Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الأبقار المبيض القشرة الأنسجة الثقافة

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61668
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Animal Production, School of Agriculture, University of Jordan
* These authors contributed equally

Summary

في المختبر ثقافة قشرة المبيض البقري وتأثير الغذائية درج خطوة النظام الغذائي على البيئة الدقيقة المبيض هو تقديم. تم استزراع قطع قشرة المبيض لمدة سبعة أيام وتم تقييم المنشطات والسيتوكينات ومراحل الجريب. وكان العلاج النظام الغذائي درج الخطوة زيادة تولد الستيرويد مما أدى إلى تطور الجريب في الثقافة.

Abstract

تطور الجريبات من المرحلة البدائية إلى المرحلة الأنترالية هو عملية ديناميكية داخل قشرة المبيض ، والتي تشمل عوامل الغدد الصماء والباراكرين من الخلايا الجسدية والتواصل بين الخلايا الركامية. لا يعرف الكثير عن البيئة المجهرية المبيض وكيف تؤثر السيتوكينات والمنشطات المنتجة في الوسط المحيط على تطور الجريب أو الاعتقال. في المختبر ثقافة قشرة المبيض تمكن بصيلات لتطوير في بيئة طبيعية التي لا تزال مدعومة من قبل ستروما المجاورة. كان هدفنا هو تحديد تأثير النظام الغذائي الدرج الخطوة الغذائية على البيئة الدقيقة المبيض (تطوير المسام, الستيرويد, وإنتاج السيتوكين) من خلال الثقافة المختبرية من قشرة المبيض البقري. ولتحقيق ذلك، أزيلت قطع قشرية المبيض من الهيفرات التي تخضع لنظامين مختلفين تم تطويرهما غذائيا قبل البلوغ: التحكم (تطوير التغذية التقليدية) ودرج الخطوة (التغذية وتقييد أثناء التنمية) التي تم قطعها إلى ما يقرب من 0.5-1 ملم3 قطع. تم تمرير هذه القطع في وقت لاحق من خلال سلسلة من يغسل ووضعها على إدراج ثقافة الأنسجة التي يتم تعيينها في بئر تحتوي على وسيلة ثقافة وايموث. تم استزراع قشرة المبيض لمدة 7 أيام مع تغييرات وسائل الإعلام الثقافية اليومية. تم إجراء قسم النسيج لتحديد التغيرات مرحلة الجريب قبل وبعد الثقافة لتحديد آثار التغذية وتأثير الثقافة دون علاج إضافي. تم تجميع القشرة الثقافة المتوسطة على مدى أيام لقياس المنشطات, نواتج الأيض الستيرويد, والسيتوكينات. كانت هناك ميول لزيادة هرمونات الستيرويد في البيئة الدقيقة المبيض التي سمحت لتطور الجريب في الثقافات درج الخطوة مقابل التحكم قشرة المبيض. تسمح تقنية ثقافة قشرة المبيض بفهم أفضل للبيئة الدقيقة المبيضية ، وكيف يمكن أن تؤثر التعديلات في إفراز الغدد الصماء على تطور الجريب ونموه من كل من العلاجات الحية وفي المختبر. قد تكون طريقة الثقافة هذه مفيدة أيضا لاختبار العلاجات المحتملة التي قد تحسن تطور الجريب لدى النساء لتعزيز الخصوبة.

Introduction

تمثل قشرة المبيض الطبقة الخارجية للمبيض حيث يحدث تطور الجريبات1. سيتم تنشيط بصيلات البدائية ، التي تم القبض عليها في البداية في التنمية ، لتصبح بصيلات أولية أو ثانوية أو ثلاثية بناء على مدخلات الباراكرين والغدد الصماء1و2و3و4. لفهم العمليات الفسيولوجية داخل المبيض بشكل أفضل ، يمكن استخدام زراعة الأنسجة كنموذج في المختبر ، مما يسمح لبيئة خاضعة للرقابة بإجراء التجارب. وقد استخدمت العديد من الدراسات زراعة أنسجة المبيض للبحوث في التكنولوجيا الإنجابية بمساعدة, الحفاظ على الخصوبة, وسرطان المبيض5,6,7. وقد عملت أيضا زراعة أنسجة المبيض كنموذج للتحقيق في السموم الإنجابية التي تضر بصحة المبيض ومسببات الاضطرابات التناسلية مثل متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS)8و9و10و11. وبالتالي، ينطبق هذا النظام الثقافي على مجموعة واسعة من التخصصات.

في القوارض ، تم استخدام النجن الجنيني أو ما حول الولادة في تجارب البيولوجيا الإنجابية12،13،14،15. ومع ذلك، لا يمكن استزراع النجانات من الماشية المحلية الكبيرة كأعضاء كاملة بسبب حجمها الكبير وانحطاطها المحتمل. لذلك ، يتم قطع قشرة المبيض الرئيسيات غير البشرية إلى قطع أصغر16،17،18. وقد استزراع العديد من الدراسات قطع قشرة المبيض الصغيرة لدراسة عوامل النمو المختلفة (ق) في بدء الجريب البدائي في الماشية المنزلية والرئيسيات غير البشرية1،17،18،19. وقد أظهر استخدام ثقافة قشرة المبيض أيضا بدء الجريبات البدائية في غياب المصل للقطع القشرية البقرية والرئيسيات المستزرعة لمدة 7 أيام20. يانغ وفورتشن في عام 2006 تعامل الجنين قشرة المبيض ثقافة المتوسطة مع مجموعة من جرعات التستوستيرون على مدى 10 أيام، ولاحظ أن تركيز10-7 M من هرمون تستوستيرون زيادة تجنيد الجريب، والبقاء على قيد الحياة، وزيادة تطور بصيلات المرحلة المبكرة19. في عام 2007 ، وذلك باستخدام ثقافات قشرة المبيض من الأجنة البقرية (5-8 أشهر من الحمل) ، يانغ وفورتشن ذكرت دورا في عامل النمو البطانية الوعائية ألف (VEGFA) في المرحلة الانتقالية الأولية إلى الثانوية بصيلات21. وعلاوة على ذلك، استخدم مختبرنا ثقافات قشرة المبيض لإظهار كيف يمكن لأشكال VEGFA (الأوعية، ومضادات الأوعية، والجمع) تنظيم مسارات نقل الإشارات المختلفة من خلال مستقبلات مجال كيناز (KDR)، وهو مستقبل نقل الإشارات الرئيسي الذي يربط VEGFA16. سمحت هذه المعلومات بفهم أفضل لكيفية تأثير أشكال VEGFA المختلفة على مسارات الإشارات للحصول على تطور الجريب أو الاعتقال. معا, زراعة قطع قشرة المبيض في المختبر مع المنشطات المختلفة أو عوامل النمو يمكن أن يكون المقايسة قيمة لتحديد الآثار على الآليات التي تنظم تولد الجريبية. وبالمثل، قد تكون الحيوانات التي يتم تطويرها على أنظمة غذائية مختلفة قد غيرت البيئات الدقيقة المبيضية، والتي قد تعزز أو تمنع تكوين الجريبات التي تؤثر على النضج الإنجابي للإناث. وهكذا، هدفنا في المخطوطة الحالية هو الإبلاغ عن تقنية ثقافة قشرة البقر وتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات في البيئات الدقيقة المبيض بعد الثقافة المختبرية من قشرة البقر من heifers تغذية إما التحكم أو درج الخطوة الوجبات الغذائية التي تم جمعها في 13 شهرا من العمر كما هو موضح سابقا16.

لذلك ، كانت خطوتنا التالية هي تحديد البيئة الدقيقة المبيض في هذه الهيفر التي تم تطويرها مع الوجبات الغذائية المختلفة. قمنا بتقييم قشرة المبيض من heifers تتغذى إما مع درج الخطوة أو السيطرة على النظام الغذائي. وعرضت الضوابط heifers حمية صيانة 97.9 غرام / كغ0.75 لمدة 84 يوما. بدأ النظام الغذائي درج الخطوة في 8 أشهر تحتوي على نظام غذائي تغذية مقيدة من 67.4 غرام / كجم0.75 لمدة 84 يوما. بعد الأيام ال 84 الأولى ، في حين واصلت السيطرة heifers لتلقي 97.9 غرام / كغ0.75، وعرضت على درج خطوة لحوم البقر heifers 118.9 غرام / كجم0.75 لمدة 68 يوما أخرى ، وبعد ذلك تم استئصال المبيضين في 13 شهرا من سن16 لدراسة التغيرات في المراحل الجريبية ومورفولوجيا قبل وبعد الثقافة. نحن أيضا المقايسة للاختلافات في المنشطات, نواتج الأيض الستيرويد, chemokines, والسيتوكينات تفرز في وسائل الإعلام القشرة. تم قياس المنشطات وغيرها من الأيض لتحديد ما إذا كان هناك أي آثار مباشرة من العلاجات التي أجريت في الجسم الحي و / أو في المختبر على صلاحية الأنسجة والإنتاجية. قدمت التغيرات في البيئة الدقيقة المبيض قبل وبعد الثقافة لمحة عن بيئة الغدد الصماء وتولد الجريبات قبل الثقافة وكيف تؤثر الثقافة أو العلاج أثناء الثقافة على تطور الجريب أو الاعتقال.

تم جمع المبيضين بعد إجراء استئصال المبيضين في الولايات المتحدة. مركز أبحاث اللحوم الحيوانية (USMARC) وفقا لإجراءات IACUC من التحكم ودرج الخطوة heifers في 13 شهرا من العمر16، وتنظيفها مع المحلول الملحي العازلة الفوسفات العقيمة (PBS) يغسل مع 0.1 ٪ من المضادات الحيوية لإزالة الدم والملوثات الأخرى ، قلصت الأنسجة الزائدة ، ونقلها إلى جامعة نبراسكا لينكولن (UNL) مختبر علم وظائف الأعضاء التناسلية UNL في 37°C23 . في UNL، قطعت قطع قشرة المبيض إلى قطع مربعة صغيرة (~ 0.5-1 مم3؛ الشكل 1) ومثقف لمدة 7 أيام (الشكل 2). وقد أجريت الأنسجة على الشرائح ثقافة القشرة قبل وبعد الثقافة لتحديد مراحل بصيلات16،24 (الشكل 3 والشكل 4) ، والبروتينات مصفوفة خارج الخلية التي قد تشير إلى التليف (بيكو سيروس الأحمر ، PSR ؛ الشكل 5). سمح هذا بتحديد تأثير الأنظمة الغذائية في الجسم الحي على مراحل الجريب وسمح بالمقارنة بين 7 أيام من قشرة المبيض على مراحل الجريب وتطور الجريب. في جميع أنحاء الثقافة ، تم جمع الوسط وتغييره يوميا (تم جمع حوالي 70٪ من الوسائط كل يوم ؛ 250 ميكرولتر / بئر) بحيث يمكن تقييم الهرمونات اليومية / السيتوكينات / chemokines أو تجميعها على مدى أيام للحصول على متوسط التركيزات. المنشطات مثل أندروستينديون (A4) والاستروجين (E2) يمكن تجميعها على مدى 3 أيام وتقييمها من خلال التصوير الإشعاعي (ريا; الشكل 6) وتجمع على مدى 4 أيام لكل و المقايسة عن طريق قياس الطيف السائل كروماتوغرافيا الكتلة عالية الأداء (HPLC-MS)24،25 ( الجدول1). واستخدمت صفائف السيتوكين لتقييم تركيزات السيتوكين والكيموكين في زراعة قشرة المبيضالمتوسطة 26 (الجدول 2). في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR) وأجريت لوحات المقايسة لتحديد التعبير الجيني لمسارات نقل إشارة محددة كما هو موضح سابقا16. كل من الستيرويد, السيتوكين, مرحلة الجريب وعلامات النسيجية توفير لقطة من البيئة المجهرية المبيض والقرائن على قدرة تلك البيئة الدقيقة لتعزيز "طبيعية" أو "غير طبيعية" تولد الجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على المبيضين من مركز أبحاث اللحوم الأمريكي16. كما ذكر سابقا16، تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامها التابعة للمركز الأمريكي لبحوث الحيوانات اللحوم (USMARC) وفقا لدليل رعاية واستخدام الحيوانات الزراعية في البحوث الزراعية والتدريس. تم إحضار المبيضين إلى مختبر الإنجاب في جامعة نبراسكا لينكولن حيث تم تجهيزهما واستزراعهما.

