Summary
פרוטוקול זה נועד להשתיל תיקון ביו-מודפס בתלת-ממד על האפיקארדיום של עכברים אוטמים המדגמים אי ספיקת לב. הוא כולל פרטים לגבי הרדמה, פתיחת החזה הכירורגית, קשירה קבועה של העורק הקדמי השמאלי (LAD) העורק הכלילי ויישום של תיקון bioprinted על האזור האוטם של הלב.
Abstract
בדיקת תכונות רגנרטיביות של 3D bioprinted מדבקות לב vivo באמצעות מודלים מורין של אי ספיקת לב באמצעות קבוע שמאל קדמי יורד (LAD) קשירה הוא הליך מאתגר ויש לו שיעור תמותה גבוה בשל אופיו. פיתחנו שיטה להשתלת באופן עקבי טלאים מודפסים ביולוגית של תאים והידרוג'לים על האפיקארדיום של לב עכבר אוטם כדי לבדוק את תכונותיהם המתחדשות בצורה חזקה ו אפשרית. ראשית, עכבר מנוקב עמוק הוא צנרר בקפידה ומאוורר. בעקבות ניקור חזה לרוחב שמאל (פתיחה כירורגית של החזה), LAD החשוף הוא קשירה לצמיתות ואת התיקון bioprinted מושתל על האפיקארדיום. העכבר מתאושש במהירות מההליך לאחר סגירת החזה. היתרונות של גישה חזקה ומהירה זו כוללים שיעור תמותה צפוי של 28 יום של עד 30% (נמוך יותר מאשר 44% שדווחו על ידי מחקרים אחרים באמצעות מודל דומה של קשירה LAD קבוע בעכברים). יתר על כן, הגישה המתוארת בפרוטוקול זה היא רב-תכליתית וניתן להתאים אותה לבדיקה של תיקונים מודפסים ביולוגית באמצעות סוגי תאים שונים או הידרוג'לים שונים שבהם יש צורך במספרים גבוהים של בעלי חיים כדי להשתמש במחקרי כוח אופטימליים. בסך הכל, אנו מציגים זאת כגישה יתרון אשר עשוי לשנות בדיקות פרה-קליניות במחקרים עתידיים עבור תחום התחדשות הלב והנדסת רקמות.
Introduction
השתלת לב היא טיפול סטנדרטי זהב עבור חולים עם אי ספיקת לב בשלב הסופי אבל יש מחסור של איברי תורם. זה דורש דיכוי מערכת החיסון כדי למנוע דחיית שתלים, שיעור התמותה לשנה אחת הוא 15% ברחבי העולם1. לכן, יש תמריץ ארוך שנים כדי לחדש את שריר הלב במודלים בעלי חיים פרה-קליניים עם נוףלתרגום לניסויים בבני אדם 2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. ההתפתחויות האחרונות בהדפסה ביולוגית תלת-מית של תאי גזע או תאי לב שמקורם בתאי גזע זכו לתשומת לב כגישה מבטיחה לחידוש שריר הלב2,,3,,9,,10,,11,,12.
ניסויי בטיחות האדם הראשונים החלת טלאים כדי לחדש את הלב דווחו, עם תאי מוח עצם אוטולוגיים mononuclear תלוי קולגן או תאי גזע עוברי נגזר תאי מבשר לב בפיברין, מושתלים epicardium7,8,13. עם זאת, עבור שיטה מדויקת יותר, מדרגית, automatable ושחזור, bioprinting 3D של מדבקות הידרוג'ל אופטימיזציה להיות מיושם על פני השטח epicardial של הלב היא גישה מבטיחה כדי לחדש את שריר הלב עבור חולים שאחרתהיו צריכים השתלת לב 2,,10,,11,,12.
לפני תרגום לניסויים בבני אדם יכול להתרחש, מחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים נדרשים. Preclinical במודלים vivo רודף התחדשות של שריר הלב דווח חזירים5,כבשים 14,חולדות 6 ועכברים 4. מודל נפוץ של אוטם שריר הלב (MI) בעכברים משתמש קשירה קבועה של העורק הקדמי השמאלי יורד (LAD)עורק כלילי 15,,16. בין הזנים השונים של עכברים בשימוש, קשירה LAD קבוע בעכברים C57BL6 יש שיעור הישרדות מקובל בדרך כלל מציג שיפוץ עקבי ושינויים לב לאחר MI16. במודלים מכרסמים, מספר גישות תוארו שבו רקמת הלב הוחלה על הלב במרדף אחר התחדשות יעילה של שריר הלב פגום4,,6,,17. בעוד בעלי חיים גדולים עדיין מייצגים מודל רלוונטי יותר מבחינה קלינית כדי לבדוקתכונות התחדשותהלב 5,14, הרב-תכליתיות והכדאיות של מודל העכבר משאיל את עצמו לאזור זה של מחקר נע במהירות. זה עשוי למנוע חלק מהמלכודות האופייניות של מחקרים גדולים בבעלי חיים, כולל (אך לא רק): 1) תמותה גבוהה של בעלי חיים (אלא אם כן עורקים כליליים אלכסוניים קשורים המובילאוטם מגזרי בלתי צפוי 14, או הסוף הדיסטלי של LAD הוא חסום ואחריו reperfusion במקוםקשירה קבועה 5); 2) בעיות אתיות עם הפגיעה המוגברת יחסית שנגרמה על ידי פרוטוקולים בעלי חיים גדולים בהשוואה לעכברים18; 3) בעיות עלות ו/או היתכנות מוגברות, למשל חוסר זמינות יחסית של ציוד בעל חיים גדול כגון סורקי MRI14. חשוב גם לקחת בחשבון כי בהתחשב משך הזמן הנרחב ומחויבות אופייני של מחקרים גדולים בבעלי חיים, יש להם את הפוטנציאל להיות מיושן לפני שהם סיימו, במיוחד עם ההתפתחויות המהירות האופייניות של תחום זה. לדוגמה, רק לאחרונה התגלה כי התפקיד הקריטי שממיאים תאים דלקתיים ומתווכים בוויסות התחדשות הלבעלה 19,20. יתר על כן, התפקיד הקריטי של מחקרים פרה-קליניים, כגון מודלים בעלי חיים קטנים, הובלט על ידי ועדת Lancet כצעד חיוני כדי להשיג ידע חזק לפני המעבר לניסוייםבבני אדם 21.
כדי להקל על ההתקדמות בהבנת מנגנונים ואופטימיזציה תנאים עבור גישות התחדשות לב מבוססתיקון ב vivo, אנו מציגים גישה חדשנית המתארת שיטה 'סקופ ו- וילונות' כדי להחיל תיקון הידרוג'ל אלגנאט/ג'לטין 3D מודפס על פני השטח של לבבות אוטמים בעכברים C57BL6. מטרת גישה זו היא לספק רב-תכליתי במודל vivo כדי לבדוק תיקונים ביו-מודפסים בתלת-ממד שסביר להניח שיהיו אפשריים בהקשרי מחקר רחבים עבור התחום המתפתח במהירות של התחדשותהלב 2. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לבדיקה תיקונים שנוצרו על ידי שיטות שאינן bioprinting, הידרוג'לים שונים ותאים אוטולוגיים או אלוגניים נגזר תאי גזע בתוך תיקונים vivo. עם זאת, שיקול מפורט של bioprinting, הידרוג'לים או סוגי תאים הוא מעבר להיקף של מחקר זה המתמקד בשיטת השתלה כירורגית.
היתרונות של הפרוטוקול כוללים כי אוטם שריר הלב ויישום של תיקון bioprinted מבוצעים בהליך כירורגי אחד שניתן לבצע במהירות, עם זמין, כלי מעבדה חסכוניים ועם שיעור תמותה נמוך יחסית. הוא גם מאפשר בדרך כלל מספר גבוה יותר של בעלי חיים מאשר מודלים בעלי חיים גדולים בחלל קטן יותר, המאפשר השוואה חזקה של קבוצות ניסיוניות מרובות, שימושי במיוחד עבור השוואה קבוצתית מרובה vivo. מצד שני, פרוטוקול זה יש את החסרונות כי: 1) מודל העכבר הוא רחוק יותר מגודל הלב האנושי, אנטומיה ופיזיולוגיה מאשר במודלים בעלי חיים גדולים וזה לא ישירות לתרגם לבני אדם; 2) הענפים murine LAD proximally, עם שונות משמעותית בין עכברים בודדים, מה שמוביל השתנות גודל אוטם (בעיה משותפת עם מודלים בעלי חיים גדולים); 3) יש להחיל את התיקון על כל משטח הלב הקדמי, שהוא פחות מדויק מאשר החלת על אזור אוטם מסוים; ו 4) התיקון מוחל מיד בזמן MI (לשימוש בבני אדם זה עשוי להיות שימושי יותר קלינית לפתח תיקון עבור יישום לב כושל אוטם כרוני חודשים לאחר MIהראשוני 14).
עם זאת, אם נבחר כראוי על פי ההשערה שנבדקו, פרוטוקול זה יכול לספק קריטי בנתוני vivo במהירות, עם מספרי n גבוהים, באופן העולה בקנה אחד עם החומרים, התקציב והמומחיות הזמינים ברוב המעבדות. בהשוואה למודלים בעלי חיים גדולים, זהו מודל vivo שהוא רב-תכליתי מספיק כדי להסתגל לטכנולוגיות ביו-הדפסה תלת-מית-מיו-מיו-מית-יותיות (לדוגמה, על ידי הקלות היחסית בביצוע מחקרי פיילוט כדי לבדוק היתכנות ובטיחות לפני המעבר למודלים בעלי חיים גדולים יותר). זה יהיה מתאים היטב עבור חוקרים שרוצים ליצור בנתוני vivo ביעילות ובצול, אולי הפעלת השוואות מרובות של תיקונים bioprinted 3D עם פרמטרים bioprinting שונים, תאים או הידרוג'לים במדבקות. זה יהיה שימושי במיוחד לבדיקת האינטראקציות של תערובות שונות של תאי גזע ותאים נגזרים תאי גזע עם הידרוג'לים ב vivo ללא בזבוז עודף של תלאות תאים יקרים או חומרים אחרים שעלולים להתרחש אם באמצעות תיקונים בקנה מידה גדול. שימוש במודל עכבר גם להקל על בדיקות של תיקונים המכילים תאים תואמי מין העכבר וגזע תוחונים או תאים נגזרים על ידי בני אדם שבו עכברים אחידים עם מחסור חיסוני ספציפי רצויים. בנוסף, בדיקות בזני עכבר מהונדסים גנטית יכול לאפשר לחוקרים לבודד את ההשפעות של גנים ספציפיים על מסלולי איתות וסוגי תאים ספציפיים הרלוונטיים למחלות לב וכלי דם, אשר לא יהיה אפשרי כיום במודל בעלי חיים גדול.
Protocol
כל ההליכים המתוארים בניסוי זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים במחוז הבריאות המקומי של צפון סידני, NSW, אוסטרליה (מספר פרויקט RESP17/55).
1. הרדמה וצנרור
הערה: הפעל והגדר את הסטריאומיקרוסקופ, את משטח החום (מכוסה בסדין סופג) ואת מערכת ההנשמה.
- כפפות נקיות, אזור הניתוח, וכלים עם 70% אתנול.
- לשקול את העכבר כדי לחשב את מינון ההרדמה מוזרק על ידי המסלול intraperitoneal (קטמין 40 מ"ג/ק"ג, xylazine 5 מ"ג/ק"ג, אטרופין 0.15 מ"ג/ק"ג) ולתת את הזריקה.
- ברגע שהעכבר מגיע לים עמוק של הרדמה, לגלח את הצד השמאלי הפתחי של בית החזה עם גוזם.
- מניחים את העכבר בתא המכיל 2% isoflurane (הבטחת אוורור חילוץ הולם בחדר).
הערה: המינון הנמוך יחסית של הזרקת קטמין/קסילאזין יחד עם שאיפת isoflurane 2% מפחית את הסיכון למוות של עכבר תוך מתן צנרור אופטימלי מבלי להעיר את העכבר. - מניחים את העכבר ומרסנים אותו מהשיניים השיניים השיניים השיניים העליונות שלו עם תפר 3.0 מודבק על הספסל, כפי שמוצג בסרטון. אשר את ההסתמה על-ידי ביצוע צביטה של בהוהן. מקם תאורה בעוצמה גבוהה מעל צוואר העכבר כך שניתן יהיה לדמיין את ה-oropharynx.
הערה: לחלופין, ניתן להציב את העכבר על הדוכן מערכת צנרור (למשל, קנט מאוס צנרור Kit) עם רצועה אלסטית מאובטחת מתחת לתחתונים העליונים להחזיק את הפה פתוח כדי לזהות את קנה הנשימה. - השתמש מרית מעוקלת כדי לפתוח את הלסת ועוד זוג משקולות / משקולות קהה להרים את הלשון בעדינות מהדרך. הקפד לצנרר בזמן ממוקם או מעט מתחת לפנים העיניים עם גוף העכבר.
- דמיינתי את הפתיחה והסגירה של מיתרי הקול. כאשר אתה פתוח, הכנס את צנתר הפלסטיק 20 G המסופק עם ערכת הצנרור.
- העבר בזהירות את העכבר הצנרר למשטח הפעלה המצויד במשטח חימום. חבר את העכבר למכונת ההנשמה (לדוגמה MouseVent) המגדירה באופן אוטומטי את עוצמת הקול של היעד בהתבסס על משקל העכבר.
- לספק 1.5-2% איזולורן עם חמצן (אשר מוסדר באופן אוטומטי על ידי מכונת ההנשמה: ודא שיש חיבור מגליל חמצן למכונת ההנשמה האוטומטית בקצב זרימה של 1-2 L/min למכונת ההנשמה). אמת את הצנרור על-ידי בדיקת עליית חזה דו-צדדית. אמת הרדמה על-ידי ביצוע צביטה בהוהן.
