de fibroblastes à utiliser, voir l’étape 3.4.
REMARQUE: Comme témoin négatif, remettre en suspension les cellules à la même concentration dans un milieu de culture de fibroblastes sans 5-aza-CR et procéder à l’encapsulation cellulaire dans de la poudre de PTFE (étape 4.1.-4.13.).
4. Encapsulation des fibroblastes dans des micro-bioréacteurs en PTFE
- Remplir une boîte de Petri de 35 mm avec de la poudre de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour produire un lit (Figure 1A).
REMARQUE: Utilisez des boîtes de Petri bactériologiques de 35 mm pour éviter l’adhérence du marbre liquide. Afin d’obtenir une fine coquille hydrophobe et poreuse, utilisez une poudre de PTFE d’une taille moyenne de particules de 1 μm et produite avec un broyage maximal de 2,0 NPIRI. Cela permet la création de billes liquides perméables au gaz. En outre, le revêtement translucide facilite l’observation des processus d’agrégation cellulaire en temps réel Une plus grande taille des particules conduit à une polydispersité élevée qui peut provoquer une évaporation élevée, une déformation et une perte de la forme sphérique, ainsi que la dissolution prématurée des micro-bioréacteurs. - Distribuer 30 μL de gouttelette simple contenant 4 x 104 cellules (voir étapes 3.4.- 3.5.) sur le lit de poudre (Figure 1B).
- Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour vous assurer que la poudre PFTE recouvre entièrement la surface de la goutte liquide pour former un micro-bioréacteur en marbre liquide (Figure 1C).
- Récupérez le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupée sur le bord, pour s’adapter au diamètre du marbre (Figure 1D,E). Plaquer le micro-bioréacteur en marbre liquide sur une boîte de Petri bactériologique propre pour le stabiliser (Figure 1F).
REMARQUE: Pour créer un frottement pour saisir le marbre à l’intérieur de la pointe, coupez les embouts de la pipette d’un diamètre environ légèrement inférieur au diamètre du marbre liquide. - Transférer le micro-bioréacteur en marbre liquide de la boîte de Petri dans une plaque de 96 puits (une bille/puits) (Figure 1G).
- Ajouter lentement 100 μL de milieu à partir de la marge du puits. Le micro-bioréacteur commence à flotter sur le support (Figure 1H).
REMARQUE: Le micro-bioréacteur se brise en contact direct avec le liquide, en raison de la perturbation de l’hydrophobicité du PTFE. Comme approche alternative, les micro-bioréacteurs en marbre liquide peuvent être placés individuellement dans une boîte de culture bactériologique de 35 mm. Dans ce cas, afin d’éviter l’évaporation du marbre liquide, la boîte de Petri de 35 mm contenant le micro-bioréacteur doit être insérée dans une boîte de Petri de 100 mm, préalablement alicitée avec de l’eau stérile - Incuber un micro-bioréacteur en marbre liquide pendant 18 h à 37 °C dans un incubateurà CO 2 à 5 % 1,2,3,8,9.
REMARQUE: La taille des particules de PTFE de 1 μm peut assurer un échange gazeux optimal entre le liquide intérieur et l’environnement environnant. - Après une incubation de 5-aza-CR pendant 18 h, prélever le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL coupée sur le bord (voir étape 4.5).
- Placez le micro-bioréacteur dans une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm (Figure 1D-F).
- Utilisez une aiguille pour percer le marbre liquide et le casser.
- Récupérer les sphéroïdes formés à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupés au bord, sous un stéréomicroscope (Figure 1I,J).
REMARQUE: Les cellules épigénétiquement effacées encapsulées dans du PTFE forment une structure sphérique 3D (un agrégat dans chaque marbre liquide). - Pour évaluer l’acquisition de l’état pluripotent en réponse au 5-aza-CR, vérifiez l’apparition de l’expression génique liée à la pluripotence, OCT4, NANOG, REX1 et SOX2, par PCR qualitative (tableau 2).
- Passez à la deuxième étape du protocole comme décrit ci-dessous.
5. Culture dans des micro-bioréacteurs en PTFE de cellules épigénétiquement effacées
- Préparer un milieu de culture ESC frais (tableau 1).