1. إعداد وسائل الإعلام المطلوبة

  1. وايموث ميغابايت 752/1 المتوسطة
    1. ملء زجاجة 1 لتر زراعة الأنسجة مع 900 مل من الماء العقيم. في حين أن الماء هو اثارة بلطف على لوحة اثارة، إضافة تدريجيا المتوسطة مسحوق. بمجرد إذابة الوسط المجفف، أضف 2.24 غرام من بيكربونات الصوديوم تليها 1.25 غرام من ألبوم مصل البقر (BSA). استخدم مقياس درجة الحموضة وضبط درجة الحموضة إلى 7.25-7.35. أضف ماء معقم إضافي لرفع الحجم النهائي إلى 1 لتر.
    2. الانتقال إلى خزانة السلامة البيولوجية وإضافة كبريتات البنسلين-ستريبتومايسين بتركيز 0.1٪ v/v من الوسط. تصفية المتوسطة مع 0.22 ميكرومتر المسام 33.2 سم2 500 مل زجاجة أعلى مرشح.
    3. صب قبالة المتوسطة المصفاة في عدة أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة 0.5 مل من الأنسولين-نقل-السيلينيوم لكل 50 مل من المتوسطة المقتبسة.
    4. التفاف أنابيب مخروطية وزجاجة الأسهم من المتوسط في رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 °C. هذه الوسيلة حساسة للضوء.
      ملاحظة: يمكن تخزين وسيطة Waymouth لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. ليبوفيتز L-15 (LB-15) المتوسطة
    ملاحظة: يستخدم LB-15 المتوسطة لتنظيف الأنسجة استعدادا للثقافة.
    1. ملء زجاجة 1 لتر زراعة الأنسجة مع 900 مل من الماء العقيم. في حين أن الماء العقيم هو اثارة بلطف على لوحة اثارة، إضافة تدريجيا المتوسطة مسحوق المعدة. استخدم مقياس درجة الحموضة وضبط درجة الحموضة إلى 7.25-7.35. أضف ماء معقم إضافي لرفع الحجم النهائي إلى 1 لتر.
    2. الانتقال إلى خزانة السلامة البيولوجية. جعل 1 لتر من LB-15 مع 0.1٪ المضادات الحيوية(انظر جدول المواد ). تصفية المتوسطة إلى اثنين من زجاجات زراعة الأنسجة 500 مل باستخدام 0.22 ميكرومتر المسام 33.2 سم2 500 مل زجاجة أعلى مرشح. التفاف زجاجات في رقائق الألومنيوم كما LB-15 المتوسطة حساسة للضوء وتخزينها في 4 °C.
      ملاحظة: يمكن تخزين وسيط LB-15 لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. ملحي الفوسفات المخزنة مؤقتا (PBS)
    1. جعل برنامج تلفزيوني في المختبر أو شراء برنامج تلفزيوني عقيمة دون الكالسيوم أو المغنيسيوم (جدول المواد). لجعل برنامج تلفزيوني في المختبر، تبدأ مع 800 مل من الماء المقطر وإضافة 8 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl) لذلك. ثم أضف 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم (KCl)، و 1.44 غرام من فوسفات الصوديوم ديباسيك (Na2HPO4)،و 0.24 غرام من فوسفات البوتاسيوم ديباسيك (KH2PO4). ضبط درجة الحموضة إلى ~ 7.4 وضبط إجمالي حجم إلى 1 L. تعقيم الحل عن طريق الالاستعباد التلقائي.
    2. جعل 1 L PBS مع 0.1٪ المضادات الحيوية(انظر جدول المواد ) بينما في خزانة السلامة البيولوجية.

2. بروتوكول ثقافة القشرية المبيض

ملاحظة: تم الحصول على المبيضين من الربيع ولدت USMARC heifers في 13 شهرا من العمر. تم شطف المبيضين جيدا، وأزيلت جميع الدم والسوائل الأخرى مع برنامج تلفزيوني يحتوي على المضادات الحيوية (0.1٪) ونقلها في 37 درجةمئوية23 إلى جامعة نبراسكا لينكولن مختبر الاستنساخ UNL (1.5 ساعة بعيدا). (للحصول على تعليقات حول درجة حرارة المبيضين أثناء النقل يرجى الاطلاع على المناقشة)

  1. إعداد أنسجة المبيض على مقاعد البدلاء نظيفة (الشكل 1).
    1. تطهير مقاعد البدلاء نظيفة مع الإيثانول 70٪. ضع وسادة ماصة جديدة على سطح المقعد. تأكد من تشغيل منفاخ مقاعد البدلاء النظيف قبل نصف ساعة من تشريحه إلى جانب ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم أي شيء في المقعد النظيف ، بما في ذلك وسادة ماصة والتأكد من استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. ترتيب أطباق بيتري (60 × 15 ملم) لغسل الأنسجة. هناك حاجة إلى ثلاثة أطباق بيتري لغسل برنامج تلفزيوني، وثلاثة لبرنامج تلفزيوني مع المضادات الحيوية، وثلاثة لغسل LB-15. سيتم استخدام طبق بيتري إضافي يحتوي على LB-15 مع غطاء مصاحب لوضع القطع النهائي بعد الغسل.
    3. ملء كل طبق بيتري مع ما يقرب من 10 مل من السوائل المناسبة، إما PBS أو LB-15.

Figure 1
الشكل 1:تخطيط لوحات لغسل المبيض وقطع القشرة في مقاعد البدلاء نظيفة. (أ) برنامج تلفزيوني يستخدم لغسل المبيض كما تتم إزالة أجزاء من القشرة. (ب) برنامج تلفزيوني مع يغسل المضادات الحيوية التي يتم نقل قطع القشرة من خلال. (ج)يتم غسل قطع قشرة المبيض أربع مرات في LB-15 قبل الانتقال إلى خزانة السلامة الحيوية لغسل النهائي في LB-15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

  1. إزالة إعداد Waymouth وLB-15 المتوسطة من الثلاجة ودافئة لدرجة حرارة الغرفة.
  2. أوتوكلاف جميع الأدوات لضمان التعقيم قبل الاستخدام.
  3. الحفاظ على المبيضين عند 37 درجة مئويةحتى تصبح قشرة المبيض جاهزة للجمع.
  4. باستخدام ملقط مع الفكين مسننة، والتقاط المبيض وغسل تماما في أول طبق بيتري مليئة PBS. نقل المبيض إلى غسل PBS الثاني وتطهير تماما مرة أخرى.
    ملاحظة: سيبقى المبيض في مغسلة PBS الثانية أثناء إزالة الشرائط القشرية المبيضية.
  5. باستخدام ملقط الفك مسننة، وتأمين المبيض وشريحة في النصف. في هذا الوقت، سوف قشرة المبيض قطع بعيدا عن النخاع. باستخدام مسطرة، تأكد من إزالة ما لا يزيد عن 1-2 مم من عمق سطح المبيض بعيدا عن النخاع16. إزالة المقاطع العرضية من قشرة المبيض من النخاع، وقطع 3-4 شرائح رقيقة من قشرة المبيض(الشكل 2)مع مشرط (# 11 مشرط شفرة؛ # 3 مقبض)، ووضع الشرائط في طبق بيتري الثالثة مليئة PBS.
    ملاحظة: في هذا الوقت، يمكن جمع أنسجة قشرية المبيض إضافية لاستخراج الحمض النووي الريبي أو ثابتة وجمعها لعلم الأنسجة من القطع القشرة غير المستزرعة الأولية. عند إزالة شرائط من قشرة المبيض، تجنب المناطق ذات بصيلات أنترال مرئية أو لوبيا كوربورا. بالإضافة إلى ذلك، تجنب جمع الأنسجة النخاعية. الأنسجة من النخاع يختلف كثيرا كما هو مبين سابقا16. إذا لم يتم قطع قشرة المبيض إلى أكثر من عمق 1-2 مم ، فلا ينبغي الحصول على النخاع. الأنسجة المتميزة تسمح بالمعالم بين القشرة والندولة.
  6. قطع شرائح قشرة المبيض في برنامج تلفزيوني الثالث يغسل إلى قطع صغيرة مربعة (~ 0.5-1 مم3) مع شفرة مشرط # 21. استخدام مسطرة تحت أطباق بيتري لضمان القطع هي من حجم مماثل وسمك لجعل قطع قشرة المبيض متسقة. استخدام ملقط لتأمين شرائط في حين قطع القطع مع مشرط.
    ملاحظة: يعتمد عدد قطع الأنسجة المقطوعة على التجربة. أربع قطع من قشرة المبيض هو الحد الأدنى من الأنسجة اللازمة للثقافة. طرق أخرى لضمان طول وعمق المناسبة تشمل استخدام شرائح خاصة26 أو قطع بلاستيكية precut كنماذج27.
  7. غسل قطع المبيض القشرية من خلال كل ثلاثة برنامج تلفزيوني مع أطباق بيتري مليئة بالمضادات الحيوية. استخدام ملقط تلميح منحني لنقل القطع بين يغسل.
  8. نقل قطع القشرة من خلال سلسلة من يغسل LB-15 ومكان في النهائي LB-15 مملوءة طبق بيتري. تسمية الغطاء مع معرف الحيوان والجانب المبيض (اليسار أو اليمين).
    ملاحظة: غمر قطع قشرة المبيض بالكامل في كل غسلة لتنظيفها جيدا.
  9. جمع أربع قطع قشرة المبيض لكل المبيض وإصلاح للأنسجة اليوم صفر. ويمكن أيضا قطع إضافية تكون فلاش المجمدة للجيش الملكي النيبالي. سيتم استخدام قطع الأنسجة المتبقية للثقافة. مسح أسفل أدوات تشريح مع الإيثانول 70٪ بعد كل جمع الأنسجة.
  10. إعداد خزانة السلامة البيولوجية لغسل الأنسجة النهائي وإعداد الثقافة. تعقيم الإمدادات مع الإيثانول 70٪ قبل وضعها في خزانة السلامة البيولوجية. استخدام تقنية العقيم عند العمل في خزانة السلامة البيولوجية.
  11. نقل جميع قشرة المبيض المخصصة للثقافة إلى خزانة السلامة البيولوجية وغسل مرة أخرى في طبق بيتري LB-15 مليئة.
  12. في لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا، ماصة 350 ميكرولتر من وايموث المتوسطة لكل بئر.
  13. وضع الثقافة غير المصقولة إدراج جيدا في كل بئر باستخدام ملقط. تأكد من عدم تشكل فقاعات تحت قاعدة الإدراج لأن هذا سيؤدي إلى جفاف الأنسجة. يجب أن يكون المتوسط لمس إدراج للسماح للوسط ليتم امتصاصها وتحيط قطع قشرة المبيض.
  14. وضع بعناية أربع قطع قشرة المبيض على شبكة كل إدراج (الشكل 2). يمكن أن ثقب ملقط شبكة إذا لم يتم وضع قطع الأنسجة بدقة. قطع الأنسجة لا ينبغي أن تلمس بعضها البعض أو الجانب من إدراج.
  15. احتضان الأنسجة في 37 درجة مئويةمع 5٪ CO216.
    ملاحظة: استخدمت آخرين 38.8 درجة مئوية28. ومع ذلك، لم يلاحظ أي فرق في سلامة الأنسجة ولا في قدرة بصيلات للتقدم في 37 °C الأنسجة ولا غيرها39،30. وبالتالي، في هذه المرحلة أي من هذه درجات الحرارة ينبغي أن تكون مواتية لنجاح التجربة. وقد استخدمت آخرون 400 ميكرولتر من المتوسط. أي من المبلغين على ما يرام طالما أن واحدا هو ثابت، والأنسجة مغمورة جزئيا مما يسمح للتوتر السطحي كافية للسماح لترطيب الأنسجة (وسائل الإعلام المحيطة قطع قشرة المبيض). املأ الآبار الفارغة ب 500 ميكرولتر من المياه المعقمة للمساعدة في تقليل التبخر من الآبار الأخرى.

Figure 2
الشكل 2: قطع قشرة المبيض ولوحة الثقافة. (أ) شريط المبيض يجري قطع من قشرة المبيض. (ب)المسطرة وقطعة القشرة هو مبين جنبا إلى جنب. (ج) أربع قطع القشرة (~ 0.5-1 مم3) يستريح على إدراج في وسط الثقافة في لوحة. (د) رفع إدراج لجمع الثقافة المتوسطة من البئر. جمع واستبدال كل ثقافة المتوسطة يوميا (250 ميكرولتر) للحفاظ على pH.About 250 μL السليم يتم الحصول عليها من كل بئر كل يوم (حوالي 70٪ من المتوسط الثقافة الأولية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. جمع وسائل الإعلام

  1. تغيير ثقافة قشرة المبيض المتوسطة يوميا لمدة 7 أيام. يجب أن تكون التغييرات المتوسطة أقرب إلى 24 ساعة بعيدا قدر الإمكان لمنع درجة الحموضة الكبيرة وتغيرات اللون في المتوسط. دافئة وايموث المتوسطة إلى 37 درجة مئوية قبل تغيير متوسط. يتم الحصول على حوالي 250 ميكرولتر من كل بئر كل يوم (حوالي 70٪ من متوسط الثقافة الأولي).
  2. خلال التغييرات المتوسطة، استخدم ملقط لرفع إدراج بلطف من البئر. جمع المتوسطة وايموث المستزرعة في أنابيب 0.5 مل (حوالي 250 ميكرولتر / يوم). تعيين إدراج مرة أخرى في جيدا وإضافة 350 ميكرولتر من الثقافة الطازجة المتوسطة عن طريق الاستغناء عن المتوسط بين جانب إدراج وجيدا.
    ملاحظة: تغيير معظم وسائل الإعلام يوميا للحصول على وسائل الإعلام كافية لقياس جميع المنشطات, السيتوكينات, وchemkines اللازمة لتحديد البيئة الدقيقة المبيض. أيضا، التغيرات اليومية المتوسطة مهمة لمنع تغييرات درجة الحموضة الكبيرة (المشار إليها بتغيير اللون) في الوسط. تم الاحتفاظ قطرات من المتوسطة المحيطة قطع قشرة المبيض لضمان القطع لا تزال رطبة. لم تلاحظ أي مشاكل مع الأنسجة المستزرعة بسبب تغيير 70٪ من وسائل الإعلام.
  3. تخزين المتوسطة التي تم جمعها من زراعة الأنسجة في -20 درجة مئوية.

4. التصوير والمعالجة المصب

  1. بعد 7 أيام من الثقافة في 37 درجة مئويةمع 5٪ CO2،صورة قطع قشرة المبيض باستخدام مجهر تشريح مع كاميرا المرفقة وبرنامج تصوير الكمبيوتر.
    ملاحظة: عادة ما تكون الغرفة المظلمة هي الأفضل لتحقيق أفضل جودة للصور للتصوير.
  2. بعد التصوير، إصلاح قطعتين قشرة المبيض لكل بئر في بوينز لعلم الأنسجة وفلاش تجميد قطعتين قشرة المبيض في النيتروجين السائل للحصول على الحمض النووي الريبي لcDNA. كرر هذه الخطوة لجميع الآبار مع الأنسجة. جمع المتوسطة من اليوم 7 وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. دع قطع قشرة المبيض تبقى مغمورة في بوينز (حمض بيريك 750 مل، وحمض الخليك الجليدي 50 مل، و37٪-40٪ من الفورمالين 250 مل) لمدة 1.5 ساعة تقريبا قبل غسلها بالإيثانول بنسبة 70٪ ثلاث مرات. ستبقى الأنسجة في الإيثانول بنسبة 70٪ ويتم تطهيرها يوميا حتى لا يعود المحلول أصفر.
    ملاحظة: يمكن استخدام المثبتات الأخرى غير بوين وكذلك بارافورمالديهايد. في هذا experiement يستخدم بوينز كما هو المثبت لتحقيق مورفولوجيا الأمثل. إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من الأنسجة لتحليل آخر، يمكن الحصول على آبار إضافية من وسائل الإعلام وقطع من قشرة المبيض من كل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن استخدام هذا الإجراء ثقافة القشرة البقرية لتحديد مجموعة واسعة من هرمون, السيتوكين, وبيانات الأنسجة من قطع صغيرة من المبيض. تلطيخ، مثل هيماتوكسيلين ويوسين (H &؛ E)، يمكن استخدامها لتحديد مورفولوجيا المبيض من خلال الجريبالتدريج 16،23،31 ( الشكل3). لفترة وجيزة، تم تصنيف بصيلات كما البدائية، وهو البويضات محاطة بطبقة واحدة من الخلايا الحرشفية قبل الجرانولوزا (0)؛ بصيلات انتقالية أو الأولية المبكرة، وهي البويضات محاطة في الغالب الخلايا الحرشفية قبل الجرانلوزا وبعض خلايا الحبيبية التكعيبية (1)؛ بصيلات الأولية، وهو البويضات محاطة 1-1.5 طبقات من خلايا الحبيبية التكعيبية (2)؛ جريب ثانوي، وهو البويضات محاطة بخلايا حبيبية أو أكثر من الحبيبية التكعيبية (3)؛ جريب أنترال، الذي لا يزيد قطره عن 1 مم وتحيط به طبقتان أو أكثر من خلايا الغرانولوزا التي تحتوي على أنتروم متميز (4)16،23 ( الشكل3). يمكن إجراء التدريج الجريب على قشرة المبيض ثابتة قبل وبعد الثقافة لتقييم تولد الجريبات(الشكل 4). أخذنا ثلاث صور لكل شريحة من ثلاث شرائح مختلفة ملطخة H &؛ E. ثم تم تنظيم الجريبات وإحصاءها من قبل ثلاثة أفراد وبلغ متوسطها تحديد عدد الجريبات في كل مرحلة16،23. مساحة مجال الرؤية لصورة (ثلاثة لكل شريحة) في 400x التكبير هو 0.4mm2. وهكذا، تم احتساب 30٪ من مساحة قطع قشرة المبيض لتحديد مراحل الجريب. يستخدم عدد المسام الأولي(قبل الثقافة) (الشكل4A)لتطبيع الجريبات التي يتم عدها بعد الثقافة (الشكل 4B).

بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشير الاختلافات في مورفولوجيا كما يحددها ترسب الكولاجين (بيكو سيروس الأحمر تلطيخ) التليف في قشرة المبيض من درج الخطوة أو التحكم heifers (الشكل 5). يمكن تجميع المجموعة اليومية من الثقافة المتوسطة على مدى 3 أيام لتقييم إنتاج هرمون الستيرويد المتنوعة من قبل ريا (باستخدام 200 ميكرولتر عينة متوسطة لكل حيوان; الشكل 6) أو الأيض الستيرويد باستخدام قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC-MS; 220 ميكرولتر عينة متوسطة مجمعة على مدى 4 أيام لكل حيوان; الجدول 1) وإنتاج السيتوكين (الجدول 2). لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى عدة تكرارات لحيوان واحد لضمان ما يكفي من القشرة المتوسطة لأداء جميع المقايسات المطلوبة.

لأن درج خطوة heifers زادت بصيلات البدائية في بداية الثقافة كنا نتوقع هذه التقدم في الثقافة والحصول على عدد أكبر من بصيلات الثانوية، والتي لاحظنا في النتائج. أيضا, بسبب زيادة في بصيلات الثانوية, نتوقع تركيزات أكبر من المنشطات. لقد رأينا ميلا إلى زيادة الاندروجين ، ونواتج الأيض الجلوكوكورتيكويد ، ونواتج الأيض البروجسترون ، والتي من شأنها أن تدعم هذا في المخطوطة الحالية. وقد قيم مختبرنا أيضا آثار isoforms VEGFA مختلفة على تطور الجريب، تولد الستيرويد، وتفعيل جزيئات نقل إشارة مختلفة في KDR (المعروف أيضا باسم الأوعية الدموية مستقبلات عامل النمو البطاني 2؛ VEGFR2) باستخدام لوحات صفيف تحويلالإشارة 16. للحد من التباين الحيواني، نستخدم 4-6 لكل علاج والتجارب الأخرى اعتمادا على تحليل الطاقة وتقلب استخدمنا ما يصل إلى 11.

تكرار النتائج من ثقافة قشرة المبيض البقري هو الأكثر تأثرا بتلوث قطع قشرة المبيض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث نتائج سالبة أو دون المستوى إذا لم يتم تغيير الوسيطة بانتظام خلال فترة 24 ساعة. الوسط عند إضافته في الأصل هو وردي اللون ، ولكن عندما يتم جمع الوسط ، ويبدو أن اللون برتقالي أو أصفر مشرق ، يمكن أن يشير ذلك إلى تغيير في درجة الحموضة التي يمكن أن تضر بالأنسجة. أيضا، قطع الأنسجة التي يتم قطع كبيرة جدا قد تتطور انحطاط في الوسط التي لن يلاحظها حتى تقسيم الأنسجة لعلم الأنسجة. هذا الانحطاط سوف يحد من استخدام الأنسجة للتحليل. تم تحليل البيانات المعروضة في هذه الورقة باستخدام اختبارات غير قياسية وتحليل نموذج خطي عام في برنامج إحصائي. تم تحليل عدد بصيلات البدائية والابتدائية والثانوية والأنطرية لكل قسم قبل وبعد الثقافة باستخدام نموذج مختلط خطي معمم. وحددت الأهمية في P < 0.05 وأبلغ عن اتجاه عند 0.14 ≤ P ≥ 0.05.

Figure 3
الشكل 3:هيماتوكسيلين و تلطيخ اليوسين للجريبات التدريج من قشرة المبيض. يشار إلى مراحل مختلفة من الجريبات بواسطة السهام. (أ)بصيلات بدائية (المرحلة 0)؛ (ب) بصيلات الأولية المبكرة (المرحلة 1)؛ (ج) بصيلات الأولية (المرحلة 2)؛ (د) المسام الثانوية (المرحلة 3)؛ (ه) بصيلات أنترال (المرحلة 4). مساحة مجال الرؤية لصورة في 400x التكبير هو 0.4 مم2. نحن نعد 30٪ من مساحة قطع قشرة المبيض لتحديد مراحل الجريب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: متوسط عدد الجريبات في مراحل الجريبية المختلفة في التحكم (n = 6) ودرج الخطوة (n = 6) heifers. (A) قبل الثقافة P البدائية = 0.001 ، P الابتدائي المبكر = 0.12 ، P الابتدائي = 0.31 ، P الثانوي = 0.22. (ب) بعد 7 أيام من الثقافة، P البدائية = 0.37، الابتدائي المبكر P = 0.84، الابتدائي P = 0.69، P الثانوية = 0.02. تمثل أشرطة الخطأ SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: الكولاجين (بيكو سيريوس الأحمر; PSR) تلطيخ في قشرة المبيض. PSR في (أ) التحكم ودرج خطوة heifers من اليوم 0 واليوم 7. (ب)رسم بياني يقارن متوسط مساحة تلطيخ إيجابي PSR لكل حقل قشرة المبيض (بكسل / μm2) بين التحكم (ن = 4) ودرج الخطوة (ن = 4) heifers. تمثل أشرطة الخطأ SEM. منطقة مجال الرؤية لصورة عند تكبير 400x هي 0.4 مم2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تركيزات A4 و E2. (A) تركيز A4 و (B) تركيز E2 تجمع على مدى 3 أيام من الثقافة في وسائل الإعلام قشرة المبيض من السيطرة ودرج خطوة heifers كما تقاس RIA. n = 4 لكل مجموعة. تمثل أشرطة الخطأ SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

هرمونات تحكم درج الخطوة قيمة P 
n 4 4
نانوغرام/مل دني ± SEM دني ± SEM
دكتور 0.33 0.28 0.72 0.48 0.15
نزل 0.61 0.60 4.93 3.99 0.08
كورت 0.003 0.003 0.01 0.01 0.85
17OHP 0.59 0.53 1.88 0.99 0.08
A4 1.46 1.43 5.74 3.27 0.08
  0.15 0.09 0.54 0.32 0.08
دهياس 4.50 2.60 7.59 0.85 0.56
E2 0.05 0.05 0.13 0.08 0.32
P4 5.05 2.78 6.52 1.66 0.39
T 0.33 0.33 1.33 0.96 0.14
دهت 0.07 0.02 0.01 0.01 0.09
DOC - 11-ديوكسيكورتيكوستيرون، INN - 11-Deoxycortisol, CORT – كورتيكوسترون, 17OHP – 17-هيدروكسيبروجيستيرون, A4- أندروستينديون, AN – أندروسترون, DHEAS – ديهيدروبياندروستيرون كبريتات, E2 - استراديول, P4 – البروجسترون, T – التستوستيرون, DHT - ديهدروتستوسترون

الجدول 1: المنشطات والستيرويد الأيض تقاس في المبيض القشرة ثقافة المتوسطة من بئر واحد لكل تجمع على مدى 4 أيام من الثقافة. البيانات المقدمة مع متوسط ± SEM. الأزرق يشير P < 0.1 ولديه ميل إلى أن تكون مختلفة.

السيتوكينات تحكم درج الخطوة قيمة P
n 4 4
pg/mL دني ± SEM دني ± SEM
ANG1 27.29 11.71 63.66 25.06 0.39
CD40L 4527.01 2986.34 3537.59 3537.59 0.74
DCN  1307.68 320.87 996.54 282.96 0.77
INFβ 0.36 0.36 0.002 0.002 0.85
IL18 0.00 0.00 1832.89 1265.33 0.13
ليف  97.45 88.12 337.58 231.25 0.54
رانت 698.06 322.59 1254.13 811.19 0.56
INFγ 4.49 1.37 3.68 0.65 0.77
IL13 501.21 285.07 810.81 159.67 0.25
IL21 24.38 9.51 18.52 6.17 0.56
IL1F5 5.07 3.85 5.40 1.70 0.56
TNFα 61.45 35.00 44.91 13.41 0.77
ANG1 – أنجيوبويتين 1, CD40L – CD40 ليغاند, DCN – Decorin, IFNβ – إنترفيرون بيتا 1, IL18 – Interleukin-18, LIF – مصنع مثبطة لسرطان الدم, RANTES – ينظم على التنشيط, العادي تي الخلية أعرب وإفراز, IFNа – إنترفيرون غاما, IL13 – Interleukin 13, IL21 – إنترلوكين 21, IL1F5 – Interleukin 1 فرد الأسرة 5, TNFα – عامل نخر الورم ألفا

الجدول 2: السيتوكين والكيموكينات مقاسة في وسط ثقافة قشرة المبيض من بئر واحد لكل مجمع على مدى 4 أيام من الثقافة. البيانات المقدمة مع متوسط ± SEM. الأزرق يشير P < 0.1-0.14 ولديه ميل إلى أن تكون مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فائدة ثقافة قشرة المبيض في المختبر ، كما هو موضح في هذه المخطوطة ، هي أن الجريبات تتطور في بيئة طبيعية مع ستروما مجاورة تحيط بصيلات. تبقى الخلايا الجسدية والبويضات سليمة، وهناك اتصال مناسب من خلية إلى خلية كنموذج في الجسم الحي. وقد وجد مختبرنا أن نظام الثقافة لمدة 7 أيام يوفر بيانات تكوين الجريبات والتمثيلية لعلاج قشرة المبيض. بروتوكولات زراعة أنسجة المبيض الأخرى إما فترات زراعة قصيرة نسبيا 1-6 أيام7،32 أو فترات زراعة طويلة من 10-15 يوما5،6،10. ومع ذلك، لاحظنا أن زراعة لأكثر من 7 أيام يؤدي إلى تدهور الأنسجة، وانخفاض تولد الستيرويد، وربما زيادة احتمال التلوث (البيانات غير مبين). كما يوفر زراعة قشرة المبيض بعد استئصال المبيضين نظرة مباشرة إلى البيئة الدقيقة المبيضية داخل ذلك الحيوان بالذات. وهذا أمر مهم لمختبر أبحاثنا حيث حددنا التغيرات في النمو الجريبي بعد فرض الأنظمة الغذائية بعد فطامها وتؤدي إلى البلوغ في heifers16.

تطور الجريبات من المرحلة البدائية إلى المرحلة الأنترالية هو عملية ديناميكية داخل قشرة المبيض ، والتي تشمل عوامل الغدد الصماء والباراكرين من الخلايا الجسدية واتصالات الخلايا النيوية الركامية33. توفر زراعة الأنسجة، مثل زراعة قشرة المبيض، بيئة خاضعة للرقابة للتحقيق في الدور الميكانيكي لهذه العوامل وبيئة الغدد الصماء في البيئة الدقيقة المبيضية. يمكن جمع المبيضين من الحيوانات التي مرت بعلاج في الجسم الحي أو تم تغييرها وراثيا لتحديد الآثار على تطور الجريب.

يمكن أيضا جمع المبيضين من مسلخ محلي (على بعد ساعة واحدة) ونقله عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في الترمس الذي يحتوي على PBS بالمضادات الحيوية. إذا كان النقل أطول (على سبيل المثال، بين عشية وضحاها)، يتم شحن المبيضين أو نقلها على الجليد22. وقد لوحظت نتائج مماثلة سواء كان نقل المبيضين يحدث على الجليد بين عشية وضحاها أو عند 37 درجة مئوية مع النقل على المدى القصير في الترمس. 37 درجة مئوية مع نقل الترمس يسمح لحصاد البويضات من هذا النسيج لنضوج المختبر (IVM) أو الإخصاب في المختبر (IVF)34. وقد وجدت دراسات أخرى أن نقل الأنسجة في درجات حرارة تتراوح بين 2-8 درجة مئوية قد استخدمت أيضا للحفاظ على الخصوبة في الأنسجة التناسلية35،36،37. ومع ذلك استخدمت دراسات أخرى المبيضين المنقولة في 34-37 درجة مئوية وعلى الجليد ولم تلاحظ اختلافات في زراعة الأنسجة البقرية38.

إذا كانت أنسجة زراعة قشرة المبيض لا تبدو صحية بعد الثقافة، وهذا يمكن أن يكون بسبب قطعة من قشرة المبيض يجري كبيرة جدا. خطوة حاسمة في البروتوكول هو التأكد من أن قطع قشرة المبيض لا تزيد عن 0.5-1 مم3. نحن نستخدم مسطرة لقياس القطع واستخدام مقياس داخل المجهر تشريح لتحديد حجم قطع قشرة المبيض(الشكل 2C). وتستخدم أجهزة أخرى معدات محددة (انظر جدول المواد)لسمك موحد وطول / عرض، على التوالي26. إذا كانت هذه القطع من المعدات غير متوفرة، ثم يمكن استخدام المربعات البلاستيكية إلى كقالب للحصول على سمك موحد وضمان حجم مماثلقطعة 27.

لضمان قطع القطع التي هي فقط من القشرة وليس لديهم النخاع بعد غسل المبيض نضعه في طبق 60 ملم وقطع في النصف. القشرة و medulla مختلفة جدا من الناحية النسيجية كما رأينا سابقا في Abedal-Majed, 202016. يتم فيليه كل نصف المبيض مع شفرة لضمان إزالة القشرة فقط من المبيض وبقايا النخاع. إذا كان الأفراد قد بدأوا للتو في اتقان تقنية القطع هذه ، فيمكنهم أيضا استخدام الأحمر المحايد لرؤية الأنسجة عن كثب لكل نصف المبيض39. وهذا سيسمح لتطوير المعالم كما تقنية القطع الخاصة بهم، ويحسن. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تستخدم الأدوات التي يمكن أن تقطع سمك موحد (انظر جدول المواد) كما ذكر أعلاه26،27.

يجب أن يكون متوسط قشرة المبيض وردي فاتح. لقد لاحظنا أن درجة الحموضة في زراعة قشرة المبيض تتغير بسرعة في بعض الحيوانات ، وبالتالي ، يجب تغيير غالبية (70٪ ) من وسط قشرة المبيض كل 24 ساعة لتعزيز صحة الثقافة. وقد ناقشت الأوراق السابقة تغيير نصف المتوسط اليومي40. كان سبب تغيير غالبية وسائل الإعلام في المخطوطة الحالية هو تعزيز صحة ثقافات قشرة المبيض. قطرات المحيطة قطع قشرة المبيض لا تزال قائمة وليس هناك آثار سلبية للتغيير المتوسط على الثقافة. وعلاوة على ذلك، سمح لنا هذا بتحليل المزيد من الهرمونات والسيتوكينات والكيموكينات لكل لتوليد نظرة ثاقبة على البيئة الدقيقة المبيض.

يوفر بروتوكول زراعة الأنسجة هذا مزايا عديدة. يسمح زراعة قشرة المبيض للجريبات بالتطور في بيئة مشابهة للبيئة الحية. لا تزال الجريبات مدعومة بالستروما المحيطة بها ويستمر التواصل بين الخلايا الجسدية والخلايا الركامية. استخدام إدراج بئر الثقافة تمكن قشرة المبيض للراحة على وسيط الثقافة دون أن تغمرها المياه، وبالتالي منع الأنسجة من الربط إلى قاعدة بلاستيكية من لوحة البئر. ميزة أخرى هي نافذة الثقافة. توفر نافذة الثقافة لمدة 7 أيام الموضحة في البروتوكول بيانات تمثيلية عن الهرمونات وعامل النمو. بالإضافة إلى ذلك ، يستمر تكوين الجريبات في التقدم في هذه البيئة المختبرية حيث قمنا بحساب عدد أقل من الجريبات المبكرة (البدائية) والمزيد من الجريبات المتأخرة (الثانوية ، الأنترال) بعد 7 أيام من الثقافة16. استخدمت بروتوكولات زراعة أنسجة المبيض السابقة قصيرة نسبيا (1-6 أيام7،32)أو طويلة (10-15 يوما5،6،10) فترات الثقافة. وقد استخدمت نوافذ الثقافة أقصر للتحقيق في تنشيط المسام البدائية في قشرة المبيض البقري الجنين41. في الرئيسيات غير البشرية ، تم استخدام فترة زراعة مدتها 20 يوما لتقييم قدرة بصيلات الرئيسيات البدائية على البقاء على قيد الحياة وبدء النمو في المختبر في المتوسط الخالي من المصل18. ومع ذلك، لاحظنا زيادة تدهور الأنسجة عند زراعة قشرة الأبقار المبيض لأكثر من 7 أيام في المتوسط الخالي من المصل. لقد حددنا أيضا في تحليل العينات اليومية أن يتم تقليل تركيزات الستيرويد بعد 4 أيام من الثقافة (البيانات غير مبين). يمكن أن تزيد نافذة الثقافة الأطول أيضا من إمكانية التلوث في ثقافات قشرة المبيض. لذلك، يمكن قياس الآثار الرئيسية من خلال 7 أيام من الثقافة15 ووقت الثقافة قد تعتمد على نموذج الحيوان والمسألة العلمية التي تعالج.

في حين أن العديد من مزايا هذا البروتوكول قشرة المبيض البقري موجودة، وهناك بعض القيود. أحد القيود هو كمية الأنسجة القشرية المبيض وحجم متوسط الثقافة التي تم جمعها خلال ثقافة القشرية المبيض. يسمح الحجم الصغير لقطع قشرة المبيض باستخدام عدد محدود من أقسام الأنسجة لأغراض التلطيخ (H&,E، الفلورة المناعية، إلخ). لأداء RT-PCR، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن أربع قطع القشرة16. وعلاوة على ذلك، فإن الحجم المنخفض للوسط الثقافي الذي يتم جمعه قد يحد من كمية التحليلات التي تجرى. لمكافحة هذه القيود، نقترح زراعة العديد من التكرارات لكل مبيض لتوفير إمدادات كافية من الأنسجة والوسط الثقافي لعلم الأنسجة والمقاولات وال PCR. في كثير من الأحيان نحن ثقافة عدة قطع من كل المبيض من بقرة واحدة / heifer للحصول على مزيد من الأنسجة لمزيد من التحليل والحصول على زيادة الثقافة المتوسطة لقياس إفراز القشرة من الهرمونات / السيتوكينات / chemokines. بصيلات ما قبل الروائب هي أكثر انتشارا في المبيضين البقر الأكبر سنا من الإناث الأصغر سنا (heifers). وهكذا، هناك قيد محتمل هو الحصول على بصيلات ما قبل الأنف على جميع قطع قشرة المبيض المستزرعة. عدة طرق للتخفيف من هذا القيد هو الحصول على المزيد من قطع قشرة المبيض وزراعة آبار إضافية لكل أو استخدام الأحمر المحايد لتصور الجريبات وضمان أن جميع قطع القشرة تحتوي على بصيلات ما قبل الأنف المبكرة. القيد الثالث لثقافة قشرة المبيض هو أن أي تلوث لنظام الثقافة يجعل وسائل الإعلام وقطع القشرة غير صالحة للاستخدام للتحليل. وهكذا، عدة طرق للحفاظ على بيئة معقمة هو تصفية المتوسطة المستخدمة في الثقافة. قبل معالجة وقطع قطع قشرة المبيض تأكد من أن مقاعد البدلاء النظيفة قد تم تعقيمها مع الإيثانول 70٪، وتدفق الهواء قد تم تشغيل لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تشريح. أيضا، إذا كان استخدام لوحة ماصة لتمكين أسهل تنظيف (الشكل 1)،تأكد من أن ضوء الأشعة فوق البنفسجية قد تم تشغيل لمدة 30 دقيقة قبل وضع أي أنسجة في مقاعد البدلاء نظيفة لتعقيم لوحة ومقاعد البدلاء نظيفة. وأخيرا، ينبغي إجراء جميع التغييرات وسائل الإعلام في خزانة السلامة البيولوجية مع تدفق الهواء الكافي، والأدوات العقيمة، وتغيير نصائح ماصة لضمان إدخال نصائح عقيمة فقط في المتوسط لوضعها في آبار لثقافة قشرة المبيض.

تطبيق هذه التقنية سوف يساعد في فهم البيئة الدقيقة المبيض، ويمكن أن تبدأ في كشف الآليات المشاركة في الاضطرابات التناسلية الأنثوية التي تنطوي على تغيير التنمية الجريبية. على سبيل المثال، لا تزال مسببات متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) وجوانب فشل المبيض المبكر (POF) غير واضحة. وبما أن الأبقار أحادية الإباضة، فإنها تصنع نموذجا ممتازا لفهم العوامل التي تؤثر على تطور المسام والاعتقال في الأنواع الأحادية الإباضة الأخرى (مثل البشر والرئيسيات غير البشرية). وعلاوة على ذلك، قد تكون طريقة زراعة قشرة المبيض هذه مفيدة أيضا لاختبار العلاجات المحتملة التي قد تحسن الاضطرابات بوساطة الجريبات مما يؤدي إلى العقم لدى النساء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا البحث المعهد الوطني للأغذية والزراعة 2013-67015-20965 إلى ASC، جامعة نبراسكا للمنح التنافسية الغذائية للصحة إلى ASC. وزارة الزراعة الأمريكية هاتش منح NEB26-202/W3112 الانضمام #1011127 إلى ASC, هاتش-NEB ANHL الانضمام #1002234 إلى ASC. مبادرة علوم الحياة الكمية دعم الباحثين الصيفيين بعد الدكتوراه – جائزة COVID-19 للتمويل الصيفي ل CMS.

ويود المؤلفون أن يقدموا تقديرهم للدكتور روبرت كوشمان، المركز الأميركي لأبحاث اللحوم، مركز كلاي، NE لشكره على توفير المبيضين في منشور سابق، والتي استخدمت بعد ذلك في الورقة الحالية كدليل على المفهوم في التحقق من صحة هذه التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scapel Blade Swann-Morton  303 Scaple Blade
#21 Scapel Blade Swann-Morton  307 Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter Corning 430514 Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay Biocrates Sterol17 Kit Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned 
Androstenedione Double Antibody RIA Kit MPBio 7109202 RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit  DIA Source  KIP0451 RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3 RayBiotech QAB-CYT-3-1 Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3 Olympus 7790 Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco ThermoFisher Scientific 5150056 Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium Gibco ThermoFisher Scientific 4130039 Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet 
Microscope  Olympus SZX16 Disection microscope used for imaging tissue culture pieces 
Microscope Camera  Olympus DP71 Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter Millipore Sigma PICM01250 Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate Falcon 353047 Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm Falcon 351007 Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) Corning 21-040-CV Used for tissue washing
SAS Version 9.3 SAS Institute  9.3 TS1M2 Statistical analysis software 
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer Thomas Scientific 6727C10 Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium Sigma-Aldrich W1625 Medium used for tissue cultures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Tags

علم الأحياء، العدد 167، قشرة المبيض البقري، الهرمونات، الجريبات، زراعة الأنسجة، الثقافة المتوسطة، المنشطات، السيتوكينات
الأبقار المبيض القشرة الأنسجة الثقافة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sutton, C. M., Springman, S. A.,… More

Sutton, C. M., Springman, S. A., Abedal-Majed, M. A., Cupp, A. S. Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture. J. Vis. Exp. (167), e61668, doi:10.3791/61668 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter