Este protocolo visa transplantar um patch bioimpresso 3D no epicárdio de camundongos infartados modelando insuficiência cardíaca. Inclui detalhes sobre anestesia, abertura do tórax cirúrgico, ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) e aplicação de um patch bioimpresso na área infarto do coração.
Testar propriedades regenerativas de manchas cardíacas bioimpressoras 3D in vivo usando modelos murinos de insuficiência cardíaca via ligadura permanente esquerda anterior (LAD) é um procedimento desafiador e tem uma alta taxa de mortalidade devido à sua natureza. Desenvolvemos um método para transplantar consistentemente manchas bioimpressoras de células e hidrogéis no epicárdio de um coração de rato infartado para testar suas propriedades regenerativas de forma robusta e viável. Primeiro, um rato profundamente anestesiado é cuidadosamente entubado e ventilado. Após a toracotomia lateral esquerda (abertura cirúrgica do peito), o LAD exposto é permanentemente ligado e o patch bioimpresso transplantado no epicárdio. O rato se recupera rapidamente do procedimento após o fechamento do peito. As vantagens dessa abordagem robusta e rápida incluem uma taxa de mortalidade prevista de 28 dias de até 30% (menor do que os 44% relatados por outros estudos usando um modelo semelhante de ligadura lad permanente em camundongos). Além disso, a abordagem descrita neste protocolo é versátil e poderia ser adaptada para testar patches bioimpressos usando diferentes tipos de células ou hidrogéis onde um grande número de animais são necessários para estudar de forma ideal. No geral, apresentamos isso como uma abordagem vantajosa que pode alterar testes pré-clínicos em estudos futuros para o campo da regeneração cardíaca e engenharia tecidual.
Um transplante de coração é o tratamento padrão ouro para pacientes com insuficiência cardíaca em estágio terminal, mas há escassez de órgãos doadores. Requer supressão do sistema imunológico para evitar a rejeição do enxerto e a taxa de mortalidade de um ano é de 15% em todo o mundo1. Portanto, há um incentivo de longa data para regenerar o miocárdio em modelos animais pré-clínicos com o objetivo de traduzir para ensaios em humanos2,,3,4,5,,6,7,8,9. Os recentes avanços na bioimpressão 3D de células-tronco ou células-tronco derivadas de células-tronco ganharam atenção como uma abordagem promissora para regenerar o miocárdio2,,3,,9,,10,11,12.
Os primeiros testes de segurança humana que aplicam patches para regenerar o coração foram relatados, com células mononucleares de medula óssea autólogas suspensas em colágeno ou células progenitoras cardíacas derivadas de células-tronco em fibrina, transplantadas para o epicárdio7,,8,,13. No entanto, para um método mais preciso, escalável, automatizado e reprodutível, a bioimpressão 3D de manchas de hidrogel otimizadas a serem aplicadas à superfície epicárida do coração é uma abordagem promissora para regenerar o miocárdio para pacientes que de outra forma precisariam de um transplante de coração2,,10,,11,12.
