Summary
Vi præsenterer her en metode, der kombinerer brugen af kemisk epigenetisk sletning med mekanosensing-relaterede signaler til effektivt at generere pattedyrs pluripotente celler uden behov for gentransfektion eller retrovirale vektorer. Denne strategi er derfor lovende for translationel medicin og repræsenterer et bemærkelsesværdigt fremskridt inden for stamcelleorganoidteknologi.
Abstract
Cellefænotype kan vendes eller modificeres med forskellige metoder med fordele og begrænsninger, der er specifikke for hver teknik. Her beskriver vi en ny strategi, der kombinerer brugen af kemisk epigenetisk sletning med mekanosensing-relaterede signaler for at generere pattedyrs pluripotente celler. To hovedtrin er påkrævet. I det første trin udsættes voksne modne (terminalt differentierede) celler for det epigenetiske viskelæder 5-aza-cytidin for at drive dem i en pluripotent tilstand. Denne del af protokollen blev udviklet, baseret på den stigende forståelse af de epigenetiske mekanismer, der styrer celleskæbne og differentiering, og involverer brugen af den epigenetiske modifikator til at slette celledifferentieret tilstand og derefter køre ind i et forbigående vindue med høj plasticitet.
I det andet trin indkapsles slettede celler i polytetrafluorethylen (PTFE) mikrobioreaktorer, også kendt som flydende marmor, for at fremme 3D-celleomlejring for at udvide og stabilt opretholde den erhvervede høje plasticitet. PTFE er en ikke-reaktiv hydrofob syntetisk forbindelse, og dens anvendelse tillader oprettelse af et cellulært mikromiljø, som ikke kan opnås i traditionelle 2D-kultursystemer. Dette system tilskynder til og øger opretholdelsen af pluripotens gennem biomekanosensing-relaterede signaler.
De tekniske procedurer, der er beskrevet her, er enkle strategier til at muliggøre induktion og vedligeholdelse af en høj plasticitetstilstand i voksne somatiske celler. Protokollen tillod afledning af celler med høj plasticitet i alle testede pattedyrarter. Da det ikke involverer anvendelse af gentransfektion og er fri for virale vektorer, kan det repræsentere et bemærkelsesværdigt teknologisk fremskridt for translationelle medicinske applikationer. Desuden giver mikrobioreaktorsystemet et bemærkelsesværdigt fremskridt inden for stamcelleorganoidteknologi ved in vitro-genskabelse af et specifikt mikromiljø, der muliggør langsigtet dyrkning af celler med høj plasticitet, nemlig som ESC'er, iPSC'er, epigenetisk slettede celler og MSC'er.
Introduction
I løbet af de sidste årtier blev det bredt accepterede koncept om ensrettet progression mod celleengagement og differentiering fuldstændig revideret. Det er blevet påvist, at cellespecifikation kan vendes, og en terminalt differentieret celle kan skubbes mod en mindre engageret og højere tilladende tilstand ved hjælp af forskellige metoder.
Blandt de flere foreslåede metoder involverer en af de mest lovende metoder brugen af kemiske forbindelser til at inducere celler i en såkaldt kemisk induceret pluripotens. De små molekyler, der anvendes i denne tilgang, er i stand til at interagere og ændre den epigenetiske signatur af en voksen moden celle, så man undgår behovet for transgen og/eller viral vektor 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Talrige undersøgelser har for nylig vist, at det er muligt at skifte celler fra en fænotype til en anden ved at tilvejebringe specifikke biokemiske og biologiske stimuli, der inducerer reaktivering af hypermethylerede gener 11,12,13,14,15. Disse demethyleringshændelser muliggør omdannelse af terminalt differentierede celler til en primitiv stamfader, en multipotent eller en høj plasticitet/pluripotent celle 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallelt hermed har mange undersøgelser for nylig fokuseret på forståelsen af mekanosensing-relaterede signaler og mere specifikt på muligheden for at anvende mekaniske kræfter til direkte at påvirke celleplasticitet og / eller differentiering 16,17,18,19. Faktisk er det tydeligt blevet påvist, at den ekstracellulære matrix (ECM) spiller en nøglerolle i kontrollen med celleskæbne. Især de biomekaniske og biofysiske signaler produceret af ECM regulerer direkte molekylære mekanismer og signalveje, der påvirker celleadfærd og funktioner20,21. Disse nylige data har banet vejen for udviklingen af nye 3D-kultursystemer, der i tættere grad efterligner in vivo-cellemikromiljøet og replikerer mekaniske og fysiske stimuli, der driver celleadfærd.