- Transférer des organoïdes dans une boîte de Petri contenant un milieu ESC pour le lavage des résidus de 5-aza-CR (voir étapes 5.1.-5.2.).
- Préparez une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm contenant du lit de poudre de PTFE (voir aussi l’étape 4.1.).
- Distribuer un seul organoïde dans une gouttelette de milieu de culture ESC de 30 μL sur le lit de poudre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupée au bord (voir étapes 4.9.; 5.3.).
- Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour former un nouveau micro-bioréacteur en marbre liquide, ramassez-la à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupez-la sur le bord et placez le micro-bioréacteur nouvellement formé dans un puits de plaque de 96 puits (un marbre / puits) (voir les étapes 4.3.-4.6.).
- Pour faire flotter les micro-bioréacteurs, ajouter 100 μL de milieu à partir de la marge du puits pour baigner lentement le marbre (voir note 4.7.).
- Cultivez des micro-bioréacteurs en marbre liquide à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 % aussi longtemps que nécessaire. Changez de support tous les deux jours, en suivant la procédure décrite aux points 5.3.-5.7.
NOTE: Dans le présent manuscrit, les résultats obtenus avec la culture d’organoïdes pendant 28 jours sont fournis. Cependant, si nécessaire, une période de culture plus longue peut être effectuée.
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Representative Results
Le présent protocole décrit toutes les étapes à effectuer pour générer et maintenir de manière stable les cellules pluripotentes de mammifères à partir de cellules somatiques adultes. Cette méthode a été couronnée de succès avec des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, à savoir la souris, le porc et l’homme. Les résultats représentatifs rapportés ici sont obtenus à partir de toutes les lignées cellulaires, indépendamment de l’espèce d’origine.
Les analyses morphologiques montrent qu’après 18 h d’incubation avec l’agent déméthylant 5-aza-CR, les fibroblastes encapsulés dans des micro-bioréacteurs en PTFE (3D Post 5-aza-CR) s’agrègent et forment des structures sphériques 3D présentant une géométrie de taille uniforme, chez les trois espèces considérées. (Figure 2A-C, 3D Post 5-aza-CR). 86,31 ± 4,13% des cellules encapsulées ont remarquablement modifié leur phénotype, montrant des caractéristiques généralement liées à un phénotype8 à haute plasticité. En revanche, les cellules post-5-aza-CR cultivées dans des conditions standard 2D, bien qu’elles aient remplacé la forme allongée typique des fibroblastes par une forme ronde ou ovale, étaient considérablement plus petites avec des noyaux plus gros et granulés, conservent une distribution monocouche (Figure 2). Les changements morphologiques ont été accompagnés par l’apparition de l’expression génique liée à la pluripotence à la fois dans les cellules 3D et 2D Post 5-aza-CR. La transcription de l’homéobox 1 (OCT4) de classe POU 5, de l’homéobox Nanog (NANOG), de la protéine du doigt de zinc ZFP42 (REX1) et de la région déterminante du sexe Y-box 2 (SOX2) a également été observée, qui est absente dans les fibroblastes non traités (T0), a été détectée (Figure 3, Figure 4, Figure 5). En outre, l’analyse PCR quantitative a démontré une régulation à la hausse significative des gènes mentionnés ci-dessus, ainsi que des dix-onze translocation-2 (TET2), de la molécule d’adhésion des cellules épithéliales (EPCAM) et des gènes de la cadhérine 1 (CDH1) dans les cellules 3D Post 5-aza-CR (Figure 3, Figure 4, Figure 5, barres bleues) par rapport aux cellules cultivées dans des boîtes en plastique standard 2D (2D Post 5-aza-CR) (Figure 3, Figure 4, Figure 5, barres orange). En parallèle, une régulation négative significative du marqueur spécifique des fibroblastes Thy-1 (THY1) était clairement détectable dans les cellules 3D et 2D Post 5-aza-CR (Figure 3, Figure 4, Figure 5).
L’atteinte d’un état de plasticité élevé a également été confirmée par l’analyse ELISA de la méthylation globale de l’ADN, qui démontre une diminution significative des niveaux de méthylation dans les cellules 3D et 2D Post 5-aza-CR (Figure 6A-C). De plus, en accord avec les résultats de l’expression génique, les niveaux de méthylation de l’ADN étaient significativement plus faibles dans les cellules 3D Post 5-aza-CR (Figure 6A-C, barres bleues), par rapport à celles 2D Post 5-aza-CR (Figure 6A-C, barres orange).
Plus intéressant encore, les cellules 3D Post 5-aza-CR conservent la structure sphérique 3D acquise (Figure 2A, 3D 28d) et maintiennent des niveaux d’expression élevés de gènes liés à la pluripotence (Figure 3, Figure 4 et Figure 5 barres bleues) ainsi que de faibles niveaux de méthylation de l’ADN (Figure 6A-C, barres bleues), pendant toute la période de culture suivante et, en particulier, jusqu’à 28 jours, quand la culture a été arrêtée. En revanche, bien que les cellules 2D Post 5-aza-CR transcrivent les mêmes gènes de pluripotence après traitement avec l’agent déméthylant, elles ont refusé cette expression au jour 7 (Figure 3, Figure 4, Figure 5, nd). De même, la diminution des niveaux de méthylation a été maintenue pendant les 72 premières heures; puis la méthylation a lentement augmenté, revenant comparable aux fibroblastes non traités (Figure 6A-C, T0, barres blanches) au jour 7 de la culture (Figure 6A-C, barres orange).
Figure 1 : Encapsulation cellulaire dans un microbioréacteur en PTFE et récupération organoïde. (A) Une boîte de Petri bactériologique a été remplie de PTFE pour préparer un lit de poudre. (B) Une seule gouttelette de milieu contenant des cellules a été distribuée sur le lit de PTFE. (C) La boîte de Petri a été doucement tournée avec des mouvements circulaires pour recouvrir la gouttelette et produire le micro-bioréacteur. (D) Une pointe de pipette de 1000 μL a été coupée à l’extrémité (flèche rouge) et (E) utilisée pour recueillir le micro-bioréacteur. (F) Le marbre liquide a été transféré dans une boîte de Petri propre pour le stabiliser, (G) placé dans une plaque de 96 puits (un marbre / puits) et (H) a flotté sur le support. (I) Pour collecter les organoïdes nouvellement formés, le micro-bioréacteur a été perforé avec une aiguille et (J) les agrégats cellulaires obtenus ont été récupérés sous un stéréomicroscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les cellules effacées épigénétiquement de mammifères encapsulées dans des micro-bioréacteurs en PTFE forment des structures sphériques 3D. Les cellules murines (A), porcines (B) et humaines (C) encapsulées dans du PTFE et traitées avec du 5-aza-CR forment des structures sphériques 3D (3D Post 5-aza-CR), qui ont été maintenues de manière stable pendant toute la période de culture suivante (3D 28d; Barre d’échelle, 100 μm). En revanche, les cellules murines (A), porcines (B) et humaines (C) plaquées sur des plats en plastique et traitées avec du 5-aza-CR ont remplacé la forme allongée typique des fibroblastes (T0) en un phénotype épithélioïde rond et ont conservé une distribution monocouche (2D Post 5-aza-CR). Au jour 7 de la culture, les cellules 2D sont revenues à leur forme allongée d’origine qui a été maintenue de manière stable pour la période de culture suivante (2D 28 d; Barre d’échelle, 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les cellules murines épigénétiquement effacées encapsulées dans des micro-bioréacteurs en PTFE montrent un niveau élevé et un maintien à long terme de l’expression génique liée à la pluripotence. Niveaux de transcription pour les gènes Oct4, Nanog, Rex1, Sox2, Tet2, Epcam, Cdh1 et Thy1 dans les fibroblastes murins non traités (T0, barres blanches), les fibroblastes exposés au 5-aza-CR (Post 5-aza-CR), et à différents moments de culture pour les cellules cultivées en PTFE (barres bleues) et en plastique standard (barres oranges). Les valeurs d’expression génique sont rapportées avec l’expression la plus élevée définie sur 1 et toutes les autres par rapport à cela. Différents exposants indiquent des différences significatives (P < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les cellules épigénétiquement effacées porcines encapsulées dans des micro-bioréacteurs en PTFE montrent un niveau élevé et un maintien à long terme de l’expression génique liée à la pluripotence. Niveaux de transcription des gènes OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 et THY1 dans les fibroblastes porcins non traités (T0, barres blanches), les fibroblastes exposés au 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) et à différents moments de culture pour les cellules cultivées en PTFE (barres bleues) et à plat en plastique standard (barres orange). Les valeurs d’expression génique sont rapportées avec l’expression la plus élevée définie sur 1 et toutes les autres par rapport à cela. Différents exposants indiquent des différences significatives (P < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les cellules humaines épigénétiquement effacées encapsulées dans des micro-bioréacteurs en PTFE montrent un niveau élevé et un maintien à long terme de l’expression génique liée à la pluripotence. Niveaux de transcription des gènes OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 et THY1 chez les fibroblastes humains non traités (T0, barres blanches), les fibroblastes exposés au 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) et à différents moments de culture pour les cellules cultivées en PTFE (barres bleues) et à plat en plastique standard (barres orange). Les valeurs d’expression génique sont rapportées avec l’expression la plus élevée définie sur 1 et toutes les autres par rapport à cela. Différents exposants indiquent des différences significatives (P < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Le micro-bioréacteur en PTFE améliore l’effet de déméthylation du 5-aza-CR et maintient l’hypométhylation à long terme de l’ADN dans les fibroblastes effacés épigénétiquement des mammifères. Niveaux globaux de méthylation de l’ADN des cellules murines (A), porcines (B) et humaines (C) encapsulées dans des micro-bioréacteurs en PTFE (barres bleues) ou plaquées sur du plastique standard (barres orange) exposées au 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) et cultivées dans un milieu ESC pendant 28 jours. Fibroblastes non traités (T0; barres blanches). Les résultats représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes avec cinq répliques biologiques indépendantes. Différents exposants indiquent des différences significatives (P < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Milieu d’isolement des fibroblastes (100 mL) | |
| DMEM, glucose élevé, pyruvate | 77 mL |
| Sérum bovin fœtal, qualifié, inactivé à la chaleur | 20 mL |
| Solution de L-Glutamine | 1 mL |
| Solution antibiotique antimycotique (100×) | 2 mL |
| Milieu de culture de fibroblastes (100 mL) | |
| DMEM, glucose élevé, pyruvate | 88 mL |
| Sérum bovin fœtal, qualifié, inactivé à la chaleur | 10 mL |
| Solution de L-Glutamine | 1 mL |
| Solution antibiotique antimycotique (100×) | 1 mL |
| Milieu de culture ESC (10 mL) | |
| Mélange de nutriments F-10 de jambon | 3,99 mL |
| DMEM, faible teneur en glucose, pyruvate | 3,99 mL |
| Remplacement du sérum KnockOut | 1 mL |
| Sérum bovin fœtal, qualifié, inactivé à la chaleur | 500 μL |
| Solution antibiotique antimycotique (100×) | 100 μL |
| Solution de L-Glutamine | 100 μL |
| Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100X) | 100 μL |
| 2-Mercaptoéthanol (10 mM) | 100 μL (0,1 mM) |
| Mélange nucléosidique (0,3 M de guanosine, 0,3 M d’adénosine, 0,3 M de cytidine, 0,3 M d’uridine et 0,1 m de timidine) | 100 μL (3 mM de guanosine, 3 mM d’adénosine, 3 mM de cytidine, 3 mM d’uridine et 1 mM de timidine) |
| Protéine LIF de souris recombinante ESGRO (1000 unités/mL) | 10 μL (1 unité/mL) |
| FGF humain recombinant basique (bFGF) (5 μg/mL) | 10 μL (5 ng/mL) |
Tableau 1 : Composition du milieu d’isolement des fibroblastes, du milieu de culture des fibroblastes et du milieu de culture ESC.
| Cible | Ensembles d’amorces PCR | Espèce | |
| Cdh1 | Attaquant : GAGGAACCCACAGCCTCATA | Souris | |
| Inverse : GTTGACCGTCCCTTCACAGT | Souris | ||
| Epcam | Attaquant : TGGCAACAAGTTGCTCTCTG | Souris | |
| Inverse : CTTGTCGGTTCTTCGGACTC | Souris | ||
| Nanog | En avant: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC | Souris | |
| Inverse : CCAGGAAGACCCACACTCAT | Souris | ||
| 4 octobre | Attaquant : ACACCTGGCTTCAGACTTCG | Souris | |
| Inverse : AGTTGCTTTCCACTCGTGCT | Souris | ||
| Rex1 | Attaquant : CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC | Souris | |
| Inverse : GACAAGCATGTGCTTCCTCA | Souris | ||
| Sox2 | Attaquant : AGAACCCCAAGATGCACAAC | Souris | |
| Inverse : CTCCGGGAAGCGTGTACTTA | Souris | ||
| Tet2 | Attaquant : GCACAGGGAGCAAGAGATTC | Souris | |
| Inverse : ATGTTGACATTGCCAGTGGA | Souris | ||
| Thy1 | Attaquant : AACTCTTGGCACCATGAACC | Souris | |
| Inverse : GCACGTGCTTCCTCTTCTCT | Souris | ||
| CDH1 | Attaquant : GAATGACAATGGCCCCATAC | Porcin | |
| Inverse : AGGTGGTCACCTGGTCTTTG | Porcin | ||
| L’EPCAM | Attaquant : GCTTGGTCAGTGCCAGTGTA | Porcin | |
| Inverse : CTTCTGACCCCAGCAGTGTT | Porcin | ||
| NANOG | Attaquant : ATCCAGCTTGTCCCCAAAG | Porcin | |
| Inverse : ATTTCATTCGCTGGTTCTGG | Porcin | ||
| PTOM4 | Attaquant : GTTCAGCCAAACGACCATCT | Porcin | |
| Inverse : CTCCAGGTTGCCTCTCACTC | Porcin | ||
| REX1 | Attaquant : CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC | Porcin | |
| Inverse : TGTCCCCAATCAAAAATGCT | Porcin | ||
| SOX2 | Attaquant : GCCCTGCAGTACAACTCCAT | Porcin | |
| Inverse : GCTGATCATGTCCCGTAGGT | Porcin | ||
| TET2 | Attaquant : CAGAAAACAATGCAGCCAGA | Porcin | |
| Inverse : GAATGGCTCGGTCTCTGAAG | Porcin | ||
| THY1 | Attaquant : GGCATCGCTCTCTTGCTAAC | Porcin | |
| Inverse : GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG | Porcin | ||
| CDH1 | Attaquant : TGCCCAGAAAATGAAAAAGG | Humain | |
| Inverse : GTGTATGTGGCAATGCGTTC | Humain | ||
| L’EPCAM | En avant: GCTGGTGTGTGAACACTGCT | Humain | |
| Inverse : ACGCGTTGTGATCTCCTTCT | Humain | ||
| NANOG | Attaquant : AGAAAAACAACTGGCCGAAG | Humain | |
| Inverse : TGCTCCAGGACTGGATGTTC | Humain | ||
| PTOM4 | Attaquant : AATTTGCCAAGCTCCTGAAG | Humain | |
| Inverse : GTTGCCTCTCACTCGGTTCT | Humain | ||
| REX1 | En avant: ACGTTTCGTGTGTCCCTTTC | Humain | |
| Inverse : TATAACCGCTTTTGGGGTTG | Humain | ||
| SOX2 | Attaquant : ACACCAATCCCATCCACACT | Humain | |
| Inverse : GCAAACTTCCTGCAAAGCTC | Humain | ||
| TET2 | Attaquant : CCCACTTACCTGCGTTTCAT | Humain | |
| Inverse : ACTGTGACCTTTCCCCACTG | Humain | ||
| THY1 | Attaquant : AGATCCCAGAACCATGAACC | Humain | |
| Inverse : GCACGTGCTTCTTTGTCTCA | Humain | ||
| Cible | Numéro de catalogue des essais TaqMan | Espèce | |
| Actb | Mm02619580_g1 | Souris | |
| Cdh1 | Mm01247357_m1 | Souris | |
| Epcam | Mm00493214_m1 | Souris | |
| Gapdh | Mm99999915_g1 | Souris | |
| Nanog | Mm02019550_s1 | Souris | |
| 4 octobre | Mm03053917_g1 | Souris | |
| Rex1 | Mm03053975_g1 | Souris | |
| Sox2 | Mm03053810_s1 | Souris | |
| Tet2 | Mm00524395_m1 | Souris | |
| Thy1 | Mm00493681_m1 | Souris | |
| L' | Ss03376563_uH | Porcin | |
| CDH1 | Ss06942341_m1 | Porcin | |
| L’EPCAM | Ss03384752_u1 | Porcin | |
| GAPDH | Ss03375629_u1 | Porcin | |
| NANOG | Ss04245375_s1 | Porcin | |
| PTOM4 | Ss03389800_m1 | Porcin | |
| REX1 | Ss03373622_g1 | Porcin | |
| SOX2 | Ss03388002_u1 | Porcin | |
| TET2 | Ss06880359_m1 | Porcin | |
| THY1 | Ss03376963_u1 | Porcin | |
| L' | Hs01060665_g1 | Humain | |
| CDH1 | Hs01023895_m1 | Humain | |
| L’EPCAM | Hs00901885_m1 | Humain | |
| GAPDH | Hs02786624_g1 | Humain | |
| NANOG | Hs02387400_g1 | Humain | |
| PTOM4 | Hs00999632_g1 | Humain | |
| REX1 | Hs00399279_m1 | Humain | |
| SOX2 | Hs01053049_s1 | Humain | |
| TET2 | Hs00325999_m1 | Humain | |
| THY1 | Hs00174816_m1 | Humain | |
Tableau 2 : Informations d’introduction.
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Discussion
Au cours des dernières décennies, plusieurs études se sont concentrées sur le développement de stratégies pour ramener une cellule différenciée en phase terminale vers un état permissif moins engagé et plus élevé. Le protocole décrit ici permet la génération et le maintien à long terme de cellules pluripotentes à partir de cellules matures matures différenciées en phase terminale. La méthode combine deux étapes indépendantes qui impliquent l’induction d’un état permissif élevé qui est obtenu par effacement épigénétique chimique et sa maintenance ultérieure assurée à l’aide d’un système de culture 3D.
La formation de structures sphéroïdes 3D observée dans les cellules encapsulées en PTFE (Figure 2) est cohérente avec d’autres études démontrant la capacité du PTFE à encourager efficacement l’agrégation cellulaire, facilitant l’établissement de structures sphéroïdes de cellules d’ensachage olfactif (OEC)25 ou la formation d’agrégats toroïdaux 3D26. Ces changements morphologiques sont mis en parallèle avec l’apparition de l’expression génique liée à la pluripotence (Figure 3, Figure 4, Figure 5) qui montre des niveaux significativement plus élevés dans les cellules 3D Post 5-aza-CR, par rapport aux cellules 2D Post 5-aza-CR (Figure 3, Figure 4, Figure 5). De manière constante, les cellules 3D Post 5-aza-CR présentent une hypométhylation de l’ADN plus élevée que les cellules 2D Post 5-aza-CR (Figure 6). Dans l’ensemble, ces résultats indiquent la capacité du 5-aza-CR à induire un état de plasticité élevé, quel que soit le système de culture cellulaire utilisé. Cependant, l’état de pluripotence induit chimiquement atteint par les cellules est significativement favorisé à l’aide d’un micro-bioréacteur en PTFE qui stimule la transcription des gènes de pluripotence et augmente les effets de déméthylation du 5-aza-CR. Plus intéressant encore, seules les cellules 3D Post 5-aza-CR conservent de manière stable la structure sphérique 3D acquise (Figure 2) et maintiennent des niveaux d’expression élevés de gènes liés à la pluripotence (Figure 3, Figure 4, Figure 5) ainsi que de faibles niveaux de méthylation de l’ADN (Figure 6), pendant toute la période de culture suivante. Dans l’ensemble, les résultats représentatifs présentés ici démontrent que cette stratégie en deux étapes est très efficace et robuste, et l’utilisation d’un micro-bioréacteur en PTFE non seulement augmente la plasticité élevée, mais permet également son maintien stable et à long terme chez les espèces de mammifères considérées. Nous avons récemment démontré que ces effets bénéfiques sont liés à l’activation de la voie de signalisation Hippo et de ses indices liés à la mécanotransduction10, dont il a déjà été démontré qu’ils jouent un rôle clé dans la régulation active de la pluripotence cellulaire 28,29,30.
Les deux étapes les plus critiques pour une procédure réussie sont l’entretien rigoureux des cellules à 37 ° C, à tout moment, y compris leur manipulation sous le flux laminaire stérile et au microscope et l’utilisation d’un nombre de cellules / débit de volume liquide correct lors de la production de micro-bioréacteurs, qui peut varier en fonction du type de cellule spécifique utilisé. D’après notre expérience, il est également fortement recommandé de préparer les réactifs fraîchement, avant leur utilisation en culture (ce qui est absolument crucial pour la solution mère 5-aza-CR). De plus, le rafraîchissement du milieu doit être effectué sous stéréomicroscope car les organoïdes sphériques 3D peuvent être perdus lors de changements de milieu.
Les principaux points forts de cette méthode sont l’absence d’exigence de vecteur transgénique et/ou viral; la robustesse et la reproductibilité chez différentes espèces de mammifères; faibles coûts; et une grande flexibilité pour différents types de cellules. D’autre part, une limitation possible pourrait être représentée par le nombre restreint de données obtenues, en raison des faibles volumes des micro-bioréacteurs. En outre, l’utilisation d’une densité cellulaire élevée peut entraîner de faibles taux de transfert d’oxygène et une croissance limitée en suspension. Pour surmonter ces problèmes, il reste nécessaire de poursuivre les travaux sur les stratégies de mise à l’échelle et/ou de réduction d’échelle.
Il est important de souligner que les aspects clés communs à toutes les applications 3D à base de sphéroïdes sont la reproductibilité, l’efficacité de la production, l’uniformité de la taille organoïde et l’influence sur la physiologie cellulaire. Ces caractéristiques sont strictement corrélées aux forces mécaniques générées au sein du système de culture et varient selon les différentes méthodes utilisées. Par exemple, les organoïdes multicellulaires peuvent être cultivés à l’aide de plats non adhérents dans des systèmes stationnaires. Cette approche est principalement basée sur des conditions de diffusion limitées et, généralement, aboutit à la formation de grappes d’agrégats lâches. La technique de suspension-chute montre la même limitation. En effet, le dépôt de gouttes de suspension cellulaire sur la face inférieure du couvercle d’une boîte de culture tissulaire conduit à la création d’un environnement de microgravité qui concentre les cellules à l’interface liquide-air libre, induisant la génération de sphères multicellulaires à faible agrégat. Une alternative possible est représentée par la technique de la fiole de spinner. Cependant, cette méthode est très coûteuse car elle nécessite des quantités élevées de milieu de culture. En outre, les organoïdes formés doivent être transférés dans un système de culture stationnaire lorsqu’ils sont utilisés pour la caractérisation ou d’autres tests in vitro. Tous ces problèmes peuvent être surmontés en utilisant des micro-bioréacteurs en marbre liquide. En effet, ils fournissent une surface liquide non adhérente qui combine les avantages des méthodes stationnaires et filantes, induisant une agrégation cellulaire rapide et la génération de sphéroïdes compacts. En parallèle, le fond concave, la forme sphérique et le flux de liquide interne de chaque marbre permettent aux cellules de se déposer sur le fond du micro-bioréacteur, ce qui entraîne la formation d’organoïdes de taille et de forme uniformes. Un autre avantage significatif dans l’utilisation des billes liquides est représenté par les échanges gazeux optimaux qui, grâce à leur forme sphérique, peuvent se produire sur toute la surface.
En conclusion, le protocole décrit ici permet une génération efficace et simple de cellules pluripotentes de mammifères. Étant donné que cette stratégie est exempte de vecteurs viraux et n’implique l’utilisation d’aucune transfection de gènes, elle est très prometteuse pour les applications de médecine translationnelle et peut être considérée comme un pas en avant dans la thérapie cellulaire spécifique au patient. En outre, l’utilisation de systèmes de culture de micro-bioréacteurs 3D peut représenter une percée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches et peut constituer un micro-environnement avantageux pour la culture à long terme de différents types de cellules, tels que les CSE, les CSPi et les CSM. Un avantage supplémentaire est représenté par le petit volume qui permet d’étudier l’effet de la signalisation paracrine/autocrine de l’environnement riche établi au sein du micro-bioréacteur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tous les auteurs sont membres de l’action COST CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
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