- למרוח משחה אופטלמית (למשל, משחה אופטלמית וטרינרית פורלובית) על שתי העיניים כדי למנוע מהן להתייבש.
2. הכנת השדה הכירורגי
- אבטחו את צינור הצנרור עם סרט הדבקה באתר המחבר בין מכונת ההנשמה לצינור הנשימה/צנתר.
- חותכים פיסת נייר דבק ארוכה יותר ומאבטחים את רגלה הקדמית השמאלית אל משטח ההפעלה בתנוחה מעט גבוהה. כמו כן, תדביק את הגפיים האחרות.
- נקה את החזה עם תמיסת יוד isopropanol סטרילית 70% ו povidone, ניקוי בתנועה מעגלית נע ממרכז לפריפריה.
- ודא את ההרדמה פעם נוספת עם צביטה בהון.
- לתת 0.08 מ"ג/ק"ג Temvet (buprenorphine) ב 0.1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח באמצעות הזרקה תת עורית.
3. ניקור חזה לעיבר
- השתמש במקצות דקים כדי להרים בעדינות את העור בנקודה של כ-5 מ"מ משמאל לסחוס ה-xiphoid הבולט. השתמש במספריים כירורגיים כדי ליצור חתך superomedial בעור מנקודה זו כלפי מעלה ולכיוון קו האמצע, לרמה של manubrium.
- השתמשו במכריחים מעוקלים כדי להפריד בעדינות את שכבות העור והשרירים. פתח את שכבת השריר, בעקבות חתך העור.
- זהה ועשה חתך בחלל הבין-צלבי השלישי, בעקבות הזווית הטבעית של בית החזה.
- השתמשו במפשל כדי לפזר בעדינות את הצלעות השלישיות והרביעות.
- מסירים בעדינות את החיידק הדק עם מפסים.
- אם LAD אינו מדמיין, בעדינות לדחוף את auricle השמאלית (ראה איור משלים 1) כלפי מעלהולאתר את העורקים הכליליים מתחת.
4. שמאל קדמי יורד (LAD) קשירה קבועה בעורק הכלילי
- לחתוך ~ 3 מ"מ ארוך 3-0 תפר משי ולשים את זה חיזוק 3-0 חתיכת תפר משי על גבי LAD באותו כיוון כמו LAD (כפי שמוצג בוידאו בנקודת זמן 02:12 – 02:20).
- זהה את הבחור ותעביר תפר משי 7-0 מתחת לLAD. אם LAD אינו חזותי בבירור, הכנס את המחט 1 מ"מ נחות מדיאלי לנקודה קצת יותר נחותה הגיע על ידי קצה auricle השמאלית במהלך תנועה דינמית של הלב.
הערה: מבנה זה הוא צבע בהיר יותר אדום לתאי החדר של הלב אבל כהה יותר מהריאה הסמוכה והוא מודמיה בצורה הטובה ביותר בוידאו בנקודת זמן 01:54 – 01:55 שבו הוא נראה רק נחות הזרוע העליונה של המפשק, מעולה על הריאה השמאלית (ראה איור משלים 1 עבור תמונה עדיין וידאו ביאורים). - להשלים שתי זריקות עם תפר משי 7-0 ולסגור אותו בחוזקה עובר על גבי תפר משי 3-0 תומך כדי לאבטח את LAD. אם הרצועה תצליח, אזור החדר הקדמי יתפוגע מהליגרה.
- להשלים את הקשר עם זריקה שלישית בכיוון ההפוך כדי לאבטח אותו, להבטיח שום כוח משיכה כלפי מעלה מועבר לתפר. זריקות נוספות אינן נדרשות כדי להפחית את הסיכון של נזק שריר הלב או LAD על ידי חיתוך תפר דרך.
5. השתלת המדבקה המודפסת על האפיקארדיום
- בזהירות להעביר את התיקון bioprinted מצלחת שש באר לאזור האוטם באמצעות משטח פנימי סטרילי של חבילת אזמל כירורגי פתוח.
- מקם בזהירות את המדבקה המודפסת הביולוגית על המשטח האפי-רדיאלי הקדמי, שם עליו לכסות את כל המשטח ולעטוף מעל הקצוות הדקים והלחוץ, המכסים את החדר השמאלי ואת האזור האוטם (אזור בלונדי).
- תסגרו בעדינות והסרו את המפשק מבלי לכוון קצוות חדים לכיוון הלב.
- השתמש 6-0 תפרים פרולין בתבנית פשוטה מופרעת כדי לסגור את בית החזה ואת שכבות השריר.
- עם פונקציית אנחה נשימה תוך סגירת החזה עם 6-0 פרולין תפרים, לנפח את הריאות כדי להסיר אוויר עודף בחלל הפלורל, אשר אחרת היה להיות לכוד בחלל החזה וכתוצאה מכך חזה אוויר.
- ודא שהחזה אטום היטב.
- ירידה של 1.0%. סגור את העור עם תפרים פרולין 6-0 בתבנית פשוטה מופרעת. כבה את מאדה האידוף.
6. שחזור העכבר
- Topically להחיל 2 מ"ג / מ"ל bupivacaine ב 0.9% תמיסת מלח על החתך. ניהול גם: i) אנטיסדן (atipamezole) 1 מ"ג/ק"ג; ii) לאסי (פורוזמיד) 8 מ"ג/ק"ג; iii) 600 μL של תמיסת מלח 0.9% באמצעות הזרקה תת עורית.
הערה: אנטיסדן הוא להפוך את ההרדמה במהירות רבה יותר; furosemide היא לפרוק נוזל עודף בשל פשרת תפוקת הלב ונוזל נוסף מנוהל עם זריקות סמים. - נטר את העכבר והמתן עד לנשימה עצמאית כדי להסיר את העכבר מצינור צנרור.
- כאשר העכבר מדגים קצב נשימה ועומק דו-צדדיים נאותים ומגיב לצביטת בהון, מקם את העכבר בכלוב התאוששות נקי הממוקם על משטח חום.
- לספק לעכבר מזון לח (לח לעיסה), בקבוק מים וג'ל מתזונה/לחות. לפקח על מאמץ נשימה מוגזם, דימום מוגזם, או סיבוכים אחרים שעלולים להיות מסכני חיים.
- במשך שלושת הימים הבאים, לנהל 0.08 מ"ג/ק"ג Temvet (buprenorphine) ב 0.1 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח באמצעות הזרקה תת עורית או תוך עורית, פעמיים ביום, ואז פעם ביום עד היום החמישי לאחר ההליך.
- עכברי בית בזוגות מופרדים על ידי חוצצים כלובים כדי למנוע בידוד תוך מניעת התנהגויות לחימה. לפקח על עכברים לפחות מדי יום עד סוף הניסויים (28 ימים) עם תשומת לב רבה לרווחתם ותדירות מוגברת של ניטור אם יש חששות.
Representative Results
עם ההשתלה, צמיגות התיקון בטמפרטורת החדר (ללא החלת crosslinker נוסף) אפשרה לו 'לעטוף' מעל קווי המתאר של הלב ( איור 1 )ולנוע באופןדינמי עם מחזור הלב. לאחר הניתוח, השארנו את הטלאים במשך 28 ימים vivo כמו מחקרים מצאו את זה להיות פרק זמן מתאים המאפשר השפעות תיקון על תפקוד הלבהמארח 3,,4 (למרות שדווח כי השפעות תפקודיות מלאות לא ניתן לראות עד שלושה חודשים לאחר ההשתלה)22. התמונה של תיקון המוצג situ על לב העכבר איור 1 נלקח מיד לאחר היישום, מראה את היכולת של התיקון לעטוף מעל הלב בהשתלה. תוצאה מייצגת זו מראה כי הידרוג'ל מאפשר את התיקון לעצב את קווי המתאר של הלב שבו מתח מוגזם התרחש הידרוג'ל היה מסוגל לפצל כפי שהראה על ידי האזור החשוף (ללא הידרוג'ל) משולש איור 1 (המצוין על ידי כוכב שחור בתמונה). נתוני הישרדות (עקומות הישרדות קפלן-מאייר) מוצגים בדמות 2 בהשוואה לעכברים העוברים הליך מזויף (מעבר של מחט ותפר מתחת ל-LAD ללא קשירה ואחריו סגירת חזה העכבר).
איור 1: תיקון לב מודפס ביולוגית החל על האפיקארדיום של לב עכבר C57BL6. תיקון ביו-מודפס של 10 מ"מ x 10 מ"מ x 0.4 מ"מ (מיד לאחר ההשתלה) המכיל הידרוג'ל (אלגנטי 4% (w/v)/gelatine 8% (w/v) במדיה) מוצג עטוף על האזור האוטם ודבק במשטח האפיארדיאלי (ראשי חצים לבנים וקווים מנוקדים = גבול התיקון). צמיגות התיקון מאפשרת לו לעצב את קווי המתאר של הלב ואיפה מתח מוגזם התרחש בהיבט מעולה התיקון לפצל כדי להפוך אזור חשוף משולש לא מכוסה הידרוג'ל (כוכב שחור). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ניתוח הישרדות קפלן-מאייר עד 28 ימים לאחר MI. תשעה עכברים בקבוצה הפרוצדורלית מתו (n=38) כדי לתת שיעור תמותה כולל של 24%. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: תמונת סטילס וידאו (נקודת זמן וידאו 01:54 – 01:55) המציגה את auricle השמאלית (תוספת פרזור שמאל). החץ מצביע על הקצה ההתפתי של התאוריה השמאלית, הנראית כמבנה משולש בקצה השמאלי העליון של הלב. במקרה LAD אינו חזותי בבירור, קצה auricle השמאלי יכול לשמש כציון דרך עבור כניסה מחט לעבור תפר תחת LAD. נקודת הכניסה היא 1 מ"מ נחות ומדיאלי לנקודה נחותה ביותר קצה auricle השמאלי מגיע במהלך תנועות דינמיות של הלב (חץ שחור מראה קצה נחית של auricle השמאלי). אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
Discussion
השיטה מאפשרת למפעיל להשתיל ביעילות תיקון מודפס ביולוגית על ידי החלתו על פני השטח האפירדיאליים של לב עכבר אוטם בעקבות קשירה קבועה של LAD. בשיטה זו ממוקדת היתכנות, אנו מסוגלים לבצע הליך זה על שמונה עכברים ליום עבודה (כולל הכנת החדר לפני ואחרי). הריצה של bioprinting המייצרת שמונה 1ס"מ 2 טלאים בארות של לוחות שש בארות לוקח 2-3 שעות (כולל זמן הכנה לפני ואחרי). השתמשנו בסטרילי בתוך חבילת אזמל כירורגי כסקופ עבור התיקון שלנו, אשר נגיש בדרך כלל מוסיף עלות מינימלית, ניצול המאפיינים הדביקים הטבעיים של מדבקת הידרוג'ל אלגנטי/ג'לטין כדי לעטוף את המדבקה על פני פני השטח הקדמי אוטם של הלב. מניסיוני, הפרוטוקול עבור קשירה LAD בעכברים הוא תלוי מפעיל שיעור תמותה נמוך יותר ב 28 ימים ניתן להשיג עם מפעילים מנוסים המתמחים במודל אחד. ואןדן בורן ואח '16 דיווח כי עכברים C57BL6 להציג 44% תמותה בעקבות קשירה LAD קבוע ב 28 ימים ללא יישום של תיקון, שהוא גבוה יותר מאשר הגבול העליון של 30% שראינו עם השיטה.
שלב צנרור הוא קריטי ובאופן בפני עצמו יכול להיות מקור תמותה לעכברים אלא אם כן בוצע על ידי מפעיל מיומן. זה נעשה קשה בשל הגודל הזעיר של קנה הנשימה, ולכן זכוכית מגדלת משוחקים על ידי המפעיל עבור שלב זה. אנו משתמשים קטמין מוזרק / xylazine, כמו גם שואף isofluorane אינדוקציה של הרדמה, כך העכבר הוא הרדמה עמוקה במינונים נמוכים יחסית של כל תרופה. לכן, אין סיכון לעכבר להתעורר במהלך שלב צנרור זה, אבל התמותה הגבוהה הקשורים במינונים גבוהים של תרופה אחת נמנעת. אטרופין ניתנה גם כדי לנטרל תופעות לוואי כגון ברדיקרדיה ו hypersalivation. השימוש באור הזרקורים המיושם על הגרון מדליק חיצוני את קנה הנשימה באופן פנימי, כך שהוא גלוי יותר ויש לדמיין את מיתרי הקול נפתחים וסוגרים עם קצב הנשימה של העכבר (בדרך כלל כ-120 נשימות לדקה). זה קריטי למקם את העכבר בצורה מושלמת (ולכן משטח קשה מועדף ולא מחצלת חימום מתחת לעכבר לצעד זה) עם שתי שיניים שן השיניים השיניים השיניים המחזיקות על ידי חוט לולאה והלשון נסוגה בעדינות רבה עם מלקות קהות / זוג מריות כדי לפתוח את הפה ולדמיין את קנה הנשימה. לאחר השלמת השרירור, על המפעיל להיזהר שלא לנתק את הצינור בהעברה מאיזור צנרור למיטת ההפעלה (שיש לה מחצלת חום מתחתיה כדי למנוע היפותרמיה). בעת חיבור צינור הנשימה למערכת ההנשמה, חשוב לייצב את הצינור ביד אחת ולחבר את מעגל ההנשמה עם השני, כך שיש תנועה מינימלית של צינור הנשימה כגון דחיפתו עמוק יותר לתוך קנה הנשימה בעת חיבור קטע מכונת ההנשמה של הצינורות.
במחקר זה, השתמשנו אלגנטי 4% (w / v)/ ג'לטין 8% (w / v) במדיום נשר שונה של Dulbecco (DMEM). אלגנאט/ ג'לטין הידרוג'לים ידועים שלהם biocompatibility, עלות נמוכה ומאפיינים ביומכניים מה שהופך אותם שימושי עבור אסטרטגיות הנדסת רקמות3D 23. הידרוג'לים אלה יכולים להיות מוצלבים על ידי gelation מתון על ידי הוספת יוני סידן, המאפשר צמיגות להשתנות. לאחר bioprinting, יישם סידן כלורי (CaCl2)2% (w / v) בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) על טלאים ולאחר מכן תרבות אותם DMEM בשש צלחות באר במשך 7-14 ימים לפני השתלתם. זה היה החלון האופטימלי לאחר טלאים המכילים תאי לב החלו להכות בתרבות אבל לפני טלאים החלו להתפורר. בעוד CaCl2 ניתן להוסיף באופן קבוע לאורך כל שלב שלאחר bioprinting כדי להפחית את התפוררות תיקון, מצאנו כי צמיגות פנימית של הידרוג'ל היה מספיק עבור תיקונים כדי לשמור על המבנה שלהם עד השתלה עם רק מנה ראשונית אחת של CaCl2.
השיטה אפשרה השתלה מוצלחת ללא תפרים (אשר עלול לפגוע בלב) או דבק (אשר עשוי לחסום את הממשק בין התיקון ללב). מחקרים עתידיים עשויים לאשר את ההשערה כי השתלה ללא דבק ותפר אינה משפיעה לרעה על ההשתלה בעכברים כפי שהוא קריטי כי התיקון לא להחליק מהלב או להפריע לריאות. מחקרים אחרים המעריכים את ההתרה של טלאים במודלים קבועים של קשירה LAD עםתיקון מבוסס תיקון 3 מדדו שטח חחירה (מ"מ2)שנותרעם זמן 24, עובי תיקון מושתל (μm) כרייהעם זמן 25,כימות של השתלה תאים מתובלים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR)26 או שטף פליטת פוטון bioluminescence של תאים תורמים חיים מסומנים (מידה של פוטונים הנפלטים לשנייה אשר יכול לכמת תאים מתובלים ששרדו בבעלי חיים חיים לאורך זמן)27. מחקרים עתידיים עשויים להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך עוד יותר אם השתלה ללא תפרים וחסרי דבק משפיעה על חפירת התיקון (כמו גם השפעות מבניות ופונקציונליות על שריר הלב המארח). עם זאת, באופן מאקרוסקופי לאחר 28 ימים בvivio בעכברים immunocompetent שלנו, mediastinum הקדמי הציג חומר פיברינוס משתנה הידבקויות. המנגנון של התחדשות לב מבוססת תיקון עשוי להיות מגירוי של תגובות דלקתיות מקרופאגהמארח 19 או גורמים חיסונייםהפרשת 20 ולא חידוש תאים מספריים. אם דלקת ממלאת תפקיד חיובי, הנוכחות של חומר הידרוג'ל זר עשוי להיות מועיל. לחלופין, כדי להפחית את הנוכחות של חומר זר זה עשוי להיות מועיל אם רכיב הידרוג'ל מתפורר לאורך זמן. למעשה, גישות מסוימות להשתמש בחומרים ביולוגיים התומכים בתאים בתחילה ולאחר מכן להתפורר, עוזב רקרקמה 28,29. מחקרים עתידיים כדי לנתח באופן מלא תיקון engraftment ולהבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי התחדשות לב מבוססת תיקון עשוי להוביל עיצובים ניסיוניים אופטימיזציה לפניתרגום לניסויים בבני אדם 2.
בסך הכל, פרוטוקול זה עשוי להיות אפשרי באופן נרחב ומתאים גם לבדיקת קבוצות מרובות של תיקונים מודפסים ביולוגית בתלת-ממד, למשל עם תוכן סלולרי שונה. כיוונים עתידיים לשיטה זו כוללים את הביוהדינטציה של תיקונים המכילים הידרוג'לים מתקדמים שלא נבדקו בעבר ב-vivo או בדיקת ההשפעות של תאים שונים של תאי גזע אוטולוגיים או אלוגניים, לצורך אופטימיזציה לפני שתמשיך למודלים בעלי חיים גדולים.
Disclosures
ללא.