Vi beskriver her en totrinsprotokol, der kombinerer brugen af kemisk epigenetisk sletning med mekanosensingrelaterede signaler for at generere pattedyrs pluripotente celler. I det første trin inkuberes celler med demethyleringsmolekylet 5-aza-cytidin (5-aza-CR). Dette middel er i stand til at inducere en signifikant global DNA-demethylering gennem en kombineret virkning af den direkte ti-elleve translokation 2 (TET2)-medierede virkning 8,10 og den indirekte hæmning af DNA-methyltransferaserne (DNMT)22,23. Dette trin inducerer fjernelsen af de epigenetiske blokke med en efterfølgende genaktivering af pluripotensrelateret genekspression og derfor dannelsen af celler med høj plasticitet 1,2,3,8,10, i det følgende benævnt "epigeneetisk slettede celler". I det andet trin indkapsles celler i et 3D-kultursystem. Til dette formål anvendes den ikke-reaktive hydrofobe syntetiske forbindelse polytetrafluorethylen (PTFE; med partikelstørrelse på 1 μm) som mikrobioreaktor, der gør det muligt at skabe et cellulært mikromiljø, der ikke kan opnås ved anvendelse af traditionelle 2D-kultursystemer10. PTFE-pulverpartiklerne klæber til overfladen af væskedråben, hvor cellerne suspenderes igen, og isolerer den flydende kerne fra understøtningsoverfladen, samtidig med at gasudvekslingen mellem den indre væske og det omgivende miljøtillades 24. Den således opnåede "PTFE-mikrobioreaktor", også kendt som "Flydende marmor", tilskynder celler til frit at interagere med hinanden, fremme 3D-celleomlægning25,26,27 og udvider og stabilt opretholder den erhvervede høje plasticitetstilstand gennem biomekanosensing-relaterede signaler10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser blev gennemgået og godkendt af det etiske udvalg ved universitetet i Milano. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, udgivet af US National Institutes of Health (NIH). Humane celler isolation fra raske voksne individer blev godkendt af den etiske komité for Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Alle metoderne i vores undersøgelse blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
1. Isolering af hudfibroblast
BEMÆRK: Alle de procedurer, der er beskrevet nedenfor, kan anvendes på fibroblaster isoleret fra forskellige pattedyrarter, herunder mus, svin og mennesker. Murineceller blev isoleret fra 7 uger gamle hanmus, og svineskindvæv blev indsamlet på det lokale slagteri. Humane celler blev isoleret fra voksne patienter efter skriftligt informeret samtykke.
- Forbered 0,1% svinegelatineopløsning.
- Væg 0,1 g svinegelatine og opløs den i 100 ml vand. Steriliser gelatineopløsning ved autoklavering før brug.
- Overtræk 35 mm petriskål med 0,1% svinegelatine ved tilsætning af 1,5 ml af den tilberedte opløsning. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
- Skær pattedyrs (mus, svin og mennesker) hudbiopsier på ca. 2-5 cm i længden og læg dem i Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (PBS), der indeholder 2% antibiotisk antimykotisk opløsning. Opbevares ved + 4 °C indtil brug.
BEMÆRK: Biopsiindsamlinger skal udføres efter aftale og efter Det Etiske Udvalgs godkendelse i overensstemmelse med de fastlagte retningslinjer. - Vask i vid udstrækning de indsamlede biopsier tre gange i frisk steril PBS indeholdende 2% antibiotisk antimykotisk opløsning.
- Saml biopsier fra den sidste vask og læg dem i en steril 100 mm petriskål. Brug en steril skalpel til at skære dem i stykker af ca. 2 mm3 størrelse.
- Ved afslutningen af 2 timers inkubation fjernes overskydende gelatineopløsning fra 35 mm petriskålen (beskrevet i trin 1.1.2), og ved hjælp af en steril kirurgisk pincet anbringes straks 5-6 hudfragmenter i hver forbelagt kulturskål.
- Våd fragmenterne ved at tilføje 100 μL dråber fibroblastisoleringsmedium (tabel 1) over hver af dem. Kultur ved 37 °C i 5 % CO2-inkubator .
BEMÆRK: For at forhindre, at mediet fordamper, anbringes 35 mm petriskålen i en 100 mm eller større petriskål, der indeholder sterilt vand. Sørg for at dække begge petriskåle. - Efter 24 timers kultur kontrolleres mængden af mediet i 35 mm kultur petriskålen. Hvis det er nødvendigt, tilsættes 500 μL fibroblastisoleringsmedium for at holde fragmenterne våde.
- Fjern forsigtigt mediet og opdater det mindst hver anden kulturdage ved hjælp af en pipette.
- Når fibroblaster begynder at vokse ud af hudfragmenterne placeret i 35 mm petriskålen (beskrevet i trin 1.5.) og begynder at danne et cellemonolag (normalt 6 dage). Fjern hudstykker ved hjælp af en steril kirurgisk pincet og kultur i 2 ml fibroblastisoleringsmedium.
- Fortsæt med at dyrke cellemonolaget ved 37 °C i 5 % CO2-inkubator indtil 80 % sammenløb og opdater medium hver anden dag.
2. Fibroblast primær cellelinjekultur
- Når fibroblaster når 80% sammenløb, skal du forsigtigt fjerne fibroblastisoleringsmedium og vaske celler tre gange med 3 ml PBS indeholdende 1% antibiotisk antimykotisk opløsning.
- Til celleafskærmning tilsættes 600 μL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning i kulturskålen og inkuberes ved 37 °C i 3-5 minutter.
- Tilsæt 5,4 ml fibroblastkulturmedium for at neutralisere trypsin, når cellerne begynder at løsne sig fra kulturskålen (tabel 1).
- Løsn celler ved gentagen og blid pipettering. Pladeceller i nye kulturretter (uden gelatine), der holder passageforholdet mellem 1: 2 og 1: 4 (afhængigt af væksthastigheden).
