Summary
Her beskriver vi protokoller til udførelse af levende billeddannelse og kvantitativ analyse af kemotiltrækningsreceptordynamik i zebrafisk neutrofiler
Abstract
Leukocytvejledning ved kemiske gradienter er afgørende for immunresponser. Neutrofiler er de første celler, der rekrutteres til steder med vævsskade, hvor de udfører vigtige antimikrobielle funktioner. Deres handel med disse loci er orkestreret af flere inflammatoriske kemotiltraptanter, herunder kemokiner. På molekylært niveau reguleres kemotatraktant signalering ved intracellulær handel med de tilsvarende receptorer. Det er dog stadig uklart, hvordan subcellulære ændringer i kemokinreceptorer påvirker leukocytmigrationsdynamikken på celle- og vævsniveau. Her beskriver vi en metode til levende billeddannelse og kvantitativ analyse af kemokinreceptordynamikken i neutrofiler under inflammatoriske reaktioner på vævsskade. Disse værktøjer har afsløret, at differentiel kemokinreceptorhandel med zebrafisk neutrofiler koordinerer neutrofil klyngedannelse og spredning på steder med vævsskade. Dette har konsekvenser for vores forståelse af, hvordan inflammatoriske reaktioner er selvopløste. De beskrevne værktøjer kunne bruges til at forstå neutrofile migrationsmønstre i en række fysiologiske og patologiske indstillinger, og metoden kunne udvides til andre signalreceptorer.
Introduction
Leukocytmigration er af afgørende betydning for immunresponser. Immunceller er prototypiske vandrende celler, som er bemærkelsesværdigt i stand til at krydse væv og blodkar og fornemme en række kemiske vejledningssignaler for at migrere retningsbestemt mod mikrober eller andre værtsceller af betydning. Korrekt vejledning er afhængig af anerkendelse af kemotiltrentriva, blandt hvilke kemokiner repræsenterer den mest fremtrædende kategori1. Kemokiner genkendes af meget specifikke syv-transmembranE G-proteinkoblede receptorer. Ved kemokinbinding ændrer kemokinreceptorer konformation, hvilket fører til aktivering af associerede trimere G-proteiner og deres dissociation i funktionelle signalunderenheder, der fremmer cytoskeletale ændringer og rettet migration1. Sekundært fosforyleres kemokinreceptorer, og denne modifikation fører til desensibilisering over for tiltrækningsmiddel, som kan efterfølges af hurtig resensibilisering /genanvendelse eller intracellulær nedbrydning og nedregulering fra celleoverfladen2. Disse receptordynamikker påvirker varigheden og dosis af signalering modtaget af cellerne, men hvordan de påvirker leukocytmigrationsadfærd har været vanskeligt at belyse in vivo.
Sporing af receptordynamik i levende leukocytter i traditionelle pattedyrssystemer står over for flere udfordringer. Til levende undersøgelser skal receptorfusioner med fluorescerende proteiner udtrykkes i cellerne. Dette er udfordrende i primære leukocytter, især i neutrofiler, og undersøgelser har hidtil brugt surrogatnetrofile cellelinjer til at udtrykke kemokinreceptorer 3,4. Generering af transgene musemodeller, hvor leukocytter udtrykker en fluorescerende receptor eller mutantreceptorer med informative trafficking-defekter 5,6, indebærer en betydelig investering af tid og ressourcer. Selv i disse tilfælde kan billeddannelsesopløsningen og kontrasten for billeddannelsesreceptordynamikken i det levende dyr begrænses, og undersøgelser har anvendt immunhistokemi på faste vævsafsnit5. I betragtning af disse tekniske udfordringer er vores forståelse af, hvordan kemotiltrækreceptordynamikken påvirker celleadfærd i en levende vævsindstilling, i øjeblikket begrænset.
Her giver vi en metode til at overvåge receptorhandel med zebrafisk neutrofiler. Zebrafisk er genetisk trækbare, ligesom mus, men transgenese er relativt mere ligetil ved brug af effektive transposonsystemer og direkte zygote manipulation7. Den gennemsigtige larve er ideelt tilgængelig til billeddannelse. Kemokinreceptordynamikken er blevet visualiseret i primordiale kimceller og sidelinjen primordium ved ekspression af tilsvarende fusioner med fluorescerende reportere 8,9,10. Zebrafisklarver er udstyret med modne neutrofiler, der har stærkt bevarede genetiske og cellulære egenskaber med hensyn til pattedyrs neutrofiler. Subcellulær signaldynamik såsom cytoskeletal dynamik og polaritetsregulatorer er blevet visualiseret i disse celler ved generering af tilsvarende transgene linjer 11,12,13. For nylig visualiserede og funktionelt analyserede vi kemokinreceptordynamikken i neutrofiler i løbet af inflammatoriske reaktioner på vævsskade14. Her beskriver vi genereringen af transgene reporterlinjer til kemokinsignalering i neutrofiler, forberedelse af embryoner til levende billeddannelse, et sårassay til undersøgelse af neutrofilsignalering og protokollen til erhvervelse og analyse af billeder. Vi leverer også en sideprotokol til test af kemokinreceptorresponser på kandidatligander, hvilket er nyttigt, når man forsøger at etablere ligandgenkendelsesmønstre i ukarakteriserede receptorer. Disse teknikker kan anvendes i kombination med yderligere genetiske manipulationer, såsom hæmning af endogen kemokinekspression eller generering af mutantreceptorer med ændret ligandinduceret handel, for at forhøre, hvordan specifik signaldynamik påvirker leukocytadfærd in vivo. De transgene linjer, der udtrykker fluorescerende mærkede kemokinreceptorer, kan også bruges som reportere for endogene kemokingradienter, som ellers er vanskelige at detektere ved direkte antistoffarvning. Den beskrevne metode giver mulighed for at udvide genereringen af indberettere til andre immunsignalreceptorer.
