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Biology

ウシ卵巣皮質組織培養

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61668
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Animal Production, School of Agriculture, University of Jordan
* These authors contributed equally

Summary

ウシ卵巣皮質のインビトロ培養と卵巣微小環境に対する栄養ステアステップ食の効果が提示される。卵巣皮質片を7日間培養し、ステロイド、サイトカイン、および卵胞ステージを評価した。ステアステップダイエット治療は、培養中の卵胞の進行をもたらすステロイド発生を増加させました.

Abstract

原始から角質段階までの卵胞の発達は、体細胞および積雲細胞卵母細胞コミュニケーションからの内分泌およびパラクリン因子を含む卵巣皮質内の動的プロセスである。卵巣微小環境についてはほとんど知られていないし、周囲のミリューで産生されるサイトカインとステロイドが卵胞の進行または逮捕に影響を与える方法.卵巣皮質のインビトロ培養は、隣接する間質によって支えられているままの正常化された環境で卵胞を発達させることができます。我々の目的は、牛の卵巣皮質のインビトロ培養を通じて、卵巣微小環境(卵胞の発達、ステロイド、およびサイトカイン産生)に対する栄養ステアステップ食の効果を決定することであった。これを達成するために、卵巣皮質片は、思春期前に2つの異なる栄養開発スキームを受けているハイファーから取り除かれました:コントロール(伝統的な栄養開発)と階段ステップ(開発中の給餌と制限)は約0.5〜1mm3 個に切断されました。これらの部分は、その後、一連のウォッシュを通過し、ウェイマスの培養培地を含む井戸に設定された組織培養インサートに配置された。卵巣皮質は、毎日の培養培地交換で7日間培養した。組織学的切除は、追加の治療なしに栄養と文化の影響を決定するために、培養前後の卵胞ステージの変化を決定するために行われました。ステロイドを測定するために皮質培養培地を数日間プール, ステロイド代謝物, サイトカイン.ステアステップ対コントロール卵巣皮質培養で卵胞の進行を可能にする卵巣微小環境でステロイドホルモンの増加の傾向があった.卵巣皮質培養技術は、卵巣微小環境のより良い理解を可能にし、内分泌の変化が生体内およびインビボ治療の両方からの卵胞の進行および成長にどのような影響を与えるかを可能にする。この培養法は、不妊治療を促進するために女性の卵胞の進行を改善する可能性のある潜在的な治療薬をテストするために有益であることが証明されるかもしれません.

Introduction

卵巣皮質は、卵胞の発生が起こる卵巣の外層を表す1。初期卵胞は、最初に開発中に逮捕され、パラクリンおよびゴナドトロピン入力1、2、3、4に基づいて、一次、二次、および第三次卵胞になるために活性化される。卵巣内の生理学的プロセスをよりよく理解するために、組織培養をインビトロモデルとして使用することができ、それによって制御された環境が実験を行うことを可能にする。多くの研究は、生殖補助技術、生殖能力の保存、および卵巣癌5、6、7の研究のために卵巣組織培養を利用している。卵巣組織培養は、卵巣の健康にダメージを与える生殖毒素を調査するためのモデルとしても役立っており、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)8、9、10、11などの生殖障害の病因と卵巣の健康に損傷を与える。このように、この文化システムは、さまざまな専門分野に適用可能です。

げっ歯類では、胎児全体または周産期生殖腺が生殖生物学実験12、13、14、15で使用されている。しかし、大きな家畜の生殖腺は、その大きさと潜在的な変性のために臓器全体として培養することはできません。したがって、ウシ、および非ヒト霊長類卵巣皮質は、小片16、17、18に切断される。多くの研究は、国内の家畜および非ヒト霊長類1、17、18、19における原始卵胞開始における様々な成長因子を研究するために小さな卵巣皮質片を培養した。卵巣皮質培養の使用は、7日間培養されたウシおよび霊長類皮質片の血清が存在しない場合の原始卵胞開始を20日間も実証した。ヤンとフォーチュン 2006年に10日間にわたってテストステロン用量の範囲で胎児卵巣皮質培養培地を治療し、テストステロンの10-7 M濃度が卵胞の募集、生存、および初期段階の卵胞19の進行を増加することを観察した。2007年、牛胎児(妊娠5~8ヶ月)の卵巣皮質培養物を用いて、ヤンとフォーチュンは、一次から二次卵胞への移行21における血管内皮成長因子A(VEGFA)の役割を報告した。さらに、我々の研究室は、VEGFAアイソフォーム(血管形成、抗血管新生、および組み合わせ)が、VEGFAが結合する主なシグナル伝達受容体であるキナーゼドメイン受容体(KDR)を介して異なるシグナル伝達経路を調節する方法を実証するために卵巣皮質培養を利用した。この情報により、異なるVEGFAアイソフォームが卵胞の進行または逮捕を引き出すシグナル伝達経路にどのような影響を与えるかをよりよく理解することができました。まとめると、異なるステロイドまたは成長因子を用いたインビトロでの卵巣皮質片の培養は、卵胞形成を調節するメカニズムへの影響を決定する貴重なアッセイであり得る。同様に、異なる栄養体制で開発された動物は、卵巣微小環境を変化させ、女性の生殖成熟に影響を与える卵胞形成を促進または阻害する可能性がある。したがって、現在の原稿における我々の目標は、ウシ皮質培養技術を報告し、前述の13ヶ月齢に集められたコントロールまたは階段ステップの食事を与えられたハイファーからウシ皮質のインビトロ培養後に卵巣微小環境に違いがあるかどうかを判断することです。

