Summary
Questo protocollo mira a trapiantare un cerotto biostampato 3D sull'epicardio di topi infarti che modellano l'insufficienza cardiaca. Include dettagli riguardanti l'anestesia, l'apertura chirurgica del torace, la legatura permanente dell'arteria coronaria anteriore sinistra (LAD) e l'applicazione di un cerotto biostampato sull'area infartata del cuore.
Abstract
Testare le proprietà rigenerative delle patch cardiache biostampate in 3D in vivo utilizzando modelli murini di insufficienza cardiaca tramite legatura permanente della discesa anteriore sinistra (LAD) è una procedura impegnativa e ha un alto tasso di mortalità a causa della sua natura. Abbiamo sviluppato un metodo per trapiantare costantemente patch di cellule e idrogel biostampati sull'epicardio di un cuore di topo infarto per testare le loro proprietà rigenerative in modo robusto e fattibile. In primo luogo, un topo profondamente anetizzato viene accuratamente intubato e ventilato. Dopo la toracotomia laterale sinistra (apertura chirurgica del torace), il LAD esposto viene ligato permanentemente e il cerotto biostampato trapiantato sull'epicardio. Il mouse si riprende rapidamente dalla procedura dopo la chiusura del torace. I vantaggi di questo approccio robusto e rapido includono un tasso di mortalità previsto di 28 giorni fino al 30% (inferiore al 44% riportato da altri studi che utilizzano un modello simile di legatura LAD permanente nei topi). Inoltre, l'approccio descritto in questo protocollo è versatile e potrebbe essere adattato per testare le patch sovrastampate utilizzando diversi tipi di cellule o idrogel in cui è necessario un elevato numero di animali per ottenere studi di potenza ottimali. Nel complesso, presentiamo questo come un approccio vantaggioso che può cambiare i test preclinici in studi futuri per il campo della rigenerazione cardiaca e dell'ingegneria dei tessuti.
Introduction
Un trapianto di cuore è il trattamento gold standard per i pazienti con insufficienza cardiaca in fase finale, ma c'è una carenza di organi da donatore. Richiede la soppressione del sistema immunitario per prevenire il rigetto dell'innesto e il tasso di mortalità di un anno è del 15% in tuttoil mondo 1. Pertanto, c'è un incentivo di lunga data a rigenerare il miocardio in modelli animali preclinici al fine di tradurre in prove umane2,3,4,5,6,7,8,9. I recenti progressi nella biostampa 3D di cellule staminali o cellule cardiache derivate da cellule staminali hanno guadagnato l'attenzione come un approccio promettente per rigenerare il miocardio2,3,9,10,11,12.
Sono stati riportati i primi studi di sicurezza umana che applicano cerotti per rigenerare il cuore, con cellule mononucleari autologhe del midollo osseo sospese in collagene o cellule staminali embrionali di progenitore cardiaco in fibrina, trapiantatenell'epicardio 7,8,13. Tuttavia, per un metodo più preciso, scalabile, automatable e riproducibile, la biostampa 3D di patch idrogel ottimizzate da applicare alla superficie epicardiale del cuore è un approccio promettente per rigenerare il miocardio per i pazienti che altrimenti avrebbero bisogno diuntrapianto di cuore2,10,11,12.
Prima che possa avvenire la traduzione in sperimentazioni umane, sono necessari studi preclinici sugli animali. I modelli preclinici in vivo che perseguono la rigenerazione del miocardio sono stati riportati nei suini5, pecore14, ratti6 e topi4. Un modello comune di infarto miocardico (MI) nei topi utilizza la legatura permanente dell'arteria coronaria anteriore sinistra (LAD)15,16. Tra i diversi ceppi di topi utilizzati, la legatura LAD permanente nei topi C57BL6 ha un tasso di sopravvivenza accettabile e presenta in genere cambiamenti cardiaci e di ristrutturazione costanti dopo MI16. Nei modelli di roditore, sono stati descritti diversi approcci in cui il tessuto cardiaco è stato applicato al cuore alla ricerca di una rigenerazione efficace del miocardiodanneggiato 4,6,17. Mentre gli animali di grandi dimensioni rappresentano ancora un modello più clinicamente rilevante per testare le proprietà rigenerative cardiache5,14, la versatilità e la fattibilità del modello murino si presta a questa zona di studio in rapido movimento. Ciò può evitare alcune delle insidie tipiche dei grandi studi sugli animali, tra cui (ma non limitato a): 1) elevata mortalità animale (a meno che le arterie coronarie diagonali non siano legate portando a imprevedibili infarti segmentali14, o l'estremità distale del LAD sia occlusa seguita da una riperfusione invece di una ligazione permanente5); 2) problemi etici con i danni relativamente aumentati causati da grandi protocolli animali rispetto ai topi18; 3) aumento dei costi e/o problemi di fattibilità, ad esempio la relativa indisponibilità di apparecchiature animali di grandi dimensioni come gli scanner MRI14. È anche importante considerare che, data l'ampia durata e l'impegno tipici dei grandi studi sugli animali, essi hanno il potenziale per diventare obsoleti prima di essere finiti, soprattutto con i rapidi sviluppi tipici di questo campo. Ad esempio, è solo di recente che il ruolo critico svolto dalle cellule infiammatorie e dai mediatori nella regolazione della rigenerazione cardiaca èemerso 19,20. Inoltre, il ruolo critico degli studi preclinici, come i modelli di piccoli animali, è stato evidenziato da una Commissione Lancet come un passo essenziale per acquisire solide conoscenze prima di passare alle sperimentazioniumane 21.
Per facilitare i progressi nella comprensione dei meccanismi e nell'ottimizzazione delle condizioni per gli approcci di rigenerazione cardiaca basati su patch in vivo, presentiamo un nuovo approccio che descrive un metodo di "scoop and drape" per applicare un cerotto idrogel alginato/gelatina biostampato 3D alla superficie dei cuori infarti nei topi C57BL6. L'obiettivo di questo approccio è quello di fornire un modello versatile in vivo per testare le patch di biostampa 3D che sono suscettibili di essere fattibili in ampi contesti di ricerca per il campo in rapida evoluzione della rigenerazione cardiaca2. Questo metodo potrebbe essere adattato per testare le patch generate da metodi di non biostampa, diversi idrogel e cellule autologhe o derivate da cellule staminali allogeniche all'interno di patch in vivo. Tuttavia, la considerazione dettagliata della biostampa, degli idrogel o dei tipi di cellule esula dall'ambito di questo studio che si concentra sul metodo di trapianto chirurgico.
I vantaggi del protocollo includono che l'infarto miocardico e l'applicazione di un cerotto biostampato vengono eseguite in una procedura chirurgica che può essere eseguita rapidamente, con strumenti di laboratorio facilmente disponibili e convenienti e con un tasso di mortalità relativamente basso. In genere consente anche un numero maggiore di animali rispetto ai modelli animali di grandi dimensioni in uno spazio più piccolo, il che consente un confronto robusto di più gruppi sperimentali, particolarmente utile per il confronto di più gruppi in vivo. D'altra parte, questo protocollo ha gli svantaggi che: 1) il modello murino è più distante dalla dimensione del cuore umano, dall'anatomia e dalla fisiologia che nei grandi modelli animali e non si traduce direttamente in esseri umani; 2) il murino LAD si dirama proximalmente, con una significativa variabilità tra i singoli topi, che porta alla variabilità delle dimensioni infarto (un problema condiviso con grandi modelli animali); 3) il cerotto deve essere applicato su tutta la superficie del cuore anteriore, che è meno precisa rispetto all'applicazione su una specifica area infarta; e 4) la patch viene applicata immediatamente al momento della MI (per uso umano è probabile che sia più clinicamente utile sviluppare una patch per l'applicazione al cuore infarto cronicamente infarto mesi dopo il MI14 iniziale).
Tuttavia, se scelto in modo appropriato in base all'ipotesi in fase di test, questo protocollo può fornire rapidamente dati critici in vivo, con numeri n elevati, in modo coerente con i materiali, il budget e le competenze disponibili nella maggior parte dei laboratori. Rispetto ai grandi modelli animali, si tratta di un modello in vivo abbastanza versatile da adattarsi alle tecnologie emergenti di biostampa 3D (ad esempio per la relativa facilità di esecuzione di studi pilota per testare la fattibilità e la sicurezza prima di passare a modelli animali più grandi). Sarebbe adatto per i ricercatori che vogliono generare dati in vivo in modo efficiente ed economico, magari eseguendo confronti multipli di patch biostampate 3D con diversi parametri di biostampa, cellule o idrogel nelle patch. Sarebbe particolarmente utile per testare le interazioni di diverse miscele di cellule staminali e cellule derivate da cellule staminali con idrogel in vivo senza eccesso di spese di derivamenti cellulari costosi o altri materiali che potrebbero verificarsi se si utilizzano patch su larga scala. L'uso di un modello murino faciliterebbe inoltre il test di patch contenenti linee cellulari e cellule staminali compatibili con le specie o cellule derivate dall'uomo in cui sono desiderabili topi uniformi con una specifica carenza immunitaria. Inoltre, i test sui ceppi di topi geneticamente modificati potrebbero consentire ai ricercatori di isolare gli effetti di geni specifici sulle vie di segnalazione e in tipi di cellule specifiche rilevanti per le malattie cardiovascolari, che attualmente non sarebbero possibili in un grande modello animale.
Protocol
Tutte le procedure descritte in questo esperimento sono state approvate dal Comitato Etico Animale presso il Northern Sydney Local Health District, NSW, Australia (numero di progetto RESP17/55).
1. Anestesia e intubazione
NOTA: accendere e impostare lo stereomicroscopio, il termo pad (coperto con un foglio assorbente) e il sistema di ventilatore.
- Guanti puliti, l'area chirurgica e gli strumenti con 70% di etanolo.
- Pesare il topo per calcolare il dosaggio dell'anestesia iniettata dal percorso intraperitoneale (ketamina 40 mg/kg, xylazina 5 mg/kg, atropina 0,15 mg/kg) e somministrare l'iniezione.
- Una volta che il topo raggiunge un piano profondo di anestesia, rade il lato sinistro ventrale del torace con un trimmer.
- Posizionare il mouse in una camera contenente 2% isoflurane (assicurando un'adeguata ventilazione di estrazione nella stanza).
NOTA: La dose relativamente bassa di iniezione di ketamina/xylazina insieme al 2% di inalazione di isoflurane riduce il rischio di morte del topo consentendo l'intubazione ottimale senza svegliare il mouse. - Posizionare la supina del mouse e trattenerlo dai suoi denti incisivi superiori con una sutura 3.0 suturata alla panca, come mostrato nel video. Confermare la sedazione eseguendo un pizzico di dita dei piedi. Posizionare un illuminatore ad alta intensità sopra il collo del mouse in modo che l'oropharynx possa essere visualizzato.
NOTA: In alternativa, il mouse può essere posizionato sul supporto dal kit di intubazione (ad esempio, Kent Mouse Intubation Kit) con una fascia elastica fissata sotto gli incisivi superiore per tenere la bocca aperta per identificare la trachea. - Utilizzare una spatola curva per aprire la mascella e un altro paio di spatole / forcelle smussate per sollevare delicatamente la lingua fuori strada. Assicurarsi di intubare mentre posizionato a o leggermente sotto il livello degli occhi con il corpo del mouse.
- Visualizzare l'apertura e la chiusura delle corde vocali. Quando è aperto, inserire il catetere di plastica da 20 G fornito con il kit di intubazione.
- Trasferire con cura il mouse intubato su una superficie operativa dotata di un tampone riscaldante. Collegare il mouse al ventilatore (ad esempio, MouseVent) che imposta automaticamente il volume di destinazione in base allo spessore del mouse.
- Fornire 1,5-2% isoflurane con ossigeno (che viene regolato automaticamente dal ventilatore: assicurarsi che ci sia una connessione da una bombola di ossigeno al ventilatore automatico a 1-2 L/min di flusso al ventilatore). Verificare l'intubazione controllando l'aumento bilaterale del torace. Verificare l'anestesia eseguendo un pizzico di dita dei piedi.
- Applicare unguento opthalmico (ad esempio, Puralube Vet Opthalmic Oguento) su entrambi gli occhi per evitare che si asciughino.
2. Preparazione del campo chirurgico
- Fissare il tubo di intubazione con nastro adesivo nel sito di collegamento tra il ventilatore e il tubo/catetere di respirazione.
- Tagliare un pezzo di nastro più lungo e fissare il piede anteriore sinistro alla superficie di funzionamento in una posizione leggermente elevata. Anche nastro giù le altre estremità.