BEMÆRK: Centrifugering er ikke nødvendig. - Oprethold celler i kultur og skift medium hver anden dag, indtil de har nået 80% sammenløb og passere dem.
BEMÆRK: Formere fibroblaster to gange om ugen for at opretholde kraftig vækst.
3. Fibroblast eksponering for 5-aza-CR
- Forbered frisk 1 mM 5-aza-CR stamopløsning.
- Vej 2,44 mg 5-aza-CR og opløs det i 10 ml DMEM højt glucose. Resuspend pulveret ved hvirvel. Steriliser opløsningen med 0,22 μm filter.
BEMÆRK: 5-aza-CR stamopløsning skal fremstilles umiddelbart før brug. - Forbered 5-aza-CR-arbejdsløsning ved fortynding af 1 μL 5-aza-CR-stamopløsning (3.1.1.) i 1 ml fibroblastkulturmedium.
BEMÆRK: Koncentrationen af 5-aza-CR-arbejdsløsning er 1 μM 1,2,3,8,9.
- Vej 2,44 mg 5-aza-CR og opløs det i 10 ml DMEM højt glucose. Resuspend pulveret ved hvirvel. Steriliser opløsningen med 0,22 μm filter.
- Trypsinize celler som tidligere beskrevet (2.1.-2.3.) og løsne celler ved gentagne gange og forsigtigt pipettering.
- Saml cellesuspensionen og overfør den til et konisk rør.
- Tæl celler ved hjælp af et tællekammer under et optisk mikroskop ved stuetemperatur. Beregn det volumen af medium, der er nødvendigt for at suspendere celler igen for at opnå 4 x 104 celler i 30 μL fibroblastkulturmedium suppleret med 1 μM 5-aza-CR (se trin 3.1.2.).
BEMÆRK: Den formel, der skal bruges, afhænger af den specifikke type kammer.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 150 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspend pellet med fibroblastkulturmediet suppleret med 1 μM 5-aza-CR (se trin 3.1.2.). For volumenet af fibroblastkulturmediet, der skal anvendes, se trin 3.4.
BEMÆRK: Som en negativ kontrol, resuspend celler ad den samme koncentration i fibroblast kultur medium uden 5-aza-CR og fortsætte med celleindkapsling i PTFE pulver (trin 4.1.-4.13.).
4. Fibroblastindkapsling i PTFE-mikrobioreaktorer
- Fyld en 35 mm petriskål med polytetrafluorethylenpulver (PTFE) for at producere en seng (figur 1A).
BEMÆRK: Brug 35 mm bakteriologiske petriskåle for at undgå vedhæftning af flydende marmor. For at opnå en tynd hydrofob og porøs skal skal du anvende et PTFE-pulver med en gennemsnitlig partikelstørrelse på 1 μm og produceret med en maksimal slibning på 2,0 NPIRI. Dette giver mulighed for oprettelse af gasgennemtrængelige flydende kugler. Desuden letter den gennemskinnelige belægning observationen af celleaggregeringsprocesser i realtid Større partikelstørrelse fører til høj polydispersitet, der kan forårsage forhøjet fordampning, deformitet og tab af den sfæriske form og for tidlig opløsning af mikrobioreaktorerne. - Dispenser 30 μL enkelt dråbe indeholdende 4 x 104 celler (se trin 3.4.-3.5.) på pulverlejet (figur 1B).
- Drej forsigtigt 35 mm petriskålen i en cirkulær bevægelse for at sikre, at PFTE-pulveret helt dækker overfladen af væskedråben for at danne en mikrobioreaktor i flydende marmor (figur 1C).
- Saml mikrobioreaktoren i flydende marmor op ved hjælp af en 1.000 μL pipettespids, skåret i kanten, for at rumme marmorets diameter (figur 1D,E). Plade den flydende marmor mikrobioreaktor på en ren bakteriologi petriskål for at stabilisere den (figur 1F).
BEMÆRK: For at skabe en friktion for at gribe fat i marmoret inde i spidsen skal du skære pipettespidserne med en diameter, der er ca. lidt mindre end den flydende marmordiameter. - Overfør mikrobioreaktoren i flydende marmor fra petriskålen til en plade med 96 brønde (en marmor/brønd) (figur 1G).
- Tilsæt langsomt 100 μL medier fra brøndens margen. Mikrobioreaktoren begynder at flyde oven på mediet (figur 1H).
BEMÆRK: Mikrobioreaktoren bryder i direkte væskekontakt på grund af forstyrrelsen af PTFE-hydrofobicitet. Som en alternativ tilgang kan mikrobioreaktorerne i flydende marmor placeres individuelt i en 35 mm bakteriologikulturskål. I dette tilfælde skal 35 mm petriskålen, der indeholder mikrobioreaktoren, for at forhindre fordampning af flydende marmor indsættes i en 100 mm petriskål, der tidligere er alikteret med sterilt vand - Inkubere mikrobioreaktor i flydende marmor i 18 timer ved 37 °C i 5 % CO 2-inkubator 1,2,3,8,9.
BEMÆRK: PTFE-partikelstørrelsen på 1 μm kan sikre en optimal gasudveksling mellem den indre væske og det omgivende miljø. - Efter 5-aza-CR-inkubation i 18 timer opsamles mikrobioreaktoren i flydende marmor ved hjælp af en pipettespids på 1.000 μL, der er skåret i kanten (se trin 4.5).
- Anbring mikrobioreaktoren i en ny 35 mm bakteriologisk petriskål (figur 1D-F).
- Brug en nål til at punktere den flydende marmor og bryde den.
- Genvind dannede sfæroider med en 200 μL pipettespids, skåret i kanten, under et stereomikroskop (figur 1I,J).
BEMÆRK: Epigenetisk slettede celler indkapslet i PTFE danner en 3D sfærisk struktur (et aggregat i hver flydende marmor). - For at vurdere erhvervelsen af pluripotent tilstand som reaktion på 5-aza-CR skal du kontrollere starten på det pluripotensrelaterede genekspression, OCT4, NANOG, REX1 og SOX2, ved kvalitativ PCR (tabel 2).
- Fortsæt med det andet trin i protokollen som beskrevet nedenfor.
5. Dyrkning i PTFE-mikrobioreaktorer af epigenetisk slettede celler
- Forbered frisk ESC-kulturmedium (tabel 1).
- Overfør organoider i en petriskål indeholdende ESC-medium til vask af 5-aza-CR-rester (se trin 5.1.-5.2.).
- Forbered en ny 35 mm bakteriologisk petriskål indeholdende PTFE-pulverseng (se også trin 4.1.).
- Dispenser en enkelt organoid i en dråbe af 30 μL ESC-dyrkningsmedium på pulverlejet ved hjælp af en 200 μL pipettespids, skåret i kanten (se trin 4.9.; 5.3.).
- Drej forsigtigt 35 mm petriskålen i en cirkulær bevægelse for at danne en ny mikrobioreaktor i flydende marmor, tag den op ved hjælp af en pipettespids på 1.000 μL, skær den i kanten, og anbring den nydannede mikrobioreaktor i en brønd med 96 brønde (en marmor/brønd) (se trin 4.3.-4.6.).
- For at flyde mikrobioreaktorerne tilsættes 100 μL medier fra brøndens rand for langsomt at bade marmoret (se note 4.7.).
- Kultur flydende marmor mikrobioreaktorer ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator så længe som nødvendigt. Medium skiftes hver anden dag efter proceduren i 5.3.-5.7.
BEMÆRK: I dette manuskript gives resultater opnået med organoidkultur i 28 dage. Men om nødvendigt kan der udføres længere kulturperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nuværende protokol beskriver alle de trin, der skal udføres for at generere og stabilt opretholde pattedyrs pluripotente celler fra voksne somatiske celler. Denne metode har været vellykket med fibroblaster isoleret fra forskellige pattedyrarter, nemlig mus, svin og mennesker. De repræsentative resultater, der her rapporteres, opnås fra alle cellelinjer, uanset oprindelsesarten.
Morfologiske analyser viser, at fibroblaster indkapslet i PTFE-mikroreaktorer (3D Post 5-aza-CR) efter 18 timers inkubation med demethyleringsmidlet 5-aza-CR aggregerer og dannede 3D-sfæriske strukturer, der viser en ensartet størrelsesgeometri i alle de tre betragtede arter. (Figur 2A-C, 3D Post 5-aza-CR). 86.31 ± 4.13% af indkapslede celler ændrede bemærkelsesværdigt deres fænotype, hvilket viser træk, der typisk er relateret til en fænotype8 med høj plasticitet. I modsætning hertil var post-5-aza-CR-celler dyrket i 2D-standardbetingelser, selvom de erstattede den typiske fibroblast-aflange form med en rund eller oval, betydeligt mindre i størrelse med større og granulerede kerner, bevarer en monolagsfordeling (figur 2). De morfologiske ændringer blev ledsaget af udbruddet af pluripotensrelateret genekspression både i 3D- og 2D Post 5-aza-CR-celler. Transkription for POU klasse 5 homeobox 1 (OCT4), Nanog homeobox (NANOG), ZFP42 zinkfingerprotein (REX1) og kønsbestemmende region Y-boks 2 (SOX2) blev også observeret, som er fraværende i ubehandlede fibroblaster (T0), blev påvist (figur 3, figur 4, figur 5). Desuden viste kvantitativ PCR-analyse en signifikant opregulering af ovennævnte gener såvel som af ti-elleve translokation-2 (TET2), epitelcelleadhæsionsmolekyle (EPCAM) og cadherin 1 (CDH1) gener i 3D Post 5-aza-CR-celler (figur 3, figur 4, figur 5, blå stænger) sammenlignet med celler dyrket i 2D-standard plastskåle (2D Post 5-aza-CR) (figur 3, Figur 4, figur 5, orange søjler). Parallelt hertil var en signifikant nedregulering af den fibroblastspecifikke markør Thy-1-celleoverfladeantigen (THY1) klart påviselig i 3D- og 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 3, figur 4, figur 5).
Opnåelsen af en høj plasticitetstilstand blev også bekræftet ved ELISA-analyse af DNA-global methylering, der viser et signifikant fald i methyleringsniveauer i både 3D- og 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 6A-C). I overensstemmelse med genekspressionsresultaterne var DNA-methyleringsniveauerne desuden signifikant lavere i 3D Post 5-aza-CR-celler (figur 6A-C, blå søjler) sammenlignet med 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 6A-C, orange søjler).
Endnu mere interessant er det, at 3D Post 5-aza-CR-celler bevarer den erhvervede 3D-sfæriske struktur (figur 2A, 3D 28d) og opretholder høje ekspressionsniveauer af pluripotensrelaterede gener (figur 3, figur 4 og figur 5 blå søjler) samt lave DNA-methyleringsniveauer (figur 6A-C, blå søjler) i hele den efterfølgende dyrkningsperiode og specifikt indtil 28 dage, da kulturen blev arresteret. I modsætning hertil, selvom 2D Post 5-aza-CR-celler transskriberer for de samme pluripotensgener efter behandling med demethyleringsmidlet, afviste de en sådan ekspression på dag 7 (figur 3, figur 4, figur 5, nd). Tilsvarende blev faldet i methyleringsniveauer opretholdt i de første 72 timer; derefter steg methyleringen langsomt og returnerede sammenlignelig med ubehandlede fibroblaster (figur 6A-C, T0, hvide søjler) efter kulturdag 7 (figur 6A-C, orange søjler).
Figur 1: Celleindkapsling i PTFE-mikrobioreaktor og organoidgendannelse. (A) En bakteriologisk petriskål blev fyldt med PTFE for at forberede et pulverbed. (B) En enkelt dråbe mediumholdige celler blev udleveret oven på PTFE-sengen. (C) Petriskålen blev forsigtigt drejet med cirkulære bevægelser for at belægge dråben og producere mikrobioreaktoren. (D) En 1000 μL pipettespids blev skåret i enden (rød pil) og (E) brugt til at opsamle mikrobioreaktoren. (F) Den flydende marmor blev overført til en ren petriskål for at stabilisere den, (G) anbragt i en 96 brøndplade (en marmor / brønd) og (H) flød på medierne. (I) For at indsamle nydannet organoid blev mikrobioreaktoren punkteret med en nål, og (J) de opnåede celleaggregater blev genvundet under et stereomikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Pattedyrs epigenetisk slettede celler indkapslet i PTFE-mikrobioreaktorer danner 3D-sfæriske strukturer. Murine (A), svin (B) og humane (C) celler indkapslet i PTFE og behandlet med 5-aza-CR form 3D sfæriske strukturer (3D Post 5-aza-CR), der blev stabilt opretholdt i hele den efterfølgende dyrkningsperiode (3D 28d; Vægtbjælke, 100 μm). I modsætning hertil erstattede murine (A), svin (B) og humane (C) celler belagt på plastskåle og behandlet med 5-aza-CR den typiske fibroblast langstrakte form (T0) til en rund epithelioid fænotype og bevarede en monolagsfordeling (2D Post 5-aza-CR). På kulturdag 7 vendte 2D-celler tilbage til deres oprindelige aflange form, som blev stabilt opretholdt i den efterfølgende kulturperiode (2D 28 d; Vægtbjælke, 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Murine epigenetisk slettede celler indkapslet i PTFE-mikrobioreaktorer viser højt niveau og langsigtet vedligeholdelse af pluripotensrelateret genekspression. Transkriptionsniveauer for okt4, Nanog, Rex1, Sox2, Tet2, Epcam, Cdh1 og Thy1 gener i murine ubehandlede fibroblaster (T0, hvide stænger), fibroblaster udsat for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) og på forskellige tidspunkter af kultur for PTFE indkapslede (blå søjler) og standard plastskål (orange barer) dyrkede celler. Genekspressionsværdier rapporteres med den højeste ekspression indstillet til 1 og alle andre i forhold til dette. Forskellige superscripts angiver signifikante forskelle (P < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Epigenetisk slettede celler fra svin indkapslet i PTFE-mikrobioreaktorer viser højt niveau og langsigtet vedligeholdelse af pluripotensrelateret genekspression. Transkriptionsniveauer for OCT4-, NANOG-, REX1-, SOX2-, TET2-, EPCAM-, CDH1- og THY1-gener i ubehandlede fibroblaster (T0, hvide stænger), fibroblaster udsat for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) og på forskellige tidspunkter af kultur for PTFE indkapslede (blå stænger) og standard plastskål (orange stænger) dyrkede celler. Genekspressionsværdier rapporteres med den højeste ekspression indstillet til 1 og alle andre i forhold til dette. Forskellige superscripts angiver signifikante forskelle (P < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Humane epigenetisk slettede celler indkapslet i PTFE-mikrobioreaktorer viser højt niveau og langsigtet vedligeholdelse af pluripotensrelateret genekspression. Transkriptionsniveauer for OCT4-, NANOG-, REX1-, SOX2-, TET2-, EPCAM-, CDH1- og THY1-gener i humane ubehandlede fibroblaster (T0, hvide bjælker), fibroblaster udsat for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) og