したがって、我々の次のステップは、異なる栄養食で開発されたこれらのハイファーにおける卵巣微小環境を決定することであった。我々は、階段ステップまたはコントロールダイエットのいずれかで供給されたハイファーからの卵巣皮質を評価した。コントロールハイファーは、84日間97.9 g /kg0.75 のメンテナンスダイエットを提供されました。階段ステップダイエットは、84日間67.4 g /kg0.75 の制限された給餌食を含む8ヶ月で開始されました。最初の84日間、コントロールハイファーは97.9 g / kg0.75を受け取り続けましたが、階段牛ハイファーはさらに68日間118.9 g/kg0.75 を提供され、その後16歳の13 ヶ月で卵巣化され、濾胞期と培養前後の変化を研究しました。我々はまた、ステロイドの違いについてアッセイ, ステロイド代謝物, ケモカイン, 皮質培地に分泌サイトカイン.ステロイドおよび他の代謝物は、生体内および/または生体外で組織の生存率と生産性に対して行われた治療から直接の影響があるかどうかを判断するために測定されました。培養前後の卵巣微小環境の変化は、培養前の内分泌ミリューおよび卵胞形成のスナップショットを提供し、培養中の培養または治療が卵胞の進行または逮捕にどのように影響するかを提供した。

卵巣摘出術が米国で行われた後に卵巣が採取された。 肉動物研究センター(USMARC)は、16歳の13ヶ月でコントロールと階段ステップハイファーからのIACUC手順に従って、無菌リン酸緩衝塩水(PBS)で洗浄し、血液やその他の汚染物質を除去するために0.1%の抗生物質で洗浄し、過剰組織をトリミングし、ネブラスカ大学リンカーン大学(UNL)生殖生理学研究所UNLに運ばれました。.UNLでは、卵巣皮質片を小さな正方形に切断した(〜0.5-1 mm3;図1)7日間培養して(図2)。組織学は、培養前後の皮質培養スライドで行われ、卵胞ステージ16、24(図3および図4)、および線維症を示す細胞外マトリックスタンパク質(ピクロシルスレッド、PSR;図 5.これにより、卵胞ステージに対するインビボ栄養レジームの効果の決定が可能となり、卵胞ステージおよび卵胞進行に対する卵巣皮質の7日間の比較が可能となった。培養を通じて、培地は毎日収集され、変化し(毎日約70%の培地が収集され、250 μL/well)、毎日のホルモン/サイトカイン/ケモカインのいずれかを評価またはプールして平均濃度を得ることができます。アンドロステンジオン(A4)やエストロゲン(E2)などのステロイドは、3日間にわたってプールすることができ、放射性免疫アッセイ(RIA;;図 6)1匹の動物につき4日間にわたってプールし、高性能液体クロマトグラフィー質量分析(HPLC-MS)24、25(表1)を介してアッセイした。サイトカインアレイは、卵巣皮質培養培地26におけるサイトカインおよびケモカイン濃度を評価するために利用した(表2)。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイプレートを実施し、前述の16に示した特定のシグナル伝達経路に対する遺伝子発現を決定した。ステロイド、サイトカイン、卵胞ステージおよび組織学的マーカーのすべては、卵巣微小環境のスナップショットを提供し、その微小環境が「正常」または「異常な」卵胞形成を促進する能力に関する手がかりを提供する。

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Protocol

卵巣は米国肉動物研究センター16から得られた。16以前に述べたように、すべての手順は、農業研究と教育における農業動物のケアと使用のためのガイドに従って、米国肉動物研究センター(USMARC)動物のケアと使用委員会によって承認されました。卵巣はネブラスカ大学リンカーン生殖研究所に持ち込まれ、そこで処理され、培養されました。

