Summary
אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.
Abstract
ניתן להפוך או לשנות את הפנוטיפ של התא בשיטות שונות, עם יתרונות ומגבלות ספציפיים לכל טכניקה. כאן אנו מתארים אסטרטגיה חדשה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. נדרשים שני שלבים עיקריים. בשלב הראשון, תאים בוגרים בוגרים (ממוינים באופן סופני) נחשפים למחק האפיגנטי 5-אזה-ציטידין כדי להניע אותם למצב פלוריפוטנטי. חלק זה של הפרוטוקול פותח, בהתבסס על ההבנה הגוברת של המנגנונים האפיגנטיים השולטים בגורל התאים ובהתמיינותם, וכרוך בשימוש במשנה האפיגנטי כדי למחוק את מצב התאים המובחנים ולאחר מכן לנסוע לתוך חלון פלסטיות גבוה חולף.
בשלב השני, תאים שנמחקו עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של פוליאטטרפלואורואתילן (PTFE), הידועים גם בשם Liquid Marbles, כדי לקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים כדי להרחיב ולשמור ביציבות על הפלסטיות הגבוהה הנרכשת. PTFE היא תרכובת סינתטית הידרופובית לא תגובתית והשימוש בה מאפשר יצירת מיקרו-סביבה תאית, שלא ניתן להשיגה במערכות תרביות דו-ממדיות מסורתיות. מערכת זו מעודדת ומגבירה את התחזוקה של פלוריפוטנטיות באמצעות רמזים הקשורים לביו-מכנוסנסינג.
ההליכים הטכניים המתוארים כאן הם אסטרטגיות פשוטות כדי לאפשר אינדוקציה ותחזוקה של מצב פלסטיות גבוהה בתאים סומטיים בוגרים. הפרוטוקול איפשר את הפקתם של תאי פלסטיות גבוהה בכל מיני היונקים שנבדקו. מכיוון שהיא אינה כרוכה בשימוש בטרנספקציה של גנים והיא נקייה מווקטורים ויראליים, היא עשויה לייצג התקדמות טכנולוגית בולטת עבור יישומי רפואה תרגומית. יתר על כן, מערכת המיקרו-ביו-ריאקטורים מספקת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי גזע על ידי יצירה מחדש במבחנה של מיקרו-סביבה ספציפית המאפשרת תרבית ארוכת טווח של תאים בעלי פלסטיות גבוהה, כלומר ESCs, iPSCs, תאים שנמחקו אפיגנטית ו-MSCs.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, הרעיון המקובל של התקדמות חד-כיוונית לעבר מחויבות והתמיינות של תאים שונה לחלוטין. הוכח כי ניתן להפוך את אפיון התא, וניתן לדחוף תא ממוין סופני לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר, בשיטות שונות.
בין מספר השיטות המוצעות, אחת השיטות המבטיחות ביותר כוללת שימוש בתרכובות כימיות כדי לגרום לתאים למה שמכונה פלוריפוטנטיות המושרה כימית. המולקולות הקטנות המשמשות בגישה זו מסוגלות לקיים אינטראקציה ולשנות את החתימה האפיגנטית של תא בוגר בוגר, תוך הימנעות מהצורך בכל וקטור מהונדס ו/או ויראלי 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים הראו לאחרונה כי ניתן להעביר תאים מפנוטיפ אחד למשנהו על ידי מתן גירויים ביוכימיים וביולוגיים ספציפיים המעוררים הפעלה מחדש של גנים היפר-מתילים 11,12,13,14,15. אירועים אלה של דה-מתילציה מאפשרים המרה של תאים ממוינים סופניים לאב פרימיטיבי, רב-פוטנטי או לתא בעל פלסטיות גבוהה/פלוריפוטנטית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
במקביל, מחקרים רבים התמקדו לאחרונה בהבנת רמזים הקשורים למכנוזנסינג, ובאופן ספציפי יותר, באפשרות להשתמש בכוחות מכניים כדי להשפיע ישירות על פלסטיות ו/או התמיינות של תאים 16,17,18,19. ואכן, הוכח בבירור כי המטריצה החוץ-תאית (ECM) ממלאת תפקיד מפתח בשליטה על גורל התא. בפרט, האותות הביומכניים והביו-פיזיקליים המיוצרים על ידי ECM מווסתים ישירות את המנגנונים המולקולריים ואת מסלולי האיתות, ומשפיעים על התנהגות התאים ועל תפקודיהם20,21. נתונים עדכניים אלה סללו את הדרך לפיתוח מערכות תרביות תלת-ממדיות חדשניות המחקות באופן הדוק יותר את המיקרו-סביבה של תאי in vivo, ומשכפלות גירויים מכניים ופיזיים המניעים את התנהגות התאים.
כאן אנו מתארים פרוטוקול דו-שלבי המשלב את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. בשלב הראשון, התאים מודגרים עם מולקולת הדה-מתילציה 5-אזה-ציטידין (5-aza-CR). סוכן זה מסוגל לגרום לדה-מתילציה גלובלית משמעותית של הדנ"א באמצעות השפעה משולבת של הפעולה הישירה של עשר-אחת-עשרה טרנסלוקציה 2 (TET2) בתיווך 8,10 והעיכוב העקיף של מתיל-טרנספראזות הדנ"א (DNMT)22,23. שלב זה גורם להסרת הבלוקים האפיגנטיים עם הפעלה מחדש לאחר מכן של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות, ולכן, יצירת תאים בעלי פלסטיות גבוהה 1,2,3,8,10, להלן "תאים שנמחקו אפיגנטית". בשלב השני, התאים עטופים במערכת תרבית תלת-ממדית. לשם כך, התרכובת הסינתטית ההידרופובית הלא תגובתית polytetrafluoroethylene (PTFE; עם גודל חלקיק של 1 מיקרומטר) משמשת כמיקרו-ביוריאקטור, המאפשרת יצירת מיקרו-סביבה תאית שאינה ניתנת להשגה באמצעות שימוש במערכות תרבית דו-ממדיות מסורתיות10. חלקיקי אבקת ה-PTFE נצמדים לפני השטח של טיפת הנוזל שבה התאים נתלים מחדש ומבודדים את ליבת הנוזל מהמשטח התומך, תוך שהם מאפשרים חילופי גזים בין הנוזל הפנימי לסביבה24 שמסביב. "מיקרו-ביוריאקטור PTFE" שהתקבל כך, הידוע גם בשם "שיש נוזלי", מעודד את התאים לקיים אינטראקציה חופשית זה עם זה, מקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים 25,26,27, ומרחיב ושומר ביציבות על מצב הפלסטיות הגבוהה הנרכשת למרות רמזים הקשורים לביו-מכניזנסינג10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מילאנו. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן, שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (NIH). בידוד תאים אנושיים מאנשים בוגרים בריאים אושר על ידי הוועדה האתית של אוספייל מג'ורה פוליקליניקו, מילאנו. כל השיטות במחקר שלנו בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות.
1. בידוד פיברובלסט בעור
הערה: ניתן ליישם את כל ההליכים המתוארים להלן על פיברובלסטים המבודדים ממיני יונקים שונים, כולל עכברים, חזירים ובני אדם. תאי מורין בודדו מעכברים זכרים בני 7 שבועות ורקמת עור חזירית נאספה בבית המטבחיים המקומי. תאים אנושיים בודדו מחולים מבוגרים, לאחר הסכמה מדעת בכתב.
- מכינים תמיסת ג'לטין חזירי 0.1%.
- שוקלים 0.1 גרם של ג'לטין חזירי וממיסים אותו ב-100 מ"ל מים. לעקר את תמיסת הג'לטין על ידי אוטוקלאב לפני השימוש.
- מצפים צלחת פטרי 35 מ"מ עם 0.1% ג'לטין חזירי על ידי הוספת 1.5 מ"ל של הפתרון המוכן. דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- חותכים ביופסיות עור של יונקים (עכברים, חזירים ובני אדם) באורך של כ-2-5 ס"מ ומניחים אותן בתמיסת הפוספט (PBS) של Dulbecco המכילה 2% תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית. יש לאחסן בטמפרטורה של + 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
הערה: אוספי ביופסיה חייבים להתבצע בהסכמה ולאחר אישור ועדת האתיקה, בהתאם להנחיות שנקבעו. - שטפו באופן נרחב את הביופסיות שנאספו שלוש פעמים ב-PBS סטרילי טרי המכיל 2% תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית.
- אספו ביופסיות מהשטיפה האחרונה והכניסו אותן לתוך צלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ. השתמשו באזמל סטרילי כדי לחתוך אותם לחתיכות בגודל של כ-2 מ"מ3 .
- בתום דגירה של 2 שעות, יש להסיר את עודף תמיסת הג'לטין מצלחת פטרי 35 מ"מ (המתוארת בשלב 1.1.2), ובאמצעות פינצטה כירורגית סטרילית, יש להניח מיד 5-6 שברי עור בכל תבשיל תרבית מצופה מראש.
- הרטיבו את השברים על ידי הוספת 100 μL טיפות של מדיום בידוד פיברובלסט (טבלה 1) מעל כל אחד מהם. תרבית ב 37 °C (84 °F) בחממתCO 2 5 %.
הערה: כדי למנוע מהמדיום להתאדות, הניחו את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ ומעלה המכילה מים סטריליים. הקפידו לכסות את שתי מנות הפטרי. - לאחר 24 שעות של תרבית, בדוק את כמות המדיום בצלחת פטרי תרבית 35 מ"מ. במידת הצורך, הוסיפו 500 μL של מדיום בידוד פיברובלסט כדי לשמור על הרטבת השברים.
- הסירו בזהירות את המדיום ורעננו אותו לפחות כל יומיים של תרבות באמצעות פיפטה.
- כאשר פיברובלסטים מתחילים לצמוח מתוך שברי העור המונחים בצלחת פטרי 35 מ"מ (המתוארת בשלב 1.5.) ומתחילים ליצור מונולאייר של תאים (בדרך כלל 6 ימים). הסר את חתיכות העור באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית ותרבית ב-2 מ"ל של מדיום בידוד פיברובלסט.
- יש להמשיך ולתרבת את חד שכבת התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 עד ל-80% מפגש ורענון בינוני כל יומיים.
2. תרבית תאים ראשונית פיברובלסטים
- כאשר פיברובלסטים מגיעים ל-80% מפגש, הסירו בזהירות את מדיום הבידוד הפיברובלסט ושטפו תאים שלוש פעמים עם 3 מ"ל של PBS המכילים תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית של 1%.
- לניתוק תאים, יש להוסיף 600 μL של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA בצלחת התרבית ולדגום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
- הוסיפו 5.4 מ"ל של מדיום תרבית פיברובלסטים כדי לנטרל טריפסין כאשר התאים מתחילים להתנתק מצלחת התרבית (טבלה 1).
- היפטרו מהתאים על ידי צנרת חוזרת ועדינה. תאי צלחת במנות תרבית חדשות (ללא ג'לטין), תוך שמירה על יחס המעבר בין 1:2 ל-1:4 (תלוי בקצב הגדילה).
הערה: צנטריפוגה אינה הכרחית. - לשמור על תאים בתרבית ולהחליף מדיום כל יומיים, עד שהם מגיעים ל-80% מפגש ומעבירים אותם.
הערה: הפץ פיברובלסטים פעמיים בשבוע כדי לשמור על צמיחה נמרצת.
3. חשיפה פיברובלסטית ל-5-aza-CR
- הכן פתרון מלאי טרי של 1 mM 5-aza-CR.