Protocol
BEMÆRK: Alle zebrafisk blev holdt i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne og UK Home Office-reglerne, UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Generation af transgene reporter zebrafisk larver til billeddannelse receptor handel med leukocytter
- Generer Tol2-baseret konstruktion til vævsspecifik ekspression af den fluorescerende mærkede receptor af interesse. For neutrofiler skal der anvendes promotorsekvenser fra lysozymC15 og myeloperoxidasegenet16. Konstruktionen kan udformes som en fusion med et enkelt fluorescerende protein (f.eks. GFP), en tandemfluorescerende timer (f.eks. en hurtigt foldende GFP og en langsommere modningstagRFP 8,14,17) eller et bicistronisk udtryk for reporter GFP og en kontrolmembranmarkør9 (se Diskussion for overvejelser ved valg af tilgang).
BEMÆRK: Denne konstruktion rekapitulerer ikke endogene niveauer af receptorekspression, men er nyttig til opnåelse af et højt niveau af receptorekspression i celletypen af interesse. Se litteraturen om lignende receptorer 3,5,6,8,9,10,14 for at afgøre placeringen af det fluorescerende mærke. - Opret en tank indeholdende voksne hanner og hunner af vildtypen efter standard opdrætspraksis18, adskilt af en barriere dagen før æggydning.
- På dagen for æggydning forberedes transgeneseblanding til mikroinjektion indeholdende 12,5 ng / μL Tol2 DNA-konstruktion og 17,5 ng / μL transposase mRNA7. Løft barrierer fra akvarier kort efter, at lysene kommer om morgenen (dette kan variere i forskellige fiskefaciliteter) og saml æg inden for 15 minutter til mRNA-injektion.
BEMÆRK: Sørg for, at DNA-opløsningen er RNase-fri for at undgå nedbrydning af transposase-mRNA'et i blandingen. En mulighed for at omgå dette er at injicere æg med separate opløsninger af Tol2-konstruktion og transposase. - Følg standardprotokollerne for transgenese og mikroinjektion af zebrafiskeæg19.
- Injicer 1 nL af opløsningen i cellen af embryoner med et celletrin.
BEMÆRK: Ekspressionsresultaterne er mere konsistente, når de injiceres inde i cellen og kasseres injektionerne, der muligvis ikke er tydeligt inde i cellen. Embryoner i et cellestadium er rettet mod på grund af variabiliteten af volumeninjektion pr. Celle ved injektion af 2-16 cellestadieembryoner. En mulighed ville være at adskille injektionerne i et celletrin fra batcher af senere injektioner, hvis disse har forskellige effektiviteter. - Kontroller de injicerede embryoner senere på dagen og fjern ubefrugtede eller døde æg for at holde koblingen sund.
- Ved 3 dage efter befrugtning (dpf) screenes larver under et fluorescerende mikroskop. Markøren vil være synlig i neutrofiler, især i det kaudale hæmatopoietiske væv (CHT), som er rig på disse celler.
BEMÆRK: Procentdelen af celler mærket varierer med forskellige konstruktioner, men normalt forventes 20-60% af neutrofiler at udtrykke konstruktionen. Lavere procentdele forudsiger normalt mere screening på voksenstadiet. Det er en god praksis også at verificere korrekt lokalisering af receptoren ved membranen med en billeddannelsesmetode med højere opløsning i en prøve af disse embryoner, før fisken dyrkes. - Dyrk positive larver efter standard opdrætspraksis20. Disse repræsenterer F0-generationen.
- Ved 3 måneders alderen skal du screene F0 fisk for grundlæggere. Kryds individuelle fisk med en ikke-transgen vildtype og screen deres afkom ved 3 dpf for receptorens udtryk ved at se under dissekeringsomfanget. Afhængigt af transgenesesuccesen, som varierer med hver konstruktion, skal du observere en procentdel af positive afkom i en delmængde af krydsene.
BEMÆRK: For god transgenese vil omkring en tredjedel til halvdelen af voksne give positive afkom. Procentdelen af afkom, der er positiv i en kobling, varierer med kopinummeret af transgener indsat og kan være mellem 10-60%. Det er nyttigt at holde styr på mendelske forhold i koblingerne for at identificere enkeltindsættelsestransgene (disse identificeres lettere i F2-koblinger ved at lede efter et forhold på 50% positive larver)20. - Voks de positive afkom, som repræsenterer F1-generationen.
- Ved 3 måneders alderen screenes F1 voksne på samme måde for at etablere stabil F2 transgen linje.
- Udfør forsøg på F2-larver efter validering af transgenets neutrofilspecifikke ekspression.
BEMÆRK: Under transgenesen kan man observere forskellige niveauer af receptorekspression, og det tilrådes at holde forskellige transgene koblinger for at opnå det mest passende ekspressionsniveau for de biologiske spørgsmål. Indledende resultater kan opnås i F0 eller F1 larver.
2. Indsamling af zebrafiskembryoner til vurdering af leukocytsårresponser
- Efter at have etableret en stabil transgen reporterlinje, skal du oprette en krydsning mellem voksne og kvindelige transgene fisk og samle æg næste morgen.
- Embryoner dyrkes ved 28,5 °C i E3-medium (eller ægvand18).
- Eventuelt inkuberer embryoner ved 24 hpf i et centrifugerør indeholdende 50 ml E3-medium suppleret med 0,003% blegemiddel i 5 minutter. Skyl derefter 3 gange i E3-medium ved at lade røret stå i et par minutter, så embryonerne kan sætte sig i bunden og derefter dekantere og udskifte mediet.
