Summary
In vitro kultur av nötkreatur äggstockscancer cortex och effekten av näringsmässiga Stair-steg diet på äggstockscancer mikromiljön presenteras. Äggstockscancer cortex bitar odlades i sju dagar och steroider, cytokiner och follikel stadier utvärderades. Stair-Step diet behandling hade ökad steroidogenes som resulterar i follikel progression i kultur.
Abstract
Follikelutveckling från det ursprungliga till antralstadiet är en dynamisk process inom äggstocksbarken, som inkluderar endokrina och parakrrinfaktorer från somatiska celler och cumulus cell-oocyte kommunikation. Lite är känt om äggstocksmikromiljön och hur cytokinerna och steroider som produceras i den omgivande miljön påverkar follikelprogression eller gripande. In vitro-kulturen av äggstocksbarken gör det möjligt för folliklar att utvecklas i en normaliserad miljö som förblir stödd av intilliggande stroma. Vårt mål var att bestämma effekten av näringsmässiga Stair-Step diet på äggstockscancer mikromiljön (follikel utveckling, steroid och cytokin produktion) genom in vitro kultur av nötkreatur äggstockscancer cortex. För att uppnå detta avlägsnades äggstockscancer kortikala bitar från kvigor som genomgår två olika näringsutvecklade system före puberteten: Kontroll (traditionell näringsutveckling) och Trappsteg (utfodring och begränsning under utveckling) som skars i cirka 0,5-1 mm3 stycken. Dessa bitar passerades därefter genom en serie tvättar och placerades på en vävnadsodlingsinsats som sätts in i en brunn som innehåller Waymouths odlingsmedium. Äggstockscancer cortex odlades i 7 dagar med dagliga kultur media förändringar. Histological avsnitt utfördes för att bestämma follikel steg förändringar före och efter kulturen för att bestämma effekter av näring och inverkan av kultur utan ytterligare behandling. Cortex kultur medium poolades över dagar för att mäta steroider, steroid metaboliter, och cytokiner. Det fanns tendenser för ökade steroidhormoner i äggstockscancer som möjliggjorde follikelprogression i trappsteg kontra kontroll äggstocksbarken kulturer. Äggstocksbarkens kulturteknik möjliggör en bättre förståelse för äggstocksmikromiljön och hur förändringar i endokrin utsöndring kan påverka follikelprogression och tillväxt från både in vivo- och in vitro-behandlingar. Denna kulturmetod kan också visa sig fördelaktig för att testa potentiella terapier som kan förbättra follikelprogression hos kvinnor för att främja fertilitet.
Introduction
Äggstocksbarken representerar äggstockens yttre skikt där follikelutveckling sker1. Primordial folliklar, ursprungligen arresterade i utveckling, kommer att aktiveras för att bli primära, sekundära och sedan antral eller tertiära folliklar baserade på parakrina och gonadotropin ingångar1,2,3,4. För att bättre förstå fysiologiska processer inom äggstocken kan vävnadskulturen användas som in vitro-modell, vilket möjliggör en kontrollerad miljö för att utföra experiment. Många studier har använt äggstocksvävnadskultur för forskning inom assisterad reproduktiv teknik, fertilitetsbevarande och äggstockscancer5,6,7. Äggstocksvävnadskultur har också fungerat som en modell för att undersöka reproduktiva toxiner som skadar äggstockshälsan och etiologin av reproduktiva störningar som polycystiskt äggstockssyndrom (PCOS)8,9,10,11. Således är detta kultursystem tillämpligt på ett brett utbud av specialiteter.
Hos gnagare har hela fetala eller perinatala gonads använts i reproduktionsbiologi experiment12,13,14,15. Gonads från större husdjur kan dock inte odlas som hela organ på grund av deras stora storlek och potentiella degenerering. Därför skärs nötkreatur och icke-mänskliga primater äggstocksbarken i mindre bitar16,17,18. Många studier har odlat små äggstocksbarkbitar för att studera olika tillväxtfaktorer i ursäcksinitiering i tamdjur och icke-mänskliga primater1,17,18,19. Användningen av äggstocksbarkkulturen har också visat primordial follikelinitiering i avsaknad av serum för nötkreatur och primater när som odlas i 7 dagar20. Yang och Fortune i 2006 behandlade fetala äggstockscancer cortex kulturmedium med en rad testosteron doser under 10 dagar och observerade att10-7 M koncentrationen av testosteron ökade follikel rekrytering, överlevnad, och ökad progression av tidiga stadium folliklar19. År 2007, med hjälp av äggstocksbarkkulturer från nötkreatursfoster (5-8 månaders graviditet), rapporterade Yang och Fortune en roll för Vaskulär endoteltillväxtfaktor A (VEGFA) i den primära till sekundära follikelövergången21. Dessutom har vårt laboratorium använt äggstocksbarkkulturer för att visa hur VEGFA-isoformer (angiogena, antiangiogena och en kombination) kan reglera olika signaltransduktionsvägar genom Kinasdomänreceptorn (KDR), som är den viktigaste signaltransduktionsreceptorn som VEGFA binder16. Denna information möjliggjorde en bättre förståelse för hur olika VEGFA-isoformer påverkar signalvägar för att framkalla follikelprogression eller gripande. Sammantaget, odling av äggstockscancer cortex bitar in vitro med olika steroider eller tillväxtfaktorer kan vara en värdefull analys för att bestämma effekter på mekanismer som reglerar folliculogenesis. På samma sätt kan djur som utvecklas på olika näringssystem ha förändrat äggstocksmikromiljön, vilket kan främja eller hämma folliculogenesis som påverkar kvinnlig reproduktiv mognad. Således är vårt mål i det nuvarande manuskriptet att rapportera bovin cortex kulturteknik och avgöra om det finns skillnader i äggstockscancermiljön efter in vitro-odling av bovin cortex från kvigor som matas antingen Kontroll eller Trappsteg dieter som samlats in vid 13 månaders ålder som beskrivits tidigare16.