- Pulire il torace con soluzione sterile di isopropanolo e iodio povidone, pulendo in un movimento circolare che si sposta dal centro alla periferia.
- Verificare l'anestesia ancora una volta con un pizzico di dita dei piedi.
- Somministrare 0,08 mg/kg Temvet (buprenorfina) in 0,1 mL dello 0,9% salino con iniezione sottocutanea.
3. Toacotomia laterale sinistra
- Utilizzare le forcelle fine per sollevare delicatamente la pelle in un punto di circa 5 mm a sinistra della cartilagine xifoide prominente. Utilizzare le forbici chirurgiche per creare un'incisione superomediale nella pelle da questo punto verso l'alto e verso la linea mediana, al livello del manubrium.
- Utilizzare le force curve per separare delicatamente gli strati della pelle e del muscolo. Aprire lo strato muscolare, seguendo l'incisione cutanea.
- Identificare e fare un'incisione nel terzo spazio intercostale, seguendo l'angolo naturale della gabbia toracica.
- Utilizzare un retrattore per dispiegare delicatamente le costole 3rd e 4th.
- Rimuovere delicatamente il pericardio sottile con le pronosità.
- Se il LAD non viene visualizzato, spingere delicatamente iluricolo sinistro (vedere La Figura supplementare 1) verso l'alto e individuare le arterie coronarie sotto.
4. Legatura coronaria permanente anteriore anteriore (LAD)
- Tagliare una sutura di seta lunga 3-0 mm e mettere questo pezzo di sutura di seta 3-0 rinforzante sopra il LAD nella stessa direzione del LAD (come mostrato nel video al momento 02:12 – 02:20).
- Identificare il LAD e passare una sutura di seta 7-0 sotto il LAD. Se il LAD non è chiaramente visualizzata, inserire l'ago 1 mm inferiore e mediale al punto più inferiore raggiunto dalla punta deluricolo sinistro durante il movimento dinamico del cuore.
NOTA: Questa struttura è di colore rosso più chiaro alle camere ventricolari del cuore ma più scura del polmone adiacente ed è meglio visualizzata nel video al momento 01:54 – 01:55 dove è visibile appena inferiore al braccio superiore del retrattore, superiore al polmone sinistro (vedi Figura supplementare 1 per l'immagine del video annotato). - Completa due tiri con la sutura di seta 7-0 e chiudila saldamente passando sopra la sutura di seta 3-0 per fissare il LAD. Se la legatura ha successo, l'area ventricolare anteriore distale dalla legatura sbollenterà.
- Completare il nodo con un terzo lancio nella direzione opposta per fissarlo, assicurando che nessuna forza di trazione verso l'alto viene trasmessa alla sutura. Non sono necessari ulteriori lanci per ridurre il rischio di danni al miocardio o ALLAD mediante il taglio della sutura.
5. Trapianto della patch biostampa sull'epicardio
- Spostare con attenzione il cerotto biostampato da una piastra di sei possente all'area dell'infarto utilizzando la superficie interna sterile di un pacchetto di bisturi chirurgico aperto.
- Posizionare con attenzione il cerotto sovrastampato sulla superficie epicardiale anteriore, dove dovrebbe coprire l'intera superficie e drappeggiare sui bordi inferiori e laterali, coprendo il ventricolo sinistro e la zona infarta (zona sbiancata).
- Chiudere delicatamente e rimuovere il retrattore senza dirigere i bordi taglienti verso il cuore.
- Utilizzare 6-0 suture di prolene in un semplice modello interrotto per chiudere la gabbia toracica e gli strati muscolari.
- Con la funzione Sospiro di soffio chiudendo il torace con le suture di prolene 6-0, gonfiare i polmoni per rimuovere l'aria in eccesso nella cavità pleurale, che altrimenti sarebbe rimasta intrappolata nella cavità toracica e si tradurrebbe in uno pneumotorace.
- Assicurarsi che il torace sia saldamente sigillato.
- Diminuire l'isoflurane all'1,0%. Chiudere la pelle con 6-0 suture di prolene in un semplice modello interrotto. Spegnere il vaporizzatore isoflurane.
6. Recupero del mouse
- Applicare per caso 2 mg/mL bupivacaina nello 0,9% salina all'incisione. Amministrare anche: i) Antisedan (atipamezole) 1 mg/kg; ii) Lasix (furosemide) 8 mg/kg; iii) 600 L della soluzione salina dello 0,9% tramite iniezione sottocutanea.
NOTA: Antisedan è quello di invertire l'anestetico più rapidamente; furosemide è quello di scaricare il liquido in eccesso a causa di compromissione di uscita cardiaca e liquido aggiuntivo somministrato con iniezioni di farmaci. - Monitorare il mouse e attendere che si osservi la respirazione indipendente per rimuovere il mouse dal tubo di intubazione.
- Quando il topo dimostra un'adeguata velocità di respirazione e profondità bilaterale e risponde a un pizzico di punta, posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulita posta su un cuscinetto termico.
- Fornire al topo cibo umido (intasato per la masticabilità), una bottiglia d'acqua e gel nutritivo/idratante. Monitorare per uno sforzo respiratorio esagerato, sanguinamento eccessivo, o altre complicazioni potenzialmente pericolose per la vita.
- Per i prossimi tre giorni, somministrare 0,08 mg/kg Temvet (buprenorfina) in 0,1 mL dello 0,9% salino con iniezione sottocutanea o intraperitoneale, due volte al giorno, quindi una volta al giorno fino al quinto giorno successivo alla procedura.
- Casa topi in coppie separate da divisori gabbia per prevenire l'isolamento, pur impedendo comportamenti di combattimento. Monitorare i topi almeno ogni giorno fino alla fine degli esperimenti (28 giorni) con molta attenzione al loro benessere e una maggiore frequenza di monitoraggio in caso di preoccupazioni.
Representative Results
Al momento del trapianto, la viscosità del cerotto a temperatura ambiente (senza l'applicazione di un crosslinker aggiuntivo) gli ha permesso di "drappeggiare" sui contorni del cuore (Figura 1) e di muoversi dinamicamente con il ciclo cardiaco. Dopo l'intervento chirurgico, abbiamo lasciato le patch per 28 giorni in vivo come studi hanno trovato questo per essere un periodo di tempo adatto permettendo per gli effetti di patch sulla funzione cardiaca ospite3,4 (anche se è stato riferito che gli effetti funzionali completi non possono essere visti fino a tre mesi dopo il trapianto)22. La fotografia di un cerotto mostrato in situ su un cuore di topo nella Figura 1 è stata scattata subito dopo l'applicazione, mostrando la capacità del cerotto di drappeggiare sul cuore al trapianto. Questo risultato rappresentativo mostra che l'idrogel permette al cerotto di modellare ai contorni del cuore e dove si è verificata un'eccessiva tensione l'idrogel è stato in grado di dividere come mostrato dall'area triangolare nuda (senza idrogel) nella Figura 1 (indicata da una stella nera nell'immagine). I dati di sopravvivenza (curve di sopravvivenza Kaplan-Meier) sono mostrati nella Figura 2 rispetto ai topi sottoposti a una procedura fittizia (passaggio di un ago e sutura sotto il LAD senza legatura seguita dalla chiusura del torace del topo).
Figura 1: Un cerotto cardiaco biostampato applicato sull'epicentro di un cuore di topo C57BL6. Un cerotto biostampato di 10 mm x 10 mm x 0,4 mm (immediatamente dopo il trapianto) contenente idrogel (alginate 4% (w/v)/gelatina 8% (w/v) nei media) viene mostrato drappeggiato sopra l'area infartata e aderente alla superficie epicardiale (teste di freccia bianca e linee punteggiate - bordo della patch). La viscosità del cerotto gli permette di modellare ai contorni del cuore e dove si è verificata un'eccessiva tensione all'aspetto superiore il cerotto si è diviso per rendere un'area nuda triangolare non coperta da idrogel (stella nera). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi di sopravvivenza Kaplan-Meier attraverso 28 giorni post-MI. Nove topi del gruppo procedurale sono morti (n. 38) per dare un tasso di mortalità complessivo del 24%. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Immagine del fermo video (punto di tempo video 01:54 – 01:55) che mostra iluricolo sinistro (appendice atriale sinistra). La freccia punta alla punta inferomediale del auricolare sinistro che è visibile come una struttura triangolare sul bordo sinistro superiore del cuore. Nel caso in cui il LAD non sia chiaramente visualizzato, la punta deluricolo sinistro può essere utilizzata come punto di riferimento per l'ingresso dell'ago per passare una sutura sotto il LAD. Il punto di ingresso è inferiore di 1 mm e mediale al punto più inferiore che la punta dell'auricolare sinistro raggiunge durante i movimenti dinamici del cuore (freccia nera mostra punta inferomediale del auricolare sinistro). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
Discussion
Il metodo facilita l'operatore a trapiantare in modo efficiente un cerotto biostampato applicandolo alla superficie epicardiale di un cuore di topo infarto dopo la legatura LAD permanente. In questo metodo incentrato sulla fattibilità, siamo in grado di eseguire questa procedura su otto topi al giorno lavorativo (compresa la preparazione della stanza prima e dopo). Una corsa di biostampa che produce otto patchda 1 cm 2 in pozzetti di piastre a sei pozzi richiede 2-3 ore (compreso il tempo di preparazione prima e dopo). Abbiamo usato l'interno sterile di un pacchetto di bisturi chirurgico come scoop per il nostro cerotto, che è facilmente accessibile e generalmente aggiunge un costo minimo, utilizzando le proprietà adesivo naturali del cerotto di idrogel alginato/gelatina per drappeggiare il cerotto attraverso la superficie anteriore infartata del cuore. Secondo la nostra esperienza, il protocollo per la legatura LAD nei topi dipende dall'operatore e un tasso di mortalità inferiore a 28 giorni può essere raggiunto con operatori esperti specializzati in un unico modello. Van den Borne et al.16 ha riferito che i topi C57BL6 presentano una mortalità del 44% dopo la legatura permanente laD a 28 giorni senza l'applicazione di un cerotto, che è superiore al limite superiore del 30% che abbiamo osservato con il metodo.
La fase di intubazione è critica e in-and-of-itself può essere una fonte di mortalità per i topi a meno che non eseguita da un operatore esperto. È reso difficile a causa delle piccole dimensioni della trachea, motivo per cui gli occhiali di ingrandimento sono indossati dall'operatore per questo passaggio. Usiamo ketamina/xylazina iniettata e isofluorane inalato per l'induzione di anestetico in modo che il topo sia profondamente anestetizzato a dosi relativamente basse di ogni farmaco. Pertanto, non vi è alcun rischio per il topo di svegliarsi durante questa fase di intubazione, ma l'alta mortalità associata con alte dosi di singolo farmaco è evitato. L'atropina è stata data anche per contrastare gli effetti collaterali come la bradicardia e l'ipersalivazione. L'uso di un riflettore applicato alla gola all'esterno illumina la trachea internamente in modo che sia più visibile e le corde vocali devono essere visualizzate aprendo e chiudendo con la frequenza respiratoria del mouse (di solito 120 respiri al minuto). È fondamentale posizionare perfettamente il mouse (per questo si preferisce una superficie dura piuttosto che un tappetino riscaldante sotto il mouse per questo passaggio) con i due denti incisivi tenuti da un filo a ciclo continuo e la lingua ritrattata estremamente delicatamente con forche /coppia di spatole smussate per aprire la bocca e visualizzare la trachea. Una volta completata l'intubazione, l'operatore deve fare attenzione a non spostare il tubo nel trasferimento dalla zona di intubazione al letto di funzionamento (che ha un tappetino termico sotto di esso per prevenire l'ipotermia). Quando si collega il tubo di respirazione all'apparato di ventilatore, è fondamentale stabilizzare il tubo con una mano e collegare il circuito del ventilatore con l'altra, in modo che vi sia un movimento minimo del tubo di respirazione come spingerlo più profondamente nella trachea quando si collega il segmento di ventilatore del tubo.
In questo studio, abbiamo usato alginato 4% (w/v)/gelatina 8% (w/v) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Gli idrogel alginate/gelatina sono noti per la loro biocompatibilità, basso costo e proprietà biomeccanici che li rende utili per le strategie di ingegneria dei tessuti 3D23. Questi idrogel possono essere incrociati da gelazione lieve con l'aggiunta di ioni di calcio, che permette di viscosità da alterare. Dopo la biostampa, abbiamo applicato il cloruro di calcio (CaCl2) 2% (w/v) in salina tamponata di fosfati (PBS) su cerotti e poi li abbiamo piantati in DMEM in sei piastre di pozzo per 7-14 giorni prima di trapiantarli. Questa era la finestra ottimale dopo che le patch contenenti cellule cardiache hanno iniziato a battere in coltura, ma prima che le patch iniziavano a disintegrarsi. Mentre CaCl2 poteva essere aggiunto regolarmente durante tutta la fase post-biostampa per ridurre la disintegrazione delle patch, abbiamo scoperto che la viscosità intrinseca dell'idrogel era sufficiente per le patch per mantenere la loro struttura fino al trapianto con una sola dose iniziale di CaCl2.
Il metodo ha permesso un trapianto riuscito senza suture (che possono danneggiare il cuore) o colla (che può bloccare l'interfaccia tra il cerotto e il cuore). Studi futuri potrebbero confermare l'ipotesi che il trapianto senza sutura e senza colla non influenzia negativamente l'innesto nei topi in quanto è fondamentale che il cerotto non scivoli dal cuore o interferisca con i polmoni. Altri studi che valutano l'innesto di patch in modelli di legatura LAD permanenti con riparazione a patch3 hanno misurato l'area innestata (mm2) rimanendo con il tempo24, lo spessore del cerotto innestato (m) che ricorda con il tempo25, la quantificazione del cellule trapiantate mediante reazione a catena polimerasi (PCR)26 o flusso di emissione di fotoni di bioluminescenza di cellule donamate vive etichettate (una misura dei fotoni emessi al secondo che può quantificare le cellule innestate etichettate sopravvissute negli animali viventi neltempo) 27. Studi futuri possono utilizzare questi metodi per valutare ulteriormente se il trapianto senza sutura e senza colla influisce sull'innesto del cerotto (così come gli effetti strutturali e funzionali sul miocardio ospite). Tuttavia, macroscopicamente dopo 28 giorni in vivo nei nostri topi immunocompetent, il mediastinum anteriore ha presentato materiale fibrinoso variabile e aderenze. Il meccanismo della rigenerazione cardiaca basata su patch può essere dalla stimolazione delle risposte infiammatorie del macrofagoospite 19 o dai fattori immunologicisecreti 20 piuttosto che dal rifornimento numerico delle cellule. Se l'infiammazione svolge un ruolo positivo, la presenza di materiale idrogel estraneo può essere utile. In alternativa, per ridurre la presenza di materiale estraneo può essere utile se il componente idrogel si disintegra nel tempo. Infatti, alcuni approcci utilizzano biomateriali che supportano le cellule inizialmente e poi si disintegrano, lasciando solotessuto 28,29. Studi futuri per analizzare completamente l'innesto delle patch e comprendere meglio i meccanismi alla base della rigenerazione cardiaca basata su patch possono portare a progetti sperimentali ottimizzati prima della traduzione nelle prove umane2.
Nel complesso, questo protocollo è probabilmente ampiamente fattibile e adatto anche a testare più gruppi di patch biostampate 3D, ad esempio con diversi contenuti cellulari. Le indicazioni future per questo metodo includono la biostampa di patch contenenti idrogel avanzati non precedentemente testati in vivo o la verifica degli effetti di diverse cellule autologhe o derivate da cellule staminali allogeniche, per l'ottimizzazione prima di procedere a modelli animali di grandi dimensioni.
Disclosures
Nessuno.
RENDICONTO FINANZIARIO:
Christopher D. Roche è stato sostenuto da una borsa di studio Sir John Loewenthal 2019 (Università di Sydney), il Le Gros Legacy Fund New zeealand (PhD012019) e una borsa di studio Heart Research Australia PhD (2019-02). Carmine Gentile è stato sostenuto da un University of Sydney Kick-Start Grant, University of Sydney Chancellor's Doctoral Incentive Programme Grant, UTS Seed Funding, Catholic Archdiocese of Sydney Grant for Adult Stem Cell Research e una Sydney Medical School Foudation Cardiothoracic Surgery Research Grant.
Acknowledgments
Grazie a Natalie Johnston per la registrazione dei filmati non chirurgici e di tutti gli editing video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
| 6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
| 7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
| Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
| Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
| Atropine sulphate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
| Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
| Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
| Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
| Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
| Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
| Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
| Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals - 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
| Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
| Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
| PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
| Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
| Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
| Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
| VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
| Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |
References
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