הצהרת מימון:
כריסטופר ד. רוש נתמך על ידי מלגת סר ג'ון Loewenthal 2019 (אוניברסיטת סידני), קרן מורשת Le Gros ניו זילנד (PhD012019) ומלגת לדוקטורט מחקר לב אוסטרליה (2019-02). קרמיין גוי נתמך על ידי אוניברסיטת סידני Kick-Start גרנט, אוניברסיטת סידני הקנצלר דוקטור תמריצים תוכנית מענק, UTS זרע מימון, הארכיבישוף הקתולי של סידני גרנט למחקר תאי גזע למבוגרים ומענק מחקר ניתוח לב-חזה Foudation בית הספר לרפואה של סידני.
Acknowledgments
עם תודה לנטלי ג'ונסטון על ההקלטה של הצילומים הלא כירורגיים וכל עריכת הווידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
| 6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
| 7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
| Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
| Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
| Atropine sulphate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
| Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
| Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
| Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
| Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
| Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
| Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
| Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals - 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
| Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
| Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
| PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
| Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
| Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
| Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
| VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
| Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |
References
- Lund, L. H., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-fourth adult heart transplantation report-2017; focus theme: allograft ischemic time. Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (10), 1037-1046 (2017).
- Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 58 (3), 500-510 (2020).
- Wang, H., Roche, C. D., Gentile, C. Omentum support for cardiac regeneration in ischaemic cardiomyopathy models: a systematic scoping review. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , Epub ahead of print. ezaa205 (2020).
- Mattapally, S., et al. Spheroids of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells improve recovery from myocardial injury in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 315 (2), 327-339 (2018).
- Gao, L., et al. Large cardiac muscle patches engineered from human induced-pluripotent stem cell-derived cardiac cells improve recovery from myocardial infarction in swine. Circulation. 137 (16), 1712-1730 (2018).
- Yang, B., et al. A net mold-based method of biomaterial-free three-dimensional cardiac tissue creation. Tissue Engineering Methods (Part C). 25 (4), 243-252 (2019).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report. European Heart Journal. 36 (30), 2011-2017 (2015).
- Menasché, P., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiovascular progenitors for severe ischemic left ventricular dysfunction. Journal of the American College of Cardiology. 71 (4), 429-438 (2018).
- Beyersdorf, F. Three-dimensional bioprinting: new horizon for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 46 (3), 339-341 (2014).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Maiullari, F., et al. A multi-cellular 3D bioprinting approach for vascularized heart tissue engineering based on HUVECs and iPSC-derived cardiomyocytes. Scientific Reports. 8 (1), 13532 (2018).
- Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D microfibrous scaffolds for engineering endothelialized myocardium and heart-on-a-chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
- Chachques, J. C., et al. Myocardial assistance by grafting a new bioartificial upgraded myocardium (MAGNUM clinical trial): one year follow-up. Cell Transplant. 16 (9), 927-934 (2007).
- Chachques, J. C., et al. Elastomeric cardiopatch scaffold for myocardial repair and ventricular support. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 57 (3), 545-555 (2020).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: an improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (122), e55353 (2017).
- van den Borne, S. W. M., et al. Mouse strain determines the outcome of wound healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 84 (2), 273-282 (2009).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
- Walker, R. L., Eggel, M. From mice to monkeys? Beyond orthodox approaches to the ethics of animal model choice. Animals. 10 (1), 77 (2020).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem-cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2019).
- Waters, R., et al. Stem cell-inspired secretome-rich injectable hydrogel to repair injured cardiac tissue. Acta Biomaterialia. 69, 95-106 (2018).
- Cossu, G., et al. Lancet Commission: stem cells and regenerative medicine. Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
- Kawamura, M., et al. Enhanced therapeutic effects of human iPS cell derived-cardiomyocyte by combined cell-sheets with omental flap technique in porcine ischemic cardiomyopathy model. Scientific Reports. 7 (1), 8824 (2017).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
- Kainuma, S., et al. Cell-sheet therapy with omentopexy promotes arteriogenesis and improves coronary circulation physiology in failing heart. Molecular Therapy. 23 (2), 374-386 (2015).
- Suzuki, R., et al. Omentopexy enhances graft function in myocardial cell sheet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 353-359 (2009).
- Zhou, Q., Zhou, J. Y., Zheng, Z., Zhang, H., Hu, S. S. A novel vascularized patch enhances cell survival and modifies ventricular remodeling in a rat myocardial infarction model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (6), 1388-1396 (2010).
- Lilyanna, S., et al. Cord lining-mesenchymal stem cells graft supplemented with an omental flap induces myocardial revascularization and ameliorates cardiac dysfunction in a rat model of chronic ischemic heart failure. Tissue Engineering (Part A). 19 (11-12), 1303-1315 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Zhang, B., et al. Biodegradable scaffold with built-in vasculature for organ-on-a-chip engineering and direct surgical anastomosis. Nature Materials. 15 (6), 669-678 (2016).