1. 必要なメディアの準備

  1. ウェイマス MB 752/1 メディア
    1. 1 L組織培養ボトルに900mLの滅菌水を充填します。水がかき混ぜる間、徐々に粉状の媒体を加えます。粉末化した培地が溶解したら、2.24gの重炭酸ナトリウムに続いて1.25gのウシ血清アルブミン(BSA)を加える。pHメーターを使用し、pHを7.25-7.35に調整します。滅菌水を追加して最終体積を1 Lにします。
    2. 生物学的安全キャビネットに移動し、ペニシリンストレプトマイシン硫酸塩を培地の0.1%v/vの濃度で添加します。0.22 μmの細孔33.2 cm2 500 mLボトルトップフィルターで媒体をフィルターします。
    3. ろ過した媒体を複数の50 mL円錐形チューブに注ぎます。アリクォート培地の50mLあたり0.5 mLのインスリントランスフェリンセレンを加える。
    4. 円錐形のチューブとミディアムのストックボトルをアルミホイルで包み、4°Cで保管します。 この媒体は光に敏感である。
      注:ウェイマス培地は最大1ヶ月間保存できます。
  2. ライボヴィッツのL-15(LB-15)培地
    注:LB-15培地は、培養に備えて組織をきれいにするために使用されます。
    1. 1 L組織培養ボトルに900mLの滅菌水を充填します。滅菌水が攪拌板で軽く撹拌されている間、徐々に調製した粉末培地を加える。pHメーターを使用し、pHを7.25-7.35に調整します。滅菌水を追加して最終体積を1 Lにします。
    2. 生物安全キャビネットに移動します。0.1%の抗生物質でLB-15の1 Lを作ります( 材料表を参照)。0.22 μmの細孔33.2 cm2 500 mLボトルトップフィルターを使用して、培地を2本の500 mL組織培養ボトルにフィルターします。LB-15培地としてアルミ箔で包み込みボトルは光に敏感で、4°Cで保存します。
      注:LB-15培地は、最大1ヶ月間保存することができます。
  3. リン酸緩衝生理食塩分 (PBS)
    1. 実験室でPBSを作るか、カルシウムやマグネシウムなしで滅菌PBSを購入する (材料の表).ラボでPBSを作るためには、蒸留水800mLから始め、それに8gの塩化ナトリウム(NaCl)を加えます。次に、0.2gの塩化カリウム(KCl)、1.44gのリン酸二塩基ナトリウム(Na2HPO4)、および0.24gのリン酸二塩基カリウム(KH2PO4)を加える。pHを~7.4に調整し、合計体積を1 Lに調整します。
    2. 生物学的安全キャビネットで、0.1%の抗生物質( 材料表を参照)で1 L PBSを作ります。

2. 卵巣皮質培養プロトコル

注:卵巣は生後13ヶ月で春生まれのUSMARCハイファーから得られました。卵巣を十分にすすいだし、すべての血液および他の体液を抗生物質を含むPBS(0.1%)で除去し、37°C23でネブラスカ大学リンカーン再生研究所UNL(1.5時間離れた場所)に運んだ。 (輸送中の卵巣の温度に関するコメントについては、議論を参照してください)

  1. きれいなベンチで卵巣組織を準備します(図1)。
    1. 70%エタノールでクリーンベンチを消毒します。ベンチトップに新鮮な吸収パッドを置きます。紫外線と一緒に解剖の30分前にクリーンベンチブロワをオンにして、吸収パッドを含むクリーンベンチ内の何かを殺菌し、適切なPPEが使用されていることを確認してください。
    2. ペトリ皿(60 x 15mm)を組織洗いのために手配します。PBS洗浄には3つのペトリ皿、抗生物質を用いたPBS用に3つ、LB-15洗浄には3つ必要です。追加のLB-15含有ペトリ皿に付属の蓋が付いたペトリ皿は、洗剤後の作品の最終的な配置に利用されます。
    3. 各ペトリ皿に、PBSまたはLB-15のいずれかの適切な液体の約10 mLを充填します。

Figure 1
図1:きれいなベンチで卵巣と皮質片を洗浄するためのプレートのレイアウト。(A)皮質の切片が除去されるので卵巣を洗浄するために使用されるPBS。(B) 皮質片が通過する抗生物質の打ち上がったPBS。(C)卵巣皮質片は、LB-15で最終洗浄のためにバイオセーフティキャビネットに移動する前にLB-15で4回洗浄される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 

  1. 準備したウェイマスとLB-15培地を冷蔵庫から取り出し、室温まで温めます。
  2. 使用前に殺菌を保障するためにすべての用具をオートクレーブ。
  3. 卵巣皮質が採取される準備ができるまで、卵巣を 37°Cで維持する。
  4. 鋸歯状の顎を持つ鉗子を使用して、卵巣を拾い、最初のPBSで満たされたペトリ皿で徹底的に洗います。卵巣を2回目のPBS洗浄に移し、もう一度完全に浄化します。
    注:卵巣皮質ストリップが除去されている間、卵巣は2回目のPBS洗浄にとどまります。
  5. 鋸歯状の顎鉗子を使用して、卵巣を固定し、半分にスライスします。このとき、卵巣皮質は髄質から切り離されます。定規を使用して、卵巣の表面の深さの1〜2mm以下が髄質16から離れて取り除かれないようにしてください。卵巣皮質の横切り部分を髄質から取り除き、メス(#11メスブレード;#3ハンドル)で卵巣皮質の3〜4薄いストリップ(図2)を切断し、3番目のPBSで満たされたペトリ皿にストリップを入れます。
    注:この時点で、RNA抽出のために追加の卵巣皮質組織を収集するか、または最初の非培養皮質片の組織学のために固定して収集することができます。卵巣皮質のストリップを除去する場合は、目に見える角包または毛小胞体を有する領域を避ける。また、髄質組織の収集は避けてください。髄質の神学は、前に示したように非常に異なっています16.もし卵巣皮質が1~2mm以上の深さに切り込まなければ、髄質は得られないはずです。明確な神学は皮質と髄質の間のランドマークを可能にする。
  6. 3番目のPBSで卵巣皮質ストリップを#21メスブレードで小さな正方形の部分(〜0.5〜1 mm3)に洗います。ペトリ皿の下の定規を使用して、一貫した卵巣皮質片を作るために、同じような大きさと厚さを確認します。メスで切り取りながら、ストリップを固定するために鉗子を使用してください。
    注:切断された組織片の数は、実験に依存します。卵巣皮質の4つの部分は、培養に必要な組織の最小量である。適切な長さと深さを確保するための他の方法には、特別なスライサー26 またはプレカットプラスチック片をテンプレート27として使用する方法が含まれます。
  7. 抗生物質で満たされたペトリ皿で3つのPBSすべてを通して卵巣皮質片を洗います。曲面の先端鉗子を使用して、打ち上げの間にピースを移動します。
  8. 一連のLB-15洗い物を通して皮質片を動かし、最終的なLB-15で満たされたペトリ皿に入れます。ふたに動物IDと卵巣側(左または右)でラベルを付けます。
    注:徹底的な洗浄のために、各洗浄に卵巣皮質片を完全に水没します。
  9. 卵巣ごとに4つの卵巣皮質片を収集し、ゼロの神学を第一日の固定.追加の部分は、RNA用にフラッシュ冷凍することもできます。残りの組織片は培養に使用されます。各組織採取後に70%エタノールで解剖ツールを拭き取ります。
  10. 最終的な組織洗浄および培養準備のための生物学的安全キャビネットを準備する。生物学的安全キャビネットに入れる前に70%エタノールで供給を消毒してください。生物学的安全キャビネットで作業する場合は、無菌技術を使用してください。
  11. 培養用のすべての卵巣皮質を生物学的安全キャビネットに移動し、LB-15で満たされたペトリ皿でもう一度洗います。
  12. 24ウェル組織培養プレートにおいて、ウェイマス培地のピペット350μLをウェルあたり。
  13. 鉗子を使用して各井戸に塗られていない培養井戸を挿入します。これにより、組織が乾燥することとなるので、挿入物の基部の下に泡が形成されていないことを確認してください。培地は、培地が吸収され、卵巣皮質片を取り囲むことを可能にするために、挿入物に触れている必要があります。
  14. 各インサートのメッシュ上に4つの卵巣皮質片を慎重に配置する(図2)。鉗子はティッシュの部分が敏感に置かれていない場合の網を穿刺することができる。組織片は、互いに、または挿入物の側面に触れてはならない。
  15. 5%CO216で37°Cで組織をインキュベートする。
    注:他の人は38.8°C28を使用しています。 しかし、組織の完全性や37°C組織で進行する卵胞の能力に違いは見られなかったが、他の39、30を有する。したがって、この時点でこれらの温度のいずれかが実験の成功を助長する必要があります。他の人は400 μLの媒体を使用した。どちらかの量は一貫性がある限り細かく、組織は部分的に沈み、組織の水和を可能にする十分な表面張力(卵巣皮質片を取り巻くメディア)を可能にする。空の井戸に500 μLの無菌水を充填して、他の井戸からの蒸発を減らします。

Figure 2
図2:卵巣皮質片と培養プレート(A)卵巣の皮質から切り取られた卵巣ストリップ。(B)ルーラーと皮質の部分を並べて表示する。(C)プレート内の培養液中のインサート上に4つの皮質片(約0.5〜1mm3)を置く。(D)インサートを持ち上げて、ウェルから培養培地を収集する。毎日すべての培養培地(250μL)を収集して交換して適切なpHを維持し、毎日各ウェルから約250μLが得られます(初期培養培地の約70%)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. メディアコレクション

  1. 卵巣皮質培養培地を毎日7日間変更する。中程度の変更は、大きなpHと色の変化を防ぐために、可能な限り24時間に近い値にする必要があります。温かいウェイマス培地を中程度に変更する前に37°Cにする。毎日約250μLが各ウェルから得られます(初期培養培地の約70%)。
  2. 中程度の変更の際は、鉗子を使用して、インサートをウェルからそっと持ち上げます。培養したウェイマス培地を0.5 mLチューブ(約250μL/日)で回収してください。インサートをうまく戻し、インサートの側面とウェルの間に培地を分配して、350 μLの新鮮な培養培地を加えます。
    注:すべてのステロイド、サイトカイン、および卵巣微小環境を決定するために必要なケモカインを測定するのに十分なメディアを得るために毎日メディアのほとんどを変更します。また、日次の培地の変化は、培地中で大きなpH変化(色の変化によって示される)を防ぐために重要である。培地の滴は、部分が濡れたままであることを確認するために、卵巣皮質片を取り囲む保持された。培地の70%の変化による培養組織では問題は認められなかった。
  3. 組織培養から採取した培地を -20°Cで保存する。

4. イメージングとダウンストリーム処理

  1. 5%CO2で37°Cで7日間培養した後、カメラを取り付けた解剖顕微鏡とコンピュータイメージングソフトウェアプログラムを用いて卵巣皮質片を画像化した。
    注:暗い部屋は、通常、画像に最適な画質を実現するのに最適です。
  2. イメージングの後、構造学のためにブインの井戸あたり2つの卵巣皮質片を固定し、液体窒素中の2つの卵巣皮質片をフラッシュ凍結してcDNAのRNAを得る。組織を持つすべての井戸に対してこのステップを繰り返します。7日目から培地を回収し 、-20°Cで保存する。
  3. 卵巣皮質片をブイン(ピクリン酸750 mL、氷酢酸50mL、ホルマリン250mL37%~40%)に浸し、70%エタノールで3回洗浄する前に約1.5時間浸漬します。組織は70%エタノールに残り、溶液が黄色でなくなるまで毎日クリアされます。
    注:ブイン以外の固定剤とパラホルムアルデヒドを使用できます。この体験でブインは最適な形態を達成するために固定剤であるとして使用されます。他の分析のためにより多くの組織が必要な場合、各動物から培地および卵巣皮質の断片の追加の井戸を得ることができる。

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Representative Results

この牛皮質培養法は、卵巣の小片から多種多様なホルモン、サイトカイン、および組織学データを決定するために使用することができる。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)のような染色は、卵胞のステージング16、23、31を通して卵巣形態を決定するために使用することができる(図3)。簡単に言えば、卵胞は、扁平上皮前顆粒球細胞の単層に囲まれた卵母細胞である原始子に分類された(0);過渡卵性卵胞または初期の初代は、主に扁平上皮前顆粒球細胞といくつかの立方腺顆粒球細胞に囲まれた卵母細胞である(1);1-1.5層の立方体顆粒球(2)に囲まれた卵子である原発卵胞。二次卵胞は、2つ以上の立方体顆粒球細胞に囲まれた卵母細胞である(3);直径1mm以下のアンタル卵胞は、それぞれ異なるアントルム(4)16、23を含む顆粒球細胞の2層以上に囲まれている(図3)。卵胞のステージングは、卵胞形成を評価するために培養前および後の培養の前に固定された卵巣皮質に対して行うことができる(図4)。H&Eで染色された3枚のスライドから、スライドごとに3枚の画像を撮影しました。次いで、卵胞を3人でステージングして数え、平均して各ステージ16,23で卵胞の数を決定した。400 倍の拡大で画像の視野の領域 (スライドあたり 3 枚) は 0.4mm2です。したがって、卵巣皮質片の面積の30%を数え、卵胞期を決定した。初期の卵胞数(培養前)(図4A)を用いて培養後に数えられる卵胞を正規化する(図4B)。

さらに、コラーゲン沈着(ピクロシルスレッド染色)によって決定される形態の違いは、階段ステップまたはコントロールハイファーからの卵巣皮質における線維症を示し得る(図5)。毎日の培養培地の収集は、RIAによる様々なステロイドホルモン産生を評価するために3日間にわたってプールすることができます(動物あたり200 μL培地サンプルを使用します。 図 6)またはステロイド代謝物高速液体クロマトグラフィー質量分析 (HPLC-MS; 220 μL 培地サンプルは、動物あたり 4 日間にわたってプール; 表 1)およびサイトカイン産生(表2)したがって、1つの動物の複数の複製は、すべての所望のアッセイを行うのに十分な皮質培地を確保するために必要とされ得る。

階段ハイファーは文化の開始時に原始卵胞を増加させ、培養の開始時にこれらを培養し、より多くの二次卵胞を得ることを期待していたため、結果で観察した。また, 二次卵胞の増加のため, 我々 はステロイドのより大きな濃度を期待します。.現在の原稿でこれを裏付けるアンドロゲン、グルココルチコイド代謝物、プロゲステロン代謝産物の増加傾向が見られた。我々の研究室はまた、卵胞進行、ステロイド発生、およびKDRにおける異なるシグナル伝達分子の活性化に対する異なるVEGFAアイソフォームの効果を評価した(血管内皮成長因子受容体2としても知られている;VEGFR2)は、信号伝達アレイプレート16を使用する。動物の変動を減らすために、1回の治療や、電力分析や変動性に応じて実験を行う場合は、11匹もの動物を使用しています。

ウシ卵巣皮質培養による結果の再現性は、卵巣皮質片の汚染によって最も影響を受ける。また、24-h 期間内に培地が定期的に変更されない場合、負の結果、またはサブパーの結果が生じることがあります。最初に添加されたときの培地は色がピンクですが、媒体が収集され、色がオレンジ色または明るい黄色に見えるとき、これは組織に有害である可能性のあるpHの変化を示す可能性があります。また、切断された組織片が大きすぎると、組織組織が切り離されるまで観察されない中間に変性を発症する可能性があります。この変性は、分析のための組織の使用を制限します。本論文で提示されたデータは、統計ソフトウェアプログラムにおけるノンパラメトリック検定および一般線形モデル分析を用いて分析された。培養前後のセクションあたりの原始、一次、二次、および角根の数を、一般化線形混合モデルを用いて分析した。有意性はP<0.05で決定され、0.14≤P≥0.05の傾向が報告された。

Figure 3
図3:卵巣皮質の卵胞ステージングのためのヘマトキシリンおよびエオシン染色 卵胞の異なる段階は、矢印によって示されます。(A) 原始卵胞 (ステージ 0);(B) 初期の初次卵胞 (ステージ 1);(C)原発卵胞(ステージ2);(D)二次卵胞 (ステージ 3);(E) アンタル卵胞 (ステージ 4).400x倍率で画像の視野の面積は0.4mm2である。卵巣皮質片の面積の30%を数え、卵胞の段階を決定する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:コントロール(n=6)および階段ステップ(n=6)ハイファーの異なる濾胞段階における卵胞の平均数。 (B) 7日間の培養後、原始P = 0.37、早期プライマリP = 0.84、プライマリP = 0.69、セカンダリP = 0.02。エラー バーは SEM を表します。

Figure 5
図5:コラーゲン(ピクロシリウスレッド;PSR)卵巣皮質の染色。 PSR の (A) コントロールと階段ステップ ハイファー 0 日目と 7 日目から。(B)コントロール(n = 4)と階段ステップ(n=4)ハイファーの間の卵巣皮質場(ピクセル/μm2)あたりのPSR陽性染色の平均面積を比較したグラフ。誤差範囲は SEM を表す 400 倍の画像の視野の面積は 0.4mm2です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:A4及びE2の濃度(A)A4及び(B)の濃度は、RIAによって測定された制御及び階段ステップハイファーの卵巣皮質培地中の培養3日間にわたってプールされたE2の濃度である。n = 各グループの 4。エラー バーは SEM を表します。 

ホルモン コントロール 階段ステップ P値 
n 4 4
ng/mL 意味する SEM ± 意味する SEM ±
ドキュメント 0.33 0.28 0.72 0.48 0.15
宿屋 0.61 0.60 4.93 3.99 0.08
コート 0.003 0.003 0.01 0.01 0.85
17OHP 0.59 0.53 1.88 0.99 0.08
A4 1.46 1.43 5.74 3.27 0.08
ひとつの  0.15 0.09 0.54 0.32 0.08
DHEAS 4.50 2.60 7.59 0.85 0.56
E2 0.05 0.05 0.13 0.08 0.32
P4 5.05 2.78 6.52 1.66 0.39
T 0.33 0.33 1.33 0.96 0.14
DHT 0.07 0.02 0.01 0.01 0.09
DOC - 11-デオキシコルチコステロン, INN - 11-デオキシコルチゾール, コルチコステロン, 17OHP – 17-ヒドロキシプロゲステロン, A4-アンドロステンジオン, AN – アンドロステロン, DHEAS – デヒドロエピアンドロストロサン硫酸, E2 - エストラジオール, P4 – プロゲステロン, T - テストステロン, DHTテストステロン

表1:卵巣皮質培養培地で測定されたステロイドおよびステロイド代謝物は、4日間にわたってプールされた動物ごとに1つの井戸から測定された。 平均± SEM. Blue で示されるデータは、P < 0.1 を示し、異なる傾向があります。

サイトカイン コントロール 階段ステップ P値
n 4 4
pg/mL 意味する SEM ± 意味する SEM ±
ANG1 27.29 11.71 63.66 25.06 0.39
CD40L 4527.01 2986.34 3537.59 3537.59 0.74
DCN  1307.68 320.87 996.54 282.96 0.77
インフβ 0.36 0.36 0.002 0.002 0.85
IL18 0.00 0.00 1832.89 1265.33 0.13
LIF  97.45 88.12 337.58 231.25 0.54
ランテス 698.06 322.59 1254.13 811.19 0.56
インフイの 4.49 1.37 3.68 0.65 0.77
IL13 501.21 285.07 810.81 159.67 0.25
IL21 24.38 9.51 18.52 6.17 0.56
IL1F5 5.07 3.85 5.40 1.70 0.56
TNFα 61.45 35.00 44.91 13.41 0.77
ANG1 – アンジオポエチン 1, CD40L – CD40 リガンド, DCN – デコリン, IFNβ – インターフェロンベータ1, IL18 – インターロイキン-18, LIF – 白血病阻害工場, RANTES – 活性化に調節, 正常T細胞発現および分泌, IFNγ – インターフェロンガンママ, IL13 – インターロイキン 13, IL21 – インターロイキン 21, IL1F5 - インターロイキン 1 家族メンバー 5, TNF因子 - 因子-

表2:4日間の培養物をプールした動物ごとに1つのウェルから卵巣皮質培養培地で測定されたサイトカインおよびケモカイン。 平均±SEM.ブルーで提示されたデータは、P<0.1-0.14を示し、異なる傾向があります。

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Discussion

この原稿に記載されているように、体外卵巣皮質培養の利点は、卵胞が卵胞を取り巻く隣接する間質を有する正常化された環境で発達することです。体細胞と卵母細胞はそのまま残っており、インビボモデルとして適切な細胞間通信がある。我々の研究室は、7日間の培養システムが卵巣皮質の治療のための代表的な卵胞形成およびステロイド生成データを提供することを発見した。他の卵巣組織培養プロトコルは、1〜6日、32または10〜15日5、6、10の長い培養期間が比較的短い培養期間を有する。しかし、我々は、7日を超える培養が組織の劣化、ステロイド生成の減少、および潜在的に汚染の可能性の増加につながることを観察した(データは示していない)。卵巣切除術後の卵巣皮質の培養は、その特定の動物内の卵巣微小環境に関する直接的な洞察も提供する。これは、栄養体制が引き続き発泡し、ハイファー16の思春期に至った後に濾胞の発達の変化を特定したので、私たちの研究室に興味深いものです。

原始から角質段階までの卵胞の発達は、卵巣皮質内の動的プロセスであり、体細胞および積雲細胞卵母細胞コミュニケーション33からの内分泌およびパラクリン因子を含む。卵巣皮質培養などの組織培養は、卵巣微小環境におけるこれらの因子および内分泌ミリューの機械化的役割を調査するための制御された環境を提供する。卵巣は、生体内治療を経た動物や、卵胞の進行に及ぼす影響を決定するために遺伝的に改変された動物から採取することができる。

卵巣はまた、地元のアバトワール(1時間離れた場所)から採取し、抗生物質とPBSを含む魔法瓶で37°Cで輸送することができます。輸送が長い場合(例えば、一晩)、卵巣は氷22で出荷または輸送される。同様の結果は、卵巣の輸送が一晩氷上で起こるか、または魔法瓶の短期輸送で37°Cで起こるかどうか観察されている。サーモ輸送を有する37°Cは、体外成熟(IVM)または体外受精(IVF)34のためにこの組織からの卵母細胞の収穫を可能にする。他の研究は、2〜8 °Cの間の温度で組織を輸送することも生殖組織35、36、37の不妊治療保存のために使用されていることを発見しました。しかし、他の研究は、34〜37°Cおよび氷上で輸送された卵巣を使用しており、ウシ組織培養38の違いを観察していない。

卵巣皮質培養組織が培養後に健康に見えない場合、これは卵巣皮質の破片が大きすぎるために起こる可能性があります。プロトコルの重要なステップは、卵巣皮質片が0.5〜1 mm 3以下であることを保証することです。我々は、ルーラーを利用して個体を測定し、解剖顕微鏡内のスケールを使用して卵巣皮質片のサイズを決定する(図2C)。その他は、それぞれ26の厚さと長さ/幅を均一に特定の機器(材料表を参照)を利用します。これらの機器が利用できない場合、プラスチックの正方形をテンプレートとして使用して均一な厚さを得て、同じようなサイズのピース27を確保することができます。

皮質からのみ、卵巣を洗った後に髄質を持たないカットピースを確保するために、60mm皿に入れて半分にカットします。皮質と髄質は、以前のアベダル・マジェド、202016で見たように非常に異なる組織学的です。卵巣の半分は、皮質のみが卵巣から取り除かれ、髄質が残っていることを確認するために、ブレードでフィレ化されます。個人がこの切断技術を完成し始めたばかりであれば、中性赤色を使用して卵巣39の各半分の組織学を密接に見ることができます。これは、その切断技術が向上するにつれて、ランドマークの開発を可能にします。さらに、26,27以上で述べたように、均一な厚さをカットできる機器(材料表を参照)を使用できます。

卵巣皮質培地は薄いピンクでなければなりません。我々は、卵巣皮質培養培地のpHが一部の動物において急速に変化することを観察し、したがって、卵巣皮質培地の大部分(70%)は、培養の健康を促進するために24時間ごとに変更されるべきである。以前の論文では、毎日のメディアの半分を変更する議論をしました40.現在の原稿のメディアの大部分を変更する私たちの理由は、卵巣皮質培養の健康を促進することでした。卵巣皮質片を取り巻く滴は残っており、培地変化が培養に及ぼす悪影響はなかった。さらに、これにより、各動物のより多くのホルモン、サイトカイン、ケモカインを分析し、卵巣微小環境に関する洞察を生み出すことを可能にしました。

この組織培養プロトコルは、いくつかの利点を提供します。卵巣皮質の培養は、卵胞がin vivoに似た環境で発症することを可能にする。卵胞は周囲の間質によって支えられ続け、体細胞と積雲細胞卵母細胞との間の通信は継続する。培養をよく挿入する培養の使用により、卵巣皮質は水没することなく培養培地の上に置き、それによって組織がウェルプレートのプラスチックベースに結合するのを防ぐことができます。もう 1 つの利点は、カルチャ ウィンドウです。プロトコルに記載されている7日間の培養ウィンドウは、代表的なホルモンおよび成長因子データを提供する。さらに、7日間の培養16日後に早期段階の卵胞(原始)および後期卵胞(二次、骨盤)を少なく数えたため、卵胞形成はこのインビトロ環境で進行し続けている。以前の卵巣組織培養プロトコルは比較的短い(1-6日7、32)または長い(10-15日5、6、10)培養期間を利用している。短い文化窓は、胎児ウシ卵巣皮質41における原始卵胞活性化を調査するために使用されてきた。非ヒト霊長類では、霊長類原始毛胞が生き残り、無血清培地18でインビトロで増殖を開始する能力を評価するために20日間培養期間が使用された。しかし、卵巣ウシ皮質を7日以上無血清培地で培養する際の組織分解の増加を観察した。我々はまた、ステロイド濃度が培養の4日後に減少することを毎日のサンプルの分析で決定しました(データは示されていません)。長い培養ウィンドウはまた、卵巣皮質培養における汚染の可能性を高めることができます。したがって、培養15日および培養時間の7日間で主要な効果を測定することができ、取り上げた動物モデルおよび科学的な質問に依存し得る。

