Summary
La culture in vitro du cortex ovarien bovin et l’effet du régime nutritionnel Stair-step sur le microenvironnement ovarien sont présentés. Des morceaux de cortex ovarien ont été cultivés pendant sept jours et les stéroïdes, les cytokines et les stades folliculaires ont été évalués. Le traitement diététique Stair-Step avait une augmentation de la stéroïdogenèse entraînant une progression des follicules en culture.
Abstract
Le développement du follicule du stade primordial au stade antral est un processus dynamique dans le cortex ovarien, qui comprend des facteurs endocriniens et paracrines des cellules somatiques et de la communication cellule-ovocyte cumulus. On sait peu de choses sur le microenvironnement ovarien et sur la façon dont les cytokines et les stéroïdes produits dans le milieu environnant affectent la progression ou l’arrêt des follicules. La culture in vitro du cortex ovarien permet aux follicules de se développer dans un environnement normalisé qui reste soutenu par le stroma adjacent. Notre objectif était de déterminer l’effet du régime nutritionnel Stair-Step sur le microenvironnement ovarien (développement de follicules, production de stéroïdes et de cytokines) par culture in vitro du cortex ovarien bovin. Pour ce faire, des morceaux corticaux ovariens ont été retirés des génisses subissant deux schémas nutritionnels différents développés avant la puberté: Control (développement nutritionnel traditionnel) et Stair-Step (alimentation et restriction pendant le développement) qui ont été coupés en environ 0,5-1 mm3 morceaux. Ces morceaux ont ensuite été passés à travers une série de lavages et positionnés sur un insert de culture tissulaire qui est placé dans un puits contenant le milieu de culture de Waymouth. Le cortex ovarien a été cultivé pendant 7 jours avec des changements quotidiens des milieux de culture. Une section histologique a été effectuée pour déterminer les changements de stade folliculaire avant et après la culture afin de déterminer les effets de la nutrition et l’impact de la culture sans traitement supplémentaire. Le milieu de culture du cortex a été mis en commun au fil des jours pour mesurer les stéroïdes, les métabolites stéroïdiens et les cytokines. Il y avait des tendances à l’augmentation des hormones stéroïdes dans le microenvironnement ovarien qui ont permis la progression du follicule dans les cultures Stair-Step versus Control ovarian cortex. La technique de culture du cortex ovarien permet de mieux comprendre le microenvironnement ovarien et comment les altérations de la sécrétion endocrinienne peuvent affecter la progression et la croissance des follicules à partir de traitements in vivo et in vitro. Cette méthode de culture peut également s’avérer bénéfique pour tester des thérapies potentielles susceptibles d’améliorer la progression des follicules chez les femmes afin de favoriser la fertilité.
Introduction
Le cortex ovarien représente la couche externe de l’ovaire où se produit le développement du follicule1. Les follicules primordiaux, initialement arrêtés en développement, seront activés pour devenir des follicules primaires, secondaires, puis antraux ou tertiaires à partir des apports de paracrine et de gonadotrophine1,2,3,4. Pour mieux comprendre les processus physiologiques au sein de l’ovaire, la culture tissulaire peut être utilisée comme modèle in vitro, permettant ainsi à un environnement contrôlé de mener des expériences. De nombreuses études ont utilisé la culture de tissu ovarien pour la recherche sur la technologie de procréation assistée, la préservation de la fertilité et le cancer de l’ovaire5,6,7. La culture de tissu ovarien a également servi de modèle pour étudier les toxines reproductrices qui nuisent à la santé ovarienne et à l’étiologie des troubles de la reproduction tels que le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK)8,9,10,11. Ainsi, ce système de culture est applicable à un large éventail de spécialités.
Chez les rongeurs, des gonades fœtales ou périnatales entières ont été utilisées dans des expériences de biologie de la reproduction12,13,14,15. Cependant, les gonades provenant d’un gros bétail domestique ne peuvent pas être cultivées en tant qu’organes entiers en raison de leur grande taille et de leur dégénérescence potentielle. Par conséquent, le cortex ovarien des primates bovins et non humains est coupé en plus petits morceaux16,17,18. De nombreuses études ont cultivé de petits morceaux de cortex ovarien pour étudier divers facteurs de croissance dans l’initiation du follicule primordial chez le bétail domestique et les primates non humains1,17,18,19. L’utilisation de la culture du cortex ovarien a également démontré l’initiation du follicule primordial en l’absence de sérum pour les morceaux corticaux bovins et primates cultivés pendant 7 jours20. Yang et Fortune en 2006 ont traité le milieu de culture du cortex ovarien fœtal avec une gamme de doses de testostérone sur 10 jours et ont observé que la concentration de 10à 7 M de testostérone augmentait le recrutement des follicules, la survie et augmentait la progression des follicules à un stade précoce19. En 2007, en utilisant des cultures de cortex ovarien de fœtus bovins (5-8 mois de gestation), Yang et Fortune ont rapporté un rôle pour le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGFA) dans la transition du follicule primaire au secondaire21. En outre, notre laboratoire a utilisé des cultures de cortex ovarien pour démontrer comment les isoformes VEGFA (angiogéniques, antiangiogéniques et une combinaison) peuvent réguler différentes voies de transduction du signal à travers le récepteur du domaine kinase (KDR), qui est le principal récepteur de transduction du signal que VEGFA lie16. Cette information a permis de mieux comprendre comment différentes isoformes de VEGFA affectent les voies de signalisation pour provoquer la progression ou l’arrêt des follicules. Pris ensemble, la culture de morceaux de cortex ovarien in vitro avec différents stéroïdes ou facteurs de croissance peut être un test précieux pour déterminer les effets sur les mécanismes régulant la folliculogenèse. De même, les animaux qui sont développés sur différents régimes nutritionnels peuvent avoir modifié les microenvironnements ovariens, ce qui peut favoriser ou inhiber la folliculogenèse affectant la maturité reproductive féminine. Ainsi, notre objectif dans le présent manuscrit est de rapporter la technique de culture du cortex bovin et de déterminer s’il existe des différences dans les microenvironnements ovariens après la culture in vitro du cortex bovin à partir de génisses nourries avec des régimes Control ou Stair-Step collectés à l’âge de 13 mois comme décrit précédemment16.