Antes que a tradução para testes em humanos possa ocorrer, estudos pré-clínicos em animais são necessários. Modelos in vivo pré-clínicos que buscam a regeneração do miocárdio foram relatados em suínos5, ovelhas14, ratos6 e camundongos4. Um modelo comum de infarto do miocárdio (MI) em camundongos utiliza a ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD)15,16. Entre as diferentes cepas de camundongos utilizados, a ligadura lad permanente em camundongos C57BL6 tem uma taxa de sobrevivência aceitável e normalmente apresenta remodelagem consistente e alterações cardíacas após o MI16. Em modelos de roedores, várias abordagens foram descritas onde o tecido cardíaco foi aplicado ao coração em busca de uma regeneração efetiva do miocárdio danificado4,,6,17. Enquanto animais de grande porte ainda representam um modelo mais clinicamente relevante para testar propriedades regenerativas cardíacas5,14, a versatilidade e viabilidade do modelo do camundongo se presta a essa área de estudo em movimento rápido. Isso pode evitar algumas das armadilhas típicas de grandes estudos em animais, incluindo (mas não se limitando a): 1) alta mortalidade animal (a menos que as artérias coronárias diagonais estejam ligadas levando a infartos segmentais imprevisíveis14, ou a extremidade distal do LAD é ocluída seguida de reperfusão em vez de ligadura permanente5); 2) questões éticas com o dano relativamente aumentado causado por protocolos animais de grande porte em comparação com camundongos18; 3) aumento do custo e/ou questões de viabilidade, por exemplo, a relativa indisponibilidade de equipamentos animais de grande porte, como os scanners de ressonância magnética14. Também é importante considerar que, dada a extensa duração e comprometimento típicos de grandes estudos em animais, eles têm o potencial de se desatualizados antes de serem concluídos, especialmente com os rápidos desenvolvimentos típicos deste campo. Por exemplo, é apenas recentemente que o papel crítico desempenhado por células inflamatórias e mediadores na regulação da regeneração cardíaca emergiu19,20. Além disso, o papel crítico dos estudos pré-clínicos, como pequenos modelos animais, tem sido destacado pela Comissão Lancet como um passo essencial para obter conhecimento robusto antes de passar para testes em humanos21.
Para facilitar o progresso na compreensão de mecanismos e condições de otimização para abordagens de regeneração cardíaca baseadas em patches in vivo, apresentamos uma nova abordagem descrevendo um método de “colher e cortina” para aplicar um patch de hidrogágênio/gelatina bioimpressora 3D à superfície de corações infartados em camundongos C57BL6. O objetivo desta abordagem é fornecer um modelo in vivo versátil para testar patches bioimpressos 3D que provavelmente serão viáveis em amplos contextos de pesquisa para o campo de regeneração cardíaca em rápidaevolução 2. Este método poderia ser adaptado para testar patches gerados por métodos não bioimpressoras, diferentes hidrogéis e células derivadas de células-tronco autólogas ou alergênicas dentro de patches in vivo. No entanto, a consideração detalhada da bioimpressão, hidrogéis ou tipos de células está além do escopo deste estudo, que se concentra no método de transplante cirúrgico.
As vantagens do protocolo incluem que o infarto do miocárdio e a aplicação de um patch bioimpresso são realizados em um procedimento cirúrgico que pode ser realizado rapidamente, com ferramentas de laboratório prontamente disponíveis e econômicas e com uma taxa de mortalidade relativamente baixa. Também normalmente permite um número maior de animais do que modelos animais grandes em um espaço menor, o que permite uma comparação robusta de múltiplos grupos experimentais, particularmente útil para comparação de múltiplos grupos in vivo. Por outro lado, este protocolo tem as desvantagens que: 1) o modelo do camundongo está mais distante do tamanho do coração humano, anatomia e fisiologia do que em grandes modelos animais e não se traduz diretamente em humanos; 2) os ramos murine LAD proximalmente, com variabilidade significativa entre camundongos individuais, o que leva à variabilidade do tamanho do infarto (problema compartilhado com grandes modelos animais); 3) o patch deve ser aplicado sobre toda a superfície cardíaca anterior, o que é menos preciso do que aplicar sobre uma área específica de infarto; e 4) o patch é aplicado imediatamente no momento do MI (para uso humano é provável que seja mais clinicamente útil para desenvolver um patch para aplicação para o coração cronicamente infartado falhando meses após o MI14inicial ).
No entanto, se escolhido adequadamente de acordo com a hipótese que está sendo testada, este protocolo pode fornecer dados in vivo críticos rapidamente, com números n elevados, de forma coerente com os materiais, orçamento e expertise disponíveis na maioria dos laboratórios. Comparado aos grandes modelos animais, é um modelo in vivo que é versátil o suficiente para se adaptar às tecnologias emergentes de bioimpressão 3D (por exemplo, pela relativa facilidade de realizar estudos piloto para testar a viabilidade e a segurança antes de se mudar para modelos animais maiores). Seria adequado para pesquisadores que querem gerar dados in vivo de forma eficiente e barata, talvez executando múltiplas comparações de patches bioimprimidos 3D com diferentes parâmetros de bioimpressão, células ou hidrogéis nas patches. Seria especialmente útil para testar as interações de diferentes misturas de células-tronco e células-tronco derivadas de células-tronco com hidrogéis in vivo sem desperdício excessivo de linhagens celulares caras ou outros materiais que poderiam ocorrer se usar patches de grande escala. O uso de um modelo de camundongo também facilitaria o teste de patches contendo linhagens de células derivadas de camundongos e células-tronco compatíveis com espécies ou células-tronco, onde ratos uniformes com deficiência imunológica específica são desejáveis. Além disso, testes em cepas de camundongos geneticamente modificados poderiam permitir que os pesquisadores isolassem os efeitos de genes específicos em vias de sinalização e em tipos de células específicas relevantes para doenças cardiovasculares, o que atualmente não seria possível em um grande modelo animal.
O método facilita o operador a transplantar eficientemente um patch bioimpresso, aplicando-o à superfície epicárida de um coração de rato infartado após a ligadura lad permanente. Neste método focado em viabilidade, podemos realizar este procedimento em oito ratos por dia de trabalho (incluindo a preparação da sala antes e depois). Uma corrida de bioimpressão produzindo oito patches de 1 cm2 em poços de placas de seis poços leva de 2-3 horas (incluindo o tempo de preparação antes e depois). Usamos o interior estéril de um pacote de bisturi cirúrgico como colher para o nosso patch, que é facilmente acessível e geralmente adiciona um custo mínimo, utilizando as propriedades adesivas naturais do patch de hidrogel de alginato/gelatina para cobrir o patch através da superfície infartada anterior do coração. Em nossa experiência, o protocolo de ligadura LAD em camundongos é dependente de operadores e uma menor taxa de mortalidade em 28 dias pode ser alcançada com operadores experientes especializados em um modelo. Van den Borne et al.16 relataram que os camundongos C57BL6 apresentam uma mortalidade de 44% após a ligadura de LAD permanente em 28 dias sem a aplicação de um patch, que é superior ao limite superior de 30% que observamos com o método.
O passo da intubação é crítico e em si pode ser uma fonte de mortalidade para camundongos, a menos que seja realizado por um operador qualificado. Isso é dificultado devido ao tamanho minúsculo da traqueia, razão pela qual as lupas são usadas pelo operador para esta etapa. Usamos cetamina/xilazina injetada, bem como isofluorano inalado para indução de anestésico para que o rato seja profundamente anestesiado em doses relativamente baixas de cada droga. Portanto, não há risco para o camundongo acordar durante esta etapa de intubação, mas a alta mortalidade associada a altas doses de um único medicamento é evitada. A atropina também foi dada para neutralizar efeitos colaterais como bradicardia e hipersalivação. O uso de um holofote aplicado na garganta externamente ilumina a traqueia internamente para que ela seja mais visível e as cordas vocais devem ser visualizadas abrindo e fechando com a taxa respiratória do mouse (geralmente ~120 respirações por minuto). É fundamental posicionar o mouse perfeitamente (e é por isso que uma superfície dura é preferida em vez de um tapete de aquecimento sob o mouse para esta etapa) com os dois dentes incisivos segurados por um fio em loop e a língua retraída extremamente suavemente com punhestumbas/par de espátulas para abrir a boca e visualizar a traqueia. Uma vez concluída a intubação, o operador deve ter cuidado para não desalojar o tubo na transferência da área de intubação para o leito de operação (que tem um tapete de calor por baixo para evitar hipotermia). Ao conectar o tubo de respiração ao aparelho do ventilador, é fundamental estabilizar o tubo com uma mão e conectar o circuito do ventilador com a outra, de modo que haja um movimento mínimo do tubo de respiração, como empurrá-lo mais profundamente para dentro da traqueia ao conectar o segmento do ventilador da tubulação.
Neste estudo, utilizou-se alginato 4% (w/v)/gelatina 8% (w/v) no Médio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco. Os hidrogéis de alginato/gelatina são conhecidos por sua biocompatibilidade, baixo custo e propriedades biomecânicas, tornando-os úteis para estratégias de engenharia de tecidos 3D23. Estes hidrogéis podem ser cruzados por gelação leve adicionando íons de cálcio, o que permite que a viscosidade seja alterada. Após a bioimpressão, aplicamos cloreto de cálcio (CaCl2) 2% (w/v) em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) em patches e depois os cultuamos em DMEM em seis placas de poço por 7-14 dias antes de transplantá-los. Esta foi a janela ideal depois que manchas contendo células cardíacas começaram a bater na cultura, mas antes das manchas começarem a se desintegrar. Embora o CaCl2 pudesse ser adicionado regularmente durante toda a fase pós-bioimpressão para reduzir a desintegração do patch, descobrimos que a viscosidade intrínseca do hidrogel era suficiente para que as manchas mantivessem sua estrutura até o transplante com apenas uma dose inicial de CaCl2.
O método permitiu o transplante bem-sucedido sem suturas (que podem danificar o coração) ou cola (que pode bloquear a interface entre o patch e o coração). Estudos futuros podem confirmar a hipótese de que o transplante sem sutura e sem cola não afeta negativamente o enxerto em camundongos, pois é fundamental que o patch não escorregue do coração ou interfira nos pulmões. Outros estudos que avaliam o enxerto de manchas em modelos permanentes de ligadura LAD com reparo à base de remendo3 mediram área engrafada (mm2) permanecendo com o tempo24, a espessura do patch enxertado (μm) reminando com o tempo25, quantificação de transplantado células por reação em cadeia de polimerase (PCR)26 ou fluxo de emissão de fótons de bioluminescência de células doadoras vivas rotuladas (uma medida de fótons emitidos por segundo que podem quantificar células enxertadas rotuladas sobrevivendo em animais vivos ao longo do tempo)27. Estudos futuros podem usar esses métodos para avaliar se o transplante sem sutura e sem cola afeta o enxerto de patch (bem como efeitos estruturais e funcionais no miocárdio hospedeiro). No entanto, macroscopicamente após 28 dias in vivo em nossos camundongos imunocompetuntes, o mediastino anterior apresentou material fibrinous variável e aderências. O mecanismo de regeneração cardíaca baseada em patches pode ser da estimulação de respostas inflamatórias do macrófago hospedeiro19 ou fatores imunológicos secretos20 em vez de reposição celular numérica. Se a inflamação desempenha um papel positivo, a presença de material hidrogel estrangeiro pode ser benéfica. Alternativamente, para reduzir a presença de material estranho pode ser benéfico se o componente hidrogel se desintegrar ao longo do tempo. Na verdade, algumas abordagens usam biomateriais que suportam células inicialmente e depois se desintegram, restando apenas tecido28,29. Estudos futuros para analisar completamente o enxerto de patches e entender melhor os mecanismos por trás da regeneração cardíaca baseada em patches podem levar a projetos experimentais otimizados antes da tradução para testes em humanos2.
No geral, este protocolo provavelmente será amplamente viável e também adequado para testar vários grupos de patches bioimpressas 3D, por exemplo, com diferentes conteúdos celulares. As direções futuras para este método incluem a bioimpressão de patches contendo hidrogéis avançados não testados anteriormente in vivo ou testando os efeitos de diferentes células-tronco autólogas ou alusias, para otimização antes de prosseguir para grandes modelos animais.
The authors have nothing to disclose.
Com agradecimentos a Natalie Johnston pela gravação das imagens não cirúrgicas e todas as ediçãos de vídeo.
3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
Atropine suplhate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals – 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |