Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61668
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Animal Production, School of Agriculture, University of Jordan
* These authors contributed equally

Summary

תרבות מבינטית של קליפת המוח השחלות שור ואת ההשפעה של דיאטה תזונתית מדרגות צעד על microenvironment השחלות מוצג. חתיכות קליפת המוח השחלתית היו מתורבתים במשך שבעה ימים, סטרואידים, ציטוקינים, ושלבי זקיק הוערכו. טיפול דיאטה מדרגות-צעד היה סטרואידוגנזה מוגברת וכתוצאה מכך התקדמות זקיק בתרבות.

Abstract

התפתחות זקיק משלב קדמוני עד antral הוא תהליך דינמי בתוך קליפת המוח השחלתית, הכולל גורמים אנדוקריניים paracrine מתאים סומטיים ותקשורת תא קומולוס-ביציות. מעט מאוד ידוע על microenvironment השחלות וכיצד ציטוקינים וסטרואידים המיוצרים בסביבה milieu להשפיע על התקדמות זקיק או מעצר. תרבות במבחנה של קליפת המוח השחלתית מאפשרת לזקיקים להתפתח בסביבה מנורמלת שנותרה נתמכת על ידי סטרומה סמוכה. המטרה שלנו הייתה לקבוע את ההשפעה של דיאטה התזונתית מדרגות-צעד על microenvironment השחלות (התפתחות זקיק, סטרואידים, וייצור ציטוקינים) באמצעות תרבות במבחנה של קליפת המוח השחלות שור. כדי להשיג זאת, חתיכות קליפת המוח השחלות הוסרו מן heifers עובר שתי תוכניות שונות שפותחו מבחינה תזונתית לפני גיל ההתבגרות: שליטה (התפתחות תזונה מסורתית) ו מדרגות-צעד (האכלה והגבלה במהלך הפיתוח) שנחתכו לכ 0.5-1 מ"מ3 חתיכות. חלקים אלה הועברו לאחר מכן דרך סדרה של שטיפות ומוצבים על תוספת תרבית רקמות שנקבעה לתוך מדיום התרבות של Waymouth המכיל היטב. קליפת המוח השחלתית הייתה בתרבית במשך 7 ימים עם שינויים מדיניים בתרבות היומית. ניתוח היסתולוגי בוצע כדי לקבוע שינויים בשלב הזקיק לפני ואחרי התרבות כדי לקבוע את ההשפעות של תזונה והשפעת התרבות ללא טיפול נוסף. מדיום תרבות קליפת המוח היה איחד במשך ימים כדי למדוד סטרואידים, מטבוליטים סטרואידים, וציטוקינים. היו נטיות להורמונים סטרואידיים מוגברים במיקרו-סביבה בשחלות שאפשרו התקדמות זקיק בתרביות קליפת המוח השחלתית של מדרגות לעומת שליטה. טכניקת תרבות קליפת המוח השחלתית מאפשרת הבנה טובה יותר של מיקרו-סביבה השחלות, וכיצד שינויים בהפרשה האנדוקרינית עשויים להשפיע על התקדמות הזקיק והצמיחה הן מטיפולי vivo והן מטיפולי מביה. שיטת תרבות זו עשויה גם להוכיח מועיל לבדיקת טיפולים פוטנציאליים שעשויים לשפר את התקדמות הזקיק אצל נשים כדי לקדם את הפוריות.

Introduction

קליפת המוח השחלות מייצגת את השכבה החיצונית של השחלה שבה מתרחשת התפתחות זקיק1. זקיקים ראשוניים, שנעצרו בתחילה בפיתוח, יופעלו כדי להפוך לזקיקים ראשוניים, משניים, ולאחר מכן אנטרליים או שלוחוניים המבוססים על כניסות paracrine ו gonadotropin1,2,3,4. כדי להבין טוב יותר תהליכים פיזיולוגיים בתוך השחלה, תרבית הרקמות יכולה לשמש כמודל במבחנה, ובכך לאפשר לסביבה מבוקרת לערוך ניסויים. מחקרים רבים השתמשו בתרבית רקמת השחלות למחקר בטכנולוגיית הרבייה בסיוע, שימור פוריות וסרטן השחלות5,6,7. תרבית רקמת השחלות שימשה גם כמודל לחקירת רעלני הרבייה הפוגעים בבריאות השחלות ובאטיולוגיה של הפרעות פוריות כגון תסמונת השחלות הפוליטיות (PCOS)8,9,10,11. לכן, מערכת תרבות זו חלה על מגוון רחב של התמחויות.

במכרסמים, נעשה שימוש בעובר שלם או בעוברים ניסויים בביולוגיה של הרבייה12,13,14,15. עם זאת, gonads מן בעלי חיים ביתיים גדולים יותר לא ניתן לתרבות כמו איברים שלמים בשל גודלם הגדול ניוון פוטנציאלי. לכן, קליפת המוח השחלות הפרימטים הלא אנושית נחתכת לחתיכות קטנות יותר16,17,18. מחקרים רבים תרבויות חתיכות קליפת המוח השחלתית הקטנה כדי לחקור גורמי גדילה שונים בייזום זקיק קדמוני בבעלי חיים מקומיים ופרימטים לא אנושיים1,17,18,19. השימוש בתרבות קליפת המוח השחלתית הוכיח גם חניכה קדמונית של זקיק בהיעדר סרום לחתיכות קליפת המוח של בקר ופרימטים בתרבית במשך 7 ימים20. יאנג ו פורצ'ן בשנת 2006 טיפלו במדיום תרבית קליפת המוח השחלתית העוברית עם מגוון של מינונים טסטוסטרון במשך 10 ימים וציין כי ריכוז10-7 M של טסטוסטרון גדל גיוס זקיק, הישרדות, והתקדמות מוגברת של זקיקים בשלב מוקדם19. בשנת 2007, באמצעות תרביות קליפת המוח השחלתית מעוברי בקר (5-8 חודשים של הריון), יאנג ועושר דיווחו על תפקיד עבור גורם גדילה אנדותל וסקולרי A (VEGFA) במעבר זקיק ראשוני למשני21. יתר על כן, המעבדה שלנו השתמשה בתרביות קליפת המוח השחלתית כדי להדגים כיצד איזופורמים של VEGFA (אנגיוגני, אנטי-אנגיוגניים ושילוב) עשויים לווסת מסלולי העברת אותות שונים דרך קולטן תחום קינאז (KDR), שהוא קולטן העברת האות העיקרי ש- VEGFA קושר16. מידע זה אפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו isoforms VEGFA שונים משפיעים על נתיבי איתות כדי לעורר התקדמות זקיק או מעצר. נלקח יחד, culturing של חתיכות קליפת המוח השחלתי במבחנה עם סטרואידים שונים או גורמי גדילה יכול להיות מטען יקר כדי לקבוע השפעות על מנגנונים המסדירים folliculogenesis. באופן דומה, בעלי חיים המפותחים על משטרים תזונתיים שונים עשויים לשנות מיקרו-סביבה בשחלות, אשר עשוי לקדם או לעכב folliculogenesis המשפיע על בגרות הרבייה הנשית. לכן, המטרה שלנו בכתב היד הנוכחי היא לדווח על טכניקת תרבית קליפת המוח בקר ולקבוע אם יש הבדלים מיקרו-וירוסים השחלות לאחר תרבית במבחנה של קליפת המוח בקר מן heifers האכילו או דיאטות בקרה או מדרגות-צעד שנאספו בגיל 13 חודשים כפי שתואר קודם לכן16.

לכן, הצעד הבא שלנו היה לקבוע את microenvironment השחלות אלה תרנגולות שפותחו עם דיאטות תזונתיים שונים. הערכנו קליפת המוח השחלות מעוגות המוזנות בדיאטת מדרגות או שליטה. עריסות בקרה הוצעו דיאטה תחזוקה של 97.9 גרם / קילוגרם0.75 במשך 84 ימים. דיאטה מדרגות-צעד החלה ב 8 חודשים המכיל דיאטה מוגבלת של 67.4 גרם / קילוגרם0.75 במשך 84 ימים. לאחר 84 הימים הראשונים, בעוד עגילות בקרה המשיכו לקבל 97.9 גרם / קילוגרם0.75, עגילות בקר מדרגות-צעד הוצעו 118.9 גרם / קילוגרם0.75 במשך 68 ימים נוספים, ולאחר מכן הם היו ovariectomized ב 13 חודשים של גיל16 לחקר שינויים בשלבי זקיקים ומורפולוגיה לפני ואחרי התרבות. אנחנו גם eded להבדלים בסטרואידים, מטבוליטים סטרואידים, כימותרפיה, וציטוקינים מופרש לתוך מדיה קליפת המוח. סטרואידים ומטבוליטים אחרים נמדדו כדי לקבוע אם היו השפעות ישירות מטיפולים שנערכו ב- vivo ו/או במבחנה על כדאיות רקמות ופרודוקטיביות. שינויים במיקרו-סביבה השחלות לפני ואחרי התרבות סיפקו תמונת מצב של המילייה האנדוקרינית והפוליקולוגנזה לפני התרבות וכיצד תרבות או טיפול במהלך התרבות משפיעים על התקדמות זקיק או מעצר.

השחלות נאספו לאחר כריתת השחלות במרכז לחקר בעלי חיים בשר בארה"ב (USMARC) על פי נהלי IACUC שלהם מפרסות בקרה ומדרגות בגיל13 חודשים 16, ניקה עם תמיסת מלח חוצץ פוספט סטרילית (PBS) שוטף עם 0.1% אנטיביוטיקה כדי להסיר דם ומזהמים אחרים, רקמה עודפת גזוז, והועבר לאוניברסיטת נברסקה-(לינקולן UNL) מעבדת פיזיולוגיה פוריות UNL ב 37 ° C23 . ב UNL, חתיכות קליפת המוח השחלתית נחתכו לחתיכות מרובעות קטנות (~ 0.5-1 מ"מ3; איור 1) ומתורבת במשך 7 ימים(איור 2). ההיסתולוגיה נערכה על שקופיות תרבות קליפת המוח לפני ואחרי התרבות כדי לקבוע זקיקים שלבים16,24 (איור 3 ואיור 4), וחלבוני מטריצה חוץ תאיים שעשויים להצביע על פיברוזיס (פיקרו-סירוס אדום, PSR; איור 5). זה איפשר קביעת השפעה של משטרים תזונתיים in vivo על שלבי זקיק ואפשר השוואה של 7 ימים של קליפת המוח השחלות על שלבי זקיק והתקדמות זקיק. לאורך כל התרבות, המדיום נאסף ושתנה מדי יום (כ -70% מהמדיה נאספה מדי יום; 250 μL / well) כך או הורמונים יומיים / ציטוקינים / כימותרפיה ניתן להעריך או לאגד במשך ימים כדי להשיג ריכוזים ממוצעים. סטרואידים כגון אנדרוסטנדיון (A4) ואסטרוגן (E2) ניתן לאגד מעל 3 ימים ולהעריך באמצעות radioimmunoassay (RIA; איור 6) ומאוחסנים במשך 4 ימים לכל חיה וניידדו באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC-MS)24,25 (טבלה 1). מערכי ציטוקינים נוצלו להערכת ריכוזי ציטוקינים וכימוקין בתרבות קליפת המוח השחלתיתבינונית 26 (טבלה 2). צלחות בדיקת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) נערכו כדי לקבוע ביטוי גנים עבור מסלולי העברת אותות ספציפיים כפי שהודגם בעבר16. כל הסטרואידים, ציטוקינים, שלב הזקיק והסמנים היסטולוגיים מספקים תמונת מצב של מיקרו-סביבה השחלות ורמזים לגבי היכולת של מיקרו-סביבה לקדם פוליקולוגנזה "נורמלית" או "לא נורמלית".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השחלות התקבלו מהמרכז לחקר בעלי חיים בשר בארה"ב16. כאמור16, כל ההליכים אושרו על ידי המרכז האמריקאי לחקר בעלי חיים (USMARC) טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים חקלאיים במחקר חקלאי והוראה. השחלות הובאו למעבדת הרבייה של אוניברסיטת נברסקה-לינקולן, שם הן עובדו והתרבותבו.