Par conséquent, notre prochaine étape a été de déterminer le microenvironnement ovarien chez ces génisses qui ont été développées avec différents régimes nutritionnels. Nous avons évalué le cortex ovarien de génisses nourries avec un régime Stair-Step ou Control. Les génisses témoins se sont vu offrir un régime d’entretien de 97,9 g/kg0,75 pendant 84 jours. Le régime Stair-Step a été initié à 8 mois contenant un régime alimentaire restreint de 67,4 g / kg0,75 pendant 84 jours. Après les 84 premiers jours, alors que les génisses témoins continuaient de recevoir 97,9 g/kg0,75, les génisses de bœuf Stair-Step se sont vu offrir 118,9 g/kg0,75 pendant 68 autres jours, après quoi elles ont été ovariectomisées à l’âge de 13 mois16 ans pour étudier les changements dans les stades folliculaires et la morphologie avant et après la culture. Nous avons également testé les différences dans les stéroïdes, les métabolites stéroïdiens, les chimiokines et les cytokines sécrétées dans le cortex. Les stéroïdes et autres métabolites ont été mesurés pour déterminer s’il y avait des effets directs des traitements menés in vivo et / ou in vitro sur la viabilité et la productivité des tissus. Les changements dans le microenvironnement ovarien avant et après la culture ont fourni un aperçu du milieu endocrinien et de la folliculogenèse avant la culture et de la façon dont la culture ou le traitement pendant la culture affecte la progression ou l’arrêt du follicule.
Les ovaires ont été prélevés après que des ovariectomies ont été effectuées au U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) selon leurs procédures IACUC auprès de génisses Control et Stair-Step à l’âge de13 mois 16ans, nettoyées avec des lavages de solution saline tampon phosphate stérile (PBS) avec 0,1% d’antibiotique pour éliminer le sang et d’autres contaminants, coupé l’excès de tissu et transporté au laboratoire de physiologie de la reproduction DE l’Université du Nebraska-Lincoln (UNL) UNL à 37 ° C23 . À l’UNL, les morceaux de cortex ovarien ont été coupés en petits morceaux carrés (~0,5-1 mm3; Figure 1) et cultivé pendant 7 jours (Figure 2). L’histologie a été réalisée sur les lames de culture du cortex avant et après la culture afin de déterminer les stades16et24 des follicules(figure 3 et figure 4)et les protéines de la matrice extracellulaire pouvant indiquer une fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figure 5). Cela a permis de déterminer l’effet des régimes nutritionnels in vivo sur les stades folliculaires et de comparer 7 jours de cortex ovarien sur les stades folliculaires et la progression des follicules. Tout au long de la culture, le milieu a été recueilli et modifié quotidiennement (environ 70 % des milieux ont été recueillis chaque jour; 250 μL/puits) afin que les hormones/cytokines/chimiokines quotidiennes puissent être évaluées ou regroupées sur des jours pour obtenir des concentrations moyennes. Les stéroïdes tels que l’androstènedione (A4) et l’œstrogène (E2) peuvent être regroupés sur 3 jours et évalués par dosage radioimmunologique (RIA; Graphique 6) et regroupés sur 4 jours par animal et analysés par chromatographie liquide à haute performance-spectrométrie de masse (HPLC-MS)24,25 ( tableau1). Des réseaux de cytokines ont été utilisés pour évaluer les concentrations de cytokines et de chimiokines dans le milieu de culture du cortex ovarien26 (tableau 2). Des plaques de dosage de la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) ont été menées pour déterminer l’expression des gènes pour des voies de transduction de signal spécifiques, comme démontré précédemment16. Tous les marqueurs stéroïdes, cytokines, follicules et histologiques fournissent un instantané du microenvironnement ovarien et des indices quant à la capacité de ce microenvironnement à favoriser la folliculogenèse « normale » ou « anormale ».
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Protocol
Les ovaires ont été obtenus du U. S. Meat Animal Research Center16. Comme indiqué précédemment16, toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux du U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) conformément au guide pour les soins et l’utilisation des animaux d’élevage dans la recherche et l’enseignement agricoles. Les ovaires ont été amenés au laboratoire de reproduction de l’Université du Nebraska-Lincoln où ils ont été traités et cultivés.
1. Préparation des supports requis
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Waymouth MB 752/1 moyen
- Remplissez une bouteille de culture tissulaire de 1 L avec 900 mL d’eau stérile. Pendant que l’eau agite doucement sur une plaque à remuer, ajoutez progressivement le milieu en poudre. Une fois le milieu en poudre dissous, ajouter 2,24 g de bicarbonate de sodium suivi de 1,25 g d’albumine sérique bovine (BSA). Utilisez un pH-mètre et ajustez le pH à 7,25-7,35. Ajouter de l’eau stérile supplémentaire pour porter le volume final à 1 L.
- Passer à une armoire de sécurité biologique et ajouter le sulfate de pénicilline-streptomycine à une concentration de 0,1 % v/v du milieu. Filtrer le milieu avec un pore de 0,22 μm 33,2 cm2 500 mL filtre de dessus de bouteille.
- Verser le milieu filtré dans plusieurs tubes coniques de 50 mL. Ajouter 0,5 mL d’insuline-transferrine-sélénium par 50 mL de milieu aliquote.
- Envelopper les tubes coniques et la bouteille de stock du milieu dans du papier d’aluminium et conserver à 4 °C. Ce médium est sensible à la lumière.
REMARQUE: Le milieu Waymouth peut être conservé jusqu’à 1 mois.
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Milieu L-15 (LB-15) de Leibovitz
REMARQUE: Le milieu LB-15 est utilisé pour nettoyer les tissus en vue de la culture.- Remplissez une bouteille de culture tissulaire de 1 L avec 900 mL d’eau stérile. Pendant que l’eau stérile agite doucement sur une plaque à remuer, ajoutez progressivement le milieu en poudre préparé. Utilisez un pH-mètre et ajustez le pH à 7,25-7,35. Ajouter de l’eau stérile supplémentaire pour porter le volume final à 1 L.
- Passez à l’armoire de sécurité biologique. Faire 1 L de LB-15 avec 0,1% d’antibiotique (voir tableau des matériaux). Filtrer le milieu dans deux flacons de culture tissulaire de 500 mL à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm de 33,2 cm et de2 500 mL. Enveloppez les bouteilles dans du papier d’aluminium car le support LB-15 est sensible à la lumière et conservez à 4 ° C.
REMARQUE: Le support LB-15 peut être conservé jusqu’à 1 mois.
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Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
- Fabriquez du PBS en laboratoire ou achetez du PBS stérile sans calcium ni magnésium (Table des matériaux). Pour fabriquer du PBS en laboratoire, commencez avec 800 mL d’eau distillée et ajoutez-y 8 g de chlorure de sodium (NaCl). Ensuite, ajoutez 0,2 g de chlorure de potassium (KCl), 1,44 g de phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4),et 0,24 g de phosphate de potassium dibasique (KH2PO4). Réglez le pH à ~7,4 et réglez le volume total à 1 L. Stérilisez la solution par autoclavage.
- Fabriquer 1 L de PBS avec 0,1 % d’antibiotique (voir tableau des matériaux)dans une armoire de sécurité biologique.
2. Protocole de culture corticale ovarienne
REMARQUE: Les ovaires ont été obtenus à partir de génisses USMARC nées au printemps à l’âge de 13 mois. Les ovaires ont été rincés abondamment, et tout le sang et les autres liquides ont été retirés avec du PBS contenant un antibiotique (0,1%) et transportés à 37 °C23 au laboratoire de reproduction DE l’Université du Nebraska-Lincoln UNL (1,5 h de distance). (Pour les commentaires sur la température des ovaires pendant le transport, veuillez consulter discussion)
- Préparer le tissu ovarien sur un banc propre (Figure 1).
- Désinfectez le banc propre avec 70% d’éthanol. Placez un tampon absorbant frais sur la paillasse. Assurez-vous que le ventilateur de banc propre est allumé une demi-heure avant la dissection avec la lumière UV pour stériliser tout ce qui se trouve dans le banc propre, y compris le tampon absorbant et assurez-vous que l’EPI approprié est utilisé.
- Disposer les boîtes de Petri (60 x 15 mm) pour les lavages de tissus. Trois boîtes de Petri sont nécessaires pour le lavage PBS, trois pour le PBS avec antibiotique et trois pour les lavages LB-15. Une boîte de Petri supplémentaire contenant du LB-15 avec couvercle d’accompagnement sera utilisée pour le placement final des pièces après le lavage.
- Remplissez chaque boîte de Pétri avec environ 10 mL de fluides appropriés, SOIT PBS ou LB-15.
Figure 1:Dispositiondes plaques pour laver les morceaux de l’ovaire et du cortex dans le banc propre. (A) PBS utilisé pour laver l’ovaire lorsque des sections du cortex sont enlevées. (B) PBS avec des lavages antibiotiques que les morceaux de cortex sont déplacés. (C) Les morceaux de cortex ovarien sont lavés quatre fois dans LB-15 avant de passer à l’armoire de biosécurité pour un lavage final dans LB-15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Retirer le waymouth préparé et le milieu LB-15 du réfrigérateur et réchauffer à la température ambiante.
- Autoclavez tous les outils pour assurer la stérilisation avant utilisation.
- Maintenir les ovaires à 37 °C jusqu’à ce que le cortex ovarien soit prêt à être collecté.
- À l’aide de pinces à mâchoires dentelées, ramassez l’ovaire et lavez-vous soigneusement dans la première boîte de Petri remplie de PBS. Transférer l’ovaire au deuxième lavage PBS et nettoyer à fond une fois de plus.
REMARQUE: L’ovaire restera dans le deuxième lavage PBS pendant que les bandelettes corticales ovariennes sont enlevées. - À l’aide de pinces à mâchoires dentelées, fixez l’ovaire et coupez-le en deux. À ce stade, le cortex ovarien va couper de la moelle. À l’aide d’une règle, assurez-vous que pas plus de 1 à 2 mm de profondeur de surface de l’ovaire est retiré de la moelle16. Retirez les sections transversales du cortex ovarien de la moelle épinière, coupez 3 à 4 fines bandes de cortex ovarien(Figure 2)avec un scalpel (lame de scalpel n ° 11; poignée n ° 3) et placez les bandes dans la troisième boîte de Petri remplie de PBS.
REMARQUE: À l’heure actuelle, du tissu cortical ovarien supplémentaire peut être collecté pour l’extraction de l’ARN ou fixé et collecté pour l’histologie des morceaux initiaux de cortex non cultivés. Lorsque vous enlevez des bandelettes du cortex ovarien, évitez les zones avec des follicules antraux visibles ou des corps jaunes. De plus, évitez de prélever du tissu médullaire. L’histologie de la médullaire est très différente comme indiqué précédemment16. Si le cortex ovarien n’est pas coupé à plus de 1–2 mm de profondeur, la moelle ne doit pas être obtenue. Une histologie distincte permet d’établir des points de repère entre le cortex et la moelle épinière. - Coupez les bandes du cortex ovarien dans le troisième lavage PBS en petits morceaux carrés (~ 0,5–1 mm3)avec une lame de scalpel #21. Utilisez une règle sous les boîtes de Petri pour vous assurer que les pièces sont de taille et d’épaisseur similaires afin de créer des pièces de cortex ovarien cohérentes. Utilisez des pinces pour fixer les bandes tout en coupant les morceaux avec un scalpel.
REMARQUE: Le nombre de morceaux de tissu coupés dépend de l’expérience. Quatre morceaux de cortex ovarien est la quantité minimale de tissu nécessaire à la culture. D’autres méthodes pour assurer une longueur et une profondeur appropriées comprennent l’utilisation de trancheuses spéciales26 ou de pièces en plastique prédécoupées commegabarits 27. - Lavez les morceaux corticaux ovariens à travers les trois PBS avec des boîtes de Petri remplies d’antibiotiques. Utilisez une pince à pointe incurvée pour déplacer les pièces entre les lavages.
- Déplacez les morceaux de cortex à travers la série de lavages LB-15 et placez-les dans la boîte de Petri finale remplie de LB-15. Étiquetez le couvercle avec l’identification de l’animal et le côté de l’ovaire (gauche ou droite).
REMARQUE: Immergez complètement les morceaux de cortex ovarien dans chaque lavage pour un nettoyage en profondeur. - Collectez quatre morceaux de cortex ovarien par ovaire et fixez-les pour l’histologie du jour zéro. Des pièces supplémentaires peuvent également être congelées pour l’ARN. Les morceaux de tissu restants seront utilisés pour la culture. Essuyez les outils de dissection avec 70% d’éthanol après chaque prélèvement de tissus.
- Préparez une armoire de sécurité biologique pour le lavage final des tissus et la préparation de la culture. Désinfectez les fournitures avec de l’éthanol à 70 % avant de les placer dans l’armoire de sécurité biologique. Utilisez la technique aseptique lorsque vous travaillez dans l’armoire de sécurité biologique.
- Déplacez tout le cortex ovarien destiné à la culture dans l’armoire de sécurité biologique et lavez-le une fois de plus dans une boîte de Petri remplie de LB-15.
- Dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits, pipette 350 μL de milieu Waymouth par puits.
- Placez des inserts de puits de culture non revêtus dans chaque puits à l’aide de pinces. Assurez-vous qu’aucune bulle ne se forme sous la base de l’insert, car cela entraînerait le dessèchement du tissu. Le milieu doit toucher les inserts pour permettre au milieu d’être absorbé et d’entourer les morceaux du cortex ovarien.
- Positionnez soigneusement quatre morceaux de cortex ovarien sur le maillage de chaque insert (Figure 2). Les pinces peuvent percer le maillage si les morceaux de tissu ne sont pas délicatement placés. Les morceaux de tissu ne doivent pas se toucher ou se toucher sur le côté de l’insert.
- Incuber le tissu à 37°Cavec 5% de CO216.
NOTE: D’autres ont utilisé 38,8 °C28. Cependant, aucune différence n’a été observée dans l’intégrité du tissu ni dans la capacité des follicules à progresser dans les tissus à 37°Cni dans les autres39,30. Ainsi, à ce stade, l’une de ces températures devrait être propice au succès de l’expérience. D’autres ont utilisé 400 μL de milieu. L’une ou l’autre quantité est bonne tant que l’une est constante et que le tissu est partiellement submergé, ce qui permet une tension superficielle adéquate pour permettre l’hydratation des tissus (milieux entourant les morceaux du cortex ovarien). Remplissez les puits vides avec 500 μL d’eau stérile pour aider à réduire l’évaporation des autres puits.
Figure 2: Morceaux de cortex ovarien et plaque de culture. (A) Une bande ovarienne coupée du cortex de l’ovaire. (B) Règle et pièce de cortex montrées côte à côte. (C) Quatre morceaux de cortex (~0,5-1 mm3) reposant sur l’insert dans le milieu de culture dans la plaque. (D) Soulever l’insert pour recueillir le milieu de culture du puits. Recueillir et remplacer tout le milieu de culture quotidiennement (250 μL) pour maintenir un pH correct.Environ 250 μL sont obtenus de chaque puits chaque jour (environ 70% du milieu de culture initial). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Collection de médias
- Changer le milieu de culture du cortex ovarien quotidiennement pendant 7 jours. Les changements moyens doivent être aussi proches que possible de 24 heures d’intervalle pour éviter les grands changements de pH et de couleur dans le milieu. Chaud Waymouth moyen à 37 °C avant le changement moyen. Environ 250 μL sont obtenus de chaque puits chaque jour (environ 70 % du milieu de culture initial).
- Lors de changements moyens, utilisez des pinces pour soulever doucement l’insert hors du puits. Recueillir le milieu waymouth cultivé dans des tubes de 0,5 mL (environ 250 μL /jour). Replacez bien l’insert et ajoutez 350 μL de milieu de culture frais en distribuant le milieu entre le côté de l’insert et le puits.
REMARQUE: Changez la plupart des médias quotidiennement pour obtenir suffisamment de médias pour mesurer tous les stéroïdes, cytokines et chimiokines nécessaires pour déterminer le microenvironnement ovarien. En outre, les changements quotidiens de milieu sont importants pour éviter de grands changements de pH (indiqués par un changement de couleur) dans le milieu. Des gouttes de milieu ont été retenues autour des morceaux du cortex ovarien pour s’assurer que les morceaux restaient humides. Aucun problème n’a été observé avec les tissus cultivés en raison de la modification de 70% des milieux. - Conserver le milieu prélevé à partir de la culture tissulaire à -20 °C.
4. Imagerie et traitement en aval
- Après 7 jours de culture à 37°Cavec 5% deCO2,imagez les morceaux du cortex ovarien à l’aide d’un microscope à dissection avec une caméra attachée et un logiciel d’imagerie informatique.
REMARQUE: Une pièce sombre est généralement la meilleure pour obtenir la meilleure qualité d’image pour l’imagerie. - Après l’imagerie, fixez deux morceaux de cortex ovarien par puits dans Bouins pour l’histologie et gèlez rapidement deux morceaux de cortex ovarien dans de l’azote liquide pour obtenir de l’ARN pour l’ADNc. Répétez cette étape pour tous les puits avec du tissu. Collecter le milieu à partir du jour 7 et conserver à -20 °C.
- Laissez les morceaux de cortex ovarien rester immergés dans Bouins (acide picrique 750 mL, acide acétique glacial 50 mL et 37% à 40% de formol 250 mL) pendant environ 1,5 h avant d’être lavés trois fois avec de l’éthanol à 70%. Le tissu restera dans de l’éthanol à 70% et sera nettoyé quotidiennement jusqu’à ce que la solution ne soit plus jaune.
REMARQUE: Des fixateurs autres que bouins ainsi que du paraformaldéhyde peuvent être utilisés. Dans cette expérience, Bouins est utilisé car c’est le fixateur pour obtenir une morphologie optimale. Si plus de tissu est nécessaire pour d’autres analyses, des puits supplémentaires de milieux et des morceaux de cortex ovarien peuvent être obtenus de chaque animal.
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Representative Results
Cette procédure de culture du cortex bovin peut être utilisée pour déterminer une grande variété de données hormonales, cytokines et histologiques à partir de petits morceaux de l’ovaire. La coloration, telle que l’hématoxyline et l’éosine (H & E), peut être utilisée pour déterminer la morphologie ovarienne par la stadification des follicules16,23,31 ( Figure3). En bref, les follicules ont été classés comme primordiaux, qui est un ovocyte entouré d’une seule couche de cellules pré-granulosauses squameuses (0); follicule transitionnel ou primaire précoce, qui est un ovocyte entouré de cellules pré-granulosa principalement squameuses et de certaines cellules de granulosa cuboïdes (1); follicule primaire, qui est un ovocyte entouré de 1 à 1,5 couche de cellules de la granulosa cuboïdale (2); follicule secondaire, qui est un ovocyte entouré de deux ou plusieurs cellules de granulosa cuboïde (3); follicule antral, qui ne dépasse pas 1 mm de diamètre et est entouré de deux ou plusieurs couches de cellules de granulosa contenant un antre distinct (4)16,23 ( Figure3). La stadification folliculaire peut être réalisée sur le cortex ovarien fixé avant et après la culture pour évaluer la folliculogenèse (Figure 4). Nous avons pris trois images par diapositive à partir de trois diapositives différentes tachées de H& E. Ensuite, les follicules ont été échelonnés et comptés par trois individus et moyennés pour déterminer le nombre de follicules à chaque stade16,23. La zone du champ de vision d’une image (trois par diapositive) à un grossissement de 400x est de 0,4 mm2. Ainsi, 30% de la zone des morceaux du cortex ovarien ont été comptés pour déterminer les stades folliculaires. Le nombre initial de follicules(avant la culture) (Figure 4A) est utilisé pour normaliser les follicules comptés après la culture (Figure 4B).
De plus, les différences de morphologie déterminées par le dépôt de collagène (coloration rouge Picro Sirus) peuvent indiquer une fibrose dans le cortex ovarien des génisses Stair Step ou Control(Figure 5). La collecte quotidienne du milieu de culture peut être regroupée sur 3 jours pour évaluer la production variée d’hormones stéroïdes par RIA (en utilisant un échantillon de milieu de 200 μL par animal; Graphique 6) ou des métabolites stéroïdiens par spectrométrie de masse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC-MS; échantillon moyen de 220 μL regroupé sur 4 jours par animal; Tableau 1) et la production de cytokines (Tableau 2). Par conséquent, plusieurs répliques d’un animal peuvent être nécessaires pour assurer un milieu de cortex suffisant pour effectuer tous les tests souhaités.
Parce que les génisses Stair-Step ont augmenté les follicules primordiaux au début de la culture, nous nous attendions à ce qu’ils progressent en culture et obtiennent un plus grand nombre de follicules secondaires, ce que nous avons observé dans les résultats. En outre, en raison de l’augmentation des follicules secondaires, nous nous attendrions à de plus grandes concentrations de stéroïdes. Nous avons constaté une tendance à l’augmentation des androgènes, des métabolites des glucocorticoïdes et des métabolites de la progestérone, ce qui soutiendrait cela dans le manuscrit actuel. Notre laboratoire a également évalué les effets de différentes isoformes VEGFA sur la progression des follicules, la stéroïdogenèse et l’activation de différentes molécules de transduction du signal dans le KDR (également connu sous le nom de récepteur 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire; VEGFR2) à l’aide de plaques de réseau de transduction de signal16. Pour réduire la variation animale, nous utilisons 4 à 6 animaux par traitement et pour d’autres expériences en fonction de l’analyse de puissance et de la variabilité, nous en avons utilisé jusqu’à 11.
La répétabilité des résultats de la culture du cortex ovarien bovin est la plus affectée par la contamination des morceaux du cortex ovarien. De plus, des résultats négatifs ou inférieurs à la normale peuvent se produire si le milieu n’est pas changé régulièrement au cours d’une période de 24 heures. Le milieu, lorsqu’il est ajouté à l’origine, est de couleur rose, mais lorsque le milieu est collecté et que la couleur semble être orange ou jaune vif, cela pourrait indiquer un changement de pH qui pourrait nuire au tissu. En outre, les morceaux de tissu qui sont coupés trop gros pourraient développer une dégénérescence au milieu qui ne serait pas observée jusqu’à la section des tissus pour l’histologie. Cette dégénérescence limitera l’utilisation du tissu pour l’analyse. Les données présentées dans cet article ont été analysées à l’aide de tests non paramétriques et d’une analyse de modèle linéaire général dans un logiciel statistique. Le nombre de follicules primordiaux, primaires, secondaires et antraux par section avant et après la culture a été analysé à l’aide d’un modèle mixte linéaire généralisé. La signification a été déterminée à P < 0,05 et une tendance a été rapportée à 0,14 ≤ P ≥ 0,05.
Figure 3: Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour la stadification des follicules du cortex ovarien. Les différents stades des follicules sont indiqués par des flèches. (A) Follicules primordiaux (stade 0); (B) Follicules primaires précoces (stade 1); (C) Follicules primaires (stade 2); D) Follicule secondaire (stade 3); (E) Follicule antral (stade 4). La zone du champ de vision pour une image à un grossissement de 400x est de 0,4 mm2. Nous comptons 30% de l’aire des morceaux du cortex ovarien pour déterminer les stades du follicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Nombre moyen de follicules à différents stades folliculaires chez les génisses Control (n=6) et Stair-Step (n=6). (A) Avant culture Primordial P = 0,001, Early Primary P = 0,12, Primary P = 0,31, Secondary P = 0,22. (B) Après 7 jours de culture, P primordial = 0,37, P primaire précoce = 0,84, P primaire = 0,69, P secondaire = 0,02. Les barres d’erreur sont représentatives du SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Collagène (Picro Sirius Red; PSR) coloration dans le cortex ovarien. PSR en (A) Génisses de contrôle et de marche d’escalier à partir du jour 0 et du jour 7. (B) Graphique comparant l’aire moyenne de coloration PSR-positive par champ de cortex ovarien (pixels/μm2) entre les génisses Control (n = 4) et Stair-Step (n = 4). Les barres d’erreur sont représentatives du MEB. La zone du champ de vision d’une image à un grossissement de 400x est de 0,4 mm2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Concentrations de A4 et E2. (A) Concentration de A4 et (B) concentration d’E2 regroupées sur 3 jours de culture dans le cortex ovarien des génisses Control et Stair-Step telles que mesurées par les RIA. n = 4 pour chaque groupe. Les barres d’erreur sont représentatives du SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
| Hormone | Contrôle | Escalier | Valeur P | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/mL | Méchant | ± SEM | Méchant | ± SEM | ||
| MÉDECIN | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| AUBERGE | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| CORT | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17OHP | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4 | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| UN | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| DHEAS | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| DHT | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-Désoxycorticostérone, DCI - 11-Désoxycortisol, CORT - Corticostérone, 17OHP - 17-Hydroxyprogestérone, A4- Androstènedione, AN - Androstérone, DHEAS - sulfate de déhydroépiandrostérone, E2 - Estradiol, P4 - Progestérone, T - Testostérone, DHT - Dihydrotestostérone | ||||||
Tableau 1 : Métabolites stéroïdiens et stéroïdiens mesurés dans un milieu de culture du cortex ovarien à partir d’un puits pour chaque animal mis en commun sur 4 jours de culture. Données présentées avec une moyenne ± SEM. Le bleu indique P < 0,1 et a tendance à être différent.
| Cytokines | Contrôle | Escalier | Valeur P | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| pg/mL | Méchant | ± SEM | Méchant | ± SEM | ||
| ANG1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| CD40L | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| DCN (en anglais seulement) | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| INFβ | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| IL18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| FRV | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| RANTES | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| INFγ | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| IL13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| IL21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| IL1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – Angiopoïétine 1, CD40L – Ligand CD40, DCN – Décorine, IFNβ – Interféron Bêta 1, IL18 – Interleukine-18, LIF – Usine inhibitrice de la leucémie, RANTES – Régulé à l’activation, Cellules T normales exprimées et sécrétées, IFNγ – Interféron Gamma, IL13 – Interleukine 13, IL21 – Interleukine 21, IL1F5 – Interleukine 1 membre de la famille 5, TNFα – Facteur de nécrose tumorale alpha | ||||||
Tableau 2 : Cytokines et chimiokines mesurées dans un milieu de culture du cortex ovarien à partir d’un puits pour chaque animal mis en commun sur 4 jours de culture. Données présentées avec une moyenne ± SEM. Le bleu indique P < 0,1-0,14 et a tendance à être différent.
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Discussion
L’avantage de la culture in vitro du cortex ovarien, tel que décrit dans ce manuscrit, est que les follicules se développent dans un environnement normalisé avec un stroma adjacent entourant les follicules. Les cellules somatiques et les ovocytes restent intacts, et il existe une communication appropriée de cellule à cellule en tant que modèle in vivo. Notre laboratoire a découvert qu’un système de culture de 7 jours fournit des données représentatives de la folliculogenèse et de la stéroïdogenèse pour le traitement du cortex ovarien. D’autres protocoles de culture de tissu ovarien ont soit des périodes de culture relativement courtes de 1 à 6 jours7,32, soit de longues périodes de culture de 10 à 15 jours5,6,10. Cependant, nous avons observé que la culture pendant plus de 7 jours entraîne une dégradation des tissus, une réduction de la stéroïdogenèse et potentiellement une probabilité accrue de contamination (données non présentées). La culture du cortex ovarien après une ovariectomie fournit également un aperçu direct du microenvironnement ovarien chez cet animal particulier. Ceci est intéressant pour notre laboratoire de recherche car nous avons identifié des changements dans le développement folliculaire après l’imposition de régimes nutritionnels après le sevrage et conduisant à la puberté chez les génisses16.
Le développement du follicule du stade primordial au stade antral est un processus dynamique au sein du cortex ovarien, qui comprend des facteurs endocriniens et paracrines des cellules somatiques et de la communication cellule-ovocyte cumulus33. La culture tissulaire, telle que la culture du cortex ovarien, offre un environnement contrôlé pour étudier le rôle mécaniste de ces facteurs et le milieu endocrinien dans le microenvironnement ovarien. Les ovaires peuvent être prélevés sur des animaux qui ont subi un traitement in vivo ou qui sont génétiquement modifiés pour déterminer les effets sur la progression des follicules.
Les ovaires peuvent également être prélevés dans un abattoir local (à 1 h de distance) et transportés à 37 °C dans un thermos contenant du PBS avec antibiotique. Si le transport est plus long (p. ex., pendant la nuit), les ovaires sont expédiés ou transportés sur la glace22. Des résultats similaires ont été observés, que le transport des ovaires se fasse sur la glace pendant la nuit ou à 37 °C avec un transport à court terme dans un thermos. Le 37 °C avec un transport thermos permet la récolte d’ovocytes de ce tissu pour la maturation in vitro (IVM) ou la fécondation in vitro (FIV)34. D’autres études ont montré que le transport de tissus à des températures comprises entre 2 et 8 ° C a également été utilisé pour la préservation de la fertilité dans les tissus reproducteurs35,36,37. D’autres études ont encore utilisé des ovaires transportés à 34-37 °C et sur de la glace et n’ont pas observé de différences dans la culture de tissus bovins38.
Si le tissu de culture du cortex ovarien n’a pas l’air sain après la culture, cela pourrait être dû au fait que les morceaux de cortex ovarien sont trop gros. Une étape critique du protocole consiste à s’assurer que les morceaux du cortex ovarien ne sont pas plus grands que 0,5-1 mm3. Nous utilisons une règle pour mesurer les pièces et utilisons une échelle dans le microscope à dissection pour déterminer la taille des pièces du cortex ovarien (Figure 2C). D’autres utilisent un équipement spécifique (voir tableau des matériaux)pour une épaisseur et une longueur/largeur uniformes, respectivement26. Si ces pièces d’équipement ne sont pas disponibles, des carrés en plastique peuvent être utilisés comme modèle pour obtenir une épaisseur uniforme et assurer des pièces de taille similaire27.
Pour assurer la coupe des morceaux qui proviennent uniquement du cortex et qui n’ont pas de médulla après le lavage de l’ovaire, nous le plaçons dans le plat de 60 mm et le coupons en deux. Le cortex et la moelle sont très différents histologiquement comme on l’a vu précédemment dans Abedal-Majed, 202016. Chaque moitié de l’ovaire est filetée avec la lame pour s’assurer que seul le cortex est retiré de l’ovaire et que la moelle reste. Si les individus commencent tout juste à perfectionner cette technique de coupe, ils peuvent également utiliser le rouge neutre pour voir de près l’histologie de chaque moitié de l’ovaire39. Cela permettra le développement de points de repère à mesure que leur technique de coupe s’améliore. En outre, ils peuvent utiliser des instruments capables de couper une épaisseur uniforme (voir tableau des matériaux)comme indiqué ci-dessus26,27.
Le milieu du cortex ovarien doit être rose clair. Nous avons observé que le pH du milieu de culture du cortex ovarien change rapidement chez certains animaux, de sorte que la majorité (70%) du milieu du cortex ovarien devrait être changé toutes les 24 heures pour promouvoir la santé de la culture. Des articles précédents ont discuté de la modification de la moitié du média quotidien40. Notre raison de changer la majorité des médias dans le manuscrit actuel était de promouvoir la santé des cultures du cortex ovarien. Les gouttes entourant les morceaux du cortex ovarien restent et il n’y a pas eu d’effets négatifs du changement de milieu sur la culture. De plus, cela nous a permis d’analyser plus d’hormones, de cytokines et de chimiokines pour chaque animal afin de générer un aperçu du microenvironnement ovarien.
Ce protocole de culture tissulaire offre plusieurs avantages. La culture du cortex ovarien permet aux follicules de se développer dans un environnement similaire à celui in vivo. Les follicules restent soutenus par le stroma environnant et la communication entre les cellules somatiques et le cumulus cellule-ovocyte se poursuit. L’utilisation d’inserts de puits de culture permet au cortex ovarien de se reposer sur le milieu de culture sans être submergé, empêchant ainsi le tissu de se lier à la base plastique de la plaque de puits. Un autre avantage est la fenêtre de culture. La fenêtre de culture de 7 jours décrite dans le protocole fournit des données représentatives sur les hormones et les facteurs de croissance. De plus, la folliculogenèse continue de progresser dans cet environnement in vitro car nous avons compté moins de follicules de stade précoce (primordial) et plus de follicules de stade avancé (secondaire, antral) après 7 jours de culture16. Les protocoles de culture de tissu ovarien précédents ont utilisé des périodes de culture relativement courtes (1-6 jours7,32)ou longues (10-15 jours5,6,10). Des fenêtres de culture plus courtes ont été utilisées pour étudier l’activation initiale des follicules dans le cortex ovarien bovin fœtal41. Chez les primates non humains, une période de culture de 20 jours a été utilisée pour évaluer la capacité des follicules primordiaux des primates à survivre et à initier la croissance in vitro dans un milieu sans sérum18. Cependant, nous avons observé une dégradation accrue des tissus lors de la culture du cortex bovin ovarien pendant plus de 7 jours dans un milieu sans sérum. Nous avons également déterminé dans l’analyse des échantillons quotidiens que les concentrations de stéroïdes sont diminuées après 4 jours de culture (données non montrées). Une fenêtre de culture plus longue peut également augmenter la possibilité de contamination dans les cultures de cortex ovarien. Par conséquent, les effets majeurs peuvent être mesurés par 7 jours de culture15 et le temps de culture peut dépendre du modèle animal et de la question scientifique abordée.
Bien qu’il existe plusieurs avantages de ce protocole de cortex ovarien bovin, il existe quelques limites. Une limitation est la quantité de tissu cortical ovarien et le volume de milieu de culture collectés lors de la culture corticale ovarienne. La petite taille des morceaux du cortex ovarien permet d’utiliser un nombre limité de coupes tissulaires à des fins de coloration (H & E, immunofluorescence, etc.). Pour effectuer la RT-PCR, un minimum de quatre pièces de cortex sont nécessaires16. De plus, le faible volume de milieu de culture collecté peut limiter la quantité d’analyses effectuées. Pour lutter contre ces limitations, nous suggérons de cultiver plusieurs répliques par ovaire afin de fournir un approvisionnement adéquat en milieu de culture et en tissu pour l’histologie, les essais et la PCR. Très souvent, nous cultivons plusieurs morceaux de chaque ovaire d’une vache / génisse pour obtenir plus de tissu pour une analyse plus approfondie et pour obtenir un milieu de culture accru pour mesurer la sécrétion cortex d’hormones / cytokines / chimiokines. Les follicules préantraux sont plus diffus dans les ovaires de vache plus âgés que chez les femelles plus jeunes (génisses). Ainsi, une limitation potentielle est l’obtention de follicules préantraux sur tous les morceaux du cortex ovarien qui sont cultivés. Plusieurs façons d’atténuer cette limitation consistent à obtenir plus de morceaux de cortex ovarien et à cultiver des puits supplémentaires pour chaque animal ou à utiliser du rouge neutre pour visualiser les follicules et s’assurer que tous les morceaux de cortex contiennent des follicules préantraux précoces. Une troisième limitation de la culture du cortex ovarien est que toute contamination du système de culture rend les milieux et les morceaux de cortex inutilisables pour l’analyse. Ainsi, plusieurs façons de maintenir un environnement stérile consiste à filtrer le milieu utilisé dans la culture. Avant de traiter et de couper les morceaux de cortex ovarien, assurez-vous que le banc propre a été stérilisé avec de l’éthanol à 70% et que le flux d’air a fonctionné pendant au moins 30 minutes avant les dissections. De plus, si vous utilisez un tampon absorbant pour faciliter le nettoyage(Figure 1),assurez-vous que la lumière UV a été allumée pendant 30 minutes avant de placer tout mouchoir dans le banc propre pour stériliser le tampon et le banc propre. Enfin, tous les changements de milieu doivent être effectués dans une armoire de biosécurité avec un flux d’air adéquat, des instruments stériles et des embouts de pipette changeants pour s’assurer que seules les pointes stériles sont introduites dans le milieu à placer dans les puits pour la culture du cortex ovarien.
L’application de cette technique aidera à comprendre le microenvironnement ovarien et peut commencer à démêler les mécanismes impliqués dans les troubles de la reproduction féminine qui impliquent une altération du développement folliculaire. Par exemple, l’étiologie du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) et les aspects de l’insuffisance ovarienne prématurée (POF) restent incertains. Étant donné que les vaches sont mono-ovulatoires, elles constituent un excellent modèle pour comprendre les facteurs qui affectent la progression et l’arrêt des follicules chez d’autres espèces mono-ovulatoires (par exemple, les humains et les primates non humains). En outre, cette méthode de culture du cortex ovarien peut également s’avérer bénéfique pour tester des thérapies potentielles susceptibles d’améliorer les troubles médiés par les follicules entraînant l’infertilité chez les femmes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture 2013-67015-20965 à ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants à ASC. Subvention Hatch du département de l’Agriculture des États-Unis NEB26-202/W3112 Accession #1011127 à ASC, Hatch–NEB ANHL Accession #1002234 à ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – Prix COVID-19 pour le financement d’été de CMS.
Les auteurs aimeraient exprimer leur gratitude au Dr Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE pour le remercier d’avoir fourni les ovaires dans une publication précédente, qui ont ensuite été utilisés dans le présent article comme preuve de concept pour valider cette technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
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