- שקלו 2.44 מ"ג של 5-אזה-CR והמיסו אותו ב-10 מ"ל של גלוקוז גבוה ב-DMEM. החייאת האבקה על ידי מערבולת. לעקר את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: יש להכין פתרון מלאי 5-aza-CR מיד לפני השימוש. - הכן פתרון עבודה 5-aza-CR על ידי דילול 1 μL של תמיסת מלאי 5-aza-CR (3.1.1.) ב-1 מ"ל של מדיום תרבית פיברובלסט.
הערה: הריכוז של פתרון עבודה 5-aza-CR הוא 1 μM 1,2,3,8,9.
- שקלו 2.44 מ"ג של 5-אזה-CR והמיסו אותו ב-10 מ"ל של גלוקוז גבוה ב-DMEM. החייאת האבקה על ידי מערבולת. לעקר את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
- נסה את התאים כפי שתואר קודם לכן (2.1.-2.3.) ופרק תאים על ידי צנרת חוזרת ועדינה.
- אספו את מתלי התא והעבירו אותו לצינור חרוטי.
- ספירת תאים באמצעות תא ספירה תחת מיקרוסקופ אופטי בטמפרטורת החדר. חשב את נפח המדיום הדרוש להשעיית תאים מחדש כדי לקבל 4 x 104 תאים ב-30 μL של מדיום תרבית פיברובלסט בתוספת 1 μM 5-aza-CR (ראה שלב 3.1.2.).
הערה: הנוסחה שיש להשתמש בה תלויה בסוג הספציפי של התא.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 150 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את גלולת הסופר-ננטנט וההחייאה עם מדיום תרבית הפיברובלסט בתוספת 1 μM 5-aza-CR (ראה שלב 3.1.2.). עבור נפח המדיום של תרבית פיברובלסט לשימוש ראה שלב 3.4.
הערה: כבקרה שלילית, תאי החייאה מפרסמים את אותו ריכוז במדיום תרבית פיברובלסטים ללא 5-aza-CR וממשיכים עם אנקפסולציה של תאים באבקת PTFE (שלב 4.1.-4.13.).
4. אנקפסולציה פיברובלסטית במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE
- מלאו צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ באבקת פוליאטראפלואורואתילן (PTFE) כדי לייצר מיטה (איור 1A).
הערה: השתמש בצלחות פטרי בקטריולוגיות 35 מ"מ כדי למנוע הידבקות שיש נוזלית. על מנת לקבל מעטפת הידרופובית ונקבובית דקה, השתמש באבקת PTFE עם גודל חלקיק ממוצע של 1 מיקרומטר ומיוצרת עם טחינה מקסימלית של 2.0 NPIRI. זה מאפשר יצירת גולות נוזליות חדירות בגז. יתר על כן, הציפוי השקוף מאפשר תצפית על תהליכי צבירה של תאים בזמן אמת גודל חלקיקים גדול יותר מוביל לפולידיספרסיות גבוהה שיכולה לגרום לאידוי מוגבר, עיוות ואובדן הצורה הכדורית, והתמוססות מוקדמת של המיקרו-ביוריאקטורים. - מחלקים 30 μL טיפה בודדת המכילה 4 x 104 תאים (ראו שלבים 3.4.-3.5.) על מצע האבקה (איור 1B).
- סובבו בעדינות את צלחת ה-Petri בקוטר 35 מ"מ בתנועה מעגלית כדי להבטיח שאבקת PFTE תכסה לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל כדי ליצור מיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי (איור 1C).
- הרימו את המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי באמצעות קצה פיפטה של 1,000 μL, שנחתך בקצה, כדי להתאים לקוטר השיש (איור 1D,E). צלחת המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי על צלחת פטרי בקטריולוגית נקייה כדי לייצב אותה (איור 1F).
הערה: כדי ליצור חיכוך לאחיזת השיש בתוך הקצה, חתכו את קצות הפיפטה בקוטר של מעט פחות מקוטר השיש הנוזלי. - העבירו את המיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי מצלחת הפטרי לצלחת של 96 בארות (שיש/באר אחת) (איור 1G).
- לאט לאט להוסיף 100 μL של מדיה משולי הבאר. המיקרו-ביו-ריאקטור מתחיל לצוף על גבי המדיה (איור 1H).
הערה: המיקרו-ביו-ריאקטור נשבר במגע ישיר עם נוזל, עקב ההפרעה להידרופוביות של PTFE. כגישה חלופית, ניתן למקם את המיקרו-ביוריאקטורים משיש נוזלי בנפרד בצלחת תרבית בקטריולוגית של 35 מ"מ. במקרה זה, על מנת למנוע אידוי שיש נוזלי, יש להחדיר את צלחת הפטרי 35 מ"מ המכילה את המיקרו-ביוריאקטור לצלחת פטרי 100 מ"מ, שבעבר הוטבעה במים סטריליים - אינקובציה של מיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% CO2 1,2,3,8,9.
הערה: גודל חלקיק ה-PTFE של 1 מיקרומטר יכול להבטיח חילופי גזים אופטימליים בין הנוזל הפנימי לסביבה שמסביב. - לאחר דגירה של 5-aza-CR במשך 18 שעות, אספו את המיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי באמצעות חתך קצה פיפטה של 1,000 μL בקצה (ראו שלב 4.5).
- מקם את המיקרו-ביוריאקטור בצלחת פטרי בקטריולוגית חדשה בקוטר 35 מ"מ (איור 1D-F).
- השתמש במחט כדי לנקב את השיש הנוזלי ולשבור אותו.
- ספרואידים שנוצרו משוחזרים עם קצה פיפטה של 200 μL, שנחתך בקצה, תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 1I,J).