1. הכנת מדיה נדרשת

  1. וויימות' MB 752/1 בינוני
    1. מלא בקבוק תרבית רקמות 1 L עם 900 מ"ל של מים סטריליים. בזמן שהמים מערבבים בעדינות על צלחת ערבוב, מוסיפים בהדרגה את האבקה המדיום. לאחר המדיום אבקת מומס, להוסיף 2.24 גרם של סודיום ביקרבונט ואחריו 1.25 גרם של אלבומין סרום בקר (BSA). השתמש במד pH ולהתאים את ה- pH ל 7.25-7.35. מוסיפים מים סטריליים נוספים כדי להביא את הנפח הסופי ל-1 ליטר.
    2. עבור לארון בטיחות ביולוגי ולהוסיף פניצילין-סטרפטומיצין סולפט בריכוז של 0.1% v/v של המדיום. סנן את המדיום עם 0.22 מיקרומטר נקבובית 33.2 ס"מ2 500 מ"ל בקבוק העליון מסנן.
    3. יוצקים את המדיום המסונן לכמה צינורות חרוט 50 מ"ל. יש להוסיף 0.5 מ"ל אינסולין-טרנספרין-סלניום לכל 50 מ"ל של מדיום עלי-
    4. עוטפים את הצינורות החרוטים ואת בקבוק המלאי של המדיום בנייר אלומיניום ומאחסנים ב 4 °C (70 °F). המדיום הזה רגיש לאור.
      הערה: ניתן לאחסן מדיום Waymouth למשך עד חודש אחד.
  2. בינוני L-15 (LB-15) של ליבוביץ
    הערה: מדיום LB-15 משמש לניקוי רקמות כהכנה לתרבות.
    1. מלא בקבוק תרבית רקמות 1 L עם 900 מ"ל של מים סטריליים. בעוד המים הסטריליים מערבבים בעדינות על צלחת ערבוב, מוסיפים בהדרגה את המדיום המוכן. השתמש במד pH ולהתאים את ה- pH ל 7.25-7.35. מוסיפים מים סטריליים נוספים כדי להביא את הנפח הסופי ל-1 ליטר.
    2. עבור לארון בטיחות ביולוגי. הפוך 1 L של LB-15 עם 0.1% אנטיביוטיקה (ראה טבלה של חומרים). לסנן את המדיום לשני בקבוקי תרבית רקמות 500 מ"ל באמצעות 0.22 מיקרומטר נקבובית 33.2 ס"מ2 500 מ"ל בקבוק העליון מסנן. לעטוף בקבוקים בנייר אלומיניום כמו LB-15 בינוני הוא רגיש לאור ולאחסן ב 4 °C (70 °F).
      הערה: ניתן לאחסן מדיום LB-15 למשך עד חודש אחד.
  3. תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)
    1. הפוך PBS במעבדה או לרכוש PBS סטרילי ללא סידן או מגנזיום (שולחן החומרים). כדי להפוך PBS במעבדה, להתחיל עם 800 מ"ל של מים מזוקקים ולהוסיף 8 גרם של נתרן כלורי (NaCl) אליו. לאחר מכן, להוסיף 0.2 גרם של אשלגן כלורי (KCl), 1.44 גרם של נתרן פוספט דיבסיק (Na2HPO4), ו 0.24 גרם של אשלגן פוספט דיבסי (KH2PO4). כוונן את ה- pH ל- ~ 7.4 והתאם את הנפח הכולל ל- 1 ליטר. עקר את הפתרון על-ידי הפעלה אוטומטית.
    2. הפוך PBS 1 L עם 0.1% אנטיביוטיקה (ראה טבלה של חומרים) בעוד בארון בטיחות ביולוגי.

2. פרוטוקול תרבות קליפת המוח השחלות

הערה: השחלות התקבלו מענפי USMARC שנולדו באביב בגיל 13 חודשים. השחלות נשטפו ביסודיות, וכל הדם ונוזלים אחרים הוסרו עם PBS המכיל אנטיביוטיקה (0.1%) והועברו ב 37 מעלות צלזיוס23 לאוניברסיטת נברסקה-לינקולן רבייה המעבדה UNL (1.5 שעות משם). (להערות על טמפרטורת השחלות במהלך התחבורה אנא ראו דיון)

  1. הכינו את רקמת השחלות על ספסל נקי(איור 1).
    1. לחטא את הספסל הנקי עם 70% אתנול. מניחים כרית ספיגה טרייה על הספסל. ודא כי מפוח הספסל הנקי מופעל חצי שעה לפני הניתוח יחד עם אור UV כדי לעקר כל דבר בספסל הנקי, כולל כרית סופג ולוודא PPE מתאים משמש.
    2. מסדרים את מנות הפטרי (60 x 15 מ"מ) לשטיפת רקמות. שלוש מנות פטרי נדרשות לשטיפת PBS, שלוש ל-PBS עם אנטיביוטיקה, ושלוש לשטיפה של LB-15. מנת פטרי נוספת המכילה LB-15 עם מכסה נלווה תשמש למיקום סופי של חתיכות לאחר הכביסה.
    3. מלאו כל צלחת פטרי בכ-10 מ"ל של נוזלים מתאימים, PBS או LB-15.

