Summary
In vitro kultur av bovine ovarial cortex og effekten av ernæringsmessig Trappetrinn diett på ovarie mikromiljø presenteres. Ovariebarkstykker ble dyrket i syv dager, og steroider, cytokiner og follikkelstadier ble evaluert. Trappetrinnet diett behandling hadde økt steroidogenese resulterer i follikkel progresjon i kulturen.
Abstract
Follikkelutvikling fra primordial til antral stadium er en dynamisk prosess innen ovarial cortex, som inkluderer endokrine og parakriminelle faktorer fra somatiske celler og cumulus celle-oocytt kommunikasjon. Lite er kjent om ovariemikromiljøet og hvordan cytokiner og steroider produsert i det omkringliggende miljøet påvirker follikkelprogresjonen eller arrestasjonen. In vitro kultur av ovarial cortex gjør det mulig for follikler å utvikle seg i et normalisert miljø som forblir støttet av tilstøtende stroma. Vårt mål var å bestemme effekten av ernæringsmessig Trappetrinn diett på ovarie mikromiljøet (follikkel utvikling, steroid, og cytokin produksjon) gjennom in vitro kultur av bovine ovarial cortex. For å oppnå dette ble eggstokkkortikale stykker fjernet fra kvier som gjennomgår to forskjellige ernæringsmessig utviklede ordninger før puberteten: Kontroll (tradisjonell ernæringsutvikling) og Trappetrinn (fôring og begrensning under utvikling) som ble kuttet i ca. 0,5-1 mm3 stykker. Disse stykkene ble deretter passert gjennom en rekke vasker og plassert på en vevskulturinnsats som er satt inn i et godt inneholdende Waymouths kulturmedium. Ovariebark ble dyrket i 7 dager med daglige kulturmedieendringer. Histologisk seksjonering ble utført for å bestemme follikkelstadiumendringer før og etter kulturen for å bestemme effekter av ernæring og påvirkning av kultur uten ytterligere behandling. Cortex kultur medium ble samlet over dager for å måle steroider, steroid metabolitter, og cytokiner. Det var tendenser for økte steroidhormoner i ovariemikromiljøet som tillot follikkelprogresjon i Trappetrinnet versus Kontroll ovarian cortex kulturer. Ovariebarkkulturteknikken gir en bedre forståelse av eggstokkmikromiljøet, og hvordan endringer i endokrine sekresjon kan påvirke follikkelprogresjonen og veksten fra både in vivo- og in vitro-behandlinger. Denne kulturmetoden kan også være gunstig for å teste potensielle terapeutiske behandlinger som kan forbedre follikkelprogresjonen hos kvinner for å fremme fruktbarhet.
Introduction
Ovariebarken representerer det ytre laget av eggstokken der follikkelutviklingen skjer1. Primordial follikler, opprinnelig arrestert i utvikling, vil bli aktivert til å bli primære, sekundære, og deretter antral eller tertiære follikler basert på parakrine og gonadotropin innganger1,2,3,4. For bedre å forstå fysiologiske prosesser innen eggstokken, kan vevskultur brukes som en in vitro-modell, og dermed tillate et kontrollert miljø å utføre eksperimenter. Mange studier har brukt eggstokkvev kultur for forskning i assistert reproduktiv teknologi, fruktbarhet bevaring, og ovariekreft5,6,7. Ovarievevskultur har også fungert som en modell for å undersøke reproduktive giftstoffer som skader eggstokkhelsen og etiologien til reproduktive lidelser som Polycystic Ovary Syndrome (PCOS)8,9,10,11. Dermed gjelder dette kultursystemet for et bredt spekter av spesialiteter.
Hos gnagere har hele foster- eller perinatale gonader blitt brukt i reproduktive biologiforsøk12,13,14,15. Imidlertid kan gonader fra større husdyr ikke dyrkes som hele organer på grunn av deres store størrelse og potensielle degenerasjon. Derfor er bovin og ikke-menneskelig primat ovarial cortex kuttet i mindre stykker16,17,18. Mange studier har dyrket små ovariebarkstykker for å studere ulike vekstfaktorer i primordial follikkelinitiering i husdyr og ikke-menneskelige primater1,17,18,19. Bruken av ovarial cortex kultur har også vist primordial follikkel initiering i fravær av serum for storfe og primat kortikale stykker dyrket i 7 dager20. Yang og Fortune i 2006 behandlet foster ovariebark kultur medium med en rekke testosteron doser over 10 dager og observert at10-7 M konsentrasjonen av testosteron økt follikkel rekruttering, overlevelse, og økt progresjon av tidlig stadium follikler19. I 2007 rapporterte Yang og Fortune en rolle for Vaskulær endotel vekstfaktor A (VEGFA) i primær til sekundær follikkelovergang21. Videre har laboratoriet vårt brukt ovariebarkkulturer for å demonstrere hvordan VEGFA-isoformer (angiogene, antiangiogene og en kombinasjon) kan regulere forskjellige signaltransduksjonsveier gjennom Kinase-domenereseptoren (KDR), som er hovedsignaltransduksjonsreseptoren som VEGFA binder16. Denne informasjonen ga en bedre forståelse av hvordan ulike VEGFA-isoformer påvirker signalveier for å fremkalle follikkelprogresjon eller arrestasjon. Samlet sett kan culturing av ovariebarkstykker in vitro med forskjellige steroider eller vekstfaktorer være en verdifull analyse for å bestemme effekter på mekanismer som regulerer folliculogenesis. På samme måte kan dyr som er utviklet på forskjellige ernæringsregimer ha endret eggstokkmikromiljøet, noe som kan fremme eller hemme folliculogenesis som påvirker kvinnelig reproduktiv modenhet. Dermed er vårt mål i det nåværende manuskriptet å rapportere bovin cortex-kulturteknikken og avgjøre om det er forskjeller i eggstokkmikromiljøet etter in vitrokultur av bovin cortex fra kvier matet enten Kontroll eller Trappetrinn dietter samlet inn ved 13 måneders alder som beskrevet tidligere16.
Derfor var vårt neste trinn å bestemme eggstokkmikromiljøet i disse kvier som ble utviklet med forskjellige ernæringsmessige dietter. Vi evaluerte ovariebark fra kvier matet med enten et trappetrinn eller kontrolldiett. Kontroller kvier ble tilbudt en vedlikeholdsdiett på 97,9 g/kg0,75 i 84 dager. Trappetrinn dietten ble initiert på 8 måneder som inneholder et begrenset matet kosthold på 67,4 g / kg0,75 i 84 dager. Etter de første 84 dagene, mens kontroll kvier fortsatte å motta 97.9 g/kg0.75, trappetrinnet biff kvier ble tilbudt 118.9 g/kg0.75 for ytterligere 68 dager, hvoretter de ble ovariectomized på 13 måneder avalder 16 for å studere endringer i follikulære stadier og morphology før og etter kultur. Vi også analysert for forskjeller i steroider, steroid metabolitter, kjemokiner, og cytokiner utskilt i cortex media. Steroider og andre metabolitter ble målt for å avgjøre om det var noen direkte effekter fra behandlinger utført in vivo og / eller in vitro på vev levedyktighet og produktivitet. Endringer i eggstokkmikromiljøet før og etter kultur ga et øyeblikksbilde av det endokrine miljøet og folliculogenesis før kultur og hvordan kultur eller behandling under kultur påvirker follikkelprogresjon eller arrestasjon.
Eggstokkene ble samlet inn etter at ovariectomies ble utført ved U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) i henhold til deres IACUC-prosedyrer fra kontroll- og trappetrinns kvier ved 13 måneders alderav 16, rengjort med steril fosfatbuffersalin (PBS) vasker med 0,1% antibiotika for å fjerne blod og andre forurensninger, trimmet overflødig vev, og transportert til University of Nebraska-Lincoln (UNL) Reproduktiv fysiologi laboratorium UNL ved 37°C23 . Ved UNL ble eggstokk cortex stykker kuttet i små firkantede stykker (~ 0,5-1 mm3; Figur 1) og dyrket i 7 dager (figur 2). Histologi ble utført på cortex kultur lysbilder før og etter kultur for å bestemme follikler stadier16,24 (Figur 3 og Figur 4), og ekstracellulære matrise proteiner som kan indikere fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figur 5). Dette tillot bestemmelse av effekt av in vivo ernæringsregimer på follikkel stadier og tillot sammenligning av 7 dager med ovarial cortex på follikkel stadier og follikkel progresjon. Gjennom hele kulturen ble mediet samlet inn og endret daglig (ca. 70% av mediene ble samlet hver dag; 250 μL / brønn) slik at enten daglige hormoner / cytokiner / kjemokiner kan vurderes eller samles over dager for å oppnå gjennomsnittlige konsentrasjoner. Steroider som androstenedione (A4) og østrogen (E2) kan samles over 3 dager og vurderes gjennom radioimmunoassay (RIA; Figur 6) og samlet over 4 dager per dyr og analysert via høyytelses væskekromatografi-massespektrometri (HPLC-MS)24,25 ( tabell1). Cytokinkjeder ble brukt til å vurdere cytokin- og kjemokinkonsentrasjoner i ovarial cortexkultur middels26 (tabell 2). Sanntids polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) analyseplater ble utført for å bestemme genuttrykk for spesifikke signaltransduksjonsveier som vist tidligere16. Alle steroid, cytokin, follikkel stadium og histologiske markører gir et øyeblikksbilde av ovarie mikromiljøet og ledetråder om evnen til at mikromiljøet for å fremme "normal" eller "unormal" folliculogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eggstokkene ble hentet fra U. S. Meat Animal Research Center16. Som nevnt tidligere16, ble alle prosedyrer godkjent av U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee i samsvar med guiden for omsorg og bruk av landbruksdyr i landbruksforskning og undervisning. Eggstokkene ble brakt til University of Nebraska-Lincoln Reproduktive Laboratory hvor de ble behandlet og dyrket.
1. Utarbeidelse av nødvendige medier
-
Waymouth MB 752/1 medium
- Fyll en 1 L vevskulturflaske med 900 ml sterilt vann. Mens vannet forsiktig rører på en røreplate, tilsett gradvis pulverisert medium. Når det pulveriserte mediet er oppløst, tilsett 2,24 g natriumbikarbonat etterfulgt av 1,25 g bovint serumalbumin (BSA). Bruk en pH-måler og juster pH til 7,25-7,35. Tilsett ekstra sterilt vann for å bringe det endelige volumet til 1 L.
- Flytt til et biologisk sikkerhetsskap og tilsett penicillin-streptomycinsulfat i en konsentrasjon på 0,1% v / v av mediet. Filtrer mediet med et 0,22 μm pore 33,2 cm2 500 ml flaske toppfilter.
- Hell av det filtrerte mediet i flere koniske rør på 50 ml. Tilsett 0,5 ml insulin-transferrin-selen per 50 ml aliquoted medium.
- Pakk de koniske rørene og lagerflasken til mediet i aluminiumsfolie og lagre ved 4 °C. Dette mediet er lysfølsomt.
MERK: Waymouth medium kan lagres i opptil 1 måned.
-
Leibovitz' L-15 (LB-15) medium
MERK: LB-15 medium brukes til å rense vev som forberedelse til kultur.- Fyll en 1 L vevskulturflaske med 900 ml sterilt vann. Mens det sterile vannet forsiktig rører på en røreplate, tilsett gradvis det forberedte pulveriserte mediet. Bruk en pH-måler og juster pH til 7,25-7,35. Tilsett ekstra sterilt vann for å bringe det endelige volumet til 1 L.
- Flytt til biologisk sikkerhetsskap. Lag 1 L LB-15 med 0,1% antibiotika (se Materialtabell). Filtrer mediet i to 500 ml vevskulturflasker ved hjelp av et 0,22 μm pore 33,2 cm2 500 ml flaske toppfilter. Wrap flasker i aluminium folie som LB-15 medium er lysfølsom og lagre ved 4 °C.
MERK: LB-15 medium kan lagres i opptil 1 måned.
-
Fosfatbufret saltvann (PBS)
- Lag PBS i laboratoriet eller kjøp steril PBS uten kalsium eller magnesium (Materialbord). For å lage PBS i laboratoriet, begynn med 800 ml destillert vann og tilsett 8 g natriumklorid (NaCl) til det. Tilsett deretter 0,2 g kaliumklorid (KCl), 1,44 g natriumfosfatdibasic (Na2HPO4) og 0,24 g kaliumfosfatdibasisk (KH2PO4). Juster pH til ~7,4 og juster det totale volumet til 1 L. Steriliser oppløsningen ved autoklavering.
- Lag 1 L PBS med 0,1 % antibiotika (se Materialfortegnelser) mens du er i et biologisk sikkerhetsskap.
2. Ovarial kortikale kulturprotokoll
MERK: Eggstokkene ble hentet fra vårfødte USMARC-kvier ved 13 måneders alder. Eggstokkene ble skyllet grundig, og alt blod og annen væske ble fjernet med PBS som inneholder antibiotika (0,1%) og transportert ved 37 °C23 til University of Nebraska-Lincoln Reproduction Laboratory UNL (1,5 timer unna). (For kommentarer til temperaturen på eggstokkene under transport, vennligst se Diskusjon)
- Forbered eggstokkvevet på en ren benk (Figur 1).
- Desinfiser den rene benken med 70% etanol. Plasser en frisk absorberende pute på benken. Forsikre deg om at den rene benkeblåseren er slått på en halv time før disseksjon sammen med UV-lys for å sterilisere alt i den rene benken, inkludert absorberende pute og sørg for at riktig personlig verneutstyr brukes.
- Ordne Petri-rettene (60 x 15 mm) for vevsvask. Tre Petri-retter kreves for PBS-vask, tre for PBS med antibiotika og tre for LB-15 vasker. En ekstra LB-15-inneholdende Petri-tallerken med tilhørende lokk vil bli brukt til endelig plassering av stykker etter vask.
- Fyll hver Petri-tallerken med ca. 10 ml passende væsker, enten PBS eller LB-15.
Figur 1:Oppsett av platerfor vasking av eggstokk- og cortex-brikkene i den rene benken. (A) PBS som brukes til å vaske eggstokken når deler av cortexen fjernes. (B) PBS med antibiotikavasker som cortex stykker flyttes gjennom. (C) Ovariebarkstykker vaskes fire ganger i LB-15 før de flyttes til biosikkerhetsskapet for sluttvask i LB-15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Fjern det tilberedte Waymouth- og LB-15-mediet fra kjøleskapet og varm til romtemperatur.
- Autoklaver alle verktøy for å sikre sterilisering før bruk.
- Vedlikehold eggstokkene ved 37 °C til ovariebarken er klar til å samles.
- Bruk tang med serrated kjever, plukk opp eggstokken og vask grundig i den første PBS-fylte Petri-parabolen. Overfør eggstokken til den andre PBS-vasken og rengjør grundig igjen.
MERK: Eggstokken forblir i den andre PBS-vasken mens eggstokkkortikale strimler fjernes. - Bruk serrated kjeve tang, sikre eggstokken og skjær i halvparten. På dette tidspunktet vil eggstokk cortex kutte bort fra medulla. Bruk en linjal til å kontrollere at ikke mer enn 1–2 mm dybde på overflaten av eggstokken fjernes bort fra medulla16. Fjern tverrgående deler av ovariebarken fra medulla, kutt 3-4 tynne strimler av ovariebark (figur 2) med en skalpell (#11 skalpellblad; #3 håndtak), og legg strimlene i den tredje PBS-fylte Petri-parabolen.