Därför var vårt nästa steg att bestämma äggstockscancermiljön i dessa kvigor som utvecklades med olika näringsdieter. Vi utvärderade äggstockscancer cortex från kvigor matas med antingen en Trappa-Steg eller Kontroll diet. Kontrollkvigor erbjöds en underhållsdiet på 97,9 g/kg0,75 i 84 dagar. Stair-Step dieten inleddes vid 8 månader som innehåller en begränsad matad diet på 67,4 g/kg0,75 i 84 dagar. Efter de första 84 dagarna, medan kontrollkvigor fortsatte att få 97,9 g/kg0,75,erbjöds Stair-Step nötköttskvigor 118,9 g/kg0,75 i ytterligare 68 dagar, varefter de ovariektomiserades vid 13 månaders ålder16 för att studera förändringar i follikulära stadier och morfologi före och efter kultur. Vi analyseras också för skillnader i steroider, steroid metaboliter, kemoker, och cytokiner utsöndras i cortex media. Steroider och andra metaboliter mättes för att avgöra om det fanns några direkta effekter från behandlingar som utförts in vivo och/eller in vitro på vävnadens livskraft och produktivitet. Förändringar i äggstockscancer mikromiljön före och efter kultur gav en ögonblicksbild av den endokrina miljön och folliculogenesis före kultur och hur kultur eller behandling under kultur påverkar follikel progression eller gripande.
Äggstockar samlades in efter att ovariektomier utfördes vid U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) enligt deras IACUC-procedurer från Control and Stair-Step-kvigor vid 13 månaders ålder16,rengjorda med steril fosfatbuffertsaltlösning (PBS) tvättar med 0,1% antibiotikum för att avlägsna blod och andra föroreningar, trimmad överskottsvävnad och transporteras till University of Nebraska-Lincoln (UNL) ReproductivePhysiology Laboratory . Vid UNL skars äggstocksbarkbitar i små fyrkantiga bitar (~ 0,5-1 mm3; Bild 1) och odlas i 7 dagar (figur 2). Histologi utfördes på cortexkulturens diabilder före och efter kultur för att bestämma folliklarna steg16,24 (figur 3 och figur 4), och extracellulära matrisproteiner som kan indikera fibros (Picro-Sirus Red, PSR; Bild 5). Detta möjliggjorde bestämning av effekten av in vivo näringsmässiga regimer på follikelstadier och tillät jämförelse av 7 dagar av äggstocksbarken på follikelstadier och follikelprogression. Genom hela kulturen samlades mediet in och ändrades dagligen (cirka 70% av media samlades in varje dag; 250 μL/brunn) så att antingen dagliga hormoner/cytokiner/kemoker kan bedömas eller poolas under dagar för att erhålla genomsnittliga koncentrationer. Steroider såsom androstenedione (A4) och östrogen (E2) kan poolas över 3 dagar och bedömas genom radioimmunoassay (RIA; Bild 6) och poolade under 4 dagar per djur och analyseras via högpresterande vätskekromatografi-masspektrometri (HPLC-MS)24,25 (tabell 1). Cytokinmatriser användes för att bedöma cytokin- och kemokinkoncentrationer i äggstocksbarkens odlingsmedel medium26 (tabell 2). Realtids polymeraskedjereaktion (RT-PCR) analysplattor genomfördes för att bestämma genuttryck för specifika signaltransduktionsvägar som visats tidigare16. Alla steroid, cytokin, follikelstadiet och histologiska markörer ger en ögonblicksbild av äggstockscancer mikromiljön och ledtrådar om förmågan hos den mikromiljön att främja "normala" eller "onormala" folliculogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Äggstockarna erhölls från U. S. Meat Animal Research Center16. Som tidigare nämnts16godkändes alla förfaranden av U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee i enlighet med guiden för vård och användning av jordbruksdjur inom jordbruksforskning och undervisning. Äggstockarna fördes till University of Nebraska-Lincoln Reproductive Laboratory där de bearbetades och odlades.
1. Förberedelse av erforderliga medier
-
Waymouth MB 752/1 medium
- Fyll en 1 L vävnadsodlingsflaska med 900 ml sterilt vatten. Medan vattnet försiktigt rörs på en omrörningsplatta, tillsätt gradvis det pulveriserade mediet. När det pulveriserade mediet har lösts, tillsätt 2,24 g natriumbikarbonat följt av 1,25 g bovint serumalbumin (BSA). Använd en pH-mätare och justera pH-värdet till 7,25-7,35. Tillsätt ytterligare sterilt vatten för att få den slutliga volymen till 1 L.
- Flytta till ett biologiskt säkerhetsskåp och tillsätt penicillin-streptomycinsulfat vid en koncentration av 0,1% v/v av mediet. Filtrera mediet med en 0,22 μm por 33,2 cm2 500 mL flaskfilter.
- Häll av det filtrerade mediet i flera 50 ml koniska rör. Tillsätt 0,5 ml insulin-transferrin-selen per 50 ml alikvoterat medium.
- Linda in de koniska rören och lagerflaskan av mediet i aluminiumfolie och förvara vid 4 °C. Detta medium är ljuskänsligt.
OBS: Waymouth medium kan lagras i upp till 1 månad.
-
Leibovitzs L-15 (LB-15) medium
OBS: LB-15 medium används för att rengöra vävnad som förberedelse för odling.- Fyll en 1 L vävnadsodlingsflaska med 900 ml sterilt vatten. Medan det sterila vattnet försiktigt rörs på en omrörningsplatta, tillsätt gradvis det beredda pulveriserade mediet. Använd en pH-mätare och justera pH-värdet till 7,25-7,35. Tillsätt ytterligare sterilt vatten för att få den slutliga volymen till 1 L.
- Flytta till biologiskt säkerhetsskåp. Gör 1 L LB-15 med 0,1% antibiotika (se Tabell över material). Filtrera mediet i två 500 ml vävnadsodlingsflaskor med en 0,22 μm por 33,2 cm2 500 ml flaskfilter. Wrap flaskor i aluminiumfolie som LB-15 medium är ljuskänslig och förvaras vid 4 °C.
OBS: LB-15 medium kan lagras i upp till 1 månad.
-
Buffrad saltlösning (PBS)
- Gör PBS i labbet eller köp steril PBS utan kalcium eller magnesium(Tabell över material). För att göra PBS i labbet, börja med 800 ml destillerat vatten och tillsätt 8 g natriumklorid (NaCl) till det. Tillsätt sedan 0,2 g kaliumklorid (KCl), 1,44 g natriumfosfatdibasisk (Na2HPO4)och 0,24 g kaliumfosfatdibasisk (KH2PO4). Justera pH till ~7,4 och justera den totala volymen till 1 L. Sterilisera lösningen genom autoklavering.
- Gör 1 L PBS med 0,1% antibiotikum (se tabell över material)medan du är i ett biologiskt säkerhetsskåp.
2. Protokoll för kortikal kultur i äggstocken
OBS: Äggstockar erhölls från vår födda USMARC kvigor vid 13 månaders ålder. Äggstockar sköljdes noggrant, och allt blod och annan vätska togs bort med PBS som innehåller antibiotika (0,1%) och transporteras vid 37 °C23 till University of Nebraska-Lincoln Reproduction Laboratory UNL (1,5 h bort). (För kommentarer om äggstockarnas temperatur under transporten, se Diskussion)
- Förbered äggstocksvävnaden på en ren bänk (figur 1).
- Desinficera den rena bänken med 70% etanol. Placera en ny absorberande dyna på bänkskivan. Se till att den rena bänkfläkten är påslagen en halvtimme före dissekering tillsammans med UV-ljus för att sterilisera allt i den rena bänken, inklusive absorberande dyna och se till att lämplig personlig skyddsutrustning används.
- Ordna Petri-disken (60 x 15 mm) för vävnadstvättar. Tre Petri-rätter krävs för PBS-tvätt, tre för PBS med antibiotika och tre för LB-15-tvättar. En extra LB-15-innehållande Petri-skål med medföljande lock kommer att användas för slutlig placering av bitar efter tvätt.
- Fyll varje Petri-skål med cirka 10 ml lämpliga vätskor, antingen PBS eller LB-15.
Bild 1:Utformning av plattorför tvättning av äggstocks- och cortexbitarna i den rena bänken. (A) PBS som används för att tvätta äggstocken när delar av cortex tas bort. (B) PBS med antibiotika tvättar som cortex bitar flyttas igenom. (C) Äggstocksbarkbitar tvättas fyra gånger i LB-15 innan de flyttas till biosäkerhetsskåpet för slutlig tvätt i LB-15. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Ta bort det beredda Waymouth- och LB-15-mediet från kylskåpet och värm till rumstemperatur.
- Autoklavera alla verktyg för att säkerställa sterilisering före användning.
- Håll äggstockarna vid 37 °C tills äggstocksbarken är redo att samlas in.
- Använd tång med sågtandade käkar, plocka upp äggstocken och tvätta noggrant i den första PBS-fyllda Petri-skålen. Överför äggstocken till den andra PBS-tvätten och rengör noggrant en gång till.
OBS: Äggstocken stannar i den andra PBS-tvätten medan äggstocksbanden tas bort. - Använd sågtandade käktårar, säkra äggstocken och skiva i hälften. Vid denna tidpunkt kommer äggstocksbarken att skära bort från medulla. Se till att inte mer än 1–2 mm äggstocksdjup avlägsnas bort från medulla16med hjälp av en linjal. Ta bort tvärgående delar av äggstocksbarken från medulla, skär 3–4 tunna remsor av äggstocksbarken (figur 2) med en skalpell (#11 skalpellblad; #3 handtag) och placera remsorna i den tredje PBS-fyllda Petri-skålen.
OBS: Vid denna tidpunkt kan ytterligare äggstockscancer när vävnad samlas in för RNA extraktion eller fixas och samlas in för histologi av inledande icke-odlade cortex bitar. När du tar bort remsor av äggstocksbarken, undvik områden med synliga antral folliklar eller korpora lutea. Undvik dessutom att samla medullär vävnad. Medullas histologi är mycket annorlunda som visats tidigare16. Om äggstocksbarken inte skärs till mer än ett 1-2 mm djup, bör medullan inte erhållas. Distinkt histologi möjliggör landmärken mellan cortex och medulla. - Skär äggstocksbarkens remsor i den tredje PBS-tvätten i små, fyrkantiga bitar (~ 0,5-1 mm3) med ett #21 skalpellblad. Använd en linjal under Petri-disken för att säkerställa att bitarna är av liknande storlek och tjocklek för att göra konsekventa äggstocksbarkbitar. Använd tång för att säkra remsorna medan du skär bitarna med en skalpell.
OBS: Antalet vävnadsbitar som skärs beror på experimentet. Fyra bitar av äggstocksbarken är den minsta mängden vävnad som behövs för kultur. Andra metoder för att säkerställa lämplig längd och djup är att använda speciella utsnitt26 eller förskurna plastbitar som mallar27. - Tvätta äggstockscancer kortikala bitar genom alla tre PBS med antibiotikafyllda Petri-rätter. Använd en böjd spetstång för att flytta bitar mellan tvättar.
- Flytta cortexbitar genom serien av LB-15 tvättar och placera i den slutliga LB-15-fyllda Petri-skålen. Märk locket med djur-ID och äggstockssida (vänster eller höger).
OBS: Sänk ner äggstocksbarken i varje tvätt helt för noggrann rengöring. - Samla fyra äggstockscancer cortex bitar per äggstock och fixa för dag noll histologi. Ytterligare bitar kan också blixtfrysas för RNA. De återstående vävnadsbitarna kommer att användas för odling. Torka av dissekeringsverktyg med 70% etanol efter varje vävnadssamling.
- Förbered ett biologiskt säkerhetsskåp för slutlig vävnadstvätt och odlingsberedning. Sanera förnödenheter med 70% etanol innan du placerar i det biologiska säkerhetsskåpet. Använd den aseptiska tekniken när du arbetar i det biologiska säkerhetsskåpet.
- Flytta all äggstocksbark avsedd för kultur till det biologiska säkerhetsskåpet och tvätta igen i en LB-15-fylld Petri-maträtt.
- I en 24-brunns mjukpappersodlingsplatta, pipetter 350 μL Waymouth medium per brunn.
- Placera obelagda kulturbrunnsinsatser i varje brunn med tång. Se till att inga bubblor bildas under skärbasen eftersom detta skulle leda till att vävnaden torkar ut. Mediet måste vidröra skären så att mediet kan absorberas och omge äggstocksbarken.
- Placera försiktigt fyra äggstocksbarkstycken på nätet på varje skär(figur 2). Tången kan punktera nätet om vävnadsbitarna inte är ömtåligt placerade. Vävnadsbitarna får inte vidröra varandra eller sidan av insatsen.
- Inkubera vävnaden vid 37 °C med 5% CO216.
OBS: Andra har använt 38,8 °C28. Ingen skillnad har dock observerats i vävnadens integritet eller i folliklarnas förmåga att utvecklas i 37 °C-vävnad och har inte heller andra39,30. Således bör någon av dessa temperaturer vid denna tidpunkt bidra till experimentframgång. Andra har använt 400 μL medium. Endera mängden är bra så länge man är konsekvent, och vävnaden är delvis nedsänkt vilket möjliggör tillräcklig ytspänning för att möjliggöra hydrering av vävnad (media som omger äggstocksbarkbitar). Fyll tomma brunnar med 500 μL sterilt vatten för att minska avdunstningen från andra brunnar.
Figur 2: Äggstockscancer cortexbitar och odlingsplatta. (A) En äggstocksremsa som skärs från äggstockens cortex. (B) Linjal och cortex bit visas sida vid sida. (C) Fyra cortexbitar (~ 0,5-1 mm3) som vilar på skäret i odlingsmediet i plattan. ( D) Lyft insatsen för att samla odlingsmediet från brunnen. Samla in och byt ut allt odlingsmedium dagligen (250 μL) för att bibehålla korrekt pH.Cirka 250 μL erhålls från varje brunn varje dag (ca 70% av det ursprungliga odlingsmediet). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
3. Mediesamling
- Ändra äggstocksbarken kultur medium dagligen i 7 dagar. Medelstora förändringar bör vara så nära 24 h från varandra som möjligt för att förhindra stora pH- och färgförändringar i medium. Varmt Waymouth medium till 37 °C före medelstor förändring. Cirka 250 μL erhålls från varje brunn varje dag (ca 70% av det ursprungliga odlingsmediet).
- Vid medelstora byten, använd tång för att försiktigt lyfta insatsen ur brunnen. Samla det odlade Waymouth-mediet i 0,5 ml rör (cirka 250 μL /dag). Sätt tillbaka insatsen väl och tillsätt 350 μL färskt odlingsmedium genom att fördela mediet mellan sidan av insatsen och brunnen.
OBS: Ändra de flesta medier dagligen för att få tillräckligt med media för att mäta alla steroider, cytokiner, och kemoker som behövs för att bestämma äggstockscancermiljön. Dagliga medelstora förändringar är också viktiga för att förhindra stora pH-ändringar (indikeras av färgförändring) i mediet. Droppar av medium behölls kring äggstockscancer cortex bitar för att säkerställa att bitarna förblev våta. Inga problem observerades med odlad vävnad på grund av att ändra 70% av media. - Förvara det insamlade mediet från vävnadskulturen vid -20 °C.
4. Avbildning och nedströmsbearbetning
- Efter 7 dagars kultur vid 37 °C med 5% CO2, avbilda äggstocksbarken med hjälp av ett dissekeringsmikroskop med en ansluten kamera och ett datoravbildningsprogram.
OBS: Ett mörkt rum är oftast bäst för att uppnå bästa bildkvalitet för avbildning. - Efter imaging, fixa två äggstockscancer cortex bitar per brunn i Bouins för histologi och flash frysa två äggstockscancer cortex bitar i flytande kväve för att erhålla RNA för cDNA. Upprepa detta steg för alla brunnar med vävnad. Samla mediet från dag 7 och lagra vid -20 °C.
- Låt äggstocksbarken förbli nedsänkta i Bouins (picric syra 750 ml, glaciär ättiksyra 50 ml och 37%-40% formalin 250 ml) i cirka 1,5 h innan de tvättas med 70% etanol tre gånger. Vävnaden kommer att finnas kvar i 70% etanol och rensas dagligen tills lösningen inte längre är gul.
OBS: Andra fixativ än Bouins samt paraformaldehyd kan användas. I denna erfarenhet används Bouins eftersom det är fixativt för att uppnå optimal morfologi. Om mer vävnad krävs för annan analys kan ytterligare brunnar av media och bitar av äggstocksbarken erhållas från varje djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta nötkreatur cortex odling förfarande kan användas för att bestämma en mängd olika hormon, cytokin och histologi data från små bitar av äggstocken. Färgning, såsom hematoxylin och eosin (H&E), kan användas för att bestämma äggstocksmorfologi genom follikel iscensättning16,23,31 ( figur3). Kort klassificerades folliklar som primordial, vilket är en äggcell omgiven av ett enda lager av skivefekta pre-granulosa celler (0); Övergångsfollikel eller tidig primär, som är en äggcell omgiven av mestadels skivevikande pre-granulosaceller och vissa kuboida granulosaceller (1). primär follikel, som är en äggcell omgiven av 1-1,5 lager kuboida granulosaceller (2); sekundär follikel, som är en äggcell omgiven av två eller flera kuboida granulosaceller (3); antral follikel, som inte är större än 1 mm i diameter och omgiven av två eller flera lager granulosaceller som innehåller ett distinkt myrrum (4)16,23 ( figur3). Follikel iscensättning kan utföras på äggstocksbarken fixerad före och efter kultur för att bedöma folliculogenesis (figur 4). Vi tog tre bilder per bild från tre olika bilder färgade med H&E. Sedan iscensattes och räknades folliklarna av tre individer och i genomsnitt för att bestämma antalet folliklar vid varje steg16,23. Området i synfältet för en bild (tre per bild) vid 400x förstoring är 0,4 mm2. Således räknades 30% av området för äggstocksbarken bitar för att bestämma follikelstadier. Det ursprungliga follikelnumret(före odling) (figur 4A) används för att normalisera de folliklar som räknas efter odling (figur 4B).
Dessutom kan skillnader i morfologi som bestäms av kollagendeposition (Picro Sirus Red färgning) indikera fibros i äggstocksbarken från Trappsteg eller Kontrollkvigor (Figur 5). Daglig insamling av odlingsmedium kan poolas under 3 dagar för att bedöma varierad steroidhormonproduktion av RIA (med 200 μL mediumprov per djur; Bild 6) eller steroidmetaboliter med hjälp av högpresterande vätskekromatografimasspektrometri (HPLC-MS; 220 μL mediumprov som samlats under 4 dagar per djur; Tabell 1) och cytokinproduktion(tabell 2). Därför kan flera replikat av ett djur krävas för att säkerställa tillräckligt med cortexmedium för att utföra alla önskade analyser.
Eftersom Stair-Step kvigor har ökat ursprungliga folliklar i början av kulturen förväntade vi oss att dessa skulle utvecklas i kultur och få ett större antal sekundära folliklar, vilket vi observerade i resultaten. Också, på grund av ökning av sekundära folliklar, Vi skulle förvänta oss större koncentrationer av steroider. Vi såg tendens till ökningar av androgener, glukokortikoider metaboliter, och progesteron metaboliter, som skulle stödja detta i det nuvarande manuskriptet. Vårt labb har också utvärderat effekter av olika VEGFA-isoformer på follikelprogression, steroidogenes och aktivering av olika signaltransduktionsmolekyler i KDR (även känd som Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2; VEGFR2) med hjälp av signaltransduktionsplattor16. För att minska djurvariationen använder vi 4-6 djur per behandling och för andra experiment beroende på effektanalys och variabilitet har vi använt så många som 11.
Repeterbarhet av resultat från bovin äggstockscancer cortex kultur påverkas mest av förorening av äggstockscancer cortex bitar. Dessutom kan negativa eller subpar resultat uppstå om mediet inte ändras regelbundet inom en 24-h-period. Mediet när det ursprungligen tillsattes är rosa i färg, men när mediet samlas in, och färgen verkar vara orange eller ljusgul kan detta indikera en förändring i pH som kan vara skadlig för vävnaden. Vävnad bitar som skärs för stora kan också utveckla degeneration i mitten som inte skulle observeras förrän vävnad avsnitting för histologi. Denna degeneration kommer att begränsa användningen av vävnaden för analys. De data som presenteras i detta dokument har analyserats med hjälp av icke-parametriska tester och en allmän linjär modellanalys i ett statistiskt program. Antalet ursprungliga, primära, sekundära och antral folliklar per avsnitt före och efter kultur analyserades med hjälp av en generaliserad linjär blandad modell. Betydelsen fastställdes vid P < 0,05 och en tendens rapporterades vid 0,14 ≤ P ≥ 0,05.
Figur 3: Hematoxylin och Eosin färgning för follikel iscensättning av äggstocksbarken. Olika stadier av folliklar indikeras av pilar. A) Ursäckar (steg 0). B)Tidiga primära folliklar (steg 1). C)Primära folliklar (steg 2). ( D) Sekundär follikel (steg 3). e)Antral follikel (steg 4). Området i synfältet för en bild vid 400x förstoring är 0,4 mm2. Vi räknar 30% av området i äggstocksbarken bitar för att bestämma follikelstadierna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Genomsnittligt antal folliklar i olika follikulära stadier i kontroll (n=6) och trappsteg (n=6) kvigor. (A) Före odling Primordial P = 0,001, Tidig primär P = 0,12, Primär P = 0,31, Sekundär P = 0,22. b) Efter 7 dagars kultur, Primordial P = 0,37, Tidig primär P = 0,84, Primär P = 0,69, Sekundär P = 0,02. Felstaplar är representativa för SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kollagen (Picro Sirius Röd; PSR) färgning i äggstockscancer cortex. PSR i (A) Kontroll- och trappstegskvigor från dag 0 och dag 7. (B) Diagram som jämför den genomsnittliga ytan av PSR-positiv färgning per äggstocksbarkfält (pixlar/μm2) mellan kontroll (n = 4) och trappsteg (n = 4) kvigor. Felstaplar är representativa för SEM. Området i synfältet för en bild vid 400x förstoring är 0,4 mm2. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Koncentrationerna av A4 och E2. (A) Koncentration av A4 och (B) koncentration av E2 poolade under 3 dagars kultur i äggstocksbarken media av kontroll och trappsteg kvigor mätt med RIA. n = 4 för varje grupp. Felstaplar är representativa för SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Hormoner | Kontroll | Trappsteg | P-värde | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/mL | Betyda | SEM ± | Betyda | SEM ± | ||
| DOC | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| VÄRDSHUS | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| CORT | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17OHP | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4 | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| EN | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| DHEAS | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| DHT | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-Deoxycorticosterone, INN - 11-Deoxycortisol, CORT – Kortikosteron, 17OHP – 17-Hydroxyprogesterone, A4- Androstenedione, AN – Androsteron, DHEAS – dehydroepiandrosteronsulfat, E2 - Estradiol, P4 – Progesteron, T – Testosteron, DHT – Dihydrotestosterone | ||||||
Tabell 1: Steroid och steroid metaboliter mätt i äggstockscancer cortex odling medium från en brunn för varje djur pooled över 4 dagars kultur. Data som presenteras med medelvärde ± SEM. Blue indikerar P < 0,1 och har en tendens att vara annorlunda.
| Cytokiner | Kontroll | Trappsteg | P-värde | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| pg/mL | Betyda | SEM ± | Betyda | SEM ± | ||
| ANG1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| CD40L | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| DCN | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| INFβ | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| IL18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| LIF | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| RANTES | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| INFγ | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| IL13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| IL21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| IL1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – Angiopoietin 1, CD40L – CD40 Ligand, DCN – Decorin, IFNβ – Interferon Beta 1, IL18 – Interleukin-18, LIF – Leukemi hämmande fabrik, RANTES – Reglerad på aktivering, normal T-cell uttryckt och utsöndrad, IFNγ – Interferon Gamma, IL13 – Interleukin 13, IL21 – Interleukin 21, IL1F5 | ||||||
Tabell 2: Cytokin och kemoker mätt i äggstocksbarkkulturmedium från en brunn för varje djur som samlats under 4 dagars kultur. Data som presenteras med medelvärde ± SEM. Blue indikerar P < 0,1-0,14 och har en tendens att vara annorlunda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelen med in vitro äggstockscancer cortex kultur, som beskrivs i detta manuskript, är att folliklar utvecklas i en normaliserad miljö med intilliggande stroma som omger folliklarna. De somatiska cellerna och äggcellerna förblir intakta, och det finns lämplig cell-till-cell kommunikation som en in vivo-modell. Vårt laboratorium har funnit att ett 7-dagars kultursystem ger representativ folliculogenesis och steroidogenes data för behandling av äggstockscancer cortex. Andra äggstocksvävnadskulturprotokoll har antingen relativt korta kulturperioder 1-6 dagar7,32 eller långa kulturperioder på 10-15 dagar5,6,10. Vi har dock observerat att odling i mer än 7 dagar leder till vävnadsnedbrytning, minskad steroidogenes och potentiellt en ökad sannolikhet för kontaminering (data visas inte). Odling av äggstockscancer cortex efter ovariectomy ger också direkt inblick i äggstockscancermiljön inom just det djuret. Detta är av intresse för vårt forskningslaboratorium eftersom vi har identifierat förändringar i follikulär utveckling efter näringsregimer infördes efter avvänjning och ledde till puberteten ikvigor 16.
Follikelutveckling från det ursprungliga till antralstadiet är en dynamisk process inom äggstocksbarken, som inkluderar endokrina och parakrrinfaktorer från somatiska celler och cumulus cell-oocyte kommunikation33. Vävnadskultur, såsom äggstocksbarkkultur, erbjuder en kontrollerad miljö för att undersöka den mekanistiska rollen av dessa faktorer och den endokrina miljön i äggstockscancermiljön. Äggstockar kan samlas in från djur som har genomgått en in vivo-behandling eller är genetiskt modifierade för att bestämma effekter på follikelprogression.
Äggstockar kan också samlas in från ett lokalt slakteri (1 h bort) och transporteras vid 37 °C i en termos som innehåller PBS med antibiotika. Om transporten är längre (t.ex. över natten) skickas äggstockarna eller transporteras på is22. Liknande resultat har observerats om transport av äggstockar sker på is över natten eller vid 37 °C med kortvarig transport i en termos. 37 °C med termostransport möjliggör skörd av äggceller från denna vävnad för in vitro-mognad (IVM) eller in vitro-befruktning (IVF)34. Andra studier har visat att transport av vävnad vid temperaturer mellan 2-8 °C också har använts för fertilitetsbevarande i reproduktiva vävnader35,36,37. Andra studier har använt äggstockar som transporterats vid 34-37 °C och på is och har inte observerat skillnader i bovinvävnadskultur38.
Om äggstocksbarkens kulturvävnad inte ser hälsosam ut efter kultur, kan detta bero på att bitarna av äggstocksbarken är för stora. Ett kritiskt steg i protokollet är att se till att äggstocksbarken inte är större än 0,5-1 mm3. Vi använder en linjal för att mäta bitarna och använda en skala i dissekeringsmikroskopet för att bestämma storleken på äggstocksbarkens bitar (figur 2C). Andra använder specifik utrustning (se Tabell över material)för enhetlig tjocklek respektive längd/bredd,26. Om dessa utrustningsdelar inte är tillgängliga, kan plastrutor användas som mall för att få enhetlig tjocklek och säkerställa liknande storleksdelar27.
För att säkerställa skurna bitar som bara är från cortex och inte har medulla efter att ha tvättat äggstocken placerar vi den i 60 mm skålen och skär i hälften. Cortex och medulla är mycket olika histologiskt som tidigare sett i Abedal-Majed, 202016. Varje halva av äggstocken fileas med bladet för att säkerställa att endast cortex avlägsnas från äggstocken och medullan förblir. Om individer just har börjat fullända denna skärteknik kan de också använda neutralrött för att nära se histologin i varje halva av äggstocken39. Detta kommer att möjliggöra utveckling av landmärken som deras skärteknik, förbättras. Dessutom kan de använda instrument som kan skära enhetlig tjocklek (se Tabell över material)enligt ovan26,27.
Äggstocksbarken bör vara ljusrosa. Vi har observerat att pH i äggstocksbarken kultur medium förändras snabbt i vissa djur, så majoriteten (70%) av äggstocksbarken medium bör ändras var 24: e timme för att främja kulturhälsa. Tidigare artiklar har diskuterat att ändra hälften av mediet dagligen40. Vårt skäl till att ändra en majoritet av medierna i det nuvarande manuskriptet var att främja hälsan hos äggstocksbarken kulturer. Droppar som omger äggstockscancer cortex bitar kvarstår och det fanns inga negativa effekter av medium förändring på kulturen. Dessutom tillät detta oss att analysera fler hormoner, cytokiner och kemoker för varje djur för att generera insikt i äggstocksmikromiljön.
Detta vävnad kultur protokoll erbjuder flera fördelar. Odling av äggstocksbarken gör det möjligt för folliklar att utvecklas i en miljö som liknar in vivo. Folliklar förblir stöds av den omgivande stroma och kommunikationen mellan somatiska celler och cumulus cell-oocyte fortsätter. Användningen av kulturbrunnsinsatser gör det möjligt för äggstocksbarken att vila på odlingsmediet utan att vara nedsänkt, vilket förhindrar vävnaden från att binda till brunnsplattans plastbas. En annan fördel är kulturfönstret. 7-dagars kulturfönstret som beskrivs i protokollet ger representativa hormon- och tillväxtfaktordata. Dessutom fortsätter folliculogenesis att utvecklas i denna in vitro-miljö eftersom vi har räknat färre tidiga folliklar (primordial) och mer sent iscensatta folliklar (sekundära, antral) efter 7 dagars kultur16. Tidigare äggstocksvävnadskulturprotokoll har använt relativt korta (1-6 dagar7,32) eller långa (10-15 dagar5,6,10)kulturperioder. Kortare odlingsfönster har använts för att undersöka ursäcksaktivering i fetala nötkreatur äggstocksbarken41. Hos icke-mänskliga primater användes en 20-dagars kulturperiod för att utvärdera primatens ursprungliga folliklars förmåga att överleva och initiera tillväxt in vitro i serumfritt medium18. Vi har dock observerat ökad vävnad nedbrytning vid odling av äggstockscancer bovin cortex längre än 7 dagar i serumfritt medium. Vi har också fastställt i analys av dagliga prover att steroid koncentrationer minskas efter 4 dagars kultur (data visas inte). Ett längre kulturfönster kan också öka risken för kontaminering i äggstocksbarkkulturer. Därför kan stora effekter mätas med 7 dagars kultur15 och kulturtid kan vara beroende av djurmodellen och den vetenskapliga fråga som tas upp.
Medan flera fördelar med detta bovin äggstockscancer cortex protokoll finns, det finns några begränsningar. En begränsning är mängden äggstockscancer när vävnad och kultur medium volym samlas in under äggstockscancer när odling. Den lilla storleken på äggstocksbarken gör det möjligt att använda ett begränsat antal vävnadssektioner för färgning (H&E, immunofluorescens, etc.). För att utföra RT-PCR behövs minst fyra cortexbitar16. Dessutom kan den låga volymen odlingsmedium som samlas in begränsa mängden analyser som utförs. För att bekämpa dessa begränsningar föreslår vi att odla flera replikat per äggstock för att ge en tillräcklig tillgång på kulturmedium och vävnad för histologi, analyser och PCR. Ganska ofta odlar vi flera bitar av varje äggstock från en ko / kvig för att få mer vävnad för ytterligare analys och för att få ökat odlingsmedium för att mäta cortexsekreation av hormoner / cytokiner / kemokiner. Preantral folliklar är mer diffusa i äldre ko äggstockar än yngre kvinnor (kvigor). Således är en potentiell begränsning att erhålla preantral folliklar på alla äggstockscancer cortex bitar som odlas. Flera sätt att mildra denna begränsning är att få fler äggstocksbarkbitar och att odla ytterligare brunnar för varje djur eller att använda neutralt rött för att visualisera folliklar och se till att alla cortexbitar innehåller tidiga preantrala folliklar. En tredje begränsning av äggstocksbarkens kultur är att all förorening av kultursystemet gör media- och cortexbitarna oanvändbara för analys. Således är flera sätt att upprätthålla en steril miljö att filtrera det medium som används i kulturen. Innan du bearbetar och skär äggstocksbarken ska de se till att den rena bänken har steriliserats med 70% etanol, och luftflödet har pågått i minst 30 minuter före dissektioner. Om du använder en absorberande dyna för att underlätta rengöringen (figur 1), se också till att UV-ljuset har tänts i 30 minuter innan du placerar någon vävnad i den rena bänken för att sterilisera dynan och rengöra bänken. Slutligen bör alla medieförändringar utföras i ett biosäkerhetsskåp med tillräckligt luftflöde, sterila instrument och byte av rörspetsar för att säkerställa att endast sterila spetsar införs i mediet som ska placeras i brunnar för äggstocksbarkkultur.
Tillämpning av denna teknik kommer att bidra till att förstå äggstockscancer mikromiljön och kan börja nysta upp mekanismer som är involverade i kvinnliga reproduktiva störningar som innebär förändrad follikulär utveckling. Till exempel är etiologin för polycystiskt äggstockssyndrom (PCOS) och aspekter av för tidig äggstockssvikt (POF) fortfarande oklart. Eftersom kor är mono-ägglossning, är de en utmärkt modell för att förstå faktorer som påverkar follikelprogression och gripande hos andra mono-ägglossningsarter (t.ex. människor och icke-mänskliga primater). Dessutom kan denna äggstocksbarkkulturmetod också visa sig vara fördelaktigt för att testa potentiella terapier som kan förbättra follikelmedierade störningar som resulterar i infertilitet hos kvinnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 till ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants till ASC. United States Department of Agriculture Hatch beviljar NEB26-202/W3112 Accession #1011127 to ASC, Hatch–NEB ANHL Accession #1002234 to ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoktoral Scholar Support – COVID-19 Award för sommarfinansiering för CMS.
Författarna vill utöka sin uppskattning till Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE för att tacka honom för att ha tillhandahållit äggstockarna i en tidigare publikation, som sedan användes i det aktuella papperet som ett konceptbevis för att validera denna teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
References
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
- Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
- McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
- Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
- Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
- Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
- Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
- Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
- Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
- Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
- Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
- Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
- Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
- Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
- Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
- Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
- Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
- Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
- Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
- Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
- Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
- Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
- Mohammed, B. T., Donadeu, F. X.
- Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).