Figure 1
איור 1: פריסת צלחות לשטיפת חתיכות השחלה וקליפת המוח בספסל הנקי. (A)PBS המשמש לשטיפת השחלה כאשר חלקים מקליפת המוח מוסרים. (B)PBS עם שטיפות אנטיביוטיות שחתיכות קליפת המוח מועברות דרכן. (C)חתיכות קליפת המוח השחלתית נשטפות ארבע פעמים ב- LB-15 לפני המעבר לארון הבטיחות הביולוגית לשטיפה סופית ב- LB-15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מוציאים מהמקרר את ה-Waymouth וה-LB-15 המוכנים.
  2. יש לאסוף את כל הכלים כדי להבטיח עיקור לפני השימוש.
  3. לשמור על השחלות ב 37 מעלות צלזיוסעד קליפת המוח השחלות מוכן לאיסוף.
  4. בעזרת מלקחיים עם לסתות משוננות, הרימו את השחלה ושטפו ביסודיות את צלחת הפטרי הראשונה במילוי PBS. מעבירים את השחלה לכביסת ה-PBS השנייה ומנקים ביסודיות פעם נוספת.
    הערה: השחלה תישאר בשטיפת PBS השנייה בזמן שפסות קליפת המוח השחלתיות מוסרות.
  5. בעזרת מלקחיים לסת משוננת, מאבטחים את השחלה ופורסים לשניים. בשלב זה, קליפת המוח השחלות תנתק מהמדולה. באמצעות סרגל, ודא כי לא יותר מ 1-2 מ"מ של עומק פני השטח של השחלה מוסר מן medulla16. הסר חלקים רוחביים של קליפת המוח השחלתית ממדולה, חתוך 3-4 רצועות דקות של קליפת המוח השחלות (איור 2) עם אזמל (להב אזמל מס '11; ידית #3), והנח את הרצועות בצלחת הפטרי השלישית המלאה PBS.
    הערה: בשלב זה, רקמת קליפת המוח השחלות נוספת ניתן לאסוף עבור מיצוי RNA או קבוע ונאסף עבור היסטולוגיה של חתיכות קליפת המוח הראשונית שאינן בתרבית. בעת הסרת רצועות של קליפת המוח השחלתית, הימנע אזורים עם זקיקי antral גלויים או corpora lutea. בנוסף, להימנע מאיסוף רקמה medullary. ההסתדרות של המדולה שונה מאוד כפי שמוצג בעבר16. אם קליפת המוח השחלות אינה חתוכה ליותר מעומק של 1-2 מ"מ, אז אין להשיג את המדולה. היסתולוגיה ברורה מאפשרת ציוני דרך בין קליפת המוח לבין המדולה.
  6. חותכים את רצועות קליפת המוח השחלתית בשטיפת PBS השלישית לחתיכות קטנות ומרובעות (~ 0.5-1 מ"מ3) עם להב אזמל #21. השתמש בסרגל מתחת לצלחות פטרי כדי להבטיח את החלקים הם בגודל ועובי דומים כדי להפוך חתיכות קליפת המוח השחלות עקבי. השתמש במלקחיים כדי לאבטח את הרצועות תוך חיתוך החלקים עם אזמל.
    הערה: מספר חלקי הרקמה שנחתכים תלוי בניסוי. ארבע חתיכות של קליפת המוח השחלתית היא הכמות המינימלית של רקמה הדרושה לתרבות. שיטות אחרות להבטחת אורך ועומק מתאימים כוללות שימוש בכלי פריסה מיוחדים26 או חתיכות פלסטיק חתוכות מראש כתבניות27.
  7. לשטוף חתיכות קליפת המוח השחלות דרך כל שלוש PBS עם צלחות פטרי מלאות באנטיביוטיקה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי להזיז חתיכות בין כביסות.
  8. העבר חתיכות קליפת המוח דרך הסדרה של LB-15 שטיפות ומניחים בצלחת פטרי סופית LB-15 מלא. סמן את המכסה עם מזהה בעלי חיים וצד השחלות (שמאל או ימין).
    הערה: שקועים באופן מלא בקליפת המוח השחלתית בכל שטיפה לניקוי יסודי.
  9. לאסוף ארבע חתיכות קליפת המוח השחלתית לכל שחלה ולתקן ליום אפס היסתולוגיה. חלקים נוספים יכולים גם להיות קפואים פלאש עבור RNA. שאר חלקי הרקמה ישמשו לתרבות. נגב כלי ניתוח עם 70% אתנול לאחר כל אוסף רקמות.
  10. הכן ארון בטיחות ביולוגי לשטיפת רקמות סופית והכנת תרבות. לחטא אספקה עם 70% אתנול לפני הצבה בארון הבטיחות הביולוגי. השתמש בטכניקה האספטית בעת עבודה בארון הבטיחות הביולוגי.
  11. העבירו את כל קליפת המוח השחלתית המיועדת לתרבות לארון הבטיחות הביולוגי ושטפו פעם נוספת בצלחת פטרי מלאה LB-15.
  12. בצלחת תרבית רקמות 24-well, פיפטה 350 μL של מדיום Waymouth לבאר.
  13. מניחים היטב את התרבות הלא מכווצת לכל באר באמצעות מלקחיים. ודא כי אין בועות נוצרות תחת הבסיס של הכנס כמו זה יגרום הרקמה להתייבש. המדיום חייב לגעת בתוספות כדי לאפשר למדיום להיספג ולהקיף את חתיכות קליפת המוח השחלתית.
  14. מקם בזהירות ארבע חתיכות קליפת המוח השחלתית על הרשת של כל תוספת(איור 2). המלקחיים יכולים לנקב את הרשת אם חתיכות הרקמה אינן ממוקמות בעדינות. חתיכות הרקמה לא אמורות לגעת זו בזו או בצד של ההוספה.
  15. לדגור את הרקמה ב 37 מעלות צלזיוסעם 5% CO216.
    הערה: אחרים השתמשו 38.8 מעלות צלזיוס28. עם זאת, לא נצפתה הבדל בשלמות הרקמה ולא ביכולתם של זקיקים להתקדם ברקמת 37 מעלות צלזיוסוגם לא אחרים39,30. לכן, בשלב זה כל הטמפרטורות האלה צריך להיות תורם להצלחה ניסוי. אחרים השתמשו 400 μL של בינוני. כל כמות היא בסדר כל עוד אחד עקבי, ואת הרקמה הוא שקוע חלקית המאפשר מתח פני השטח נאותה כדי לאפשר הידרציה של רקמות (מדיה סביב חתיכות קליפת המוח השחלתית). מלא בארות ריקות עם 500 μL של מים סטריליים כדי לעזור להפחית את האידוי מבארות אחרות.

Figure 2
איור 2: חתיכות קליפת המוח השחלתית וצלחת התרבות. (A)רצועה שחלתית שנחתכת מקליפת המוח של השחלה. (B)פיסת הסרגל וקליפת המוח מוצגת זו לצד זו. (C)ארבעה חתיכות קליפת המוח (~ 0.5-1 מ"מ3) נח על ההוספה במדיום התרבות בצלחת. (ד)הרמת התוספת כדי לאסוף את מדיום התרבות מהבאר. לאסוף ולהחליף את כל מדיום התרבות מדי יום (250 μL) כדי לשמור על pH.כ 250 μL מתקבל מכל באר בכל יום (כ 70% של מדיום התרבות הראשונית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. אוסף מדיה

  1. לשנות את תרבות קליפת המוח השחלות מדי יום במשך 7 ימים. שינויים בינוניים צריכים להיות קרובים ככל האפשר ל-24 שעות זה מזה כדי למנוע שינויי pH וצבע גדולים במדיום. חום Waymouth בינוני עד 37 °C (50 °F) לפני שינוי בינוני. כ 250 μL מתקבל מכל באר בכל יום (כ 70% של מדיום התרבות הראשונית).
  2. במהלך שינויים בינוניים, יש להשתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את ההוספה מהבאר. לאסוף את מדיום Waymouth תרבותי בצינורות 0.5 מ"ל (כ 250 μL ליום). הגדר את ההוספה בחזרה היטב ולהוסיף 350 μL של מדיום תרבות טרי על ידי חלוקת המדיום בין הצד של ההוספה היטב.
    הערה: לשנות את רוב התקשורת מדי יום כדי להשיג מספיק מדיה כדי למדוד את כל הסטרואידים, ציטוקינים, וכימותרפיה הדרושים כדי לקבוע microenvironment השחלות. כמו כן, שינויים בינוניים יומיים חשובים כדי למנוע שינויים גדולים pH (מסומן על ידי שינוי צבע) במדיום. טיפות של מדיום נשמרו סביב חתיכות קליפת המוח השחלתית כדי להבטיח את החלקים נשאר רטוב. לא נצפו בעיות עם רקמה בתרבית עקב שינוי 70% מהתקשורת.
  3. לאחסן את המדיום שנאסף מתרבית הרקמות ב -20 מעלות צלזיוס.