BEMÆRK: Dette giver et niveau af kontrol med larvernes infektionseksponering, hvilket kan påvirke leukocytternes opførsel under såring. - Efter blegning skal embryoner i E3-medium suppleret med 0,003% 1-phenyl-2-thiourinstof for at forhindre melaninsyntese. Methylenblåt, som ofte bruges til at forhindre svampeinfektioner, tilsættes ikke her for at minimere vævsautofluorescens.
- Lad larverne klække naturligt og brug ved 3 dpf, når neutrofiler er rigelige21.
3. Ventral fin såring af larver
- Forbered larver til såring. Brug larver ved 2,5-3,5 dpf, når der observeres rigelige neutrofiler. Overfør larver til E3-medium suppleret med 160-200 mg/l tricain MS222.
BEMÆRK: Koncentrerede opløsninger af tricain skal tilberedes og fryses i alikvoter på forhånd og optøes på dagen. - Lad larverne være i E3+tricainmediet i 15 min. for at sikre, at de bliver aetiseret. Kontroller deres svar ved forsigtigt at røre ved med en lille pensel eller lignende værktøj.
- Vælg larver med transgen receptorekspression under et fluorescerende dissekeringsomfang.
- Overfør larver til en 120 mm petriskål i E3 + tricain til såring. Ved hjælp af en steril skalpel skæres larvens ventrale fin, mens man observerer under dissekeringsomfanget (figur 1).
BEMÆRK: Ideen er at udføre en dyb nok nedskæring til at forårsage betydelig neutrofil rekruttering, men uden at skære CHT's kar. Snittet er lavet vinkelret på CHT-aksen, således at snittet næsten når CHT's kar. Dette kræver en vis øvelse og bør først udføres med tilsyn med larver, der ikke genereres til dette formål (f.eks. Overskydende larver fra et andet forsøg).
4. Forberedelse af larver til levende billeddannelse
- Agarose med lavt smeltepunkt (LMP) opløses i E3-medium ved opvarmning for at opnå en flydende 2% agaroseopløsning.
- Lad denne opløsning køle af til 60 °C.
BEMÆRK: Opbevar en kolbe eller et rør med agarose i en inkubator ved 60 °C for at undgå, at agaroseindstillingen mellem monteringen af forskellige larver holdes. - Pipette 0,5 ml af væsken LMP + E3 i en glasbundsskål til mikroskopibilleddannelse.
- Pipette en såret, anæstetiseret zebrafisklarve sammen med 0,5 ml E3 + 2x trikain i glasbundsfadet.
- Bland forsigtigt de to opløsninger for at opnå en 1% LMP/1x Tricaine agarose/E3-opløsning, så man undgår generering af bobler. Orienter embryoet sideværts og skub forsigtigt ned, så den kaudale del af fisken er så tæt som muligt på glasset.
BEMÆRK: Vævet, der skal afbildes, skal være så tæt som muligt på glasbunden, når der afbildes med et omvendt mikroskop. Indstillingen af orientering for larven skal være hurtig, så agarose ikke sætter sig, før larven er placeret. - Lad agaroseopløsningen køle af og størkne i 5-10 minutter. Test om agarose er indstillet ved forsigtigt at røre ved agarosegelen med en lille pensel eller spids.
- Når agarose er fast, tilsættes 2 ml E3 suppleret med 0,2 mg/ml tricain til billedbehandlingspladen.
5. Levende konfokal billeddannelse
BEMÆRK: Billede embryoner på et roterende disk konfokalmikroskop eller tilsvarende (figur 2). Et laserscanningsmikroskop kan også bruges, men den tidsmæssige opløsning af dynamikken vil være mere begrænsende. Forbered billeddannelsesindstillingerne, før du bringer den sårede larve, så responsen kan afbildes så hurtigt som muligt efter såring. Neutrofiler ankommer til såret inden for 5 minutter, og receptorer i de første ankommende celler kan internalisere inden for denne tidsramme. Med øvelse er det muligt at afbilde så tidligt som 15 min efter såring.
- Tænd mikroskopet: laser, kamera og computer i henhold til producentens anvisninger.
- Brug anskaffelsessoftware til at konfigurere billedbehandlingsindstillingerne. Vælg lasere til de relevante fluoroforer og omtrentlige eksponeringstider baseret på tidligere eksperimenter (anskaf GFP med 488 nm og tagRFP med 561 nm laser).
- Overfør pladen med det monterede embryo, så hurtigt som muligt efter at agarose sætter sig, på den konfokale billeddannelse spindeskive platform.
- Brug mikroskopets øjestykke til at finde fisken i fadet ved hjælp af scenens joystick.
- Fokuser på sårområdet ved hjælp af fokuseringsknappen.
BEMÆRK: For at finde interesseområdet kan det være lettere at bruge et luftmål med lav forstørrelse (10x). - Vælg det felt, der skal afbildes omkring såret. Brug et mål på 30x/40x med høj numerisk blænde for at opnå tilstrækkelig opløsning.
- Brug softwareknapperne til at justere eksponeringstiden, så den fluorescerende markør kan ses med god kontrast, men uden at mætte signalet.
BEMÆRK: Eksponeringstiden skal være så lav som muligt for at minimere fluorescerende eksponering og maksimere tidsopløsningen i tidsforløbet. Lasereffekten afhænger af laserens tilstand, men skal justeres til et niveau, der tillader lav nok eksponeringstid til dynamisk billeddannelse. - Brug softwareknapperne til at vælge lydstyrken, der skal afbildes som en z-stack
- Konfigurer en tidsforfald hver 30. s for den ønskede varighed.
BEMÆRK: For sterile ventrale finsår observeres den maksimale rekruttering med 2-3 timer. - Før du starter timelapset, skal du tage et øjebliksbillede af et lyst felt for at dokumentere synsfeltet. Hvis det er muligt, skal du erhverve lyst felt inden for time-lapse-filmen.
6. Kvantificering af receptorinternalisering i zebrafisk neutrofiler
- Optag tidsintervallet for billedoptagelse og billedets pixelstørrelse. Registrer, hvor mange minutter efter såring af billeddannelsen startede.
- Åbn billeddatasættene ved hjælp af Fiji ved at trække billedet til softwaregrænsefladen, vælg en repræsentativ ramme af interesse for hvert datasæt ved hjælp af tidsskyderen, f.eks. ved 1-1,5 time efter såring, og gem det.
- Fortsæt med MATLAB for at behandle billeddatasættet.
- Opret et nyt script, og inkluder funktioner til billedlæsning (linje 6 i script kaldet 'select_neutrophils.m' for centroiddefinition i supplerende fil 1), åbning (linje 11 i supplerende fil 1) og manuel udvælgelse af punkter på billedet (linje 12 i supplerende fil 1).
- Åbn rammen af interesse ved at køre dette script (Supplerende fil 1), identificer neutrofilerne til analyse ved visuel inspektion, klik på dem og registrer et skøn over deres centroider, både i det ventrale finsår og i CHT.
BEMÆRK: De ikke-mobiliserede neutrofiler i CHT tjener som en intern reference for neutrofiler, hvis receptorfordeling forbliver konstant. Dette muliggør normalisering af kontrastværdier af celler ved såret til en intern reference. - Fortsæt med segmentering af neutrofilerne i hver ramme ved hjælp af aktiv konturteknik22 som beskrevet i trin nedenfor.
- Opret en funktion til at inkludere de metadata, der kræves til segmentering efter aktive konturer (dvs. antal iterationer, konturforspænding, estimeret centroid osv.) 22 (jf. »sårdata.m« i supplerende sagsmappe 2).
- Opret et script, der kalder funktionen 'wound_data.m' for at indtaste de nødvendige oplysninger til segmentering af hver neutrofil (linje 28 i script kaldet 'calc_contrast.m' i supplerende fil 3).
- Medtag i scriptet kommandoer til billedlæsning (linje 32 i Supplerende fil 3).
- Tilføj genereringen af et sort billede (dvs. billede, hvor pixelværdier er nuller) med en lige størrelse til inputbilledet (linje 44 i supplerende fil 3) og definitionen af en firkant på 10 × 10 pixels omkring centroiden for hver neutrofil (linje 45 i supplerende fil 3).
- Inkluder neutrofilsegmenteringen ved hjælp af aktive konturer (linje 48-49 i supplerende fil 3) og fjernelse af små falske detekterede objekter (linje 52 i supplerende fil 3).
BEMÆRK: Den indledende segmenteringskontur er firkanten omkring centroiden, som udvikler sig ved aktiv konturteknik baseret på pixelintensiteterne, antallet af iterationer og konturens bias. Resultatet af segmentering er en binær maske, hvor alle pixels har værdi 0 bortset fra det neutrofile område, hvis pixels har værdi 1. - Inkluder multiplikationen af det segmenterede binære billede med det originale for kun at få pixelintensiteterne for neutrofilen, hvor resten af billedet ikke er et tal, så det bidrager ikke til beregninger (linjer 56-57 i supplerende fil 3).
- Tilføj beregningen af grå-niveau co-forekomst matrixen for hver neutrofil (GLCM)14,23 (linje 61 i supplerende fil 3). GLCM er en anden repræsentation af billedet, der viser relativ position af pixels med hensyn til pixelintensitet.
- Medtag beregningen af kontrasten af neutrofilen baseret på GLCM (linje 62,65 i supplerende fil 3). Kontrastmetrikken måler forskelle i intensitet mellem nabopixels. Pixels sammenlignes med pixels en vis afstand fra hinanden, som kan justeres empirisk baseret på størrelsen af lokale toppe i intensitet. Som en indikation for billederne med en pixelstørrelse på 0,389 μm, da receptoren viste vesikulær fordeling, var hver lys prik i området 5 pixels. Derfor blev intensiteter sammenlignet i pixels med en afstand på 5 pixels fra hinanden.
- Tilføj kommandoer for at gemme værdierne separat for individuelle neutrofiler i den ventrale finne (linje 68 i supplerende fil 3).
- Inkluder beregningen af den gennemsnitlige neutrofile kontrastværdi fra alle CHT-neutrofiler på samme måde som for neutrofiler ved såret (linje 72-119 i supplerende fil 3). For CHT-neutrofiler kaldes funktionen 'cht_data.m' (linje 77 i supplerende fil 4).
- Inkluder normaliseringen af kontrastværdien af individuelle neutrofiler ved såret til den gennemsnitlige kontrast af CHT-neutrofiler beregnet ovenfor i trin 6.16 (dvs. division) (linje 122 i supplerende fil 3). Dette giver en normaliseret kontrast, der afspejler, hvor 'prikket' udseendet af receptor er i individuelle responderende celler i forhold til kontrol ikke-responderende celler (figur 3 og figur 4).
- Kør scriptet (supplerende fil 3) ved at klikke på kørselssymbolet i softwaren.
- Gentag alle trin under forskellige forhold.
- Brug statistisk software (se Tabel over materialer) til at importere resultaterne for de forskellige betingelser ved at oprette en kolonnetabel, plotte resultaterne og udføre statistisk test for at kontrollere signifikansen af forskellen mellem middelværdierne.
BEMÆRK: Koderne til analysen kan også findes i GitHub på https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. Kemokinresponsassays i tidlige embryoner
BEMÆRK: Dette er et valgfrit sideeksperiment, der gør det muligt at teste receptorfordelingsændringer som reaktion på en kandidatkemokin og er uafhængig af de ovenfor beskrevne eksperimenter vedrørende neutrofil ekspression af receptorkonstruktionerne. Forskelle i ligandinduceret handel mellem receptorer er vanskelige at fastslå med denne teknik, da ligandniveauerne mætter14. Men hvis man ser ligand-internalisering af en receptor i dette system, kan dette være en indikation af, at liganden genkendes af receptoren i tilfælde, hvor ligandidentiteten er uklar. Dette er nyttigt, fordi ekspression af kemokinreceptorer i etablerede cellelinjer såsom HEK293T-celler14 kan være besværlig.
- Sæt et kryds af fisk af vild type (f.eks. AB) op, og saml æg næste morgen kort efter løft af separatorerne (som beskrevet ovenfor).
- Injicer 100 pg fluorescerende mærket receptor mRNA (f.eks. Cxcr1-FT) sammen med 100 pg mRNA til en membranmarkør (f.eks. Membran CFP). Inkluder i blandingen varierende doser af mRNA til kemokinligand.
BEMÆRK: Som en indikation gav 150 pg Cxcl8a mRNA fremtrædende internalisering af fluorescerende Cxcr1-FT (se figur 5). - Skyl embryoner med E3-medium og inkuber ved 28 ° C.
- Ved ca. 7 hpf testes ekspression af mRNA'et på et fluorescerende dissekeringsomfang og vælger embryonerne til billede.
- 0,8 % LMP-agarose på forhånd forberedes, og opbevares i glasrør i en varmeblok ved 60 °C. Brug en glaspipette til at manipulere embryonerne. Forsigtigt dechorionate embryoner ved hjælp af et par tang i hver hånd.
- Aspirat et individuelt deforkortet embryo med glaspipetten, der sikrer, at der ikke er bobler i spidsen. Slip forsigtigt embryoet i røret af agarose, så det kan synke ned i røret.
- Aspirer embryoet fra agaroserøret og opsaml noget flydende agarose undervejs. Slip forsigtigt embryoet på midten af en glasbundet billedbehandlingsskål. Drej hurtigt embryo, så dyrestangen vender mod bunden af skålen (denne side skal være tættest på målet, når du bruger et omvendt mikroskop).
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere orienteringen af embryoner, mens agarose stadig sætter sig. - Når agarose er indstillet, suppleres med 2 ml E3-medium.
BEMÆRK: Embryonerne på dette stadium er meget skrøbelige i forhold til larver, og det kræver lidt øvelse at dekriionere og montere. Det er vigtigt at aspirere og frigive så forsigtigt som muligt for at undgå embryobrud. - Gentag processen med det formål at indlæse 3-5 embryoner pr. Skål.
- Billede embryoner på et omvendt konfokalmikroskop (se Tabel over materialer). Brug et 40x / 1.3 NA oliemål for at opnå høj nok opløsning. Visualiser mCFP, sfGFP og tagRFP med henholdsvis 405, 488 og 552 nm på omfanget. Juster filtre og indstillinger for at have høj kontrast, samtidig med at du undgår mætning og minimerer lækage mellem kanalerne.
- Gentag monteringen og billeddannelsen under forskellige forhold.
Representative Results
Ventral fin såring efterfølges af hurtig neutrofil mobilisering fra CHT ind i den ventrale fin og klyngedannelse ved sårmargenen inden for 30-60 minutter (figur 1). Vi visualiserede fordelingen af to kemokinreceptorer, Cxcr1 og Cxcr2, som udtrykkes af zebrafisk neutrofiler24 og genkender Cxcl8a og Cxcl8b14 ved hjælp af konfokalmikroskopi med spindeskiven. Vi genererede to tilsvarende transgene linjer, Tg(lyz:Cxcr1-FT) og Tg(lyz:Cxcr2-FT), hvor neutrofiler udtrykker en fluorescerende timer (FT) konstruktion af receptoren, dvs. en fusion med en tandem af sfGFP og tagRFP (figur 2 og reference14). Anvendelsen af de to fluoroforer var beregnet til at muliggøre overvågning af en bred vifte af receptorskæbner og give estimater af proteinomsætningstiden ved plasmamembranen, da nyligt syntetiserede receptorer ville fluorescere i grønt og gradvist blive røde, når de bliver 8,14 år. Disse receptorer viste sig imidlertid at have hurtig konstitutiv omsætning ved neutrofilplasmamembranen, og at opholdstiden var kortere end modningstiden for tagRFP, hvor sfGFP viste membranlokalisering og tagRFP, der viste vesikulær lokalisering ved steady state (Supplerende video 1 og ref14). Derfor fokuserede vi på distributionen af sfGFP for at overvåge ligandinduceret internalisering på steder med vævsskade. Mønsteret af receptorfordeling blev kvantificeret ved hjælp af kontrastmetrikken, som rapporterer forskelle i intensitet mellem nabopixels. Begrundelsen er, at når receptorfordelingen er membranøs og glat, er kontrastværdien lav. Når receptorfordelingen er vesikulær og mere punkteret, er kontrastværdien høj (figur 3).
En alternativ metode er at kvantificere forholdet mellem receptorniveauer (sfGFP-intensitet) over niveauerne af en kontrolmembranmarkør, f.eks. membran-CFP (mCFP) (figur 3). Begge metoder kunne detektere receptorinternalisering, som indikeret af mere vesikulær receptorfordelingsmønster globalt i cellen (højere kontrastværdi) eller lavere receptorniveauer ved membranen (lavere sfGFP / mCFP-forhold). Kontrastmetrikken kunne imidlertid også detektere receptorinternalisering i neutrofile klynger ved såret, hvor membransegmentering var mindre nøjagtig og ikke anvendelig (figur 3). Ved hjælp af denne måling var vi i stand til at kvantificere synlige forskelle mellem Cxcr1 og Cxcr2-handel med neutrofiler ved sår (figur 4 og supplerende video 2). Cxcr1-FT internaliseret i celler placeret ved såret, mens Cxcr2-FT forblev membranøs i neutrofiler ved såret (figur 4A-C, Supplerende video 2 og supplerende video 3). Undertrykkelse af Cxcl8a og Cxcl8b gennem morpholino-behandling påvirkede forskelligt Cxcr1-FT-internalisering ved sår (figur 4C,D). For yderligere at validere, at Cxcr1-FT reagerer på Cxcl8a, udførte vi kemokinresponsassays i tidlige embryoner. Vi fandt ud af, at Cxcr1-FT markant internaliserede sig i embryoner, hvor Cxcl8a blev udtrykt sammen (figur 5). Alt i alt indikerer disse resultater, at de beskrevne metoder kan anvendes til at måle kemokininduceret receptorinternalisering i neutrofiler og fastslå identiteten af liganden, der formidler disse virkninger.
Figur 1: Neutrofil migration til ventrale finsår. (A) (Venstre) Tegneserie af 3 dpf larve, der viser placeringen af det kaudale hæmatopoietiske væv (CHT), venuscirkulationen (VC, blå), den ventrale fin (VF) og sårstedet. (Højre) Tegneserie, der viser sårets område (W) med neutrofiler, der mobiliseres fra CHT og klynger sig ved såret. Cht-vævets kaudale veneplexus (CVP) tegnes i blåt. (B) Lyst feltbillede (venstre) og konfokal projektion (højre), der viser det ventrale finnesår og fordelingen af neutrofiler i Tg(mpx:GFP) larver ved 2 timer efter såring. Stiplede linjer viser VF- og CHT-konturer. Skalastang = 25 μm. Tegneserie og fluorescerende billede modificeret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Levende billeddannelse af kemokinreceptorhandel med neutrofiler. A) Konstruktioner, der anvendes til neutrofilspecifik transgen ekspression af Cxcr1-FT (fluorescerende timer) og Cxcr2-FT. Konfokale fremspring af neutrofiler i hovedet på en 3 dpf transgen larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), øverst Tg(lyz:Cxcr2-FT), nederst), der viser tRFP (magenta) og sfGFP (grøn) kanaler. Skalastang = 20 μm. (B) Anatomisk skema af 3 dpf larve som i figur 1A. Under larven er ordninger, der viser sårets område (W) med neutrofiler, der mobiliseres fra CHT (øverst) eller udfører kemotaxis, når de kommer ind i den ventrale fin (nederst). Stiplet firkant angiver område afbildet i snapshots til højre. (C) Neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) larver (sfGFP er vist) ved mobilisering fra CHT (toppaneler) eller kemotaxis mod såret (bundpaneler). Pile viser de samme celler over tid. Tidspunkter på højre billede er minutter, der er gået efter billedet til venstre. Skalabjælke = 10 μm. (D) Skematisk repræsentation af eksperimentel tilgang til levende billeddannelse af handel med kemokinreceptorer. Paneler A-C modificeret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificeringseksempler på receptordynamik. Enkelte (blå) eller klyngede neutrofiler (grøn) ved sår eller ikke-mobiliserede neutrofiler i CHT (rød, orange) blev segmenteret og analyseret ved forskellige metoder til sammenligning af resultater. De samme eksempelceller, der blev vist, blev analyseret med to metoder til at relatere, hvad der ses på billedet, med det ekstraherede værdiområde. (A) Overfladen af de valgte eksempelceller blev segmenteret baseret på konturdefinition i sfGFP-kanalen. (B) Kontrast blev beregnet ud fra eksempelcellerne vist i A. (C) Membranen i de udvalgte eksempelceller blev segmenteret baseret på konturdefinition i den fælles fiskeripolitikkanal. Ratiometrisk analyse af sfGFP/den fælles fiskeripolitik fulgte. (D) Forholdet mellem sfGFP/CFP blev beregnet på de eksempelceller, der er vist i C. Fejlbjælker repræsenterer S.E.M. fra individuelle celler, i tilfælde af n>1 blev værdier her ikke brugt til statistisk analyse, men blot til at eksemplificere målinger opnået med de forskellige kvantificeringsmetoder. Skalabjælke = 10 μm. Figur ændret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Differentiel dynamik i Cxcr1 og Cxcr2 som reaktion på såring. (A) Konfokal projektion af neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) eller Tg(lyz:Cxcr2-FT) larver ved såret ved 80 min efter såring (sfGFP kanal vist). Skalabjælke = 10 μm. (B) Forstørret Cxcr1-FT neutrofil (venstre) og Cxcr2-FT (højre) ved såret. Grøn receptor er vist i gråt. Skalabjælke = 5 μm. (C) Normaliseret kontrast (kontrast pr. Individuel neutrofil normaliseret til den gennemsnitlige kontrast af ikke-mobiliserede celler i CHT). cxcl8a refererer til injektion af en splejsningsblokering sammen med en translationsblokerende morpholino for cxcl8a. cxcl8b refererer til injektion med en splejsningsblokerende morpholino til cxcl8b. For Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 celler (CHT), n=47 celler (sår) fra 8 larver. For Tg(lyz:Cxcr1-FT) med morpholinos: n=28 celler (Cxcl8a-MO) fra 5 larver, n=16 celler (Cxcl8b-MO) fra 5 larver. For Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 celler (CHT) og n=20 celler (sår) fra 3 larver. Data blev samlet fra uafhængige larver erhvervet i 1-5 billeddannelsessessioner. Kruskal-Wallis test med Dunns multiple sammenligningstest for Tg(lyz:Cxcr1-FT), to-halet uparret Mann-Whitney test for Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Konfokal projektion af neutrofiler i transgene larver af Tg(lyz:Cxcr1-FT) behandlet med cxcl8a morpholino (MO) (venstre) og cxcl8b MO (højre), der reagerer på finnesår (sfGFP-kanal vist med grønt). Snapshot taget på tidspunkter af ækvivalent neutrofilakkumulering (85 min eftersåring i venstre billede og 45 min efter såring i højre billede). Skalabjælke = 10 μm. Figur ændret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kemokinresponsassay i tidlige embryoner. Laserscanning konfokale skiver af gastrulerende embryoner, der viser ekspression og fordeling af Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA blev injiceret i et celletrin æg med eller uden 150 pg Cxcl8a mRNA. Grønne og røde receptorer vises i separate kanaler. Kontrolmembran CFP-markør (mCFP) vises i cyankanalen. Skalabjælke = 20 μm. Figur ændret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende film 1: Transgene neutrofiler i hovedet på en Tg(lyz:Cxcr1-FT) (venstre) og Tg(lyz:Cxcr2-FT) (højre) larve ved 3 dpf. sfGFP (grøn), tagRFP (magenta). Billedintervallet er 30 sek., og billedhastigheden er 5 fps. Skalabjælke = 20 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at downloade denne video.
Supplerende film 2: Neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) (venstre) og Tg(lyz:Cxcr2-FT) (højre) transgene larver, der reagerer på finnesår. Filmen starter inden for 10 min efter såring og varer 60 min. sfGFP (grøn), tagRFP (magenta). Billedintervallet er 30 sek., og billedhastigheden er 10 fps. CHT = kaudalt hæmatopoietisk væv. VF = ventral fin. Skalastang = 25 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at downloade denne video.
Supplerende film 3. Yderligere eksempler på neutrofiler fra en såret Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgen larve (forskellig larve end den, der er vist i video 2), erhvervet ved højere opløsning, der viser receptorinternalisering (sfGFP-kanal vist med grønt) ved mobilisering i CHT eller ved indrejse og kemotaxis i den ventrale fin. Billedintervallet er 30 sek., og billedhastigheden er 2 fps. Skalabjælke = 10 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik her for at downloade denne video.
Supplerende fil 1: Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Den beskrevne metode tillader levende billeddannelse af receptordynamik som reaktion på endogene ligander in situ under et inflammatorisk respons på vævsskade. Brugen af Cxcr1/Cxcr2 neutrofile indberettere kan udvides til andre fysiologiske indstillinger, såsom infektion, tumormodeller eller andre former for vævsskade 14,25,26,27. Derudover kan transgene redningslinjer, hvor den endogene receptor undertrykkes og reddes af en eksogen mutantreceptor, give nyttige værktøjer til at dissekere betydningen af specifikke neutrofile migrationsmønstre i immunresponser. For eksempel forårsager Cxcr1-receptormutanter, der har nedsat desensitisering, mere fremtrædende neutrofil klyngedannelse på inflammatoriske steder14. Denne gevinst af funktion fænotype kan bruges til at forstå neutrofilmenighedens rolle i forskellige fysiologiske processer, f.eks. sårreparation, infektionssygdom eller tumorudvikling og komplementere receptor knockdown / knockout-eksperimenter. Metoden giver også grundlag for at udvide rækken af tilgængelige indberettere. Valget af fluorescerende reporter er vigtigt at overveje og afhænger af det biologiske spørgsmål. Vi fandt ud af, at den konstitutive omsætning af disse kemokinreceptorer i neutrofiler var høj sammenlignet med epitelceller, og at journalister med hurtig modning (f.eks. sfGFP) var forpligtet til at rapportere membranniveauer i stabil tilstand og løse forskelle ved neutrofilstimulering 8,14. Således er membranforholdet mellem sfGFP / tagRFP ikke anvendeligt til måling af ligandinduceret internalisering i denne celletype, men mønsteret af tagRFP tillader sporing af receptorens intracellulære skæbner, hvilket kan være nyttigt i nogle undersøgelser. Vi fandt også, at det mere koncentrerede intracellulære signal fra tagRFP er nyttigt til screening af individuelle larver. En alternativ metode til måling af receptorniveauer ved plasmamembranen ville være at co-udtrykke en fluorescerende membranmarkør i neutrofiler enten i det samme transgen9 eller i et uafhængigt transgen14. I førstnævnte scenarie ville transgenet udgøre et yderligere middel til screening af fiskene, og ekspressionsniveauerne ville være sammenlignelige mellem markøren og receptoren. Sidstnævnte tilgang ville være mere modulær, idet en zebrafiskelinje med en receptorreporter kunne kombineres med forskellige reporterlinjer. I begge tilfælde er det værd at bemærke, at membrankvantificering af receptorniveauerne er udfordrende i klyngede neutrofiler (se nedenfor). Endelig bemærker vi, at en mulig udvidelse af denne protokol ville være at følge op på den levende billeddannelse ved hjælp af immunhistokemi for mere detaljerede lokaliseringsanalyser.