MERK: På dette tidspunktet kan ytterligere ovarial kortikale vev samles inn for RNA-ekstraksjon eller festes og samles inn for histologi av innledende ikke-dyrkede cortex stykker. Når du fjerner strimler av ovarial cortex, unngå områder med synlige antral follikler eller corpora lutea. I tillegg, unngå å samle medullært vev. Histologien til medulla er svært forskjellig som vist tidligere16. Hvis eggstokk cortex ikke er kuttet til mer enn en 1-2 mm dybde, bør medulla ikke oppnås. Distinkt histologi gir mulighet for landemerker mellom cortex og medulla. - Klipp ovariebarkstrimlene i den tredje PBS-vasken i små, firkantede stykker (~ 0,5-1 mm3) med et #21 skalpellblad. Bruk en linjal under Petri-rettene for å sikre at brikkene er av lignende størrelse og tykkelse for å lage konsistente eggstokk cortex stykker. Bruk tang for å feste strimlene mens du kutter brikkene med en skalpell.
MERK: Antall kuttede vevsstykker avhenger av eksperimentet. Fire stykker eggstokkbark er den minste mengden vev som er nødvendig for kulturen. Andre metoder for å sikre riktig lengde og dybde inkluderer bruk av spesielle slicere26 eller precut plaststykker som maler27. - Vask eggstokkkortikale stykker gjennom alle tre PBS med antibiotikafylte Petri-retter. Bruk en buet spiss tang til å flytte stykker mellom vasker.
- Flytt cortex stykker gjennom serien av LB-15 vasker og plasser i siste LB-15-fylt Petri parabolen. Merk lokket med dyre-ID og eggstokkside (venstre eller høyre).
MERK: Senk ovarian cortex-brikkene helt ned i hver vask for grundig rengjøring. - Samle fire ovarie cortex stykker per eggstokk og fikse for dag null histologi. Ekstra deler kan også blinke frosset for RNA. De resterende vevstykkene vil bli brukt til kultur. Tørk av dissekeringsverktøy med 70% etanol etter hver vevssamling.
- Forbered et biologisk sikkerhetsskap for endelig vevsvask og kulturpreparat. Desinfiser forsyninger med 70% etanol før du plasserer i det biologiske sikkerhetsskapet. Bruk aseptisk teknikk når du arbeider i det biologiske sikkerhetsskapet.
- Flytt all ovariebark beregnet for kultur til det biologiske sikkerhetsskapet og vask igjen i en LB-15-fylt Petri-tallerken.
- I en 24-brønns vevskulturplate, pipette 350 μL Waymouth medium per brønn.
- Plasser ubestrøket kultur godt innlegg i hver brønn ved hjelp av tang. Pass på at det ikke dannes bobler under bunnen av innsatsen, da dette vil føre til at vevet tørker ut. Mediet må berøre innsatsene for at mediet skal kunne absorberes og omgi eggstokk cortex-brikkene.
- Plasser forsiktig fire eggstokk cortex stykker på nettet av hver innsats (Figur 2). Tangene kan punktere nettet hvis vevsstykkene ikke er delikat plassert. Vevsstykkene skal ikke berøre hverandre eller siden av innsatsen.
- Inkuber vevet ved 37 °C med 5% CO216.
MERK: Andre har brukt 38,8 °C28. Det er imidlertid ikke observert noen forskjell i vevets integritet eller i folliklenes evne til å utvikle seg i 37 °C vev og heller ikke ha andre39,30. Dermed bør noen av disse temperaturene på dette tidspunktet bidra til å eksperimentere suksess. Andre har brukt 400 μL medium. Begge mengdene er fine så lenge man er konsekvent, og vevet er delvis nedsenket, noe som gir tilstrekkelig overflatespenning for å muliggjøre hydrering av vev (medier rundt eggstokkbarkstykker). Fyll tomme brønner med 500 μL sterilt vann for å redusere fordampning fra andre brønner.
Figur 2: Ovariebarkstykker og kulturplate. (A) En eggstokkstrimmel som kuttes fra eggstokkens cortex. (B) Linjal og cortex stykke vist side om side. (C) Fire cortex stykker (~0,5-1 mm3) hviler på innsatsen i kulturmediet i platen. (D) Løft innsatsen for å samle kulturmediet fra brønnen. Samle og erstatt alle kulturmediet daglig (250 μL) for å opprettholde riktig pH.Ca. 250 μL oppnås fra hver brønn hver dag (ca. 70% av det første kulturmediet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Mediesamling
- Endre ovarian cortex kultur medium daglig i 7 dager. Middels endringer bør være så nær 24 timer fra hverandre som mulig for å forhindre store pH- og fargeendringer i medium. Varm Waymouth medium til 37 °C før middels endring. Omtrent 250 μL oppnås fra hver brønn hver dag (ca. 70% av det første kulturmediet).
- Under middels endringer, bruk tang for å løfte innsatsen forsiktig ut av brønnen. Samle det kultiverte Waymouth-mediet i 0,5 ml rør (ca. 250 μL /dag). Sett innsatsen godt tilbake og tilsett 350 μL friskt kulturmedium ved å dispensere mediet mellom siden av innsatsen og brønnen.
MERK: Endre de fleste medier daglig for å få nok medier til å måle alle steroider, cytokiner og kjemokiner som er nødvendige for å bestemme eggstokkmikromiljøet. Daglige middels endringer er også viktige for å forhindre store pH-endringer (indikert ved fargeendring) i mediet. Dråper av medium ble beholdt rundt eggstokk cortex stykker for å sikre at brikkene forblir våte. Ingen problemer ble observert med dyrket vev på grunn av endring av 70% av media. - Oppbevar det innsamlede mediet fra vevskultur ved -20 °C.
4. Bildebehandling og nedstrøms prosessering
- Etter 7 dager med kultur ved 37 °C med 5% CO2, bilde ovarian cortex stykker ved hjelp av en disseksjon mikroskop med et tilkoblet kamera og en dataavbildning program.
MERK: Et mørkt rom er vanligvis best for å oppnå den beste bildekvaliteten for avbildning. - Etter avbildning, fikse to ovarian cortex stykker per brønn i Bouins for histologi og flash fryse to ovarian cortex stykker i flytende nitrogen for å oppnå RNA for cDNA. Gjenta dette trinnet for alle brønnene med vev. Samle mediet fra dag 7 og lagre ved -20 °C.
- La ovarian cortex-brikkene forbli nedsenket i Bouins (picrinsyre 750 ml, glasial eddiksyre 50 ml og 37% -40% formalin 250 ml) i ca. 1,5 timer før de vaskes med 70% etanol tre ganger. Vevet forblir i 70% etanol og fjernes daglig til løsningen ikke lenger er gul.
MERK: Andre fixativer enn Bouins samt paraformaldehyd kan brukes. I denne erfaringen brukes Bouins, da det er fixativet for å oppnå optimal morfologi. Hvis mer vev er nødvendig for annen analyse, kan ytterligere brønner av medier og biter av eggstokkbark fås fra hvert dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne bovine cortex kulturprosedyren kan brukes til å bestemme et bredt utvalg av hormon-, cytokin- og histologidata fra små biter av eggstokken. Farging, som hematoksylin og eosin (H&E), kan brukes til å bestemme ovariemorfologi gjennom follikkeloppsamling16,23,31 ( figur3). Kort sagt ble follikler klassifisert som primordial, som er en oocytt omgitt av et enkelt lag av squamous pre-granulosa celler (0); overgangssekk eller tidlig primær, som er en oocytt omgitt av for det meste squamous pre-granulosa celler og noen cuboidal granulosa celler (1); primær follikkel, som er en oocytt omgitt av 1-1,5 lag med cuboidal granulosa celler (2); sekundær follikkel, som er en oocytt omgitt av to eller flere cuboidal granulosa celler (3); antral follikkel, som ikke er større enn 1 mm i diameter og omgitt av to eller flere lag granulosa celler som inneholder et tydelig antrum (4)16,23 ( Figur3). Follikkeloppsamling kan utføres på ovarial cortex fast før og etter kultur for å vurdere folliculogenesis (Figur 4). Vi tok tre bilder per lysbilde fra tre forskjellige lysbilder farget med H&E. Deretter ble folliklene iscenesatt og telt av tre personer og i gjennomsnitt for å bestemme antall follikler i hvert trinn16,23. Området i synsfeltet for et bilde (tre per lysbilde) med 400x forstørrelse er 0,4 mm2. Dermed ble 30% av arealet av ovariebarkstykkene talt for å bestemme follikkelstadier. Det første follikkelnummeret(før kultur) (Figur 4A) brukes til å normalisere folliklene som telles etter kultur (Figur 4B).
I tillegg kan forskjeller i morfologi som bestemt av kollagenavsetning (Picro Sirus Red-farging) indikere fibrose i ovarial cortex fra Trappetrinn eller Kontroll kvier (Figur 5). Daglig samling av kultur medium kan samles over 3 dager for å vurdere variert steroidhormon produksjon av RIA (ved hjelp av 200 μL medium prøve per dyr; Figur 6) eller steroid metabolitter ved hjelp av høy ytelse flytende kromatografi massespektrometri (HPLC-MS; 220 μL medium prøve samlet over 4 dager per dyr; Tabell 1) og cytokinproduksjon (tabell 2). Derfor kan flere replikeringer av ett dyr være nødvendig for å sikre nok cortex medium til å utføre alle de ønskede analysene.
Fordi Trappetrinns kvier har økt primordiale follikler i begynnelsen av kulturen, forventet vi at disse skulle utvikle seg i kulturen og få større antall sekundære follikler, som vi observerte i resultatene. Også, på grunn av økning i sekundære follikler, ville vi forvente større konsentrasjoner av steroider. Vi så tendensen til økning i androgener, glukokortikoidmetabolitter og progesteronmetabolitter, som ville støtte dette i det nåværende manuskriptet. Laboratoriet vårt har også evaluert effekter av forskjellige VEGFA-isoformer på follikkelprogresjon, steroidogenese og aktivering av forskjellige signaltransduksjonsmolekyler i KDR (også kjent som Vaskulær endotel vekstfaktorreseptor 2; VEGFR2) ved hjelp av signaltransduksjonsmatriseplater16. For å redusere dyrevariasjon bruker vi 4-6 dyr per behandling og til andre eksperimenter avhengig av kraftanalyse og variasjon har vi brukt så mange som 11.
Repeterbarhet av resultater fra bovin ovarial cortex kultur er mest påvirket av forurensning av ovarie cortex stykker. I tillegg kan negative eller subpar resultater oppstå hvis mediet ikke endres regelmessig i løpet av en 24-timers periode. Mediet når det opprinnelig ble lagt til er rosa i fargen, men når mediet samles inn, og fargen ser ut til å være oransje eller lysegul, kan dette indikere en endring i pH som kan være skadelig for vevet. Også vevsstykker som er kuttet for store, kan utvikle degenerasjon i midten som ikke ville bli observert før vevsseksjon for histologi. Denne degenerasjonen vil begrense bruken av vevet til analyse. Dataene som presenteres i denne artikkelen har blitt analysert ved hjelp av ikke-parametriske tester og en generell lineær modellanalyse i et statistisk program. Antall primordiale, primære, sekundære og antrale follikler per seksjon før og etter kultur ble analysert ved hjelp av en generalisert lineær blandet modell. P < 0,05 og det ble rapportert en tendens ved 0,14 ≤ P ≥ 0,05.
Figur 3: Hematoksylin og Eosinfarging for follikkeloppsamling av ovarial cortex. Ulike stadier av follikler er indikert med piler. (A) Primordial follikler (trinn 0); (B) Tidlige primære follikler (trinn 1); (C) Primære follikler (trinn 2); (D) Sekundær follikkel (trinn 3); (E) Antral follikkel (trinn 4). Arealet av synsfeltet for et bilde med 400x forstørrelse er 0,4 mm2. Vi teller 30% av området av ovariebarkstykkene for å bestemme follikkelstadiene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gjennomsnittlig antall follikler i ulike follikulære stadier i Kontroll (n=6) og Trappetrinn (n=6) kvier. (A) Før kultur Primordial P = 0,001, Tidlig Primær P = 0,12, Primær P = 0,31, Sekundær P = 0,22. (B) Etter 7 dager med kultur, Primordial P = 0,37, Tidlig Primær P = 0,84, Primær P = 0,69, Sekundær P = 0,02. Feilfelt er representative for SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kollagen (Picro Sirius Red; PSR) farging i ovarial cortex. PSR i (A) kontroll- og trappetrinn kvier fra dag 0 og dag 7. (B) Graf som sammenligner gjennomsnittsarealet av PSR-positiv farging per ovarial cortex-felt (piksler/μm2) mellom kontroll (n = 4) og trappetrinn (n = 4) kvier. Feilfelt er representative for SEM. Synsfeltet for et bilde med 400x forstørrelse er 0,4 mm2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Konsentrasjoner av A4 og E2. (A) Konsentrasjon av A4 og (B) konsentrasjon av E2 samlet over 3 dager med kultur i ovariebarkmedier av kontroll- og trappetrinns kvier målt ved RIA.s. n = 4 for hver gruppe. Feilfelt er representative for SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Hormoner | Kontroll | Trappetrinn | P-verdi | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/ml | Bety | SEM ± | Bety | SEM ± | ||
| DOC | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| VERTSHUS | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| KORT | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17OHP | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4 | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| EN | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| DHEAS | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| DHT | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-Deoxycorticosteron, INN - 11-Deoxycortisol, CORT – Corticosterone, 17OHP – 17-Hydroxyprogesteron, A4- Androstenedione, AN – Androsterone, DHEAS – dehydroepiandrosteronsulfat, E2 - Estradiol, P4 – Progesteron, T – Testosteron, DHT – Dihydroostosteron | ||||||
Tabell 1: Steroid og steroid metabolitter målt i ovariebarkkultur medium fra en brønn for hvert dyr samlet over 4 dager med kultur. Data presentert med gjennomsnittlig ± SEM. Blue indikerer P < 0,1 og har en tendens til å være annerledes.
| Cytokiner | Kontroll | Trappetrinn | P-verdi | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| side/ml | Bety | SEM ± | Bety | SEM ± | ||
| ANG1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| CD40L | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| LIKESTRØMN | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| INFβ | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| IL18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| LIF | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| RANTES | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| INFγ | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| IL13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| IL21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| IL1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – Angiopoietin 1, CD40L – CD40 Ligand, DCN – Dekorin, IFNβ – Interferon Beta 1, IL18 – Interleukin-18, LIF – Leukemi hemmende fabrikk, RANTES – Regulert på aktivering, Normal T-celle uttrykt og utskilt, IFNγ – Interferon Gamma, IL13 – Interleukin 13, IL21 – Interleukin 21, IL1F5 – Interleukin 1 familiemedlem 5, TNFα – Tumor nekrose | ||||||
Tabell 2: Cytokin og kjemokiner målt i ovariebarkkulturmedium fra en brønn for hvert dyr samlet over 4 dager med kultur. Data presentert med gjennomsnittlig ± SEM. Blue indikerer P < 0,1-0,14 og har en tendens til å være annerledes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelen med in vitro ovariebarkkultur, som beskrevet i dette manuskriptet, er at folliklene utvikler seg i et normalisert miljø med tilstøtende stroma rundt folliklene. De somatiske cellene og oocytten forblir intakte, og det er passende celle-til-celle-kommunikasjon som en in vivo-modell. Vårt laboratorium har funnet ut at et 7-dagers kultursystem gir representativ folliculogenesis og steroidogenese data for behandling av ovarial cortex. Andre ovarievevskulturprotokoller har enten relativt korte kulturperioder 1-6 dager7,32 eller lange kulturperioder på 10-15 dager5,6,10. Vi har imidlertid observert at dyrking i mer enn 7 dager fører til vevsforringelse, redusert steroidogenese og potensielt økt sannsynlighet for forurensning (data ikke vist). Culturing ovariarian cortex etter ovariectomy gir også direkte innsikt i ovarial mikromiljøet i det aktuelle dyret. Dette er av interesse for vårt forskningslaboratorium da vi har identifisert endringer i follikulær utvikling etter at ernæringsregimer ble pålagt etter avvenning og fører til pubertet i kvier16.
Follikkelutvikling fra primordial til antralstadium er en dynamisk prosess innen ovarial cortex, som inkluderer endokrine og parakriminelle faktorer fra somatiske celler og cumulus celle-oocyttkommunikasjon33. Vevskultur, som ovariebarkkultur, tilbyr et kontrollert miljø for å undersøke den mekanistiske rollen til disse faktorene og det endokrine miljøet i eggstokkmikromiljøet. Eggstokkene kan samles fra dyr som har gått gjennom en in vivo-behandling eller er genetisk endret for å bestemme effekter på follikkelprogresjon.
Eggstokkene kan også hentes fra en lokal abattoir (1 time unna) og transporteres ved 37 °C i en termos som inneholder PBS med antibiotika. Hvis transporten er lengre (f.eks. over natten), sendes eller transporteres eggstokkene på is22. Lignende resultater har blitt observert om transport av eggstokkene skjer på is over natten eller ved 37 °C med kortsiktig transport i en termos. 37 °C med termostransport gjør det mulig å høste oocytter fra dette vevet for in vitro modning (IVM) eller in vitro befruktning (IVF)34. Andre studier har funnet at transport av vev ved temperaturer mellom 2-8 °C også har blitt brukt til fertilitetsbevaring i reproduktivt vev35,36,37. Likevel har andre studier brukt eggstokkene transportert ved 34-37 °C og på is og har ikke observert forskjeller i storfevevskultur38.
Hvis ovariebarkkulturvev ikke ser sunt ut etter kultur, kan dette skyldes at biter av eggstokkbark er for store. Et kritisk trinn i protokollen er å sikre at eggstokk cortex-brikkene ikke er større enn 0,5-1 mm3. Vi bruker en linjal til å måle bitene og bruke en skala i dissekeringsmikroskopet for å bestemme størrelsen på eggstokk cortex-brikkene (Figur 2C). Andre benytter spesifikt utstyr (se Materialliste) for jevn tykkelse og lengde/bredde, henholdsvis26. Hvis disse utstyrsdelene ikke er tilgjengelige, kan plast firkanter brukes som mal for å oppnå jevn tykkelse og sikre lignende størrelse stykker27.
For å sikre kuttstykker som bare er fra cortex og ikke har medulla etter vasking av eggstokken, plasserer vi den i 60 mm parabolen og kuttes i halvparten. Cortex og medulla er svært forskjellige histologisk sett tidligere i Abedal-Majed, 202016. Hver halvdel av eggstokken er filetert med bladet for å sikre at bare cortex fjernes fra eggstokken og medulla forblir. Hvis enkeltpersoner bare begynner å perfeksjonere denne skjæreteknikken, kan de også bruke nøytral rød for å se histologien til hver halvdel av eggstokken39. Dette vil tillate utvikling av landemerker som deres skjæreteknikk, forbedres. Videre kan de bruke instrumenter som kan kutte ensartet tykkelse (se Materialliste) som angitt ovenfor26,27.
Ovariebark medium skal være lys rosa. Vi har observert at pH i ovariebarkkulturmediet endres raskt hos noen dyr, og dermed bør flertallet (70%) av eggstokk cortex-mediet endres hver 24. Tidligere aviser har diskutert å endre halvparten av mediet daglig40. Vår grunn til å endre et flertall av mediene i det nåværende manuskriptet var å fremme helsen til ovariebarkkulturene. Dråper rundt ovariebarkstykkene forblir, og det var ingen negative effekter av middels endring på kulturen. Videre tillot dette oss å analysere flere hormoner, cytokiner og kjemokiner for hvert dyr for å generere innsikt i eggstokkmikromiljøet.
Denne vevskulturprotokollen gir flere fordeler. Culturing ovariebark gjør at follikler kan utvikle seg i et miljø som ligner på in vivo. Follikler forblir støttet av den omkringliggende stroma og kommunikasjon mellom somatiske celler og cumulus celle-oocyte fortsetter. Bruken av kulturbrønninnlegg gjør det mulig for ovarial cortex å hvile på kulturmediet uten å bli nedsenket, og dermed forhindre vevet i å binde seg til brønnplatens plastbase. En annen fordel er kulturvinduet. Det 7-dagers kulturvinduet som er beskrevet i protokollen gir representative hormon- og vekstfaktordata. I tillegg fortsetter folliculogenesis å utvikle seg i dette in vitro-miljøet, da vi har talt færre tidlig-iscenesatte follikler (primordial) og mer sene iscenesatte follikler (sekundær, antral) etter 7 dager med kultur16. Tidligere ovarievevskulturprotokoller har brukt relativt korte (1-6 dager7,32) eller lange (10-15 dager5,6,10) kulturperioder. Kortere kulturvinduer har blitt brukt til å undersøke primordial follikkelaktivering i fosterbovint ovarial cortex41. I ikke-menneskelige primater ble en 20-dagers kulturperiode brukt til å evaluere primatprimordial folliklers evne til å overleve og initiere vekst in vitro i serumfritt medium18. Vi har imidlertid observert økt vevsforringelse når vi dyrker ovarial bovint cortex i mer enn 7 dager i serumfritt medium. Vi har også bestemt i analyse av daglige prøver at steroidkonsentrasjoner reduseres etter 4 dager med kultur (data ikke vist). Et lengre kulturvindu kan også øke muligheten for forurensning i ovariebarkkulturer. Derfor kan store effekter måles med 7 dager kultur15 og kulturtid kan være avhengig av dyremodellen og det vitenskapelige spørsmålet som tas opp.
Mens flere fordeler med denne bovine ovarie cortex-protokollen eksisterer, er det noen begrensninger. En begrensning er mengden eggstokk kortikale vev og kultur middels volum samlet under ovarial kortikal kultur. Den lille størrelsen på ovariebarkstykkene gjør det mulig å bruke et begrenset antall vevsseksjoner til fargingsformål (H&E, immunfluorescens, etc.). For å utføre RT-PCR er det nødvendig med minst fire cortex-stykker16. Videre kan det lave volumet av kulturmedium som samles inn begrense mengden analyser som gjennomføres. For å bekjempe disse begrensningene foreslår vi å dyrke flere repliker per eggstokk for å gi en tilstrekkelig tilførsel av kulturmedium og vev for histologi, analyser og PCR. Ofte dyrker vi flere stykker av hver eggstokk fra en ku / kvier for å få mer vev for videre analyse og for å oppnå økt kulturmedium for å måle cortex sekresjon av hormoner / cytokiner / kjemokiner. Preantrale follikler er mer diffuse hos eldre ku eggstokkene enn yngre kvinner (kvier). Dermed er en potensiell begrensning å skaffe preantrale follikler på alle eggstokk cortex stykker som er dyrket. Flere måter å redusere denne begrensningen på er å skaffe flere ovarial cortex stykker og å kultur ekstra brønner for hvert dyr eller å bruke nøytral rød for å visualisere follikler og sikre at alle cortex stykker inneholder tidlige preantral follikler. En tredje begrensning av ovariebarkkulturen er at enhver forurensning av kultursystemet gjør media og cortex stykker ubrukelige for analyse. Dermed er flere måter å opprettholde et sterilt miljø på å filtrere mediet som brukes i kulturen. Før du behandler og kutter eggstokk cortex stykker sørg for at den rene benken har blitt sterilisert med 70% etanol, og luftstrømmen har gått i minst 30 minutter før disseksjoner. Hvis du bruker en absorberende pute for å muliggjøre enklere opprydding (figur 1), må du også kontrollere at UV-lyset er slått på i 30 minutter før du plasserer vev i den rene benken for å sterilisere puten og den rene benken. Til slutt bør alle medieendringer utføres i et biosikkerhetsskap med tilstrekkelig luftstrøm, sterile instrumenter og skiftende pipetspisser for å sikre at bare sterile spisser blir introdusert i mediet som skal plasseres i brønner for ovarial cortexkultur.
Anvendelse av denne teknikken vil bidra til å forstå eggstokkmikromiljøet og kan begynne å avdekke mekanismer involvert i kvinnelige reproduktive lidelser som involverer endret follikulær utvikling. For eksempel forblir etiologien til polycystisk eggstokksyndrom (PCOS) og aspekter av for tidlig eggstokksvikt (POF) uklart. Siden kyr er mono-ovulatoriske, gjør de en utmerket modell for å forstå faktorer som påvirker follikkelprogresjon og arrestasjon i andre mono-ovulatoriske arter (f.eks. mennesker og ikke-menneskelige primater). Videre kan denne ovariebarkkulturmetoden også være gunstig for å teste potensielle terapeutiske stoffer som kan forbedre follikkelmedierede lidelser som resulterer i ufruktbarhet hos kvinner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 til ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants til ASC. UsAs landbruksdepartement Hatch grant NEB26-202/W3112 Tiltredelse #1011127 til ASC, Hatch-NEB ANHL Tiltredelse #1002234 til ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – COVID-19 Award for sommerfinansiering for CMS.
Forfatterne ønsker å utvide sin takknemlighet til Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE for å takke ham for å ha gitt eggstokkene i en tidligere publikasjon, som deretter ble brukt i den nåværende artikkelen som et konseptbevis for å validere denne teknikken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
References
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
- Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
- McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
- Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
- Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
- Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
- Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
- Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
- Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
- Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
- Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
- Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
- Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
- Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
- Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
- Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
- Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
- Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
- Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
- Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
- Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
- Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
- Mohammed, B. T., Donadeu, F. X.
- Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).