4. הדמיה ועיבוד במורד הזרם

  1. לאחר 7 ימים של תרבות ב 37 מעלות צלזיוסעם 5% CO2, תמונה חתיכות קליפת המוח השחלתית באמצעות מיקרוסקופ ביתוח עם מצלמה מחוברת ותוכנת הדמיה ממוחשבת.
    הערה: חדר חשוך הוא בדרך כלל הטוב ביותר להשגת איכות התמונה הטובה ביותר להדמיה.
  2. לאחר ההדמיה, לתקן שתי חתיכות קליפת המוח השחלתית לבאר ב Bouins עבור היסתולוגיה ולהקפיא פלאש שתי חתיכות קליפת המוח השחלתית בחנקן נוזלי כדי להשיג RNA עבור cDNA. חזור על שלב זה עבור כל בארות עם רקמה. לאסוף את המדיום מיום 7 ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. תן חתיכות קליפת המוח השחלות להישאר שקוע בוינס (חומצה פיקרית 750 מ"ל, חומצה אצטית קרחונית 50 מ"ל, ו 37%-40% פורמלין 250 מ"ל) במשך כ 1.5 שעות לפני שטוף עם 70% אתנול שלוש פעמים. הרקמה תישאר ב 70% אתנול ותנוקה מדי יום עד שהתמיסה כבר לא צהובה.
    הערה: ניתן להשתמש בתיקונים שאינם בוינס כמו גם paraformaldehyde. ב experiement זה Bouins משמש כפי שהוא הקיבוטיב כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית. אם דרושה רקמה נוספת לניתוח אחר, ניתן להשיג בארות נוספות של מדיה וחתיכות של קליפת המוח השחלתית מכל בעל חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הליך זה של תרבית קליפת המוח בקר יכול לשמש כדי לקבוע מגוון רחב של הורמונים, ציטוקינים, ונתונים היסטולוגיים מחתיכות קטנות של השחלה. כתמים, כגון המטוקסילין ואוסין (H&E), יכולים לשמש לקביעת מורפולוגיה של השחלות באמצעות בימוי זקיק16,23,31 (איור 3). בקצרה, זקיקים סווגו כקדימיים, שהוא ביציות מוקפות בשכבה אחת של תאי קדם גרנולוזה קשקשים (0); זקיק מעבר או ראשוני מוקדם, שהוא ביוציטים מוקפים בעיקר בתאי קדם גרנולוזה קשקש וכמה תאי גרנולוזה קוביואידיים (1); זקיק ראשוני, שהוא בוצנית מוקפת 1-1.5 שכבות של תאי גרנולוזה קוביואידליים (2); זקיק משני, שהוא בוציטים מוקפים בשני תאי גרנולוזה קוביואידיים או יותר (3); זקיק antral, שקוטרו אינו עולה על 1 מ"מ ומוקף בשתי שכבות או יותר של תאי גרנולוזה המכילות אנטרום ייחודי (4)16,23 (איור 3). היערכות זקיקית יכולה להתבצע על קליפת המוח השחלתית קבוע לפני ובעקבות התרבות כדי להעריך פוליקולוגנזה (איור 4). צילמנו שלוש תמונות בכל שקופית משלוש שקופיות שונות מוכתמות ב- H&E. לאחר מכן, הזקיקים בוימו ונספרו על ידי שלושה אנשים וממוצע כדי לקבוע את מספר הזקיקים בכל שלב16,23. שטח שדה הראייה עבור תמונה (שלוש לשקופית) בהגדלה של 400x הוא 0.4 מ"מ2. לכן, 30% מהשטח של חתיכות קליפת המוח השחלתית נספרו כדי לקבוע את שלבי הזקיק. מספר הזקיק ההתחלתי(לפני התרבות) (איור4A)משמש לנרמול הזקיקים שנספרו לאחר התרבות (איור 4B).

בנוסף, הבדלים במורפולוגיה כפי שנקבע בתצהיר קולגן (פיקרו סירוס כתמים אדומים) יכולים להצביע על פיברוזיס בקליפת המוח השחלות ממדרגות מדרגות או עריסות בקרה(איור 5). אוסף יומי של מדיום תרבות ניתן לאגד מעל 3 ימים כדי להעריך ייצור הורמון סטרואידים מגוונים על ידי RIA (באמצעות 200 μL מדגם בינוני לכל חיה; איור 6) או מטבוליטים סטרואידים באמצעות ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC-MS; 220 μL מדגם בינוני מאוחסן מעל 4 ימים לכל חיה; טבלה 1) והפקת ציטוקינים(טבלה 2). לכן, מספר שכפולים של חיה אחת עשויים להידרש כדי להבטיח מספיק מדיום קליפת המוח כדי לבצע את כל ההסתה הרצויה.

מכיוון שפרני מדרגות-סטפ הגדילו את הזקיקים הקדמוניים בתחילת התרבות, ציפינו שאלה יתקדמו בתרבות ויקבלו מספר גדול יותר של זקיקים משניים, שראינו בתוצאות. כמו כן, בשל עלייה זקיקים משניים, היינו מצפים ריכוזים גדולים יותר של סטרואידים. ראינו נטייה לעלייה באנדרוגנים, מטבוליטים של גלוקוזקורטיקואידים ומטבוליטים של פרוגסטרון, שיתמכו בכך בכתב היד הנוכחי. המעבדה שלנו גם העריכה את ההשפעות של איזופורמים שונים VEGFA על התקדמות זקיק, steroidogenesis, והפעלה של מולקולות שונות טרנסדוקציה אות ב KDR (הידוע גם בשם קולטן גורם גדילה אנדותל וסקולרי 2; VEGFR2) באמצעות לוחות מערך העברת אותות16. כדי להפחית את השונות של בעלי החיים, אנו משתמשים ב-4-6 בעלי חיים לטיפול ולניסויים אחרים בהתאם לניתוח כוח ושונות שהשתמשנו בהם עד 11.

החזרה על תוצאות מתרבית קליפת המוח השחלות של השחלות מושפעת ביותר מזיהום של חתיכות קליפת המוח השחלתית. בנוסף, תוצאות שליליות או תת-חלוקה יכולות להתרחש אם המדיום אינו משתנה באופן קבוע בתוך פרק זמן של 24 שעות. המדיום כאשר הוסיף במקור הוא ורוד בצבע, אבל כאשר המדיום נאסף, ואת הצבע נראה כתום או צהוב בהיר זה יכול להצביע על שינוי pH שיכול להיות מזיק לרקמה. כמו כן, חתיכות רקמות שנחתכות גדולות מדי עלולות לפתח ניוון באמצע שלא היה נצפה עד לחיתוך רקמות להיסתולוגיה. ניוון זה יגביל את השימוש ברקמה לניתוח. הנתונים המוצגים במאמר זה נותחו באמצעות בדיקות לא פרמטריות וניתוח מודל ליניארי כללי בתוכנה סטטיסטית. מספר הזקיקים הקדמוניים, הראשוניים, המשניים והאנטרליים לכל מקטע לפני ואחרי התרבות נותחו באמצעות מודל מעורב ליניארי כללי. המשמעות נקבעה ב P < 0.05 ונטייה דווחה בשעה 0.14 ≤ P ≥ 0.05.

Figure 3
איור 3: המטוקסילין ואוסין מכתימים את הזקיקים של קליפת המוח השחלתית. שלבים שונים של זקיקים מסומנים על ידי חצים. (א)זקיקים קדמוניים (שלב 0); (B)זקיקים ראשוניים מוקדמים (שלב 1); (C)זקיקים ראשוניים (שלב 2); (D)זקיק משני (שלב 3); (ה)זקיק אנטרלי (שלב 4). שטח שדה הראייה עבור תמונה בהגדלה של 400x הוא 0.4 מ"מ2. אנו סופרים 30% מהשטח של חתיכות קליפת המוח השחלתית כדי לקבוע את שלבי הזקיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: המספר הממוצע של זקיקים בשלבים זקיקים שונים בבקרה (n=6) וב-Stair-Step (n=6) heifers. (A) לפני התרבות P ראשוני = 0.001, P ראשוני מוקדם = 0.12, ראשי P = 0.31, משני P = 0.22. (B)לאחר 7 ימים של תרבות, P ראשוני = 0.37, P ראשוני מוקדם = 0.84, ראשי P = 0.69, P משני = 0.02. קווי שגיאה מייצגים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: קולגן (פיקרו סיריוס אדום; נ.ב. מכתים בקליפת המוח השחלות. PSR ב (A)שליטה ומדרגות מדרגות מעפרות מיום 0 ויום 7. (B)גרף המשווה את השטח הממוצע של כתמים חיוביים PSR לכל שדה קליפת המוח השחלתית (פיקסלים / μm2) בין בקרה (n = 4) ו- Stair-Step (n = 4) עפרות. קווי שגיאה מייצגים את SEM. שטח שדה הראייה עבור תמונה בהגדלה של 400x הוא 0.4 מ"מ2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ריכוזים של A4 ו- E2. (A) ריכוז של A4 ו -( B)ריכוז של E2 התאגד במשך 3 ימים של תרבות בקליפת המוח השחלתית מדיה של שליטה ו- Stair-Step heifers כפי שנמדד על ידי RIA של. n = 4 עבור כל קבוצה. קווי שגיאה מייצגים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הורמונים לשלוט מדרגות מדרגות ערך P 
n 4 4
ng/mL התכוון ± SEM התכוון ± SEM
דוק 0.33 0.28 0.72 0.48 0.15
INN 0.61 0.60 4.93 3.99 0.08
קורט 0.003 0.003 0.01 0.01 0.85
17OHP 0.59 0.53 1.88 0.99 0.08
A4 1.46 1.43 5.74 3.27 0.08
AN  0.15 0.09 0.54 0.32 0.08
DHEAS 4.50 2.60 7.59 0.85 0.56
E2 0.05 0.05 0.13 0.08 0.32
P4 5.05 2.78 6.52 1.66 0.39
T 0.33 0.33 1.33 0.96 0.14
DHT 0.07 0.02 0.01 0.01 0.09
DOC - 11-Deoxycorticosterone, INN - 11-Deoxycortisol, CORT - קורטיקוסטרון, 17OHP – 17-הידרוקסיפרופילוגסטרון, A4- אנדרוסטנדיון, AN - אנדרוסטרון, DHEAS - דהידרואפיאנדרוסטרון סולפט, E2 - אסטרדיול, P4 – פרוגסטרון, T – טסטוסטרון, DHT – דיהידרוטסטוסטרון

טבלה 1: מטבוליטים סטרואידים וסטרואידים נמדדים בתרבות קליפת המוח השחלתית מדיום מבאר אחת עבור כל חיה ממוליכה מעל 4 ימים של תרבות. נתונים המוצגים עם ממוצע ± SEM. כחול מציין P < 0.1 ויש לו נטייה להיות שונה.

ציטוקינים לשלוט מדרגות מדרגות ערך P
n 4 4
pg/mL התכוון ± SEM התכוון ± SEM
אנג-1 27.29 11.71 63.66 25.06 0.39
CD40L 4527.01 2986.34 3537.59 3537.59 0.74
DCN  1307.68 320.87 996.54 282.96 0.77
INFβ 0.36 0.36 0.002 0.002 0.85
IL18 0.00 0.00 1832.89 1265.33 0.13
LIF  97.45 88.12 337.58 231.25 0.54
ראנטים 698.06 322.59 1254.13 811.19 0.56
INFγ 4.49 1.37 3.68 0.65 0.77
IL13 501.21 285.07 810.81 159.67 0.25
IL21 24.38 9.51 18.52 6.17 0.56
IL1F5 5.07 3.85 5.40 1.70 0.56
TNFα 61.45 35.00 44.91 13.41 0.77
ANG1 – אנגיופיאטין 1, CD40L – CD40 Ligand, DCN – Decorin, IFNβ – אינטרפרון בטא 1, IL18 – Interleukin-18, LIF – מפעל מעכב לוקמיה, RANTES – מוסדר על הפעלה, תא T רגיל מבוטא ומופרש, IFNγ – אינטרפרון גמא, IL13 – Interleukin 13, IL21 – Interleukin 21, IL1F5 – Interleukin 1 בן משפחה 5, TNFα – גורם נמק הגידול אלפא

טבלה 2: ציטוקינים וכימותרפיה נמדדים בתרבות קליפת המוח השחלתית מדיום מבאר אחת עבור כל חיה המ pooled במשך 4 ימים של תרבות. נתונים המוצגים עם ממוצע ± SEM. כחול מציין P < 0.1-0.14 ויש לו נטייה להיות שונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרון של תרבות קליפת המוח השחלתית במבחנה, כפי שמתואר בכתב יד זה, הוא שהזקיקים מתפתחים בסביבה מנורמלת עם סטרומה סמוכה המקיפה את הזקיקים. התאים הסומטיים והבוציטים נשארים שלמים, ויש תקשורת מתאימה בין תא לתא כמודל in vivo. המעבדה שלנו מצאה כי מערכת תרבית 7 ימים מספקת folliculogenesis נציג ונתונים steroidogenesis לטיפול של קליפת המוח השחלות. פרוטוקולים אחרים של תרבית רקמת השחלות יש תקופות תרבות קצרות יחסית 1-6 ימים7,32 או תקופות תרבות ארוכות של 10-15 ימים5,6,10. עם זאת, ראינו כי culturing במשך יותר מ 7 ימים מוביל השפלת רקמות, steroidogenesis מופחת, ואולי סבירות מוגברת של זיהום (נתונים לא הראו). קליפת המוח השחלות פולחנית בעקבות כריתת השחלות מספקת גם תובנה ישירה על המיקרו-סביבה השחלות בתוך החיה המסוימת הזו. זה מעניין את מעבדת המחקר שלנו כפי שזיהינו שינויים בהתפתחות זקיקים לאחר משטרים תזונתיים הוטלו לאחר גלד והוביל להתבגרות מינית בעוגות16.