på forskellige tidspunkter af kultur for PTFE indkapslede (blå stænger) og standard plastskål (orange stænger) dyrkede celler. Genekspressionsværdier rapporteres med den højeste ekspression indstillet til 1 og alle andre i forhold til dette. Forskellige superscripts angiver signifikante forskelle (P < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: PTFE-mikrobioreaktoren forbedrer 5-aza-CR-demethyleringseffekten og opretholder langsigtet DNA-hypomethylering i pattedyrs epigenetisk slettede fibroblaster. Globale DNA-methyleringsniveauer af murin (A), svin (B) og humane (C) celler indkapslet i PTFE-mikrobioreaktorer (blå søjler) eller belagt på standardplast (orange stænger) udsat for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) og dyrket i ESC-medium i 28 dage. Ubehandlede fibroblaster (T0; hvide stænger). Resultaterne repræsenterer gennemsnittet ± SD for tre uafhængige eksperimenter med fem uafhængige biologiske replikater. Forskellige superscripts angiver signifikante forskelle (P < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Fibroblast isolation medium (100 ml) | |
| DMEM, højt glucose, pyruvat | 77 ml |
| Føtal bovin serum, kvalificeret, varme inaktiveret | 20 ml |
| L-glutaminopløsning | 1 ml |
| Antibiotisk antimykotisk opløsning (100×) | 2 ml |
| Fibroblastkultur Medium (100 ml) | |
| DMEM, højt glucose, pyruvat | 88 ml |
| Føtal bovin serum, kvalificeret, varme inaktiveret | 10 ml |
| L-glutaminopløsning | 1 ml |
| Antibiotisk antimykotisk opløsning (100×) | 1 ml |
| ESC-dyrkningsmedium (10 ml) | |
| Skinkes F-10 næringsstofblanding | 3,99 ml |
| DMEM, lav glukose, pyruvat | 3,99 ml |
| KnockOut Serum Udskiftning | 1 ml |
| Føtal bovin serum, kvalificeret, varme inaktiveret | 500 μL |
| Antibiotisk antimykotisk opløsning (100×) | 100 μL |
| L-glutaminopløsning | 100 μL |
| MEM ikke-essentielle aminosyrer opløsning (100X) | 100 μL |
| 2-Mercaptoethanol (10 mM) | 100 μL (0,1 mM) |
| Nukleosidblanding (0,3 m guanosin, 0,3 m adenosin, 0,3 m cytidin, 0,3 m uridin og 0,1 m timidin) | 100 μL (3 mM Guanosin, 3 mM Adenosin, 3 mM Cytidin, 3 mM Uridin og 1 mM Timidin) |
| ESGRO Rekombinant Mus LIF Protein (1000 enheder/ml) | 10 μL (1 enhed/ml) |
| Rekombinant human fGF basisk (bFGF) (5 μg/ml) | 10 μL (5 ng/ml) |
Tabel 1: Sammensætning af fibroblastisoleringsmedium, fibroblastkulturmedium og ESC-kulturmedium.
| Mål | PCR-primersæt | Art | |
| Cdh1 | Fremad: GAGGAACCCACAGCCTCATA | Mus | |
| Baglæns: GTTGACCGTCCCTTCACAGT | Mus | ||
| Epcam | Fremad: TGGCAACAAGTTGCTCTCTG | Mus | |
| Baglæns: CTTGTCGGTTCTTCGGACTC | Mus | ||
| Nanog | Fremadrettet: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC | Mus | |
| Baglæns: CCAGGAAGACCCACACTCAT | Mus | ||
| okt4 | Fremad: ACACCTGGCTTCAGACTTCG | Mus | |
| Baglæns: AGTTGCTTTCCACTCGTGCT | Mus | ||
| Rex1 | Fremad: CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC | Mus | |
| Baglæns: GACAAGCATGTGCTTCCTCA | Mus | ||
| Sox2 | Fremad: AGAACCCCAAGATGCACAAC | Mus | |
| Baglæns: CTCCGGGAAGCGTGTACTTA | Mus | ||
| Tet2 | Fremad: GCACAGGGAGCAAGAGATTC | Mus | |
| Baglæns: ATGTTGACATTGCCAGTGGA | Mus | ||
| Thy1 | Fremadrettet: AACTCTTGGCACCATGAACC | Mus | |
| Baglæns: GCACGTGCTTCCTCTTCTCT | Mus | ||
| CDH1 | Fremad: GAATGACAATGGCCCCATAC | Svin | |
| Baglæns: AGGTGGTCACCTGGTCTTTG | Svin | ||
| EPCAM | Fremad: GCTTGGTCAGTGCCAGTGTA | Svin | |
| Baglæns: CTTCTGACCCCAGCAGTGTT | Svin | ||
| NANOG | Fremad: ATCCAGCTTGTCCCCAAAG | Svin | |
| Baglæns: ATTTCATTCGCTGGTTCTGG | Svin | ||
| OKT4 | Fremad: GTTCAGCCAAACGACCATCT | Svin | |
| Baglæns: CTCCAGGTTGCCTCTCACTC | Svin | ||
| REX1 | Fremad: CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC | Svin | |
| Baglæns: TGTCCCCAATCAAAAATGCT | Svin | ||
| SOX2 | Fremad: GCCCTGCAGTACAACTCCAT | Svin | |
| Baglæns: GCTGATCATGTCCCGTAGGT | Svin | ||
| TET2 | Fremad: CAGAAAACAATGCAGCCAGA | Svin | |
| Baglæns: GAATGGCTCGGTCTCTGAAG | Svin | ||
| THY1 | Fremad: GGCATCGCTCTTGCTAAC | Svin | |
| Baglæns: GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG | Svin | ||
| CDH1 | Fremad: TGCCCAGAAAATGAAAAAGG | Menneskelig | |
| Baglæns: GTGTATGTGGCAATGCGTTC | Menneskelig | ||
| EPCAM | Fremad: GCTGGTGTGTGAACACTGCT | Menneskelig | |
| Baglæns: ACGCGTTGTGATCTCCTTCT | Menneskelig | ||
| NANOG | Fremad: AGAAAAACAACTGGCCGAAG | Menneskelig | |
| Baglæns: TGCTCCAGGACTGGATGTTC | Menneskelig | ||
| OKT4 | Fremad: AATTTGCCAAGCTCCTGAAG | Menneskelig | |
| Baglæns: GTTGCCTCTCACTCGGTTCT | Menneskelig | ||
| REX1 | Fremad: ACGTTTCGTGTGTCCCTTTC | Menneskelig | |
| Baglæns: TATAACCGCTTTTGGGGTTG | Menneskelig | ||
| SOX2 | Fremad: ACACCAATCCCATCCACACT | Menneskelig | |
| Baglæns: GCAAACTTCCTGCAAAGCTC | Menneskelig | ||
| TET2 | Fremadrettet: CCCACTTACCTGCGTTTCAT | Menneskelig | |
| Baglæns: ACTGTGACCTTTCCCCACTG | Menneskelig | ||
| THY1 | Fremad: AGATCCCAGAACCATGAACC | Menneskelig | |
| Baglæns: GCACGTGCTTCTTTGTCTCA | Menneskelig | ||
| Mål | TaqMan Assays katalognummer | Art | |
| Actb | Mm02619580_g1 | Mus | |
| Cdh1 | Mm01247357_m1 | Mus | |
| Epcam | Mm00493214_m1 | Mus | |
| Gapdh | Mm99999915_g1 | Mus | |
| Nanog | Mm02019550_s1 | Mus | |
| okt4 | Mm03053917_g1 | Mus | |
| Rex1 | Mm03053975_g1 | Mus | |
| Sox2 | Mm03053810_s1 | Mus | |
| Tet2 | Mm00524395_m1 | Mus | |
| Thy1 | Mm00493681_m1 | Mus | |
| ACTB | Ss03376563_uH | Svin | |
| CDH1 | Ss06942341_m1 | Svin | |
| EPCAM | Ss03384752_u1 | Svin | |
| GAPDH | Ss03375629_u1 | Svin | |
| NANOG | Ss04245375_s1 | Svin | |
| OKT4 | Ss03389800_m1 | Svin | |
| REX1 | Ss03373622_g1 | Svin | |
| SOX2 | Ss03388002_u1 | Svin | |
| TET2 | Ss06880359_m1 | Svin | |
| THY1 | Ss03376963_u1 | Svin | |
| ACTB | Hs01060665_g1 | Menneskelig | |
| CDH1 | Hs01023895_m1 | Menneskelig | |
| EPCAM | Hs00901885_m1 | Menneskelig | |
| GAPDH | Hs02786624_g1 | Menneskelig | |
| NANOG | Hs02387400_g1 | Menneskelig | |
| OKT4 | Hs00999632_g1 | Menneskelig | |
| REX1 | Hs00399279_m1 | Menneskelig | |
| SOX2 | Hs01053049_s1 | Menneskelig | |
| TET2 | Hs00325999_m1 | Menneskelig | |
| THY1 | Hs00174816_m1 | Menneskelig | |
Tabel 2: Primer information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løbet af de sidste årtier fokuserede flere undersøgelser på udviklingen af strategier til at vende en terminalt differentieret celle mod en mindre engageret og højere tilladende tilstand. Protokollen her beskrevet tillader generering og langsigtet vedligeholdelse af pluripotente celler startende fra voksne modne terminalt differentierede celler. Metoden kombinerer to uafhængige trin, der involverer induktion af en høj tilladende tilstand, som opnås gennem kemisk epigenetisk sletning og dens efterfølgende vedligeholdelse sikret ved hjælp af et 3D-kultursystem.
Dannelsen af 3D-sfæroidstrukturer observeret i PTFE-indkapslede celler (figur 2) er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der viser PTFE's evne til effektivt at tilskynde til celleaggregering, hvilket letter etableringen af olfaktoriske ensheathing cell (OEC) sfæroidstrukturer25 eller dannelsen af 3D-toroidale aggregater26. Disse morfologiske ændringer er parallelle med udbruddet af pluripotensrelateret genekspression (figur 3, figur 4, figur 5), der viser signifikant højere niveauer i 3D Post 5-aza-CR-celler sammenlignet med 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 3, figur 4, figur 5). Konsekvent viser 3D Post 5-aza-CR-celler en højere DNA-hypomethylering end 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 6). Samlet set indikerer disse resultater 5-aza-CR evne til at fremkalde en høj plasticitetstilstand, uanset hvilket cellekultursystem der anvendes. Imidlertid fremmes den kemisk inducerede pluripotenstilstand, der opnås af cellerne, signifikant ved hjælp af en PTFE-mikrobioreaktor, som øger pluripotensgentranskription og øger 5-aza-CR-demethylerende virkninger. Endnu mere interessant er det, at kun 3D Post 5-aza-CR-celler stabilt bevarer den erhvervede 3D-sfæriske struktur (figur 2) og opretholder høje ekspressionsniveauer af pluripotensrelaterede gener (figur 3, figur 4, figur 5) samt lave DNA-methyleringsniveauer (figur 6) i hele den efterfølgende kulturperiode. Alt i alt viser de repræsentative resultater, der her er rapporteret, at denne totrinsstrategi er yderst effektiv og robust, og brugen af en PTFE-mikrobioreaktor øger ikke kun den høje plasticitet, men muliggør også en stabil, langsigtet vedligeholdelse heraf hos de pågældende pattedyrarter. Vi har for nylig demonstreret, at disse gavnlige virkninger er relateret til aktiveringen af Hippo-signalvejen og dens mekanotransduktionsrelaterede signaler10, der tidligere har vist sig at have en nøglerolle i den aktive regulering af cellepluripotens 28,29,30.
De to mest kritiske trin for en vellykket procedure er den strenge vedligeholdelse af celler ved 37 °C til enhver tid, herunder deres håndtering under den sterile laminære strøm og mikroskopet og brugen af et korrekt celletal/væskevolumenhastighed under mikrobioreaktorproduktionen, som kan variere afhængigt af den specifikke celletype, der anvendes. Efter vores erfaring anbefales det også stærkt at forberede reagenser frisk, inden de anvendes i kultur (dette er helt afgørende for 5-aza-CR stamopløsning). Desuden skal medium opfriskning udføres under et stereomikroskop, da de 3D-sfæriske organoider kan gå tabt under mellemstore ændringer.
De vigtigste styrker ved denne metode er intet transgent og/eller viralt vektorkrav; robustheden og reproducerbarheden hos forskellige pattedyrarter lave omkostninger; og høj fleksibilitet til forskellige celletyper. På den anden side kan en mulig begrænsning udgøre af det begrænsede antal opnåede data på grund af mikrobioreaktorernes små mængder. Derudover kan brugen af høj celletæthed forårsage lave iltoverførselshastigheder og begrænset vækst i suspension. For at løse disse problemer er det fortsat nødvendigt at arbejde videre med opskalerings- og/eller nedskaleringsstrategier.
Det er vigtigt at fremhæve, at de vigtigste aspekter, der er fælles for alle 3D-sfæroidbaserede applikationer, er reproducerbarheden, produktionseffektiviteten, organoidstørrelsensensartetheden og indflydelsen på cellulær fysiologi. Disse egenskaber er strengt korreleret med de mekaniske kræfter, der genereres i kultursystemet, og varierer afhængigt af de forskellige anvendte metoder. For eksempel kan multicellulære organoider dyrkes ved hjælp af ikke-klæbende retter i stationære systemer. Denne tilgang er primært baseret på diffusionsbegrænsede forhold og resulterer normalt i dannelsen af løse aggregerede klynger. Hanging-drop-teknikken viser den samme begrænsning. Faktisk falder aflejringen af cellesuspension på undersiden af låget på en vævskulturskål til skabelsen af mikrogravitationsmiljø, der koncentrerer celler ved den frie væske-luft-grænseflade, hvilket inducerer dannelsen af lavaggregaterede multicellulære kugler. Et muligt alternativ er repræsenteret ved spinnerkolbeteknikken. Denne metode er imidlertid meget dyr, da den kræver forhøjede mængder kulturmedium. Desuden skal de dannede organoider overføres til stationært dyrkningssystem, når de anvendes til karakterisering eller yderligere in vitro-test. Alle disse problemer kan overvindes ved hjælp af mikrobioreaktorer i flydende marmor. Faktisk giver de en ikke-klæbende flydende overflade, der kombinerer fordelene ved både stationære og spindemetoder, hvilket inducerer en hurtig celleaggregering og dannelsen af kompakte sfæroider. Parallelt tillader den konkave bund, den sfæriske form og den indre væskestrøm af hver marmor celler at slå sig ned på bunden af mikrobioreaktoren, hvilket resulterer i dannelsen af organoider, der er ensartede i størrelse og form. En anden væsentlig fordel ved brugen af de flydende kugler er repræsenteret af de optimale gasudvekslinger, der takket være deres sfæriske form kan forekomme gennem hele overfladen.
Afslutningsvis giver den her beskrevne protokol mulighed for en effektiv og enkel generering af pattedyrs pluripotente celler. Da denne strategi er viral vektorfri og ikke involverer anvendelse af nogen gentransfektion, er den meget lovende for translationelle medicinske applikationer og kan betragtes som et skridt fremad inden for patientspecifik celleterapi. Desuden kan anvendelsen af 3D-mikrobioreaktorkultursystemer udgøre et bemærkelsesværdigt gennembrud inden for stamcelleorganoidteknologi og kan udgøre et fordelagtigt mikromiljø for langsigtet dyrkning af forskellige celletyper, såsom ESC'er, iPSC'er og MSC'er. En yderligere fordel er repræsenteret ved det lille volumen, der gør det muligt at studere effekten af parakrin / autokrin signalering af det rige miljø, der er etableret inden for mikrobioreaktoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Carraresi Foundation og MiND FoodS Hub ID: 1176436. Alle forfatterne er medlemmer af COST Action CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