הערה: תאים שנמחקו באופן אפיגנטי עטופים ב-PTFE יוצרים מבנה כדורי תלת-ממדי (צבירה אחת בכל שיש נוזלי). - כדי להעריך את הרכישה של מצב פלוריפוטנטי בתגובה ל-5-aza-CR, בדקו את תחילת ביטוי הגנים הקשורים לפלוריפוטנטיות, OCT4, NANOG, REX1 ו-SOX2, על ידי PCR איכותי (טבלה 2).
- המשך עם השלב השני של הפרוטוקול כמתואר להלן.
5. תרבית במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE של תאים שנמחקו אפיגנטית
- הכינו מדיום תרבות ESC טרי (טבלה 1).
- העברת אורגנואידים בצלחת פטרי המכילה מדיום ESC לשטיפת שאריות 5-aza-CR (ראה שלבים 5.1.-5.2.).
- הכינו צלחת פטרי בקטריולוגית חדשה בקוטר 35 מ"מ המכילה מצע אבקת PTFE (ראו גם שלב 4.1).
- מחלקים אורגנואיד יחיד בטיפה של 30 μL מדיום תרבית ESC על מצע האבקה באמצעות קצה פיפטה של 200 μL, שנחתך בקצה (ראו שלבים 4.9.; 5.3.).
- סובבו בעדינות את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ בתנועה מעגלית כדי ליצור מיקרו-ביו-ריאקטור חדש משיש נוזלי, הרימו אותה באמצעות קצה פיפטה של 1,000 μL, נחתכו בקצה, והניחו את המיקרו-ביוריאקטור החדש שנוצר לתוך באר של צלחת בת 96 בארות (שיש/באר אחת) (ראו שלבים 4.3.-4.6).).
- כדי להציף את המיקרו-ביוריאקטורים, הוסיפו 100 μL של מדיה משולי הבאר כדי לרחוץ לאט את השיש (ראו הערה 4.7)."
- מיקרו-ביוריאקטורים משיש נוזלי תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 של 5% למשך זמן רב ככל שנדרש. שינוי בינוני כל יומיים, בעקבות ההליך המתואר ב 5.3.-5.7.
הערה: בכתב היד הנוכחי, מסופקות תוצאות המתקבלות עם תרבית אורגנואידים במשך 28 ימים. עם זאת, במידת הצורך ניתן לבצע תקופת תרבות ארוכה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את כל השלבים שיש לבצע כדי ליצור ולתחזק ביציבות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים מתאים סומטיים בוגרים. שיטה זו הצליחה עם פיברובלסטים שבודדו ממיני יונקים שונים, כלומר עכברים, חזירים ובני אדם. התוצאות הייצוגיות כאן המדווחות מתקבלות מכל קווי התאים, ללא קשר למיני המוצא.
ניתוחים מורפולוגיים מראים כי לאחר דגירה של 18 שעות עם חומר הדה-מתילציה 5-אזה-CR, פיברובלסטים עטפו במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE (3D Post 5-aza-CR) הצטברו ויצרו מבנים כדוריים תלת-ממדיים המציגים גיאומטריית גודל אחידה, בכל שלושת המינים שנחשבו. (איור 2A-C, 3D Post 5-aza-CR). 86.31 ± 4.13% מהתאים העטופים שינו בצורה יוצאת דופן את הפנוטיפ שלהם, והראו תכונות הקשורות בדרך כלל לפנוטיפ 8בעל פלסטיות גבוהה. לעומת זאת, תאים פוסט-אזה-CR בתרבית לתנאים סטנדרטיים דו-ממדיים, למרות שהחליפו את הצורה המוארכת הפיברובלסטית הטיפוסית בצורה עגולה או אליפטית, היו קטנים משמעותית בגודלם עם גרעינים גדולים ומגורענים יותר, ושמרו על התפלגות חד-שכבתית יותר (איור 2). השינויים המורפולוגיים לוו בהתפרצות של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות הן בתאים תלת-ממדיים והן בתאי 2D Post 5-aza-CR. כמו כן נצפה תעתיק עבור הומיאובוקס 1 (OCT4), הומיאובוקס של Nanog (NANOG), חלבון אצבעות אבץ ZFP42 (REX1) ואזור קביעת מין Y-box 2 (SOX2), שנעדר בפיברובלסטים לא מטופלים (T0), (איור 3, איור 4, איור 5). יתר על כן, ניתוח PCR כמותי הדגים ויסות משמעותי של הגנים שהוזכרו לעיל, כמו גם של עשרה-11 גנים של טרנסלוקציה-2 (TET2), מולקולת הידבקות של תאי אפיתל (EPCAM) וקדהרין 1 (CDH1) בתאי 3D Post 5-aza-CR (איור 3, איור 4, איור 5, פסים כחולים) בהשוואה לתאים בתרבית במנות פלסטיק סטנדרטיות דו-ממדיות (2D Post 5-aza-CR) (איור 3, איור 4, איור 5, פסים כתומים). במקביל, ניתן היה לזהות בבירור הפחתה משמעותית של הסמן הספציפי לפיברובלסטים של אנטיגן פני השטח של תאי Thy-1 (THY1) בתאים תלת-ממדיים ודו-ממדיים לאחר 5-aza-CR (איור 3, איור 4, איור 5).
ההישג של מצב פלסטיות גבוהה אושר גם על ידי ניתוח ELISA של מתילציה גלובלית של דנ"א, המדגים ירידה משמעותית ברמות המתילציה הן בתאי 3D והן בתאי 2D Post 5-aza-CR (איור 6A-C). יתר על כן, בהסכמה עם תוצאות ביטוי הגנים, רמות המתילציה של הדנ"א היו נמוכות משמעותית בתאי 3D Post 5-aza-CR (איור 6A-C, פסים כחולים), בהשוואה לתאים דו-ממדיים מסוג Post 5-aza-CR (איור 6A-C, פסים כתומים).
באופן מעניין עוד יותר, תאי 3D Post 5-aza-CR שומרים על המבנה הכדורי התלת-ממדי הנרכש (איור 2A, 3D 28d) ושומרים על רמות ביטוי גבוהות של גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות (איור 3, איור 4 ואיור 5 פסים כחולים) כמו גם על רמות מתילציה נמוכות של DNA (איור 6A-C, פסים כחולים), במהלך כל תקופת התרבית שלאחר מכן, ובמיוחד עד 28 יום, כשהתרבות נעצרה. לעומת זאת, אף על פי שתאי פוסט 5-אזה-CR דו-ממדיים מתמללים עבור אותם גנים פלוריפוטנטיים לאחר הטיפול בחומר הדה-מתילציה, הם דחו ביטוי כזה עד יום 7 (איור 3, איור 4, איור 5, nd). באופן דומה, הירידה ברמות המתילציה נשמרה במשך 72 השעות הראשונות; לאחר מכן, המתילציה עלתה בהדרגה, וחזרה בדומה לפיברובלסטים שלא טופלו (איור 6A-C, T0, פסים לבנים) ביום ה-7 של התרבית (איור 6A-C, פסים כתומים).
איור 1: אנקפסולציה של תאים במיקרו-ביו-ריאקטור PTFE ובהתאוששות אורגנואידית. (A) צלחת פטרי בקטריולוגית מולאה ב-PTFE להכנת מיטת אבקה. (B) טיפה אחת של תאים המכילים תווך הונחה על גבי מצע ה-PTFE. (C) צלחת הפטרי סובבה בעדינות בתנועות מעגליות כדי לצפות את הטיפות ולייצר את המיקרו-ביוריאקטור. (D) קצה פיפטה של 1000 μL נחתך בסוף (חץ אדום) ו-(E) שימש לאיסוף המיקרו-ביו-ריאקטור. (F) השיש הנוזלי הועבר לצלחת פטרי נקייה כדי לייצב אותה, (G) הונחה בצלחת 96 באר (שיש/באר אחת) ו-(H) צפה על המדיה. (I) כדי לאסוף אורגנואידים חדשים שנוצרו, המיקרו-ביו-ריאקטור נוקב במחט ו-(J) אגרגטי התאים שהתקבלו נמצאו תחת סטריאומיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תאים שנמחקים באופן אפיגנטי על ידי יונקים, עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE, יוצרים מבנים כדוריים תלת-ממדיים. תאי מורין (A), חזיריים (B) ואדם (C) עטופים ב-PTFE וטופלו במבנים כדוריים תלת-ממדיים בצורת 5-aza-CR (3D Post 5-aza-CR), שנשמרו ביציבות במהלך כל תקופת התרבית שלאחר מכן (3D 28d; סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר). לעומת זאת, תאי מורין (A), חזירי (B) ואדם (C) המצופים בכלי פלסטיק וטופלו ב-5-aza-CR החליפו את הצורה המוארכת הפיברובלסטית הטיפוסית (T0) לפנוטיפ אפיתליואידי עגול ושמרו על התפלגות חד-שכבתית (2D Post 5-aza-CR). ביום ה-7 של התרבית, התאים הדו-ממדיים חזרו לצורתם המוארכת המקורית, שנשמרה ביציבות במשך תקופת התרבית שלאחר מכן (2D 28 d; סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תאים שנמחקו באופן אפיגנטי על ידי מורין, עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE, מראים רמה גבוהה ושמירה ארוכת טווח על ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות. רמות שעתוק עבור גנים Oct4, Nanog, Rex1, Sox2, Tet2, Epcam, Cdh1 ו-Thy1 בגנים של פיברובלסטים לא מטופלים של מורין (T0, פסים לבנים), פיברובלסטים שנחשפו ל-5-aza-CR (פוסט 5-aza-CR), ובנקודות זמן שונות של תרבית עבור תאי תרבית עטוף PTFE (פסים כחולים) ותבשיל פלסטיק סטנדרטי (פסים כתומים). ערכי ביטוי גנים מדווחים כאשר הביטוי הגבוה ביותר מוגדר ל-1 וכל האחרים ביחס לכך. כתב עילי שונה מציין הבדלים משמעותיים (P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תאים שנמחקו באופן אפיגנטי חזירי, עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE, מראים תחזוקה ברמה גבוהה ובטווח ארוך טווח של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנציה. רמות שעתוק עבור OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 ו-THY1 גנים בפיברובלסטים לא מטופלים חזיריים (T0, פסים לבנים), פיברובלסטים שנחשפו ל-5-aza-CR (פוסט 5-aza-CR), ובנקודות זמן שונות של תרבית עבור תאי תרבית דחוסים ב-PTFE (פסים כחולים) ותאי פלסטיק סטנדרטיים (פסים כתומים) בתרבית. ערכי ביטוי גנים מדווחים כאשר הביטוי הגבוה ביותר מוגדר ל-1 וכל האחרים ביחס לכך. כתב עילי שונה מציין הבדלים משמעותיים (P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תאים אנושיים שנמחקו באופן אפיגנטי עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE מראים רמה גבוהה ותחזוקה ארוכת טווח של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנציה. רמות שעתוק עבור OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 ו-THY1 בגנים של פיברובלסטים לא מטופלים בבני אדם (T0, פסים לבנים), פיברובלסטים שנחשפו ל-5-aza-CR (פוסט 5-אזה-CR), ובנקודות זמן שונות של תרבית עבור תאים עטופי PTFE (פסים כחולים) ותאי פלסטיק סטנדרטיים (פסים כתומים) מתורבתים. ערכי ביטוי גנים מדווחים כאשר הביטוי הגבוה ביותר מוגדר ל-1 וכל האחרים ביחס לכך. כתב עילי שונה מציין הבדלים משמעותיים (P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: המיקרו-ביו-ריאקטור של PTFE משפר את אפקט הד-מתילציה של 5-aza-CR ושומר על היפומתילציה ארוכת טווח של דנ"א בפיברובלסטים שנמחקו באופן אפיגנטי של יונקים. רמות מתילציה גלובליות של דנ"א של תאי מורין (A), חזיריים (B) ואדם (C) עטופים במיקרו-ביו-ריאקטורים של PTFE (פסים כחולים) או מצופים בפלסטיק סטנדרטי (פסים כתומים) שנחשפו ל-5-aza-CR (פוסט 5-אזה-CR) ותרביתו במדיום ESC במשך 28 ימים. פיברובלסטים לא מטופלים (T0; פסים לבנים). התוצאות מייצגות את הממוצע ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים עם חמישה שכפולים ביולוגיים בלתי תלויים. כתב עילי שונה מציין הבדלים משמעותיים (P < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מדיום בידוד פיברובלסט (100 מ"ל) | |
| DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט | 77 מ"ל |
| סרום בקר עוברי, מוסמך, חום מומת | 20 מ"ל |
| תמיסת L-גלוטמין | 1 מ"ל |
| תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית (100×) | 2 מ"ל |
| מדיום תרבית פיברובלסט (100 מ"ל) | |
| DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט | 88 מ"ל |
| סרום בקר עוברי, מוסמך, חום מומת | 10 מ"ל |
| תמיסת L-גלוטמין | 1 מ"ל |
| תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית (100×) | 1 מ"ל |
| מדיום תרבות ESC (10 מ"ל) | |
| תערובת החומרים המזינים F-10 של בשר חזיר | 3,99 מ"ל |
| DMEM, גלוקוז נמוך, פירובט | 3,99 מ"ל |
| החלפת סרום נוקאאוט | 1 מ"ל |
| סרום בקר עוברי, מוסמך, חום מומת | 500 μL |
| תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית (100×) | 100 μL |
| תמיסת L-גלוטמין | 100 μL |
| תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100X) | 100 μL |
| 2-מרקפטואתנול (10 מ"מ) | 100 μL (0.1 mM) |
| תערובת נוקלאוזידים (0.3 מ' גואנוזין, 0.3 מ' אדנוזין, 0.3 מ' ציטידין, 0.3 מ' אורידין ו-0.1 מ' ביימידין) | 100 μL (3 mM גואנוזין, 3 mM אדנוזין, 3 mM ציטידין, 3 mM אורידין ו 1 mM טימידין) |
| חלבון LIF של עכבר רקומביננטי ESGRO (1000 יחידות/מ"ל) | 10 מיקרול (1 יחידה/מ"ל) |
| FGF אנושי רקומביננטי בסיסי (bFGF) (5 מיקרוגרם/מ"ל) | 10 μL (5 ננוגרם/מ"ל) |
טבלה 1: הרכב של מדיום בידוד פיברובלסטים, מדיום תרבית פיברובלסטים ומדיום תרבית ESC.
| יעד | ערכות פריימר PCR | מינים | |
| Cdh1 | קדימה: GAGGAACCCACAGCCTCATA | עכבר | |
| הפוך: GTTGACCGTCCCTTCACAGT | עכבר | ||
| אפקם | קדימה: TGGCAACAAGTTGCTCTCTG | עכבר | |
| הפוך: CTTGTCGGTTCTTCGGACTC | עכבר | ||
| נאנוג | קדימה: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC | עכבר | |
| הפוך: CCAGGAAGACCCACACTCAT | עכבר | ||
| אוק4 | קדימה: ACACCTGGCTTCAGACTTCG | עכבר | |
| הפוך: AGTTGCTTTCCACTCGTGCT | עכבר | ||
| רקס1 | קדימה: CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC | עכבר | |
| הפוך: GACAAGCATGTGCTTCCTCA | עכבר | ||
| סוקס2 | פורוורד: AGAACCCCAAGATGCACAAC | עכבר | |
| הפוך: CTCCGGGAAGCGTGTACTTA | עכבר | ||
| טט2 | פורוורד: GCACAGGGAGCAAGAGATTC | עכבר | |
| הפוך: ATGTTGACATTGCCAGTGGA | עכבר | ||
| Thy1 | קדימה: AACTCTTGGCACCATGAACC | עכבר | |
| הפוך: GCACGTGCTTCCTCTCT | עכבר | ||
| CDH1 | קדימה: GAATGACAATGGCCCCATAC | חזיר | |
| הפוך: AGGTGGTCACCTGGTCTTTG | חזיר | ||
| EPCAM | קדימה: GCTTGGTCAGTGCCAGTGTA | חזיר | |
| הפוך: CTTCTGACCCCAGCAGTGTT | חזיר | ||
| נאנוג | קדימה: ATCCAGCTTGTCCCCAAAG | חזיר | |
| הפוך: ATTTCATTCGCTGGTTCTGG | חזיר | ||
| אוקטב4 | קדימה: GTTCAGCCAAACGACCATCT | חזיר | |
| הפוך: CTCCAGGTTGCCTCTCACTC | חזיר | ||
| רקס1 | פורוורד: CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC | חזיר | |
| הפוך: TGTCCCCAATCAAAAATGCT | חזיר | ||
| SOX2 | קדימה: GCCCTGCAGTACAACTCCAT | חזיר | |
| הפוך: GCTGATCATGTCCCGTAGGT | חזיר | ||
| טט2 | פורוורד: CAGAAAACAATGCAGCCAGA | חזיר | |
| הפוך: GAATGGCTCGGTCTGAAG | חזיר | ||
| THY1 | קדימה: GGCATCGCTCTCTTGCTAAC | חזיר | |
| הפוך: GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG | חזיר | ||
| CDH1 | קדימה: TGCCCAGAAAATGAAAAAGG | אנוש | |
| הפוך: GTGTATGTGGCAATGCGTTC | אנוש | ||
| EPCAM | קדימה: GCTGGTGTGTGAACACTGCT | אנוש | |
| הפוך: ACGCGTTGTGATCTCT | אנוש | ||
| נאנוג | פורוורד: AGAAAAACAACTGGCCGAAG | אנוש | |
| הפוך: TGCTCCAGGACTGGATGTTC | אנוש | ||
| אוקטב4 | קדימה: AATTTGCCACAAGCTCCTGAAG | אנוש | |
| הפוך: GTTGCCTCTCACTCGGTTCT | אנוש | ||
| רקס1 | קדימה: ACGTTTCGTGTGTCCCTTTC | אנוש | |
| הפוך: TATAACCGCTTTTGGGGTTG | אנוש | ||
| SOX2 | קדימה: ACACCAATCCCATCCACACT | אנוש | |
| הפוך: GCAAACTTCCTGCAAAGCTC | אנוש | ||
| טט2 | קדימה: CCCACTTACCTGCGTTTCAT | אנוש | |
| הפוך: ACTGTGACCTTTCCCCACTG | אנוש | ||
| THY1 | פורוורד: AGATCCCAGAACCATGAACC | אנוש | |
| הפוך: GCACGTGCTTCTTTTTCTCA | אנוש | ||
| יעד | מספר קטלוגי של מבחני TaqMan | מינים | |
| אקטב | Mm02619580_g1 | עכבר | |
| Cdh1 | Mm01247357_m1 | עכבר | |
| אפקם | Mm00493214_m1 | עכבר | |
| גאפדה | Mm99999915_g1 | עכבר | |
| נאנוג | Mm02019550_s1 | עכבר | |
| אוק4 | Mm03053917_g1 | עכבר | |
| רקס1 | Mm03053975_g1 | עכבר | |
| סוקס2 | Mm03053810_s1 | עכבר | |
| טט2 | Mm00524395_m1 | עכבר | |
| Thy1 | Mm00493681_m1 | עכבר | |
| אקט"ב | Ss03376563_uH | חזיר | |
| CDH1 | Ss06942341_m1 | חזיר | |
| EPCAM | Ss03384752_u1 | חזיר | |
| GAPDH | Ss03375629_u1 | חזיר | |
| נאנוג | Ss04245375_s1 | חזיר | |
| אוקטב4 | Ss03389800_m1 | חזיר | |
| רקס1 | Ss03373622_g1 | חזיר | |
| SOX2 | Ss03388002_u1 | חזיר | |
| טט2 | Ss06880359_m1 | חזיר | |
| THY1 | Ss03376963_u1 | חזיר | |
| אקט"ב | Hs01060665_g1 | אנוש | |
| CDH1 | Hs01023895_m1 | אנוש | |
| EPCAM | Hs00901885_m1 | אנוש | |
| GAPDH | Hs02786624_g1 | אנוש | |
| נאנוג | Hs02387400_g1 | אנוש | |
| אוקטב4 | Hs00999632_g1 | אנוש | |
| רקס1 | Hs00399279_m1 | אנוש | |
| SOX2 | Hs01053049_s1 | אנוש | |
| טט2 | Hs00325999_m1 | אנוש | |
| THY1 | Hs00174816_m1 | אנוש | |
טבלה 2: מידע על פריימר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך העשורים האחרונים, מספר מחקרים התמקדו בפיתוח אסטרטגיות להחזרת תא מובחנות סופנית לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ייצור ותחזוקה ארוכת טווח של תאים פלוריפוטנטיים החל מתאים בוגרים בוגרים שהתמיינו באופן סופני. השיטה משלבת שני שלבים בלתי תלויים הכוללים אינדוקציה של מצב מתירני גבוה אשר מושג באמצעות מחיקה אפיגנטית כימית ותחזוקתו לאחר מכן מובטחת באמצעות מערכת תרבית תלת-ממדית.
היווצרותם של מבנים ספרואידיים תלת-ממדיים שנצפו בתאים עטופים ב-PTFE (איור 2) עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים המדגימים את יכולת ה-PTFE לעודד ביעילות צבירת תאים, ובכך להקל על הקמת מבנים ספרואידיים של תאי חוש הריח (OEC)25 או על היווצרותם של אגרגטים טורואידיים תלת-ממדיים26. השינויים המורפולוגיים האלה מקבילים להתפרצות של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות (איור 3, איור 4, איור 5) שמראה רמות גבוהות יותר באופן משמעותי בתאי 3D Post 5-aza-CR, בהשוואה לתאי 2D Post 5-aza-CR (איור 3, איור 4, איור 5). באופן עקבי, תאי 3D Post 5-aza-CR מציגים היפומתילציה גבוהה יותר של הדנ"א בהשוואה לתאי 2D Post 5-aza-CR (איור 6). באופן כללי, תוצאות אלה מצביעות על יכולת של 5-aza-CR לגרום למצב פלסטיות גבוה, ללא קשר למערכת תרביות התאים שבה נעשה שימוש. עם זאת, מצב הפלוריפוטנטיות המושרה כימית שהושג על ידי התאים, מקודם באופן משמעותי באמצעות מיקרו-ביוריאקטור PTFE המגביר את שעתוק הגנים של פלוריפוטננסי ומגביר את השפעות הד-מתילציה של 5-aza-CR. באופן מעניין עוד יותר, רק תאי 3D Post 5-aza-CR שומרים ביציבות על המבנה הכדורי התלת-ממדי הנרכש (איור 2) ושומרים על רמות ביטוי גבוהות של גנים הקשורים לפלוריפוטנציות (איור 3, איור 4, איור 5) כמו גם על רמות מתילציה נמוכות של DNA (איור 6), במהלך כל תקופת התרבית שלאחר מכן. בסך הכל, התוצאות הייצוגיות שדווחו כאן מראות כי אסטרטגיה דו-שלבית זו יעילה וחזקה ביותר, והשימוש במיקרו-ביו-ריאקטור PTFE לא רק מגביר את הפלסטיות הגבוהה, אלא גם מאפשר את תחזוקתו היציבה וארוכת הטווח במיני היונקים הנחשבים. לאחרונה הראינו כי השפעות מועילות אלה קשורות להפעלת מסלול האיתות של היפופוטם ולרמזים הקשורים למכנוטרנסדוקציהשלו 10, שהוכחו בעבר כבעלי תפקיד מפתח בוויסות הפעיל של פלוריפוטנטיות תאים 28,29,30.
שני השלבים הקריטיים ביותר להליך מוצלח הם תחזוקה קפדנית של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, בכל עת, כולל הטיפול בהם תחת הזרימה הלמינרית הסטרילית והמיקרוסקופ ושימוש במספר תא נכון / קצב נפח נוזלי במהלך ייצור מיקרו-ביוריאקטור, שעשוי להשתנות בהתאם לסוג התא הספציפי שבו נעשה שימוש. מניסיוננו, מומלץ מאוד גם להכין ריאגנטים טריים, לפני השימוש בהם בתרבית (זה בהחלט חיוני לפתרון מלאי 5-aza-CR). יתר על כן, רענון בינוני חייב להתבצע תחת סטריאומיקרוסקופ מכיוון שהאורגנואידים הכדוריים התלת-ממדיים עלולים ללכת לאיבוד במהלך שינויים בינוניים.
החוזקות העיקריות של שיטה זו אינן דרישה וקטורית מהונדסת ו/או ויראלית; החוסן ויכולת השכפול במינים שונים של יונקים; עלויות נמוכות; וגמישות גבוהה לסוגי תאים שונים. מצד שני, מגבלה אפשרית יכולה להיות מיוצגת על ידי מספר הנתונים המוגבל המתקבל, בשל הנפחים הקטנים של המיקרו-ביוריאקטורים. בנוסף, שימוש בצפיפות תאים גבוהה עלול לגרום לשיעורי העברת חמצן נמוכים ולצמיחה מוגבלת בתרחיף. כדי להתגבר על בעיות אלה, עדיין יש צורך בעבודה נוספת על אסטרטגיות מדרגה ו/או צמצום.
חשוב להדגיש כי ההיבטים המרכזיים המשותפים לכל היישומים מבוססי הספרואידים התלת-ממדיים הם יכולת השכפול, יעילות הייצור, אחידות גודל האורגנואידים וההשפעה על הפיזיולוגיה התאית. תכונות אלה מתואמות בקפדנות עם הכוחות המכניים הנוצרים בתוך מערכת התרבית ומשתנות בהתאם לשיטות השונות בהן נעשה שימוש. לדוגמה, ניתן לתרבת אורגנואידים רב-תאיים באמצעות כלים שאינם דבקים במערכות נייחות. גישה זו מבוססת בעיקר על תנאים מוגבלים בדיפוזיה, ובדרך כלל מביאה להיווצרותם של אשכולות רופפים. טכניקת התלייה-טיפה מראה את אותה מגבלה. ואכן, התצהיר של תרחיף התאים נופל על החלק התחתון של המכסה של צלחת תרבית רקמה מוביל ליצירת סביבת מיקרו-כבידה המרכזת תאים בממשק הנוזלי-אוויר החופשי, וגורמת ליצירת כדורים רב-תאיים בעלי צבירה נמוכה. חלופה אפשרית מיוצגת על ידי טכניקת בקבוקון הספינר. עם זאת, שיטה זו יקרה מאוד מכיוון שהיא דורשת כמויות גבוהות של מדיום תרבות. יתר על כן, האורגנואידים שנוצרו צריכים להיות מועברים למערכת תרביות נייחות כאשר הם משמשים לאפיון או לבדיקות נוספות במבחנה. ניתן להתגבר על כל הבעיות הללו באמצעות מיקרו-ביוריאקטורים משיש נוזלי. ואכן, הם מספקים משטח נוזלי שאינו דביק המשלב את היתרונות של שיטות נייחות וטוויית כאחד, מה שגורם לצבירת תאים מהירה וליצירת ספרואידים קומפקטיים. במקביל, התחתית הקעורה, הצורה הכדורית והזרימה הנוזלית הפנימית של כל שיש מאפשרות לתאים להתיישב על קרקעית המיקרו-ביו-ריאקטור, וכתוצאה מכך להיווצרות אורגנואידים אחידים בגודלם ובצורתם. יתרון משמעותי נוסף בשימוש בגולות הנוזליות מיוצג על ידי חילופי הגז האופטימליים, אשר הודות לצורתם הכדורית, יכולים להתרחש דרך כל פני השטח.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירת תאים פלוריפוטנטיים יעילים ופשוטים של יונקים. מכיוון שאסטרטגיה זו היא נטולת וקטורים ויראליים ואינה כרוכה בשימוש בטרנספקציה של גנים כלשהם, היא מבטיחה מאוד ליישומי רפואה תרגומית ועשויה להיחשב כצעד קדימה בטיפול בתאים ספציפיים לחולה. יתר על כן, השימוש במערכות תרביות מיקרו-ביו-ריאקטור תלת-ממדיות עשוי להוות פריצת דרך בולטת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי גזע, ועשוי להוות מיקרו-סביבה מועילה לתרבית ארוכת טווח של סוגי תאים שונים, כגון תאי גזע, תאי גזע, iPSCs ו-MSCs. יתרון נוסף מיוצג על ידי הנפח הקטן המאפשר לחקור את ההשפעה של איתות פאראקרין /אוטוקרין של הסביבה העשירה שהוקמה בתוך המיקרו-ביוריאקטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי קרן Carraresi ומזהה מרכז המזון MiND: 1176436. כל המחברים הם חברים ב- COST Action CA16119 In vitro 3-D סה"כ הדרכה וכושר תאים (CellFit).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