Tol2-transgenesesystemet er veletableret7, og lysozym C-promotoren er blevet anvendt i vid udstrækning til neutrofilekspression11,15. Transgenesetilgangen er derfor relativt ligetil, og ekspressionsniveauet opnået med denne promotor er højt nok til at give tilstrækkelig kontrast til analyse af receptordynamik. En mulig begrænsning er, at ekspressionsniveauet ikke rekapitulerer endogene receptorekspressionsniveauer. Nye CRISPR-teknologier kan anvendes til at etablere knock-in-linjer for receptorer af særlig interesse28. Disse teknologier er stadig besværlige og garanterer muligvis ikke de krævede ekspressionsniveauer for subcellulær billeddannelse, men deres vellykkede udvikling ville være et vigtigt gennembrud for forståelsen af endogen signaldynamik. Funktionelle valideringer er vigtige for fortolkning af data med transgene receptorkonstruktioner. For eksempel kan ligandgenkendelsesassays bruges til at fastslå, at det fluorescerende fusionsprotein er funktionelt, og redning af knockout-fænotyper kan bruges til at fastslå, at de transgene neutrofile ekspressionsniveauer er kompatible med funktionalitet14. Endelig ville en mere direkte måde at validere receptorfusionen på være at anvende et in vitro-funktionelt assay med mærket receptor sammen med ikke-mærkede versioner14.
Kvantificeringsmetoden adresserer specifikke vanskeligheder med nøjagtig membransegmentering i neutrofiler in vivo. I celler af epitelmæssig karakter kan kvantificering af receptorniveauer udføres automatisk ved at normalisere membranreceptorniveauer til en kontrolmarkør, som kan udtrykkes i tandem eller separat9. Faktisk har vi anvendt en sådan tilgang, når vi bruger ligandgenkendelsesassayet i gastrulerende embryoner14. Imidlertid gennemgår neutrofiler komplekse, hurtige ændringer i celleform in vivo, hvilket gør membransegmenteringen vanskelig både i 2D og 3D14. Dette er endnu mere udfordrende, når neutrofiler klynger sig, hvilket forekommer i mange fysiologiske omgivelser29. Kontrastmetrikken overvinder denne begrænsning, da den ikke kræver membransegmentering, men i stedet afspejler den overordnede tilstand af receptorfordeling i cellen (membranøs / glat vs vesikulær / prikket). Det er vigtigt at bemærke, at kontrastmetrik kan påvirkes af billedets overordnede kontrast, så normalisering af individuelle celleværdier til en intern reference er nødvendig for at tage højde for signalets variabilitet i forskellige embryoner / prøver. For eksempel brugte vi den gennemsnitlige cellekontrastværdi af ikke-responsive neutrofiler i CHT (dvs. neutrofiler, der forbliver stationære og ikke migrerer ind i den ventrale fin)14. En yderligere mulighed ville være at normalisere med kontrastværdier af en kontrolmarkør i samme celle. Dette ville give en løsning, når en intern reference af ikke-responderende celler ikke er tilgængelig og kan sandsynligvis løse finere kvantitative forskelle i receptordynamik mellem forskellige forhold.
Placeringen af billeddannelse er en anden variabel at overveje. Årsagen til at vælge det ventrale finnesår her, i modsætning til den mere almindeligt anvendte halefinnesårmodel16,30, er fordi sårstedet ligger i nærheden af stedet for neutrofil bopæl / migrerende oprindelse. Dette fremskynder tidslinjen for analysen, da det tager relativt lidt tid for neutrofiler at ankomme. Derudover giver det mulighed for at fange celleadfærd både ved migrationsoprindelsen (CHT) og målplaceringen af interesse (såret). Dette er relevant her, fordi den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves til subcellulær billeddannelse, er vanskelig at kombinere med et stort synsfelt eller scanning med flere positioner. Således tillader det ventrale finsårassay sporing af udviklingen af det migrerende respons fra migrationsoprindelsen og samtidig indfangning af uspecifikke receptorudsving i celler, der ikke reagerer. Som nævnt ovenfor er sidstnævnte nyttig til kvantificeringsformål, da den giver en intern reference for uspecifik dynamik. I andre systemer er det muligvis ikke muligt at have en sådan intern reference, i hvilket tilfælde kontrastværdierne for en co-udtrykt membranmarkør ville give en alternativ kontrol.
Sammenfattende forventer vi, at metoden kan anvendes på andre systemer og kan implementeres til en række forskellige formål. For eksempel kan de samme journalister bruges i andre inflammatoriske indstillinger, såsom infektionsindstillinger eller andre sygdomsmodeller. Repertoiret af zebrafiskreceptor reporterlinjer kunne udvides til andre signalreceptorer for at forstå signalmekanismer eller rapportere liganddynamik in vivo. Tilgangen kan kombineres med knockdown/knockout teknikker til at forhøre det mekanistiske grundlag for observeret dynamik. For eksempel kan forstyrrelse af ligandekspression indikere ligandafhængigheden for observeret receptordynamik. I fremtiden forestiller vi os, at systemet kan forbedres yderligere for at indarbejde indsættelse af journalister. I sidste ende vil resultater, der bruger denne metode, give ny indsigt, der er værdifuld ud over zebrafiskesamfundet, i betragtning af bevarelsen af disse signalreceptorer hos pattedyr og den relative udfordring ved at gennemføre disse undersøgelser i større organismer.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt
Acknowledgments
Vi takker Christine Holt og Bill Harris for hjælp med konfokalmikroskopi. Vi takker Darren Gilmour for de fluorescerende timer-rygradskonstruktioner og Anna Huttenlocher for Tol2-Lyz-rygradsvektoren. Vi takker Steve Renshaw for Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Dette arbejde blev støttet af MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] og et Isaac Newton Trust-tilskud 19.23(n). C.C. blev støttet af et MRC DTP-studieopmål og delvist af Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] tilskud. H.W. blev støttet af et MRC DTP Studentship. H.P. blev støttet af et Wellcome Trust ph.d.-stipendium (105391/Z/14/Z) og dels af en Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] tilskud og MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A.
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