この牛の卵巣皮質プロトコルのいくつかの利点が存在するが、いくつかの制限がある。1つの制限は、卵巣皮質培養中に収集された卵巣皮質組織および培養培地量の量である。卵巣皮質片の小さなサイズは、染色目的(H&E、免疫蛍光など)に使用する組織切片の限られた数を可能にする。RT-PCR を実行するには、最低 4 つの皮質部分が必要です16.さらに、収集される培養培地の量が少ない場合、分析の量が制限される場合がある。これらの制限に対処するために、我々は、組織学、アッセイ、およびPCRのための培養培地および組織の適切な供給を提供するために卵巣当たり複数の複製を培養することを提案する。非常に頻繁に我々は、さらなる分析のためにより多くの組織を得るために1つの牛/ハイファーから各卵巣のいくつかの部分を培養し、ホルモン/サイトカイン/ケモカインの皮質分泌を測定するために増加した培養培地を得る。前骨前葉包は、若い女性(ハイファー)よりも高齢の牛の卵巣でよりびまん性である。したがって、潜在的な制限は、培養されたすべての卵巣皮質片に対する前骨胞を得る。この制限を緩和するいくつかの方法は、より多くの卵巣皮質片を得て、各動物のための追加の井戸を培養すること、または中性赤色を使用して卵胞を視覚化し、すべての皮質片に初期の前根卵胞が含まれていることを保証することである。卵巣皮質培養の第3の制限は、培養系の汚染により、培地および皮質片が分析に使用できなくなることである。したがって、滅菌環境を維持するいくつかの方法は、培養に用いられる培地を濾過する。卵巣皮質片の処理および切断に先立ち、クリーンベンチが70%エタノールで殺菌され、排解前に空気の流れが少なくとも30分間動いされていることを確認してください。また、吸収パッドを使用してクリーンアップを容易にする場合(図1)、清潔なベンチに組織を入れる前に、30分間UV光を点灯して、パッドとクリーンベンチを殺菌してください。最後に、すべてのメディアの変更は、適切な気流、無菌器具、および無菌の先端のみが卵巣皮質培養のための井戸に配置される培地に導入されることを保証するためにピペットの先端を変更するバイオセーフティキャビネットで行われるべきです。

この技術の適用は、卵巣微小環境を理解するのに役立ち、濾胞の発達を伴う女性の生殖障害に関与するメカニズムを解明し始める可能性がある。例えば、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の病因と早期卵巣不全(POF)の側面は不明のままである。牛は単葉性であるため、他の単葉種(例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類)における卵胞の進行および逮捕に影響を与える因子を理解するための優れたモデルを作る。さらに、この卵巣皮質培養法は、女性の不妊症をもたらす卵胞媒介性障害を改善する可能性のある潜在的な治療薬を試験するのに有益であることを証明することもできる。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、米国国立食品農業研究所2013-67015-20965によって、ASCへのネブラスカ大学健康競争力のある助成金のための食品ASCに支援されました。米国農業ハッチ省は、ASC、ハッチ-NEB ANHL加盟#1002234 ASCにNEB26-202/W3112加盟#1011127を付与します。定量的ライフサイエンスイニシアチブ夏のポスドク学者のサポート - COVID-19 CMSのための夏の資金調達のための賞。

著者らは、この技術を検証する概念実証として現在の論文で使用された以前の出版物で卵巣を提供してくれたことに感謝するために、NE州クレイセンターの米国肉動物研究センターであるロバート・クッシュマン博士に感謝したいと考えています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scapel Blade Swann-Morton  303 Scaple Blade
#21 Scapel Blade Swann-Morton  307 Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter Corning 430514 Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay Biocrates Sterol17 Kit Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned 
Androstenedione Double Antibody RIA Kit MPBio 7109202 RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit  DIA Source  KIP0451 RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3 RayBiotech QAB-CYT-3-1 Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3 Olympus 7790 Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco ThermoFisher Scientific 5150056 Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium Gibco ThermoFisher Scientific 4130039 Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet 
Microscope  Olympus SZX16 Disection microscope used for imaging tissue culture pieces 
Microscope Camera  Olympus DP71 Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter Millipore Sigma PICM01250 Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate Falcon 353047 Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm Falcon 351007 Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) Corning 21-040-CV Used for tissue washing
SAS Version 9.3 SAS Institute  9.3 TS1M2 Statistical analysis software 
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer Thomas Scientific 6727C10 Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium Sigma-Aldrich W1625 Medium used for tissue cultures

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生物学 問題 167 ウシ卵巣皮質 ホルモン 卵胞 組織培養物 培養培地 ステロイド サイトカイン
ウシ卵巣皮質組織培養
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Sutton, C. M., Springman, S. A., Abedal-Majed, M. A., Cupp, A. S. Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture. J. Vis. Exp. (167), e61668, doi:10.3791/61668 (2021).

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