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Biology

एक दो कदम की रणनीति है कि Epigenetic संशोधन और Biomechanical Cues को जोड़ती है स्तनधारी Pluripotent कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए

Published: August 29, 2020 doi: 10.3791/61655
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

Summary

हम यहां एक ऐसी विधि प्रस्तुत करते हैं जो जीन अभिकर्मक या रेट्रोवायरल वैक्टर की आवश्यकता के बिना स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए मेचानोसेंसिंग-संबंधित संकेतों के साथ रासायनिक एपिजेनेटिक मिटाने के उपयोग को जोड़ती है। इसलिए, यह रणनीति ट्रांसलेशनल दवा के लिए आशाजनक है और स्टेम सेल ऑर्गेनोइड तकनीक में एक उल्लेखनीय प्रगति का प्रतिनिधित्व करती है।

Abstract

सेल फेनोटाइप को विभिन्न तरीकों से उलटा या संशोधित किया जा सकता है, जिसमें लाभ और सीमाएं हैं जो प्रत्येक तकनीक के लिए विशिष्ट हैं। यहां हम एक नई रणनीति का वर्णन करते हैं जो स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए मेकेनोसेंसिंग से संबंधित संकेतों के साथ रासायनिक एपिजेनेटिक मिटाने के उपयोग को जोड़ती है। दो मुख्य चरणों की आवश्यकता होती है। पहले चरण में, वयस्क परिपक्व (टर्मिनल रूप से विभेदित) कोशिकाओं को एपिजेनेटिक इरेज़र 5-अजा-साइटिडीन के संपर्क में लाया जाता है ताकि उन्हें प्लुरिपोटेंट राज्य में चलाया जा सके। प्रोटोकॉल का यह हिस्सा विकसित किया गया था, जो सेल भाग्य और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले एपिजेनेटिक तंत्र की बढ़ती समझ के आधार पर विकसित किया गया था, और इसमें सेल विभेदित राज्य को मिटाने के लिए एपिजेनेटिक संशोधक का उपयोग शामिल है और फिर एक क्षणिक उच्च प्लास्टिसिटी विंडो में ड्राइव करना शामिल है।

दूसरे चरण में, मिटाए गए कोशिकाओं को पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) माइक्रो-बायोरिएक्टर में समझाया जाता है, जिसे लिक्विड मार्बल्स के रूप में भी जाना जाता है, ताकि अधिग्रहित उच्च प्लास्टिसिटी को विस्तारित करने और स्थिर रूप से बनाए रखने के लिए 3 डी सेल पुनर्व्यवस्था को बढ़ावा दिया जा सके। पीटीएफई एक गैर-प्रतिक्रियाशील हाइड्रोफोबिक सिंथेटिक यौगिक है और इसका उपयोग सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के निर्माण की अनुमति देता है, जिसे पारंपरिक 2 डी संस्कृति प्रणालियों में प्राप्त नहीं किया जा सकता है। यह प्रणाली प्रोत्साहित करती है और जैव-mechanosensing से संबंधित संकेतों के बावजूद pluripotency के रखरखाव को बढ़ावा देती है।

यहां वर्णित तकनीकी प्रक्रियाएं वयस्क दैहिक कोशिकाओं में एक उच्च प्लास्टिसिटी राज्य के प्रेरण और रखरखाव के लिए अनुमति देने के लिए सरल रणनीतियां हैं। प्रोटोकॉल ने परीक्षण किए गए सभी स्तनधारी प्रजातियों में उच्च प्लास्टिसिटी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति की अनुमति दी। चूंकि इसमें जीन अभिकर्मक का उपयोग शामिल नहीं है और वायरल वैक्टर से मुक्त है, इसलिए यह ट्रांसलेशनल दवा अनुप्रयोगों के लिए एक उल्लेखनीय तकनीकी प्रगति का प्रतिनिधित्व कर सकता है। इसके अलावा, माइक्रो-बायोरिएक्टर सिस्टम इन विट्रो द्वारा स्टेम सेल ऑर्गेनोइड तकनीक में एक उल्लेखनीय प्रगति प्रदान करता है जो एक विशिष्ट सूक्ष्म-पर्यावरण को फिर से बनाता है जो उच्च प्लास्टिसिटी कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति देता है, अर्थात् ईएससी, आईपीएससी, एपिजेनेटिक रूप से मिटाए गए कोशिकाओं और एमएससी के रूप में।

Introduction

पिछले दशकों के दौरान, सेल प्रतिबद्धता और भेदभाव की ओर यूनिडायरेक्शनल प्रगति की व्यापक रूप से स्वीकृत अवधारणा को पूरी तरह से संशोधित किया गया था। यह प्रदर्शित किया गया है कि सेल विनिर्देश को उलटा किया जा सकता है, और एक टर्मिनल रूप से विभेदित सेल को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके कम प्रतिबद्ध और उच्च अनुमेय स्थिति की ओर धकेला जा सकता है।

प्रस्तावित कई तरीकों में से, सबसे आशाजनक विधि में से एक में कोशिकाओं को तथाकथित रासायनिक रूप से प्रेरित प्लूरिफिकेशन में प्रेरित करने के लिए रासायनिक यौगिकों का उपयोग शामिल है। इस दृष्टिकोण में उपयोग किए जाने वाले छोटे अणु एक वयस्क परिपक्व कोशिका के एपिजेनेटिक हस्ताक्षर को बातचीत करने और संशोधित करने में सक्षम हैं, किसी भी ट्रांसजेनिक और / या वायरल वेक्टर 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 की आवश्यकता से बचते हैं। . कई अध्ययनों से हाल ही में पता चला है कि विशिष्ट जैव रासायनिक और जैविक उत्तेजनाओं को प्रदान करके कोशिकाओं को एक फेनोटाइप से दूसरे में स्विच करना संभव है जो हाइपरमेथिलेटेड जीन11,12,13,14,15 के पुनर्सक्रियन को प्रेरित करते हैं। ये demethylating घटनाएं एक आदिम पूर्वज, एक multipotent या एक उच्च plasticity / pluripotent सेल 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 में टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं के रूपांतरण के लिए अनुमति देते हैं।

समानांतर में, कई अध्ययन हाल ही में मेकानोसेंसिंग से संबंधित संकेतों की समझ पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं और, अधिक विशेष रूप से, सेल प्लास्टिसिटी और / या भेदभाव को सीधे प्रभावित करने के लिए यांत्रिक बलों का उपयोग करने की संभावना पर 16,17,18,19। दरअसल, यह स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया है कि बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) सेल भाग्य के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। विशेष रूप से, ईसीएम द्वारा उत्पादित बायोमैकेनिकल और बायोफिजिकल सिग्नल सीधे आणविक तंत्र और सिग्नलिंग मार्गों को विनियमित करते हैं, जो सेल व्यवहार और कार्योंको प्रभावित करते हैं 20,21। इन हालिया आंकड़ों ने उपन्यास 3 डी संस्कृति प्रणालियों के विकास का मार्ग प्रशस्त किया है जो विवो सेल माइक्रोएन्वायरमेंट में अधिक बारीकी से नकल करते हैं, यांत्रिक और शारीरिक उत्तेजनाओं को सेल व्यवहार को चलाने की नकल करते हैं।

हम यहां एक दो-चरणीय प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए मेकानोसेंसिंग से संबंधित संकेतों के साथ रासायनिक एपिजेनेटिक मिटाने के उपयोग को जोड़ता है। पहले चरण में, कोशिकाओं को डिमेथिलेटिंग अणु 5-aza-cytidine (5-aza-CR) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। यह एजेंट प्रत्यक्ष दस-ग्यारह ट्रांसलोकेशन 2 (TET2) के संयुक्त प्रभाव के माध्यम से एक महत्वपूर्ण वैश्विक डीएनए डिमिथाइलेशन को प्रेरित करने में सक्षम है- मध्यस्थता कार्रवाई 8,10 और डीएनए मिथाइलट्रांसफरेज़ (DNMT) 22,23 के अप्रत्यक्ष निषेध। यह कदम एपिजेनेटिक ब्लॉकों को हटाने के लिए प्रेरित करता है, जिसमें बाद में पुन: सक्रियण के साथ प्लूरिबिलिटी से संबंधित जीन अभिव्यक्ति और इसलिए, उच्च प्लास्टिसिटी कोशिकाओं की पीढ़ी 1,2,3,8,10, इसके बाद "एपिजेनेटिक रूप से मिटाई गई कोशिकाओं" के रूप में संदर्भित किया जाता है। दूसरे चरण में, कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति प्रणाली में समझाया जाता है। इस अंत तक, गैर-प्रतिक्रियाशील हाइड्रोफोबिक सिंथेटिक यौगिक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई; 1 μm के कण आकार के साथ) का उपयोग माइक्रो-बायोरिएक्टर के रूप में किया जाता है, जो पारंपरिक 2 डीसंस्कृति प्रणालियों के उपयोग के माध्यम से अप्राप्य सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के निर्माण की अनुमति देता है। पीटीएफई पाउडर कण तरल बूंद की सतह का पालन करते हैं जिसमें कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया जाता है और सहायक सतह से तरल कोर को अलग किया जाता है, जबकि आंतरिक तरल और आसपास के वातावरण के बीच गैस विनिमय की अनुमति देताहै। इस प्रकार प्राप्त "PTFE माइक्रो-बायोरिएक्टर" जिसे "लिक्विड मार्बल" के रूप में भी जाना जाता है, कोशिकाओं को एक-दूसरे के साथ स्वतंत्र रूप से बातचीत करने के लिए प्रोत्साहित करता है, 3 डी सेल पुनर्व्यवस्था को बढ़ावा देता है 25,26,27, और अधिग्रहित उच्च प्लास्टिसिटी राज्य को बढ़ाता है और स्थिर रूप से बनाए रखता है, हालांकि जैव-मेचानोसेंसिंग-संबंधित संकेत10।

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Protocol

सभी अध्ययनों की समीक्षा की गई और मिलान विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया था, जिसे यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) द्वारा प्रकाशित किया गया था। स्वस्थ वयस्क व्यक्तियों से मानव कोशिकाओं के अलगाव को ओस्पेडेल मैगिओर पॉलिक्लिनिको, मिलानो की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। हमारे अध्ययन में सभी तरीकों को अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. त्वचा फाइब्रोब्लास्ट अलगाव

नोट: नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं को माउस, पोर्सिनी और मानव सहित विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों से अलग किए गए फाइब्रोब्लास्ट्स पर लागू किया जा सकता है। मुरीन कोशिकाओं को 7 सप्ताह के नर चूहों से अलग किया गया था और पोर्सिनी त्वचा के ऊतकों को स्थानीय बूचड़खाने में एकत्र किया गया था। मानव कोशिकाओं को वयस्क रोगियों से अलग कर दिया गया था, लिखित सूचित सहमति के बाद।

  1. 0.1% पोर्सिनी जिलेटिन समाधान तैयार करें।
    1. पोर्सिनी जिलेटिन के 0.1 ग्राम वजन और इसे 100 मिलीलीटर पानी में भंग करें। उपयोग करने से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा जिलेटिन समाधान को निष्फल करें।
    2. तैयार समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़कर 0.1% पोर्सिनी जिलेटिन के साथ 35 मिमी पेट्री डिश कोट करें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. स्तनधारी (माउस, पोर्सिनी, और मानव) त्वचा बायोप्सी को लगभग 2-5 सेमी लंबाई में काटें और उन्हें 2% एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान युक्त ड्यूलबेको के फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) में रखें। उपयोग करने तक + 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: बायोप्सी संग्रह समझौते में और नैतिक समिति के अनुमोदन के बाद, स्थापित दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए।
  3. बड़े पैमाने पर 2% एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान युक्त ताजा बाँझ पीबीएस में तीन बार एकत्र बायोप्सी धोएं।
  4. पिछले धोने से बायोप्सी ले लीजिए और उन्हें एक बाँझ 100 मिमी पेट्री पकवान में जगह है। उन्हें लगभग 2 मिमी3 आकार के टुकड़ों में काटने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें।
  5. 2 ज इनक्यूबेशन के अंत में, 35 मिमी पेट्री डिश (चरण 1.1.2 में वर्णित) से जिलेटिन समाधान की अधिकता को हटा दें और, एक बाँझ सर्जिकल चिमटी का उपयोग करके, तुरंत प्रत्येक पूर्व-लेपित संस्कृति पकवान में 5-6 त्वचा के टुकड़े रखें।
  6. उनमें से प्रत्येक पर फाइब्रोब्लास्ट अलगाव माध्यम (तालिका 1) की 100 μL बूंदों को जोड़कर टुकड़ों को गीला करें। 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
    नोट: वाष्पीकरण से माध्यम को रोकने के लिए, 35 मिमी पेट्री डिश को 100 मिमी या बड़े पेट्री डिश के भीतर रखें जिसमें बाँझ पानी होता है। दोनों पेट्री व्यंजनों को कैप करना सुनिश्चित करें।
  7. संस्कृति के 24 घंटे के बाद, 35 मिमी संस्कृति पेट्री डिश में माध्यम की मात्रा की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो टुकड़ों को गीला रखने के लिए फाइब्रोब्लास्ट अलगाव माध्यम के 500 μL जोड़ें।
  8. ध्यान से माध्यम को हटा दें और इसे कम से कम हर 2 दिनों की संस्कृति में एक पिपेट का उपयोग करके ताज़ा करें।
  9. जब फाइब्रोब्लास्ट्स 35 मिमी पेट्री डिश (चरण 1.5 में वर्णित) में रखे गए त्वचा के टुकड़ों से बाहर निकलना शुरू करते हैं और एक सेल मोनोलेयर (आमतौर पर 6 दिन) बनाना शुरू करते हैं। फाइब्रोब्लास्ट अलगाव माध्यम के 2 एमएल में एक बाँझ सर्जिकल चिमटी और संस्कृति का उपयोग करके त्वचा के टुकड़ों को हटा दें।
  10. 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल मोनोलेयर को 80% संगम तक संस्कृति करना जारी रखें और हर दूसरे दिन माध्यम को ताज़ा करें।

2. Fibroblast प्राथमिक सेल लाइन संस्कृति

  1. जब फाइब्रोब्लास्ट 80% संगम तक पहुंचते हैं, तो ध्यान से फाइब्रोब्लास्ट अलगाव माध्यम को हटा दें और 1% एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान वाले पीबीएस के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
  2. सेल अलग करने के लिए, संस्कृति पकवान में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 600 μL जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति माध्यम के 5.4 मिलीलीटर जोड़ें जब कोशिकाएं संस्कृति पकवान (तालिका 1) से अलग होना शुरू कर देती हैं।
  4. बार-बार और कोमल पिपेटिंग द्वारा कोशिकाओं को विस्थापित करें। नए संस्कृति व्यंजनों में प्लेट कोशिकाएं (जिलेटिन के बिना), 1: 2 और 1: 4 (विकास दर के आधार पर) के बीच मार्ग अनुपात रखते हैं।
    नोट: centrifugation आवश्यक नहीं है।
  5. संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखें और हर 2 दिनों में माध्यम बदलें, जब तक कि वे 80% confluency तक नहीं पहुंच जाते हैं और उन्हें पारित नहीं करते हैं।
    नोट: जोरदार विकास को बनाए रखने के लिए सप्ताह में दो बार फाइब्रोब्लास्ट का प्रचार करें।

3. 5-aza-CR करने के लिए Fibroblast जोखिम

  1. ताजा 1 mM 5-aza-CR स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. 5-aza-CR के 2.44 मिलीग्राम वजन और इसे DMEM उच्च ग्लूकोज के 10 मिलीलीटर में भंग। भंवर द्वारा पाउडर resuspend. 0.22 μm फिल्टर के साथ समाधान sterilize.
      नोट: 5-aza-CR स्टॉक समाधान उपयोग करने से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए।
    2. फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में 5-aza-CR स्टॉक समाधान (3.1.1.1.) के 1 μL को पतला करके 5-aza-CR काम करने वाला समाधान तैयार करें।
      नोट: 5-aza-CR कार्य समाधान की सांद्रता 1 μM 1,2,3,8,9 है।
  2. पहले वर्णित कोशिकाओं (2.1.-2.3.) के रूप में ट्रिप्सिनाइज़ करें और बार-बार और धीरे-धीरे पिपेटिंग द्वारा कोशिकाओं को विस्थापित करें।
  3. सेल निलंबन ले लीजिए और इसे एक शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. कमरे के तापमान पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक गिनती कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 1 μM 5-aza-CR के साथ पूरक फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति माध्यम के 30 μL में 4 x 104 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा की गणना करें (चरण 3.1.2 देखें)।
    नोट:: उपयोग किया जाने वाला सूत्र कक्ष के विशिष्ट प्रकार पर निर्भर करता है।
    Equation 1
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 150 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। 1 μM 5-aza-CR के साथ पूरक fibroblast संस्कृति माध्यम के साथ supernatant और resuspend गोली निकालें (चरण 3.1.2 देखें). उपयोग किए जाने वाले फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति माध्यम की मात्रा के लिए चरण 3.4 देखें।
    नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, resuspend कोशिकाओं 5-aza-CR के बिना fibroblast संस्कृति माध्यम में एक ही एकाग्रता विज्ञापन और PTFE पाउडर (चरण 4.1.-4.13.) में सेल encapsulation के साथ आगे बढ़ें।

4. PTFE माइक्रो bioreactors में Fibroblast encapsulation

  1. एक बिस्तर (चित्रा 1 ए) का उत्पादन करने के लिए पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) पाउडर के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश भरें।
    नोट: तरल संगमरमर आसंजन से बचने के लिए 35 मिमी बैक्टीरियोलॉजी पेट्री व्यंजनों का उपयोग करें। एक पतली हाइड्रोफोबिक और झरझरा खोल प्राप्त करने के लिए, 1 μm के औसत कण आकार के साथ एक PTFE पाउडर का उपयोग करें और 2.0 NPIRI की अधिकतम पीसने के साथ उत्पादित करें। यह गैस-पारगम्य तरल संगमरमर के निर्माण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, पारभासी कोटिंग वास्तविक समय में सेल एकत्रीकरण प्रक्रियाओं के अवलोकन की सुविधा प्रदान करती है बड़े कण आकार से उच्च पॉलीडिस्पर्सिटी होती है जो ऊंचा वाष्पीकरण, विकृति और गोलाकार आकार के नुकसान का कारण बन सकती है, और माइक्रो-बायोरिएक्टर के समय से पहले विघटन का कारण बन सकती है।
  2. पाउडर बिस्तर (चित्रा 1B) पर 4 x 104 कोशिकाओं वाली 30 μL एकल बूंद (चरण 3.4.- 3.5.) को वितरित करें।
  3. धीरे से एक परिपत्र गति में 35 मिमी पेट्री डिश घुमाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि PFTE पाउडर पूरी तरह से तरल बूंद की सतह को कवर करने के लिए एक तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर (चित्रा 1 सी) बनाने के लिए।
  4. संगमरमर के व्यास को समायोजित करने के लिए 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर को उठाएं, किनारे पर काटा जाए (चित्रा 1डी, ई)। इसे स्थिर करने के लिए एक साफ बैक्टीरियोलॉजी पेट्री डिश पर तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर प्लेट करें (चित्रा 1 एफ)।
    नोट: टिप के अंदर संगमरमर को पकड़ने के लिए एक घर्षण बनाने के लिए, तरल संगमरमर व्यास से लगभग थोड़ा कम व्यास के साथ पिपेट युक्तियों को काटें।
  5. पेट्री डिश से तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर को 96 अच्छी तरह से प्लेट (एक संगमरमर / अच्छी तरह से) (चित्रा 1 जी) में स्थानांतरित करें।
  6. धीरे-धीरे कुएं के मार्जिन से मीडिया के 100 μL जोड़ें। माइक्रो-बायोरिएक्टर मीडिया के शीर्ष पर तैरना शुरू कर देता है (चित्रा 1 एच)।
    नोट: सूक्ष्म bioreactor सीधे तरल संपर्क में टूट जाता है, PTFE हाइड्रोफोबिकिटी के व्यवधान के कारण. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर को व्यक्तिगत रूप से 35 मिमी जीवाणु विज्ञान संस्कृति पकवान में रखा जा सकता है। इस मामले में, तरल संगमरमर वाष्पीकरण को रोकने के लिए, माइक्रो-बायोरिएक्टर युक्त 35 मिमी पेट्री डिश को 100 मिमी पेट्री डिश में डाला जाना चाहिए, जिसे पहले बाँझ पानी के साथ एलीकोट किया गया था।
  7. 5% CO 2 इनक्यूबेटर 1,2,3,8,9 में 37 °C पर 18 h के लिए तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर इनक्यूबेट करें।
    नोट: 1 μm के PTFE कण आकार आंतरिक तरल और आसपास के वातावरण के बीच एक इष्टतम गैस विनिमय सुनिश्चित कर सकते हैं।
  8. 18 घंटे के लिए 5-aza-CR इनक्यूबेशन के बाद, किनारे पर कटौती की गई 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर एकत्र करें (चरण 4.5 देखें)।
  9. माइक्रो-बायोरिएक्टर को एक नए 35 मिमी बैक्टीरियोलॉजी पेट्री डिश (चित्रा 1डी-एफ) में रखें।
  10. तरल संगमरमर को पंचर करने और इसे तोड़ने के लिए एक सुई का उपयोग करें।
  11. एक 200 μL पिपेट टिप के साथ गठित गोलाकार को पुनर्प्राप्त करें, किनारे पर कटौती की गई, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 1I, J) के तहत।
    नोट: Epigenetically मिटा कोशिकाओं PTFE में encapsulated एक 3 डी गोलाकार संरचना (प्रत्येक तरल संगमरमर में एक कुल) फार्म.
  12. 5-aza-CR के जवाब में प्लुरिपोटेंट राज्य के अधिग्रहण का आकलन करने के लिए, गुणात्मक पीसीआर (तालिका 2) द्वारा प्लूरिपोटेंट से संबंधित जीन अभिव्यक्ति, OCT4, NANOG, REX1, और SOX2 की शुरुआत की जांच करें।
  13. नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के दूसरे चरण के साथ आगे बढ़ें।

5. EPIgenetically मिटा कोशिकाओं के PTFE माइक्रो bioreactors में संस्कृति

  1. ताजा ईएससी संस्कृति माध्यम तैयार करें (तालिका 1)।
  2. 5-aza-CR अवशेषों को धोने के लिए ESC माध्यम युक्त एक पेट्री डिश में ऑर्गेनोइड्स को स्थानांतरित करें (चरण 5.1.-5.2 देखें)।
  3. एक नया 35 मिमी बैक्टीरियोलॉजी पेट्री डिश तैयार करें जिसमें पीटीएफई पाउडर बेड होता है (चरण 4.1 भी देखें)।
  4. 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके पाउडर बिस्तर पर 30 μL ESC संस्कृति माध्यम की एक बूंद में एक एकल ऑर्गेनोइड वितरित करें, किनारे पर कटौती करें (चरण 4.9 देखें); 5.3.).
  5. धीरे से एक नया तरल संगमरमर माइक्रो बायोरिएक्टर बनाने के लिए एक परिपत्र गति में 35 मिमी पेट्री डिश को घुमाएं, इसे 1,000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके उठाएं, किनारे पर काटें, और नवगठित माइक्रो-बायोरिएक्टर को 96-अच्छी तरह से प्लेट (एक संगमरमर / अच्छी तरह से) के कुएं में रखें (चरण 4.3.-4.6 देखें)।
  6. माइक्रो-बायोरिएक्टर को फ्लोट करने के लिए, धीरे-धीरे संगमरमर को स्नान करने के लिए कुएं के मार्जिन से 100 μL मीडिया जोड़ें (नोट 4.7 देखें)।
  7. संस्कृति तरल संगमरमर माइक्रो bioreactors 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर के रूप में लंबे समय के रूप में के रूप में आवश्यक के रूप में. 5.3.-5.7 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करते हुए, हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
    नोट: वर्तमान पांडुलिपि में, 28 दिनों के लिए ऑर्गेनोइड्स संस्कृति के साथ प्राप्त परिणाम प्रदान किए जाते हैं। हालांकि, यदि आवश्यक हो तो लंबी संस्कृति अवधि का प्रदर्शन किया जा सकता है।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल वयस्क दैहिक कोशिकाओं से स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं को उत्पन्न करने और स्थिर रूप से बनाए रखने के लिए किए जाने वाले सभी चरणों का वर्णन करता है। यह विधि विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों, अर्थात् माउस, पोर्सिनी और मानव से अलग किए गए फाइब्रोब्लास्ट के साथ सफल रही है। यहां रिपोर्ट किए गए प्रतिनिधि परिणाम सभी सेल लाइनों से प्राप्त किए जाते हैं, भले ही मूल की प्रजातियों की परवाह किए बिना।

रूपात्मक विश्लेषण ों से पता चलता है कि, डिमेथिलिंग एजेंट 5-अजा-सीआर के साथ 18 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, फाइब्रोब्लास्ट्स ने पीटीएफई माइक्रो-बायोरिएक्टर (3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर) में समझाया और सभी तीन प्रजातियों में एक समान आकार ज्यामिति प्रदर्शित करने वाली 3 डी गोलाकार संरचनाओं का गठन किया। (चित्रा 2ए-सी, 3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर)। 86.31 ± 4.13% encapsulated कोशिकाओं ने उल्लेखनीय रूप से अपने फेनोटाइप को संशोधित किया, जो आमतौर पर एक उच्च प्लास्टिसिटी फेनोटाइप 8 से संबंधित विशेषताओं को दर्शाताहै। इसके विपरीत, पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाओं को 2 डी मानक स्थितियों में सुसंस्कृत किया गया है, हालांकि विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट लम्बी आकृति को गोल या अंडाकार के साथ बदल दिया गया है, बड़े और दानेदार नाभिक के साथ आकार में काफी छोटा था, एक मोनोलेयर वितरण को बनाए रखता है (चित्रा 2)। रूपात्मक परिवर्तन 3 डी और 2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाओं दोनों में प्लुरिबिलिटी से संबंधित जीन अभिव्यक्ति की शुरुआत के साथ थे। POU कक्षा 5 होमोबॉक्स 1 (OCT4), Nanog होमोबॉक्स (NANOG), ZFP42 जस्ता उंगली प्रोटीन (REX1), और लिंग निर्धारण क्षेत्र Y-बॉक्स 2 (SOX2) के लिए प्रतिलेखन भी देखा गया था, जो अनुपचारित फाइब्रोब्लास्ट (T0) में अनुपस्थित है, का पता लगाया गया था (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5)। इसके अलावा, मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण ने उपर्युक्त जीनों के साथ-साथ दस-ग्यारह ट्रांसलोकेशन -2 (टीईटी 2), उपकला सेल आसंजन अणु (ईपीसीएएम), और कैडरिन 1 (सीडीएच 1) जीन ों के साथ-साथ 3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाओं (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, नीली सलाखों) में 2 डी मानक प्लास्टिक व्यंजनों (2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर) (चित्रा 3) में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में एक महत्वपूर्ण अप-विनियमन का प्रदर्शन किया (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, नारंगी सलाखों)। समानांतर में, फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट मार्कर Thy-1 सेल सतह एंटीजन (THY1) का एक महत्वपूर्ण डाउनरेगुलेशन स्पष्ट रूप से 3D और 2D पोस्ट 5-aza-CR कोशिकाओं (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5) में पता लगाने योग्य था।

एक उच्च प्लास्टिसिटी राज्य की उपलब्धि की पुष्टि डीएनए वैश्विक मिथाइलेशन के एलिसा विश्लेषण द्वारा भी की गई थी, जो 3 डी और 2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाओं (चित्रा 6ए-सी) दोनों में मिथाइलेशन के स्तर की महत्वपूर्ण कमी को दर्शाता है। इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति परिणामों के साथ समझौते में, डीएनए मिथाइलेशन का स्तर 3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाओं (चित्रा 6ए-सी, नीली सलाखों) में काफी कम था, 2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर वाले (चित्रा 6ए-सी, नारंगी सलाखों) की तुलना में।

इससे भी अधिक दिलचस्प बात यह है कि, 3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाएं अधिग्रहित 3 डी गोलाकार संरचना (चित्रा 2 ए, 3 डी 28 डी) को बनाए रखती हैं और प्लुरिपोटेंसी से संबंधित जीन (चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5 नीली सलाखों) के साथ-साथ कम डीएनए मिथाइलेशन स्तर (चित्रा 6ए-सी, नीली सलाखों) के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को बनाए रखती हैं, बाद की सभी संस्कृति अवधि के दौरान और विशेष रूप से, 28 दिन तक, जब संस्कृति को गिरफ्तार किया गया था। इसके विपरीत, हालांकि 2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाएं डिमेथिलेटिंग एजेंट के साथ उपचार के बाद एक ही प्लूरिफिकेशन जीन के लिए प्रतिलेखन करती हैं, उन्होंने दिन 7 तक इस तरह की अभिव्यक्ति को अस्वीकार कर दिया (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, एनडी)। इसी तरह, मेथिलिकरण के स्तर में कमी को पहले 72 घंटों के लिए बनाए रखा गया था; फिर मिथाइलेशन धीरे-धीरे बढ़ गया, संस्कृति के दिन 7 (चित्रा 6ए-सी, टी 0, सफेद सलाखों) द्वारा अनुपचारित फाइब्रोब्लास्ट (चित्रा 6ए-सी, टी 0, सफेद सलाखों) के तुलनीय लौट रहा है।

Figure 1
चित्रा 1: PTFE माइक्रो बायोरिएक्टर और organoid वसूली में सेल encapsulation. (ए) एक बैक्टीरियोलॉजी पेट्री डिश को पाउडर बेड तैयार करने के लिए पीटीएफई से भरा गया था। (बी) पीटीएफई बिस्तर के शीर्ष पर माध्यम युक्त कोशिकाओं की एक एकल बूंद को वितरित किया गया था। (सी) पेट्री डिश को धीरे-धीरे परिपत्र आंदोलनों के साथ घुमाया गया था ताकि बूंद को कोट किया जा सके और माइक्रो-बायोरिएक्टर का उत्पादन किया जा सके। (डी) एक 1000 μL पिपेट टिप अंत में काटा गया था (लाल तीर) और (ई) माइक्रो बायोरिएक्टर को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया। (एफ) तरल संगमरमर को स्थिर करने के लिए एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित कर दिया गया था, (जी) एक 96 अच्छी तरह से प्लेट (एक संगमरमर / अच्छी तरह से) में रखा गया था और (एच) मीडिया पर तैरता था। (I) नवगठित ऑर्गेनोइड को इकट्ठा करने के लिए, माइक्रो-बायोरिएक्टर को सुई के साथ पंचर किया गया था और (जे) प्राप्त सेल समुच्चय को एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत बरामद किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्तनधारी epigenetically मिटा कोशिकाओं PTFE माइक्रो bioreactors में encapsulated 3 डी गोलाकार संरचनाओं फार्म. मुरीन (ए), पोर्सिनी (बी) और मानव (सी) कोशिकाओं को पीटीएफई में समझाया गया और 5-अजा-सीआर फॉर्म 3 डी गोलाकार संरचनाओं (3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर) के साथ इलाज किया गया, जिन्हें बाद की सभी संस्कृति अवधि (3 डी 28 डी) के दौरान स्थिर रूप से बनाए रखा गया था; स्केल बार, 100 μm)। इसके विपरीत, मुरीन (ए), पोर्सिनी (बी) और मानव (सी) कोशिकाओं को प्लास्टिक के व्यंजनों पर चढ़ाया गया और 5-अजा-सीआर के साथ इलाज किया गया, विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट लम्बी आकृति (टी 0) को एक गोल एपिथेलियोइड फेनोटाइप में बदल दिया और एक मोनोलेयर वितरण (2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर) को बरकरार रखा। संस्कृति के दिन 7 तक, 2 डी कोशिकाएं अपने मूल लम्बी आकार में वापस आ गईं, जिसे बाद की संस्कृति अवधि (2 डी 28 डी) के लिए स्थिर रूप से बनाए रखा गया था; स्केल बार, 100 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मुरीन epigenetically मिटा कोशिकाओं PTFE माइक्रो bioreactors में encapsulated उच्च स्तर और लंबे समय तक रखरखाव दिखाने के लिए pluripotency से संबंधित जीन अभिव्यक्ति. Oct4, Nanog, Rex1, Sox2, Tet2, Epcam, Cdh1 और Thy1 जीन के लिए प्रतिलेखन स्तर मुरीन अनुपचारित fibroblasts (T0, सफेद सलाखों), 5-aza-CR (पोस्ट 5-aza-CR) के संपर्क में fibroblasts, और PTFE encapsulated (नीली सलाखों) और मानक प्लास्टिक डिश (नारंगी सलाखों) सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए संस्कृति के विभिन्न समय बिंदुओं पर। जीन अभिव्यक्ति मूल्यों को 1 पर सेट की गई उच्चतम अभिव्यक्ति के साथ रिपोर्ट किया जाता है और इसके सापेक्ष अन्य सभी। विभिन्न सुपरस्क्रिप्ट महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाते हैं (पी < 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Porcine epigenetically मिटा कोशिकाओं PTFE माइक्रो bioreactors में encapsulated उच्च स्तर और लंबे समय तक रखरखाव दिखाने के लिए pluripotency से संबंधित जीन अभिव्यक्ति. OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 और THY1 जीन के लिए प्रतिलेखन स्तर पोर्सिनी अनुपचारित फाइब्रोब्लास्ट (T0, सफेद सलाखों), 5-aza-CR (पोस्ट 5-aza-CR) के संपर्क में आने वाले फाइब्रोब्लास्ट्स, और PTFE encapsulated (नीली सलाखों) और मानक प्लास्टिक डिश (नारंगी सलाखों) सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए संस्कृति के विभिन्न समय बिंदुओं पर। जीन अभिव्यक्ति मूल्यों को 1 पर सेट की गई उच्चतम अभिव्यक्ति के साथ रिपोर्ट किया जाता है और इसके सापेक्ष अन्य सभी। विभिन्न सुपरस्क्रिप्ट महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाते हैं (पी < 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: PTFE माइक्रो-बायोरिएक्टर में encapsulated मानव epigenetically मिटा कोशिकाओं उच्च स्तर और लंबे समय तक रखरखाव दिखाने के लिए pluripotency से संबंधित जीन अभिव्यक्ति. OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 और THY1 जीन के लिए प्रतिलेखन स्तर मानव अनुपचारित फाइब्रोब्लास्ट (T0, सफेद सलाखों), 5-aza-CR (पोस्ट 5-aza-CR) के संपर्क में फाइब्रोब्लास्ट, और PTFE encapsulated (नीली सलाखों) और मानक प्लास्टिक डिश (नारंगी सलाखों) सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए संस्कृति के विभिन्न समय बिंदुओं पर। जीन अभिव्यक्ति मूल्यों को 1 पर सेट की गई उच्चतम अभिव्यक्ति के साथ रिपोर्ट किया जाता है और इसके सापेक्ष अन्य सभी। विभिन्न सुपरस्क्रिप्ट महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाते हैं (पी < 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: PTFE माइक्रो बायोरिएक्टर 5-aza-CR demethylating प्रभाव को बढ़ाता है और स्तनधारी epigenetically मिटा fibroblasts में दीर्घकालिक डीएनए hypomethylation बनाए रखता है। मुरीन (ए), पोर्सिनी (बी) और मानव (सी) कोशिकाओं के वैश्विक डीएनए मेथिलिकरण स्तर पीटीएफई माइक्रो-बायोरिएक्टर (नीली सलाखों) में encapsulated या मानक प्लास्टिक (नारंगी सलाखों) पर मढ़वाया 5-aza-CR (पोस्ट 5-aza-CR) के संपर्क में और 28 दिनों के लिए ESC माध्यम में सुसंस्कृत। अनुपचारित फाइब्रोब्लास्ट्स (टी 0; सफेद सलाखों)। परिणाम पांच स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। विभिन्न सुपरस्क्रिप्ट महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाते हैं (पी < 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फाइब्रोब्लास्ट अलगाव मध्यम (100 मिलीलीटर)
DMEM, उच्च ग्लूकोज, पाइरूवेट 77 mL
भ्रूण गोजातीय सीरम, योग्य, गर्मी निष्क्रिय 20 mL
एल-ग्लूटामाइन समाधान 1 मिलीलीटर
एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन (100×) 2 मिलीलीटर
फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति मध्यम (100 मिलीलीटर)
DMEM, उच्च ग्लूकोज, पाइरूवेट 88 mL
भ्रूण गोजातीय सीरम, योग्य, गर्मी निष्क्रिय 10 mL
एल-ग्लूटामाइन समाधान 1 मिलीलीटर
एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन (100×) 1 मिलीलीटर
ESC संस्कृति माध्यम (10 mL)
हैम का एफ -10 पोषक तत्व मिश्रण 3,99 mL
DMEM, कम ग्लूकोज, पाइरूवेट 3,99 mL
नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट 1 मिलीलीटर
भ्रूण गोजातीय सीरम, योग्य, गर्मी निष्क्रिय 500 μL
एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक सॉल्यूशन (100×) 100 μL
एल-ग्लूटामाइन समाधान 100 μL
एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान (100x) 100 μL
2-Mercaptoethanol (10 mM) 100 μL (0.1 mM)
न्यूक्लियोसाइड मिश्रण (0.3 एम गुआनोसिन, 0.3 एम एडेनोसिन, 0.3 एम साइटिडीन, 0.3 एम यूरिडिन और 0.1 एम टिमिडीन) 100 μL (3 mM Guanosine, 3 mM Adenosine, 3 mM Cytidine, 3 mM Uridine और 1 mM Timidine)
ESGRO पुनः संयोजक माउस LIF प्रोटीन (1000 इकाइयों / 10 μL (1 इकाई/mL)
पुनः संयोजक मानव FGF बुनियादी (bFGF) (5 μg / mL) 10 μL (5 ng/mL)

तालिका 1: फाइब्रोब्लास्ट अलगाव माध्यम, फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति माध्यम और ईएससी संस्कृति माध्यम की संरचना।

लक्ष्य पीसीआर प्राइमर सेट प्रजातियां
Cdh1 आगे: GAGGAACCCACCCACCCTCATA चूहा
रिवर्स: GTTGACCGTCCCTTCACAGT चूहा
Epcam आगे: TGGCAACAAGTTGCTCTCTCTG चूहा
रिवर्स: CTTGTCGGTTCTTCGGACTC चूहा
नैनोग आगे: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC चूहा
रिवर्स: CCAGGAAGACCCACACTCAT चूहा
Oct4 आगे: ACACCTGGCTTCAGACTTCG चूहा
रिवर्स: AGTTGCTTTTTCCACTCGTGCT चूहा
Rex1 आगे: CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC चूहा
रिवर्स: GACAAGCATGTGCTTCCTCCTCA चूहा
Sox2 आगे: AGAACCCCAAGATGCACAAC चूहा
रिवर्स: CTCCGGGAAGCGTGTACTTA चूहा
Tet2 आगे: GCACAGGGAGCAAGAGATTC चूहा
रिवर्स: ATGTTGACATTGCCAGTGGA चूहा
आपका1 आगे: AACTCTTGGCACCATGAACC चूहा
रिवर्स: GCACGTGCTTCCTCTCCTCTCTCT चूहा
CDH1 आगे: GAATGACAATGGCCCCCATAC पोर्सिनी
रिवर्स: AGGTGGTCACCTGGCTTTTTG पोर्सिनी
EPCAM आगे: GCTTGGTCAGTGCCAGTGTA पोर्सिनी
रिवर्स: CTTCTGACCCCCCAGCAGTGTT पोर्सिनी
NANOG आगे: ATCCAGCTTGTCCCCAAAG पोर्सिनी
रिवर्स: ATTTCATTCGCTGGTTCTGG पोर्सिनी
OCT4 आगे: GTTCAGCCAAACGACCATCT पोर्सिनी
रिवर्स: CTCCAGGTTGCCTCTCTCACTC पोर्सिनी
REX1 आगे: CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC पोर्सिनी
रिवर्स: TGTCCCCAATCAAAAATGCT पोर्सिनी
SOX2 आगे: GCCCTGCAGTACAACTCCAT पोर्सिनी
रिवर्स: GCTGATCATGTCCCGTAGGT पोर्सिनी
TET2 आगे: CAGAAAACAATGCAGCCAGA पोर्सिनी
रिवर्स: GAATGGCTCGGTCTCTGAAG पोर्सिनी
THY1 आगे: GGCATCGCTCTCTCTTTCGCTAAC पोर्सिनी
रिवर्स: GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG पोर्सिनी
CDH1 आगे: TGCCCAGAAAATGAAAAAGG मानवीय
रिवर्स: GTGTATGTGGCAATGCGTTC मानवीय
EPCAM आगे: GCTGGTGTGTGAACACTGCT मानवीय
रिवर्स: ACGCGTTGTGTCTCTCCTTCTCTCTCTCT मानवीय
NANOG आगे: AGAAAAACAACTGGCCGAAG मानवीय
रिवर्स: TGCTCCAGGGGACTGGATGTTC मानवीय
OCT4 आगे: AATTTGCCAAGCTCCTGAAG मानवीय
रिवर्स: GTTGCCTCTCACTCGGTTCT मानवीय
REX1 आगे: ACGTTTCGTGTGTCCCTTTC मानवीय
रिवर्स: TATAACCGCTTTTGGGGGGTTG मानवीय
SOX2 आगे: ACACCAATCCCATCCACACT मानवीय
रिवर्स: GCAAACTTCCTGCAAAGCTC मानवीय
TET2 आगे: CCCACTTACCTGCGTTTCAT मानवीय
रिवर्स: ACTGTGACCTTTCCCCCCACTG मानवीय
THY1 आगे: AGATCCCAGAACCATGAACC मानवीय
रिवर्स: GCACGTGCTTCTCTTTGTCTCTCTCTCA मानवीय
लक्ष्य TaqMan Assays कैटलॉग संख्या प्रजातियां
Actb Mm02619580_g1 चूहा
Cdh1 Mm01247357_m1 चूहा
Epcam Mm00493214_m1 चूहा
Gapdh Mm99999915_g1 चूहा
नैनोग Mm02019550_s1 चूहा
Oct4 Mm03053917_g1 चूहा
Rex1 Mm03053975_g1 चूहा
Sox2 Mm03053810_s1 चूहा
Tet2 Mm00524395_m1 चूहा
आपका1 Mm00493681_m1 चूहा
ACTB Ss03376563_uH पोर्सिनी
CDH1 Ss06942341_m1 पोर्सिनी
EPCAM Ss03384752_u1 पोर्सिनी
GAPDH Ss03375629_u1 पोर्सिनी
NANOG Ss04245375_s1 पोर्सिनी
OCT4 Ss03389800_m1 पोर्सिनी
REX1 Ss03373622_g1 पोर्सिनी
SOX2 Ss03388002_u1 पोर्सिनी
TET2 Ss06880359_m1 पोर्सिनी
THY1 Ss03376963_u1 पोर्सिनी
ACTB Hs01060665_g1 मानवीय
CDH1 Hs01023895_m1 मानवीय
EPCAM Hs00901885_m1 मानवीय
GAPDH Hs02786624_g1 मानवीय
NANOG Hs02387400_g1 मानवीय
OCT4 Hs00999632_g1 मानवीय
REX1 Hs00399279_m1 मानवीय
SOX2 Hs01053049_s1 मानवीय
TET2 Hs00325999_m1 मानवीय
THY1 Hs00174816_m1 मानवीय

तालिका 2: प्राइमर जानकारी.

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Discussion

पिछले दशकों के दौरान, कई अध्ययनों ने कम प्रतिबद्ध और उच्च अनुमेय राज्य की ओर एक टर्मिनल रूप से विभेदित सेल को वापस करने के लिए रणनीतियों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क परिपक्व टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं से शुरू होने वाली प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं की पीढ़ी और दीर्घकालिक रखरखाव की अनुमति देता है। विधि दो स्वतंत्र चरणों को जोड़ती है जिसमें एक उच्च अनुमेय राज्य का प्रेरण शामिल है जो रासायनिक एपिजेनेटिक मिटाने के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और इसके बाद के रखरखाव को 3 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके सुनिश्चित किया जाता है।

पीटीएफई एनकैप्सुलेटेड कोशिकाओं (चित्रा 2) में देखी गई 3 डी गोलाकार संरचनाओं का गठन अन्य अध्ययनों के अनुरूप है जो सेल एकत्रीकरण को कुशलतापूर्वक प्रोत्साहित करने के लिए पीटीएफई क्षमता का प्रदर्शन करते हैं, घ्राण एनशीथिंग सेल (ओईसी) गोलाकार संरचनाओं की स्थापना की सुविधा प्रदान करते हैं25 या 3 डी टोरोइडल समुच्चय26 के गठन की सुविधा प्रदान करते हैं। इन रूपात्मक परिवर्तनों को प्लुरिबिलिटी से संबंधित जीन अभिव्यक्ति (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5) की शुरुआत से समानांतर किया जाता है, जो 2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाओं (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5) की तुलना में 3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाओं में काफी उच्च स्तर दिखाता है। लगातार, 3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाएं 2 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर वाले (चित्रा 6) की तुलना में एक उच्च डीएनए हाइपोमिथाइलेशन प्रदर्शित करती हैं। कुल मिलाकर, ये परिणाम एक उच्च प्लास्टिसिटी राज्य को प्रेरित करने के लिए 5-aza-CR क्षमता का संकेत देते हैं, भले ही उपयोग की जाने वाली सेल संस्कृति प्रणाली की परवाह किए बिना। हालांकि, कोशिकाओं द्वारा प्राप्त रासायनिक रूप से प्रेरित प्लूरिफिकेशन राज्य को पीटीएफई माइक्रो-बायोरिएक्टर का उपयोग करके काफी बढ़ावा दिया जाता है जो प्लूरिपोटेंसी जीन ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ाता है और 5-aza-CR demethylating प्रभावों को बढ़ाता है। इससे भी अधिक दिलचस्प बात यह है कि केवल 3 डी पोस्ट 5-अजा-सीआर कोशिकाएं अधिग्रहित 3 डी गोलाकार संरचना (चित्रा 2) को स्थिर रूप से बनाए रखती हैं और संस्कृति के बाद की सभी अवधि के दौरान प्लुरिबिलिटी से संबंधित जीन (चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5) के साथ-साथ कम डीएनए मिथाइलेशन स्तर (चित्रा 6) के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को बनाए रखती हैं। कुल मिलाकर, यहां रिपोर्ट किए गए प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि यह दो-चरणीय रणनीति अत्यधिक कुशल और मजबूत है, और पीटीएफई माइक्रो-बायोरिएक्टर का उपयोग न केवल उच्च प्लास्टिसिटी को बढ़ाता है, बल्कि स्तनधारी प्रजातियों में इसके स्थिर, दीर्घकालिक रखरखाव की भी अनुमति देता है। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया है कि ये लाभकारी प्रभाव हिप्पो-सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण और इसके मेचानोट्रांसडक्शन से संबंधितसंकेतों 10 से संबंधित हैं, जिन्हें पहले सेल प्लूरिफिकेशन 28,29,30 के सक्रिय विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है।

एक सफल प्रक्रिया के लिए दो सबसे महत्वपूर्ण कदम 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं का कठोर रखरखाव हैं, हर समय, जिसमें बाँझ लैमिनर प्रवाह और माइक्रोस्कोप के तहत उनकी हैंडलिंग और माइक्रो-बायोरिएक्टर उत्पादन के दौरान एक सही सेल नंबर / तरल मात्रा दर का उपयोग शामिल है, जो उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट सेल प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकता है। हमारे अनुभव में, संस्कृति में उनके उपयोग से पहले अभिकर्मकों को ताजा तैयार करने की भी अत्यधिक सिफारिश की जाती है (यह 5-aza-CR स्टॉक समाधान के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है)। इसके अलावा, मध्यम ताज़ा एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए क्योंकि मध्यम परिवर्तनों के दौरान 3 डी गोलाकार ऑर्गेनोइड्स खो सकते हैं।

इस विधि की मुख्य ताकत कोई ट्रांसजेनिक और / या वायरल वेक्टर आवश्यकता नहीं है; विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों में मजबूती और पुनरुत्पादकता; कम लागत; और विभिन्न सेल प्रकारों के लिए उच्च लचीलापन। दूसरी ओर, माइक्रो-बायोरिएक्टर की छोटी मात्रा के कारण प्राप्त डेटा की सीमित संख्या द्वारा एक संभावित सीमा का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। इसके अलावा, उच्च सेल घनत्व का उपयोग कम ऑक्सीजन हस्तांतरण दर और निलंबन में सीमित वृद्धि का कारण बन सकता है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, स्केल-अप और / या स्केल-डाउन रणनीतियों पर आगे काम करना आवश्यक है।

यह हाइलाइट करना महत्वपूर्ण है कि सभी 3 डी गोलाकार-आधारित अनुप्रयोगों के लिए आम प्रमुख पहलू पुनरुत्पादन, उत्पादन दक्षता, ऑर्गेनोइड आकार एकरूपता और सेलुलर शरीर विज्ञान पर प्रभाव हैं। ये विशेषताएं संस्कृति प्रणाली के भीतर उत्पन्न यांत्रिक बलों से सख्ती से संबंधित हैं और उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तरीकों के अनुसार भिन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, स्थिर प्रणालियों में गैर-अनुयायी व्यंजनों का उपयोग करके बहुकोशिकीय ऑर्गेनोइड्स को सुसंस्कृत किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण मुख्य रूप से प्रसार-सीमित स्थितियों पर आधारित है और आमतौर पर, ढीले-एकत्रित समूहों के गठन में परिणाम होता है। हैंगिंग-ड्रॉप तकनीक एक ही सीमा दिखाती है। दरअसल, सेल निलंबन का जमाव एक ऊतक संस्कृति पकवान के ढक्कन के नीचे की ओर गिरता है, जो माइक्रोग्रैविटी वातावरण के निर्माण की ओर जाता है जो मुक्त तरल-वायु इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं को केंद्रित करता है, जो कम-एकत्रित बहुकोशिकीय क्षेत्रों की पीढ़ी को प्रेरित करता है। एक संभावित विकल्प स्पिनर फ्लास्क तकनीक द्वारा दर्शाया जाता है। हालांकि, यह विधि अत्यधिक महंगी है क्योंकि इसके लिए संस्कृति माध्यम की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, गठित ऑर्गेनोइड्स को स्थिर संस्कृति प्रणाली में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है जब लक्षण वर्णन के लिए या आगे इन विट्रो परीक्षणों के लिए उपयोग किया जाता है। इन सभी मुद्दों को तरल संगमरमर माइक्रो-बायोरिएक्टर का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। दरअसल, वे एक गैर-अनुयायी तरल सतह प्रदान करते हैं जो स्थिर और कताई दोनों तरीकों के फायदों को जोड़ती है, जो एक तेजी से सेल एकत्रीकरण और कॉम्पैक्ट गोलाकार की पीढ़ी को प्रेरित करती है। समानांतर में, अवतल तल, गोलाकार आकार, और प्रत्येक संगमरमर का आंतरिक तरल प्रवाह कोशिकाओं को सूक्ष्म-बायोरिएक्टर के तल पर बसने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप आकार और आकार में समान ऑर्गेनोइड्स का गठन होता है। तरल संगमरमर के उपयोग में एक और महत्वपूर्ण लाभ इष्टतम गैस एक्सचेंजों द्वारा दर्शाया गया है, जो उनके गोलाकार आकार के लिए धन्यवाद, पूरी सतह के माध्यम से हो सकता है।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्तनधारी प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं की एक कुशल और सरल पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। चूंकि यह रणनीति वायरल वेक्टर मुक्त है और इसमें किसी भी जीन अभिकर्मक का उपयोग शामिल नहीं है, इसलिए यह ट्रांसलेशनल मेडिसिन अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक आशाजनक है और रोगी-विशिष्ट सेल थेरेपी में एक कदम आगे माना जा सकता है। इसके अलावा, 3 डी माइक्रो-बायोरिएक्टर कल्चर सिस्टम का उपयोग स्टेम सेल ऑर्गेनोइड तकनीक में एक उल्लेखनीय सफलता का प्रतिनिधित्व कर सकता है और विभिन्न सेल प्रकारों की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक लाभप्रद सूक्ष्म-पर्यावरण का गठन कर सकता है, जैसे कि ईएससी, आईपीएससी और एमएससी। एक अतिरिक्त लाभ को छोटी मात्रा द्वारा दर्शाया जाता है जो माइक्रो-बायोरिएक्टर के भीतर स्थापित समृद्ध वातावरण के पैराक्राइन / ऑटोक्राइन सिग्नलिंग के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को Carraresi Foundation और MiND FoodS Hub ID: 1176436 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। सभी लेखक लागत कार्रवाई CA16119 इन विट्रो 3-डी कुल सेल मार्गदर्शन और फिटनेस (CellFit) के सदस्य हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522 Component of ESC medium
5-Azacytidine Sigma-Aldrich A2385 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing
Adenosine Sigma-Aldrich A4036 Component of nucleoside mix for ESC medium
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955 Component of fibroblast and ESC media
CFX96 Real-Time PCR Bio-Rad Laboratories NA Thermal cycler for quantitative PCR
Cytidine Sigma-Aldrich C4654 Component of nucleoside mix for ESC medium
DMEM, high glucose, pyruvate Thermo Fisher Scientific 41966052 For fibroblast isolation and culture medium
DMEM, low glucose, pyruvate Thermo Fisher Scientific 31885023 For ESC medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D5652 PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit Thermo Fisher Scientific 61021 mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein Sigma-Aldrich ESG1106 Component of ESC medium
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermo Fisher Scientific 10500064 Component of fibroblast and ESC media
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Component of ESC medium
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890 For dish coating
GeneAmp PCR System 2700 Applied Biosystems NA Thermal cycler for qualitative PCR
Global DNA Methylation ELISA Kit CELL BIOLABS STA-380 Methylation study
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7801 Qualitative PCR
Guanosine Sigma-Aldrich G6264 Component of nucleoside mix for ESC medium
Ham's F-10 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31550031 For ESC medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Component of ESC medium
KOVA glasstic slide 10 with grids Hycor Biomedical 87144 For cell counting
Leica MZ APO Stereo Microscope Leica NA For organoid observation
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Component of fibroblast and ESC media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035 Component of ESC medium
Millex-GS 0.22 µm pore filters Millipore SLGS033SB For solution sterilization
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant Promega M3681 mRNA reverse transcription
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific 51119000 For ELISA plate reading
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope Nikon NA For cell observation
Perkin Elmer Thermal Cycler 480 Perkin Elmer NA Thermal cycler for reverse transcription
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size Sigma-Aldrich 430935 For generating micro-bioreactor
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 Genomic DNA estraction
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit Thermo Fisher Scientific AM1728 Quantitative PCR
Thymidine Sigma-Aldrich T1895 Component of nucleoside mix for ESC medium
Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard Sarstedt 833902 For fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard Sarstedt 833900 For Fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension Sarstedt 833900500 Bacteriology petri dish for liquid marble culture
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F Sarstedt 833924005 For liquid marble culture
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 For fibroblast dissociation
Tube 15ml, 120x17mm, PS Sarstedt 62553041 For cell suspension centrifugation
Uridine Sigma-Aldrich U3003 Component of nucleoside mix for ESC medium

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References

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जीवविज्ञान अंक 162 5-aza-CR 3 डी संस्कृति प्रणाली epigenetic मिटा fibroblast mechanosensing से संबंधित क्यू pluripotency PTFE माइक्रोबायोरियाक्टर
एक दो कदम की रणनीति है कि Epigenetic संशोधन और Biomechanical Cues को जोड़ती है स्तनधारी Pluripotent कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए
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Pennarossa, G., Ledda, S., Arcuri, S., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells. J. Vis. Exp. (162), e61655, doi:10.3791/61655 (2020).

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