התפתחות זקיק משלב קדמוני עד antral הוא תהליך דינמי בתוך קליפת המוח השחלתית, הכולל גורמים אנדוקריניים paracrine מתאים סומטיים ותקשורת תא קומולוסoocyte 33. תרבית הרקמות, כגון תרבית קליפת המוח השחלתית, מציעה סביבה מבוקרת לחקור את התפקיד המכניסטי של גורמים אלה ואת המילייה האנדוקרינית במיקרו-סביבה השחלות. השחלות ניתן לאסוף מבעלי חיים שעברו טיפול in vivo או משתנים גנטית כדי לקבוע השפעות על התקדמות הזקיק.

השחלות ניתן גם לאסוף מבית מטבחיים מקומי (1 שעה משם) ומועבר ב 37 °C (50 °F) בתרמוס המכיל PBS עם אנטיביוטיקה. אם התחבורה ארוכה יותר (למשל, בן לילה), השחלות נשלחות או מועברות על קרח22. תוצאות דומות נצפו אם הובלת השחלות מתרחשת על קרח לילה או ב 37 °C (50 °F) עם תחבורה לטווח קצר תרמוס. 37 °C עם הובלת תרמוס מאפשר קציר של ביציות מרקמה זו להבשלה חוץ גופית (IVM) או הפריה חוץ גופית (IVF)34. מחקרים אחרים מצאו כי הובלת רקמות בטמפרטורות בין 2-8 מעלות צלזיוס שימשו גם לשימור פוריות ברקמות הרבייה35,36,37. עם זאת, מחקרים אחרים השתמשו בשחלות שהועברו ב 34-37 °C (34 °F) ועל קרח ולא הבחינו בהבדלים בתרבית רקמת בקר38.

אם רקמת תרבית קליפת המוח השחלתית לא נראית בריאה לאחר התרבות, זה יכול להיות בגלל חתיכות של קליפת המוח השחלתית להיות גדול מדי. צעד קריטי בפרוטוקול הוא להבטיח כי חתיכות קליפת המוח השחלתית אינם גדולים יותר מ 0.5-1 מ"מ3. אנו משתמשים בסרגל כדי למדוד את החלקים ולהשתמש בקנה מידה בתוך המיקרוסקופ הניתוח כדי לקבוע את גודל חתיכות קליפת המוח השחלתית (איור 2C). אחרים משתמשיםבציוד ספציפי (ראה טבלת חומרים ) לעובי אחיד ואורך / רוחב, בהתאמה26. אם חתיכות אלה של ציוד אינם זמינים, אז ריבועי פלסטיק יכול לשמש כתבנית כדי לקבל עובי אחיד ולהבטיח חתיכות בגודל דומה27.

כדי להבטיח חתיכות חתוכות כי הם רק מקליפת המוח ואין להם medulla לאחר שטיפת השחלה אנו מניחים אותו בצלחת 60 מ"מ לחתוך לשניים. קליפת המוח והמדולה שונות מאוד מבחינה היסתולוגית כפי שניתן לראות בעבר בעבדאל-מג'ד, 202016. כל חצי מהשחלה הוא פילה עם הלהב כדי להבטיח כי רק קליפת המוח מוסרת מן השחלה ואת medulla נשאר. אם אנשים רק מתחילים לשכלל טכניקת חיתוך זו, הם יכולים גם להשתמש באדום נייטרלי כדי לראות מקרוב את ההסתדרות של כל מחצית השחלה39. זה יאפשר פיתוח של ציוני דרך כמו טכניקת חיתוך שלהם, משתפר. יתר על כן, הם יכולים להשתמש במכשירים שיכולים לחתוך עובי אחיד (ראה טבלת חומרים) כאמור מעל26,27.

מדיום קליפת המוח השחלתית צריך להיות ורוד בהיר. ראינו כי ה- pH של תרבות קליפת המוח השחלתית משתנה במהירות אצל בעלי חיים מסוימים, ולכן, יש לשנות את הרוב (70%) של מדיום קליפת המוח השחלתית כל 24 שעות כדי לקדם את בריאות התרבות. מאמרים קודמים דנו בשינוי מחצית מהמדיום מדי יום40. הסיבה שלנו לשינוי רוב התקשורת בכתב היד הנוכחי הייתה כדי לקדם את הבריאות של תרביות קליפת המוח השחלתית. טיפות המקיפות את חתיכות קליפת המוח השחלתית נשארות ולא היו השפעות שליליות של שינוי בינוני על התרבות. יתר על כן, זה איפשר לנו לנתח יותר הורמונים, ציטוקינים, וכימותרפיה עבור כל בעל חיים כדי ליצור תובנה לתוך microenvironment השחלות.

פרוטוקול תרבית רקמות זה מציע מספר יתרונות. קליפת המוח השחלות פולחנית מאפשרת לזקיקים להתפתח בסביבה הדומה ל- in vivo. זקיקים נשארים נתמכים על ידי הסטרומה שמסביב והתקשורת בין תאים סומטיים לבין ביציות תא קומולוס ממשיכה. השימוש בתרבית היטב מוסיף מאפשר קליפת המוח השחלתי לנוח על המדיום התרבותי מבלי להיות שקוע, ובכך למנוע את הרקמה מחייב לבסיס הפלסטיק של צלחת הבאר. יתרון נוסף הוא חלון התרבות. חלון התרבות 7 ימים המתואר בפרוטוקול מספק נתונים הורמון מייצג גורם גדילה. בנוסף, folliculogenesis ממשיך להתקדם בסביבה זו במבחנה כפי שספרנו פחות זקיקים בשלב מוקדם (ראשוני) ויותר זקיקים בשלב מאוחר (משני, antral) לאחר 7 ימים של תרבות16. פרוטוקולים קודמים של תרבית רקמת השחלות השתמשו קצר יחסית (1-6 ימים7,32) או ארוך (10-15 ימים5,6,10) תקופות תרבות. חלונות תרבות קצרים יותר שימשו כדי לחקור הפעלת זקיק קדמוני בקליפת המוח השחלות של שור העובר41. בפרימטים לא אנושיים, נעשה שימוש בתקופת תרבות של 20 יום כדי להעריך את היכולת של הזקיקים הקדמונים של הפרימטים לשרוד וליזום צמיחה במבחנה במדיום18ללא סרום . עם זאת, ראינו השפלה מוגברת של רקמות כאשר פולחן קליפת המוח השחלות במשך יותר מ 7 ימים במדיום ללא סרום. קבענו גם בניתוח של דגימות יומיות כי ריכוזי סטרואידים מופחתים לאחר 4 ימים של תרבות (נתונים לא הראו). חלון תרבות ארוך יותר יכול גם להגביר את האפשרות של זיהום בתרביות קליפת המוח השחלתית. לכן, השפעות עיקריות ניתן למדוד על ידי 7 ימים של תרבות15 וזמן התרבות עשוי להיות תלוי במודל בעלי החיים ושאלה מדעית טופלו.

בעוד מספר יתרונות של פרוטוקול קליפת המוח השחלות שור זה קיימים, יש כמה מגבלות. מגבלה אחת היא כמות רקמת קליפת המוח השחלתית ונפח בינוני תרבית שנאסף במהלך תרבות קליפת המוח השחלות. הגודל הקטן של חתיכות קליפת המוח השחלתית מאפשר מספר מוגבל של קטעי רקמות לשמש למטרות כתמים (H&E, immunofluorescence, וכו '). כדי לבצע RT-PCR, מינימום של ארבעה חתיכות קליפת המוח נדרשים16. יתר על כן, הנפח הנמוך של מדיום התרבות שנאסף עשוי להגביל את כמות הניתוחים שנערכו. כדי להילחם במגבלות אלה, אנו מציעים culturing כמה שכפולים לכל שחלה כדי לספק אספקה נאותה של מדיום ורקמות תרבית עבור היסתולוגיה, עשייה, ו- PCR. לעתים קרובות אנו תרבית כמה חתיכות של כל שחלה מפרה אחת / פרה כדי להשיג יותר רקמה לניתוח נוסף ולקבל בינוני תרבות מוגברת כדי למדוד הפרשת קליפת המוח של הורמונים/ציטוקינים/כימותרפיה. זקיקים פרה-קדמוניים מפוזרים יותר בשחלות פרה מבוגרות יותר מאשר נקבות צעירות יותר (עופות). לכן, מגבלה פוטנציאלית היא קבלת זקיקים פרה-אנטרליים על כל חתיכות קליפת המוח השחלתית כי הם תרבותיים. מספר דרכים למתן מגבלה זו היא להשיג יותר חתיכות קליפת המוח השחלתית ולתרבות בארות נוספות עבור כל בעל חיים או להשתמש באדום נייטרלי כדי לדמיין זקיקים ולהבטיח כי כל חתיכות קליפת המוח מכילות זקיקים פרה-קדמוניים מוקדמים. מגבלה שלישית של תרבות קליפת המוח השחלתית היא שכל זיהום של מערכת התרבות הופך את כלי התקשורת וקליפת המוח לבלתי שמישות לניתוח. לכן, מספר דרכים לשמור על סביבה סטרילית היא לסנן את המדיום המשמש בתרבות. לפני עיבוד וחיתוך חתיכות קליפת המוח השחלתית לוודא כי הספסל הנקי כבר מעוקר עם 70% אתנול, ואת זרימת האוויר כבר פועל לפחות 30 דקות לפני ניתוחים. כמו כן, אם אתם משתמשים בפנקס סופג כדי לאפשר ניקוי קל יותר (איור 1),ודאו כי נורית ה-UV נדלקה במשך 30 דקות לפני הנחת רקמה כלשהי בספסל הנקי כדי לחטא את הפנקס ואת הספסל הנקי. לבסוף, כל השינויים בתקשורת צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית עם זרימת אוויר נאותה, מכשירים סטריליים, ושינוי טיפים pipet כדי להבטיח רק טיפים סטריליים הם הציגו לתוך המדיום להיות ממוקם בארות עבור תרבות קליפת המוח השחלות.

יישום טכניקה זו יסייע בהבנת המיקרו-סביבה השחלתית ועשוי להתחיל לפענח מנגנונים המעורבים בהפרעות הרבייה הנשיות הכרוכות בהתפתחות זקיקית שונה. לדוגמה, האטיולוגיה של תסמונת השחלות הפוליטיסטיות (PCOS) והיבטים של כשל השחלות בטרם עת (POF) עדיין לא ברורים. מכיוון שפרות הן מונו-ביוציות, הן מהוות מודל מצוין להבנת גורמים המשפיעים על התקדמות הזקיק ומעצר במינים מונו-ביוציות אחרים (למשל, בני אדם ופרימטים שאינם אנושיים). יתר על כן, שיטה זו של תרבות קליפת המוח השחלות עשויה גם להוכיח מועיל לבדיקת טיפולים פוטנציאליים שעשויים לשפר הפרעות בתיווך זקיק וכתוצאה מכך פוריות אצל נשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי למזון וחקלאות 2013-67015-20965 ל- ASC, אוניברסיטת נברסקה מזון לבריאות מענקים תחרותיים ASC. ארצות הברית מחלקת החקלאות האץ' להעניק NEB26-202/W3112 גישה #1011127 ASC, האץ'-NEB גישה ANHL #1002234 ASC. תמיכה בפוסט דוקטורט של יוזמת מדעי החיים הכמותית – פרס COVID-19 למימון הקיץ עבור CMS.

המחברים רוצים להרחיב את הערכתם לד"ר רוברט קושמן, המרכז לחקר בעלי חיים בשר בארה"ב, קליי סנטר, NE כדי להודות לו על מתן השחלות בפרסום קודם, אשר שימשו אז במאמר הנוכחי כהוכחת מושג באימות טכניקה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scapel Blade Swann-Morton  303 Scaple Blade
#21 Scapel Blade Swann-Morton  307 Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter Corning 430514 Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay Biocrates Sterol17 Kit Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned 
Androstenedione Double Antibody RIA Kit MPBio 7109202 RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit  DIA Source  KIP0451 RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3 RayBiotech QAB-CYT-3-1 Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3 Olympus 7790 Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco ThermoFisher Scientific 5150056 Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium Gibco ThermoFisher Scientific 4130039 Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet 
Microscope  Olympus SZX16 Disection microscope used for imaging tissue culture pieces 
Microscope Camera  Olympus DP71 Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter Millipore Sigma PICM01250 Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate Falcon 353047 Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm Falcon 351007 Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) Corning 21-040-CV Used for tissue washing
SAS Version 9.3 SAS Institute  9.3 TS1M2 Statistical analysis software 
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer Thomas Scientific 6727C10 Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium Sigma-Aldrich W1625 Medium used for tissue cultures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Tags

ביולוגיה גיליון 167 קליפת המוח השחלות הורמונים זקיקים תרבית רקמות בינוני תרבות סטרואידים ציטוקינים
תרבית רקמת קליפת המוח השחלות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sutton, C. M., Springman, S. A.,… More

Sutton, C. M., Springman, S. A., Abedal-Majed, M. A., Cupp, A. S. Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture. J. Vis. Exp. (167), e61668, doi:10.3791/61668 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter