Summary
Vi præsenterer en high-throughput, in vitro metode til kvantificering regionale lungeaflejring på lobe niveau ved hjælp af CT-scanning-afledte, 3D trykte lunge modeller med tunable luftstrøm profiler.
Abstract
Udviklingen af målrettede behandlingsformer for lungesygdomme er begrænset af tilgængeligheden af prækliniske testmetoder med evnen til at forudsige regional aerosollevering. Ved at udnytte 3D-udskrivning til at generere patientspecifikke lungemodeller skitserer vi designet af en høj gennemløbshastighed, in vitro eksperimentel opsætning til kvantificering af lobulær lungeaflejring. Dette system er lavet med en kombination af kommercielt tilgængelige og 3D-trykte komponenter og gør det muligt at styre strømningshastigheden gennem hver lap af lungen uafhængigt. Levering af fluorescerende aerosoler til hver lap måles ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Denne protokol har potentiale til at fremme væksten af personlig medicin til luftvejssygdomme gennem sin evne til at modellere en bred vifte af patientdemografi og sygdomstilstande. Både geometrien i den 3D-printede lungemodel og indstillingen for luftstrømsprofilen kan let moduleres for at afspejle kliniske data for patienter med forskellig alder, race og køn. Klinisk relevante lægemiddelleveringsenheder, såsom det endotrachealrør, der vises her, kan indarbejdes i testopsætningen for mere præcist at forudsige en enheds evne til at målrette terapeutisk levering til en syg region i lungerne. Alsidigheden i denne eksperimentelle opsætning gør det muligt at tilpasse den til at afspejle et væld af indåndingsforhold, hvilket forbedrer strengheden af præklinisk terapeutisk testning.
Introduction
Mange lungesygdomme som lungekræft og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) udviser regionale forskelle i sygdomskarakteristika; der er dog mangel på terapeutiske teknikker til rådighed til at målrette lægemiddellevering til kun syge regioner i lungerne1. Flere CFD-modeller (Computational Fluid Dynamic) har vist , at det er muligt at modulere narkotikadepositionsprofiler ved at identificere specifikke strømlinjer i lungerne2,3. Udvikling af både inhalatorer og endotracheal (ET) røradaptere med regionale målretningskapaciteter er i gang i vores laboratorium for at kontrollere aerosolfordeling til syge lungeregioner. Udvidelsen af disse principper til klinisk brug er begrænset af den nuværende prækliniske testkapacitet. Den nøjagtige placering et lægemiddel indskud i lungerne er kendt for at være den bedste prædiktor for effekt; de nuværende lægemiddelvurderinger af inhalerbar behandling forudsiges dog oftest ved hjælp af in vitro-in vivo-korrelationer af partikelstørrelse til blot omtrentlig deposition4. Denne teknik giver ikke mulighed for nogen rumlig analyse for at bestemme virkningerne af forskellige luftvejsgeometrier på den regionale fordeling gennem de forskellige lapper i lungerne. Derudover mangler denne test anatomisk nøjagtige lungegeometrier, som forskere har vist kan have en betydelig indvirkning på depositionsprofiler5. Der er gjort en vis indsats for at indarbejde patientspecifikke lungegeometrier i testprotokollerne gennem tilsætning af de øvre luftveje; men de fleste af disse metoder prøve aerosol levering til forskellige generationer af lungerne i stedet for hver lunge lap6,7,8. Følgende protokol præsenterer en høj gennemløbsmetode til generering af patientspecifikke lungemodeller med kapacitet til at kvantificere relativ partikelaflejring i hver af de fem lapper i lungerne9.
Anatomisk nøjagtige model lunger er genereret af 3D-udskrivning patient computertomografi (CT) scanninger. Når det bruges sammen med en let samlet flow system, den relative strømningshastigheder gennem hver af modellen lunges lapper kan uafhængigt kontrolleres og skræddersyet til at efterligne dem af forskellige patient demografi og / eller sygdomstilstande. Med denne metode kan forskere teste effekten af potentielle terapeutiske metoder i en relevant lungegeometri og korrelere hver metodes ydeevne med udviklingen af syge morfologi. Her testes to enhedsdesign udviklet i vores laboratorium for deres evne til at øge depositionen i en ønsket lungelap ved at kontrollere placeringen af aerosoludslip i munden eller luftrøret. Denne protokol har også potentiale til at påvirke udviklingen af personlige procedurer for patienter betydeligt ved at lette den hurtige forudsigelse af behandlingseffektiviteten i en model lunge, der er specifik for den pågældende patients CT-scanningsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af 3D-printede forsøgskomponenter
BEMÆRK: Al software, der bruges i protokollen, er angivet i materialeoversigten. Derudover er den anvendte udskæringssoftware specifik for den 3D-printer, der er anført i materialeoversigten; Denne protokol kan dog udvides til en lang række SLA-3D-printere (Stereolithography).
- Konverter patient-CT-scanninger til 3D-objekter (.stl-filer).
BEMÆRK: For en mere detaljeret diskussion af de geometriske træk ved den specifikke lungemodel, der anvendes i disse undersøgelser, henvises til Feng et al.5.- Gengiv CT-scanninger til et 3D-objekt ved hjælp af CT-scanningssoftware (se Materialetabel). Åbn CT-scanningen, og opret en maske på luftrummet ved hjælp af tærskelværktøjet med en indstilling i intervallet -800 til -1000. Brug værktøjet 3D Preview til at få vist 3D-gengivelsen, og eksporter objektet(File | Eksporter) som en .stl-fil.
- Import af filerne til mesh-redigeringssoftware (se Materialeoversigt), fjern eventuelle takkede funktioner ved hjælp af markeringsværktøjet (Sculpt | Pensler: "Krymp/glat" | Egenskaber: Styrke (50), Størrelse (10), Dybde(0)). Glat overfladen(Ctrl+A | Deformer | Jævn | Udjævning (0,2), udjævningsskala (1)).
- Udvid væggen for disse objekter med 2 mm (Ctrl+A | Rediger | Forskydning), og lad det indre objekt forblive hult, så kun væggen forbliver. Skær objektet ud (Marker | Rediger | Plane Cut) ved luftrøret for at danne et indløb og i generationer 2 eller 3, hvor objektet forgrener sig til hver lap for at skabe afsætningsmuligheder (Figur 1A).
BEMÆRK: Tykkelsen på 2 mm blev valgt på grundlag af de acceptable funktionsstørrelser, der er angivet af producenten af den 3D-printer, der er angivet i materialeoversigten. Denne tykkelse kan justeres ud fra specifikationerne for den tilgængelige 3D-printer, hvis modellens indvendige geometri opretholdes.
- Patientens lungemodels udløbsgeometrier ændres, så de er kompatible med tidligere designede lobe outlet cap-komponenter (figur 1B,C), der er anført i materialetabellen.
- Importér 3D-objektet, som replikerer CT-scanningen på indersiden, har en vægtykkelse på 2 mm og er åben ved indløbet og stikkontakterne i 3D-modelleringssoftware (se Materialetabel) som en solid krop (Åben | | mesh-filer Indstillinger | Massiv krop).
- Opret et plan baseret på et ansigt på hver af de forretninger(Indsæt | Referencegeometri | Plan). Brug splejsningsværktøjet til at spore stikkontaktens indvendige væg og ydervæg i en skitse på flyet (Skitse | Sløjfe).
- Loft en cylinder (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) for at oprette forbindelse til modellens indre og ydre væg og dermed udvide stikkontakten til at være ensartet ved hver lap (Funktioner | Ophøjet Boss / Base). Tilføj et hak rundt om kanten af stikkontakten for at matche med hætten (Funktioner | Ekstruderet skåret | Forskydning).
BEMÆRK: Hætten (Figur 1D) er en hul cylinder, der matcher udtagenes dimensioner og har en hylde, der forbinder med hak i modeludgangen. Den ene ende af hætten er blokeret således, at ID'et er mindre end resten af delen, dette sikrer en tæt pasform omkring pigtrådsrørforbindelsen (Figur 1E). Den piggede slangeforbindelse er en barbed kegleform, således at barbing passer gennem åbningen af hætten, men resten af delen gør det ikke, så slangeforbindelsen passer sikkert i hætten. Således passer hætten tæt omkring både pigtrådsrørsforbindelsen og lungemodellen(Figur 1F,G). - Ændre indløbet i lungemodellen afhængigt af de ønskede eksperimentelle tilstande. Halsen og glottal regioner kan indgå for at efterligne en patient, der kan trække vejret på egen hånd (Figur 1B). Områder over luftrøret kan fjernes ved hjælp af et ekstruderet snit for at efterligne en intuberet patient på respiratorstøtte (Funktioner | Ekstruderet snit) (figur 1C).
- Orientere og understøtte eksperimentelle komponenter i udskæringssoftware leveret af 3D-printerproducenten.
- Importer 3D-delfiler til 3D-printerudleveringssoftware, og vælg den relevante harpiks. Brug en hård harpiks til at udskrive lunge modeller og pigtråd slanger forbindelser, og en blød harpiks til at udskrive hætter.
BEMÆRK: Den harpiks, der bruges til udskrivning af hætterne, skal have elastiske egenskaber, så den kan strække sig over lobeudgangen og skabe en lufttæt forsegling. - Indstil delretningen på en sådan måde, at alle "øer" og uopfindede mængder minimeres. Den bedste orientering for lungemodellerne er med lobeudtagene vendt væk fra printplatformen. Sørg for, at både pigtrådsrørforbindelserne og hætterne har de bredere dele, der vender mod printplatformen.
BEMÆRK: Individuelle skiver kan ses for at kontrollere udseendet af "øer", dele af den del, der først vises i et udsnit uden at være forbundet til hoveddelen af delen. Gennemgangsfunktionen kan bruges til at kontrollere, om der er udsnit med uopfindede diskenheder, områder, hvor uhærdet harpiks kan blive fanget inde i delen under udskrivning. Både "øer" og uopfindede mængder reducerer udskriftskvaliteten og kan føre til udskrivningsfejl. - Når du ser hver skive individuelt, skal du tilføje understøtninger til eventuelle resterende "øer" i delen såvel som eventuelle områder med betydelige udhæng. Eksporter og få vist udsnittene til udskriften for at kontrollere, at alle områder understøttes korrekt.
- Importer 3D-delfiler til 3D-printerudleveringssoftware, og vælg den relevante harpiks. Brug en hård harpiks til at udskrive lunge modeller og pigtråd slanger forbindelser, og en blød harpiks til at udskrive hætter.
- Udskriv eksperimentelle komponenter og komplet efterbehandling i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Alle nedenstående efterbehandlingstrin er specifikke for den 3D-printer, der er angivet i materialeoversigten. Når du bruger alternative printere eller materialer, skal du justere disse trin, så de afspejler producentens anvisninger.- For dele, der er trykt i blød harpiks, skal du vaske med ≥99% renhed isopropylalkohol (IPA) for at fjerne overskydende uhærdet harpiks og termisk hærdning i en konvektionsovn i 8 timer i henhold til producentens specifikationer.
BEMÆRK: Dele, der er trykt i blød harpiks, kan være meget sarte umiddelbart efter udskrivningen, så der skal udvises særlig forsigtighed under rengøringstrinnene. Eksponering for IPA bør holdes under materialets grænse for eksponering af opløsningsmidler for at forhindre delforringelse. - For dele, der er trykt i hård harpiks, skal du vaske med IPA for at fjerne overskydende uhærdet harpiks og hærde i en UV-ovn (365 nm lys ved 5-10 mW/cm2) i 1 min pr. Side.
BEMÆRK: For at vurdere nøjagtigheden af den 3D-printede replika anbefales det at bruge μCT-scanning af den trykte del og CT-scanningssoftwaren til kvantitativt at sammenligne variationer mellem den oprindelige 3D-gengivelse og den 3D-printede replika.
- For dele, der er trykt i blød harpiks, skal du vaske med ≥99% renhed isopropylalkohol (IPA) for at fjerne overskydende uhærdet harpiks og termisk hærdning i en konvektionsovn i 8 timer i henhold til producentens specifikationer.
2. Samling af slangesystem til styring af strømningshastigheden
- Skru 1/4" pigtrådsrørsbeslag ind i siden af manifolden med 6 porte (figur 2A-6) og et 3/8" pigtrådsrør, der passer ind i den resterende port.
- Skær 1/4" slange til de ønskede længder og sæt den i hver ende af push-to-connect-ventilerne(Figur 2A-5). Fastgør hver ventil til en af de 1/4"-beslag, der er indsat i manifolden.
- Tilslut en flowmåler (Figur 2A-4) til den anden ende af hver ventil.
- Placer slangesystemet oven på træbrættet, så manifoldens enkelt 3/8" montering strækker sig ud over brættets kant. For at sikre på plads, tilsæt to skruer til siden af træbrættet og fastgør manifolden til skruerne ved hjælp af tråd.
- Tilsæt fire skruer placeret omkring hver af ventilerne og flowmålerne og brug ledning til at fastgøre hver af dem til træbrættet (Figur 2E).
- Med ca. 6" 3/8" ID-slange skal manifolden forbindes med et in-line 0,1 μm porestørrelse vakuumkvalitetsfilter. Tilslut den anden ende af filteret til flowcontrolleren ved hjælp af en anden 6" 3/8" ID-slange
BEMÆRK: Slangesystemet skal kun samles én gang.
3. Samling af lap stikkontakt hætter med patientens lunge model
BEMÆRK: Denne del af protokollen skal være afsluttet inden hver forsøgskørsel.
- Sæt pigtrådsslangeforbindelsen ind i hætten med dyse, der stikker gennem åbningen i hættebunden. Først indsættes den ene ende af den ovale pigtrådsrørsforbindelsesbase i hætten. Derefter skal du forsigtigt strække den fleksible hætte over den anden ende af den ovale base og være særlig omhyggelig med ikke at knække den tynde base.
BEMÆRK: Nytrykte hætter kan være stivere end ønsket og kan strækkes ud ved at løbe to fingre langs hætten interiør. - Der skæres 10 μm filterpapir, så det er lidt større end udløbsområdet. Fold filtrerpapiret over lobeudgangen, og hold det på plads med den ene hånd.
- Med den anden hånd skal du bruge pincet til at strække hætten med pigtrådsrørforbindelse over stikkontakten. Tryk hætten ned, indtil hættens hak passer sammen med det tilsvarende hak på lobeudgangen (Figur 2C).
BEMÆRK: Hvis du kopierer filterpapiret i dette trin, kan det gøre resultaterne ugyldige, så der skal udvises særlig forsigtighed for at undgå overdreven kraft, når hætten trykkes på stikkontakten. - Gentag dette for alle resterende lobeudtag(Figur 2D).
4. Generering af klinisk relevant luftstrømsprofil
BEMÆRK: Denne del af protokollen skal være afsluttet inden hver forsøgskørsel.
- Tilslut hver lungemodel lap stikkontakt til slangen af den tilsvarende flow meter og ventil, idet man sørger for ikke at anvende for meget lateralt tryk på pigtrådsrørsforbindelsen. Fastgør den elektroniske flowmåler til lungemodellens mundindløb for at måle den samlede luftstrømshastighed til lungemodellen.
- Tænd for flowstyringen (Figur 2A-7) og vakuumpumpen (Figur 2A-8). Vælg indstillingen "testopsætning" på flowcontrolleren, og øg langsomt strømningshastigheden, indtil den elektroniske flowmåler viser den ønskede samlede strømningshastighed.
- Brug ventilerne (Figur 2E-5), juster strømningshastigheden gennem hver af de fem lungeflipper: Højre øvre (RU), højre midte (RM), højre nedre (RL), venstre overdel (LU) og venstre nedre (LL). Når de lobeflowhastigheder, der vises på flowmålerne (Figur 2E-4), er stabile ved den ønskede værdi, skal du kontrollere den samlede strømningshastighed igen på den elektroniske strømningsmåler for at kontrollere, at der ikke er lækager i systemet.
- Hvis der er en uoverensstemmelse i den samlede strømningshastighed, skal du sænke strømningshastigheden med strømningsregulatoren, indstille alle ventiler til den helt åbne konfiguration og gentage trin 4.2 og 4.3.
BEMÆRK: Resultaterne præsenteret her blev opnået ved hjælp af luftstrømsprofiler baseret på data rapporteret af Sul et al.10 Disse lobar flow-fraktioner blev beregnet ved hjælp af tynde skiver computertomografibilleder af patient lunger ved fuld inspiration og udløb, der sammenligner de relative ændringer i mængden af hver lungeflipp. Resultaterne præsenteres for to forskellige strømningsforhold, begge ved en samlet indløbshastighed på 1 L/min. Den sunde lunge lap udløbsprofil fordeles til hver stikkontakt med følgende procentdel af indløbsflowet: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. COPD lobe-udløbsprofilen fordeles mellem hver stikkontakt med følgende procentdel af indløbsflowet: LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%9,10.
- Hvis der er en uoverensstemmelse i den samlede strømningshastighed, skal du sænke strømningshastigheden med strømningsregulatoren, indstille alle ventiler til den helt åbne konfiguration og gentage trin 4.2 og 4.3.
- Afslut flowstyringens "testopsætningsfunktion", men lad vakuumpumpen være tændt.
BEMÆRK: Hvis vakuumpumpen slukkes mellem indstilling af strømningshastigheder og udførelse af depositionseksperimentet, kan det føre til unøjagtigheder i den genererede flowprofil. Det anbefales at lade vakuumpumpen være tændt, når de ønskede strømningshastigheder er indstillet til at fuldføre aerosolaflejringstesten.
5. Levering af aerosol til lungemodellen
BEMÆRK: Der skal udføres forsøg i en røghætte med rammen lukket for at minimere eksponeringen for aerosoler, der genereres af forstøveren.
- Fyld forstøveren med opløsning af ønskede fluorescerende partikler (Figur 2A-1) og tilslut til lungemodelindløbet (Figur 2B).
BEMÆRK: De her præsenterede resultater blev opnået ved hjælp af 30 mL af en 1:100 fortynding af 1 μm fluorescerende polystyrenpartikler i methanol.- For at validere den eksperimentelle opsætning skal du forbinde forstøveren direkte til lungemodelindløbet uden nogen målretningsenhed.
- For at måle effekten af en målretningsanordning skal du tilslutte forstøveren til enheden og indsætte enheden i lungemodellen.
- Tilslut trykluftledningen til forstøveren, og luk røghættens skærf så meget som muligt.
- Indstil flowcontrolleren til at køre i en prøveversion på 10 s. Før du trykker på start, skal du åbne trykluftventilen lidt for at begynde at generere en aerosol i forstøveren.
- Tryk på start på flowstyringen, og åbn straks trykluftventilen helt. Når strømningsregulatoren når ca. 9 s, skal du begynde at lukke trykluftventilen.
- Når trykluftventilen er helt lukket, skal du frakoble forstøveren fra trykluftledningen, lukke røghættens skærf helt, slukke vakuumpumpen og lade eventuelle aerosoler klare fra røghætten i ca. 10 minutter.
BEMÆRK: Det er vigtigt at lukke vakuumpumpen af efter at have afsluttet et løb for at forhindre, at der opbygges et vakuum i slangesystemet. - Efter at have ventet i en tilstrækkelig mængde tid, skal du afbryde lungemodellen fra slangesystemet og være særlig omhyggelig med ikke at knække pigtrådsrørforbindelserne.
- Fjern lobe udløbshætterne ved at køre et par pincet under kanten af hætten og forsigtigt løfte den af lungemodellen.
- Fjern filterpapiret fra hætten og læg det i en 24-brøndsplade med den side, hvorpå partikler, der deponeres, er på bunden mod pladens brønd. Gentag for de resterende forretninger og mærk brønden, der svarer til hver lap.
BEMÆRK: For at forhindre, at restpartikelaflejring påvirker efterfølgende forsøg, er det vigtigt at skylle både lungemodellen og kapselkomponenterne med IPA eller passende opløsningsmiddel mellem kørslerne. Dette kan indsamles og indgå i analysen som ønsket. Derudover føres en log for at sikre, at alle anvendte replikaer har været minimalt udsat for IPA for at opretholde en delintegritet, og visuel delinspektion anbefales før brug.
6. Outlet filter papir billedbehandling
- Placer brøndpladen i det digitale fluorescensmikroskop, og sæt mikroskopet til 4x forstørrelse og den relevante fluorescenskanal.
- Visuelt identificere, hvilken lap's filterpapir har den højeste mængde partikelaflejring og bruge funktionen "Auto Expose". Vær opmærksom på de resulterende eksponerings- og integrationstidsværdier.
- Anvend denne eksponering på alle filtrene for kørslen, og vurder, om indstillingen giver et tilfredsstillende billede for alle områder med høj aflejring af filtrene.
BEMÆRK: Fokusindstillinger kan ændres fra filter til filter; Alle filtre for en given kørsel skal dog analyseres med de samme eksponeringsindstillinger. Det er kun muligt at have en ramme af fokus ad gangen, så bøjninger eller tårer i filterpapiret kan forhindre, at alle de deponerede partikler i visningen er i fokus. Dette kan undgås ved at sikre, at filterpapiret er fladt mod bunden af brøndpladen. - Tag mindst tre billeder af hver laps filterpapir på tilfældige steder, og gem som .tiff filer.
7. Kvantificering af partikelaflejring
- Importer alle filterpapirbillederne for en given kørsel til en ImageJ-session.
- Skift hvert billedes type til 8-bit ved at vælge Billede | Skriv | 8-bit.
- Åbn billedet med den højeste fluorescens, og vælg Billede | Juster | Tærskel for at åbne et tærskelvindue. Juster tærskelværdierne for at minimere baggrundssignalet fra filterpapiret, og definer tydeligt partiklernes kanter. Se figur 3 for skildringer af tærskelværdier af god kvalitet og dårlig kvalitet.
BEMÆRK: For filtre med høje niveauer af deposition, en "korona" af fluorescens, forårsaget af diffraktion af lys ved filterpapir fibre, kan observeres omkring store grupperinger af partikler. Når disse billeder tærskels, viser et område, der er for stort, små prikker eller "fjerlignende" figurer omkring disse grupperinger som observeret i de "dårlige" tærskelbilleder i figur 3. Dette kan forbedres ved gradvist at øge den nedre grænse for tærsklen, indtil signalet fra filterpapirfibrene minimeres uden at tilsløre signalet fra partiklerne selv. - Overfør tærskelindstillingerne for det højeste fluorescensbillede til alle andre billeder.
- Kvantificer antallet af partikler og det samlede fluorescerende område ved at vælge Analyser | Analyser partikler.
BEMÆRK: Datasæt sammenlignes ved hjælp af Sidaks multiple comparisons-test og en tovejs ANOVA. Derudover er deposition i netop lap af interesse sammenlignes ved hjælp af en Student T-test under forudsætning af lige varians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Partikler i dette størrelsesområde (1-5 μm) og strømningsforhold (1-10 L/min) følger væskestrømslinjerne baseret på både deres teoretiske Stokes-nummer og in vivo-data. I mangel af en målrettet leveringsanordning forventes partikler, der frigives i lungemodellen, derfor at deponere i henhold til procentdelen af den samlede luftstrøm, der omdirigeres til hver lap. De relative mængder partikellevering til hver lap kan derefter sammenlignes med kliniske lobe flow rate data opnået ved at analysere patientspecifikke højopløsnings computertomografi (HRCT) scanner10. En valideret eksperimentel opsætning vil give en ikke-målrettet partikelaflejringsprofil, der ikke har nogen statistisk signifikant forskel fra den kliniske luftstrømsprofil. Valideringsdata præsenteres for to forskellige strømningsbetingelser: 1 L/min i en sund lunge (figur 4A) og 1 L/min i en lunge, der er ramt af KOL (figur 4B). Under begge disse forhold var den eksperimentelt bestemte depositionsprofil ikke statistisk forskellig fra de kliniske data, hvilket viser, at opsætningen nøjagtigt efterligner fordelingen af luftstrømmen til hver af lungeflipperne. Disse baseline depositionsprofiler fungerede som den kontrol, som målrettede partikelaflejringsprofiler sammenlignes med.
For at illustrere denne protokols evne til at kvantificere ændringer i den regionale lungeaflejring blev der medtaget data til test af to forskellige målretningsanordninger: et modificeret endotrachealt (ET) rør (Figur 5B) og en koncentrisk cylinderenhed (Figur 5E). Begge disse enheder indeholdt en 2 mm ID-stikkontakt med justerbar placering til målrettet partikeludløsning. Det modificerede ET-rør blev vurderet med den intuberede lungemodel for dets evne til at målrette partikelaflejring til både venstre nedre (LL) Lap og højre nedre (RL) Lobe. Sammenlignet med den ikke-målrettede partikelaflejringsprofil genererede denne enhed en næsten firedobbelt stigning i LL Lobe-levering (T-test p =0,004, n =3) ud over at omdirigere over 96% af de leverede partikler til venstre lunge (T-test p = 0,0001, n = 3) (Figur 5A). Ved at ændre indstillingen for frigivelsesplacering til at målrette RL Lobe genererede denne enhed mere end fordobler partikellevering til RL Lobe (T-test p = 0,02, n = 3) og omdirigerede 94% af de leverede partikler til højre lunge (T-test p = 0,0005, n = 3) (Figur 5C). Dette indikerer, at enheden har stor succes med at producere den tilsigtede depositionsprofilmodulation. Den koncentriske cylinder enhed blev testet i fuld lunge model med et tilsigtet mål for Venstre Øvre (LU) Lobe. Sammenlignet med den ikke-målrettede partikelaflejringsprofil forårsagede denne enhed en næsten tredobbelt stigning i LU Lobe-levering (T-test p = 0,0003, n = 3) ud over at omdirigere over 87% af de leverede partikler til venstre lunge (T-test p = 0,002, n = 3) (Figur 5D). Målretning effektivitet kan også observeres kvalitativt ved at sammenligne billederne af målet lap filter til de andre outlet filtre. Som beskrevet i figur 3vil den mest effektive målretningsmetode give høj partikelaflejring ved den tilsigtede lap af interesse og lav deposition ved de resterende lobe-forretninger. For yderligere demonstrationer af mulighederne i denne protokol, se de eksperimenter, der udføres af Kolewe etal. 9.
Figur 1: 3D-printede forsøgskomponenter. (A) Patient CT-scanning omdannet til 3D-del fil ved hjælp af CT-scanning og mesh redigering software. (B) Lunge model med lobe stikkontakt ændringer foretaget i mesh redigering og 3D modellering software. (C) Lungemodel med indløb modificeret i 3D-modelleringssoftware for at afspejle en intuberet patient. (D) Pigtrådsrørsforbindelse og (E) hætte designet i 3D-modelleringssoftware. (F) Tværsnit af 3D-model, der skildrer lungemodeludtagpens sammenkoblede karakter med hætten og pigtrådsrørtilslutningen. (G) Eksploderet visning af lungemodel udløbshætte. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Samling af eksperimentel opsætning. (A)Skematisk over eksperimentel opsætning, herunder (1) forstøver, (2) lungemodel, (3) udløbshætter, (4) strømningsmålere, (5) ventiler, (6) manifold, (7) strømningsregulator og (8) en vakuumpumpe. (B) Fuldt samlet opsætning. (C) Nærbillede af lobeudtag med samlet hætte. (D) Lungemodel med alle hætter tilføjet. (E) Nærbillede af rørnet til indstilling af lobe-udløbshastigheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Behandling af papirbilleder. De fremlagte rå billeder blev indsamlet under et forsøg på at målrette venstre lunge ved hjælp af 1 μm fluorescerende polystyrenpartikler ved 1 L/min under en sund vejrtrækningsprofil. De "høje" og "lave" depositionsbilleder viser henholdsvis LL- og RU Lobe-filtrene. Den "gode" tærskel, der anvendes med et interval på 43 til 255, opretholder definerede kanter mellem individuelle partikler og undgår påvisning af filterpapirfibre. Den "dårlige" tærskel, der anvendes med et interval på 17 til 255, tilslører de enkelte partikelkanter og overvurderer filterets fluorescerende område. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksperimentel opsætningsvalidering. (A) Valideringsresultater for raske patienter og (B) en KOL-patient ved 1 L/min. Alle fremlagte data er gennemsnitlige ± SD med tre replikater (undtagen kliniske KOL-data, hvor kun én patient blev rapporteret). Der blev indhentet kliniske referencedata for raske patienter og KOL-patienter fra Sul, etal. 10. Datasæt blev sammenlignet ved hjælp af Sidaks test af flere sammenligninger, og alle forskelle er ikke signifikante. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempeldata til målretning af eksperimenter. (A) Venstre nedre Lap og (C) Højre Nedre Lap målretning opnået ved hjælp af (B) en modificeret ET rør leveringssystem. (D) Venstre Øvre Lap målretning opnået ved hjælp af (E) en koncentrisk rør leveringssystem. For alle tre datasæt repræsenterer den indre ring den ikke-målrettede depositionsprofil, der er opnået under opsætningsvalideringen, og den ydre ring repræsenterer den depositionsprofil, der er produceret med tilføjelsen af den angivne målretningsenhed. Der vises tre replikater for hver opsætning. Datasæt blev sammenlignet ved hjælp af Sidak's Multiple Comparisons Test og en Student T-test under forudsætning af lige varians. Alle tre opsætninger medførte en betydelig stigning i leveringen til lobe af interesse: LL Lobe (T-test p = 0,004, n = 3), RL Lobe (T-test p = 0,02, n = 3), og LU Lobe (T-test p = 0,0003, n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende state-of-the-art enhed til lungelægetest af en komplet indåndingsdosis er Next Generator Impactor (NGI), som måler den aerodynamiske diameter af en aerosol4. Denne dimensionering data bruges derefter til at forudsige lunge generation, hvor aerosolen vil deponere baseret på en korrelation udviklet til en sund voksen mand11. Desværre er denne metode begrænset i sin evne til at vurdere forskelle i regionale lungeaflejring, bestemme virkningerne af sygdomstilstande på farmaceutisk levering og forudsige depositionsprofiler for forskellige aldersgrupper, racer og køn12,13,14. Protokollen, der er skitseret her, har kapacitet til at opfylde disse testbehov ved at give forskere mulighed for at generere justerbare, anatomisk nøjagtige lungemodeller med evnen til at kvantificere relativ deposition på lobe-niveau, baseret på væskeflowadfærd, der tidligere er demonstreret i beregningsmodeller3,5,15. Ved hjælp af denne metode kan farmaceutisk dosering og levering bedre vurderes for pædiatriske og syge lungegeometrier, før de kommer ind i kliniske forsøg.
Som vist i figur 4 og figur 5kan deposition på lobe-niveau måles nøjagtigt og hurtigt for både målrettede og ikke-målrettede inhalations aerosoler. I mangel af en målretningsanordning følger partikler i dette størrelsesområde (1-5 μm) og strømningsforhold (1-10 L/min) væskestrømmene og den samlede luftstrømsprofil, der omdirigeres til hver lap (figur 4). Især kan forskellige inhalatoranordninger og ET-rørtilbehør udvikles til at koncentrere inhalerede lægemidler til kontrollerede lobe-steder. Som beskrevet i vores seneste arbejde og andres, bidrager mange funktioner i inhalatorenheden, flowprofilen og luftvejsgeometrien til målrettet aflejringsadfærd2,3,9,16. Generelt kræver effektiv regional målretning, som det fremgår af vores unikke in vitro-modeller, en smal aerosolstørrelsesfordeling og lave indåndingsflowhastigheder for at undgå luftvejsturbulens, der specifikt findes inden for luftrøret. Inddragelse af den fulde øvre luftveje i vores in vitro model giver mulighed for nøjagtig genskabelse af disse luftstrømsmønstre, der er kendt for at påvirke downstream lobe-niveau distribution9. På grund af disse komplekse strømme har det seneste arbejde vist øget målretning fra under glottis9. Vores resultater i figur 5 fremhæver specifikt fordelen ved at bruge en ET-røradapter til regionalt at målrette individuelle lobes fra frigivelse under glottis, med effektiv lobe-specifik målretning vist for lobes af både højre og venstre lunge ved effektivitetsgevinster mellem 62-74% af den samlede dosis. Dette repræsenterer en stigning i forhold til tidligere eksperimentelt rapporterede lækre regionale målretningseffektiviteter og er en vigtig vej til klinisk gennemførelse af denne tilgang9. Det er vigtigt, at protokollen giver mulighed for eksperimentelle lobe distributionsmålinger af en komplet farmaceutisk dosis fra en bred vifte af potentielle regionale målretning enheder ud over dem, der demonstreres her.
Med kun en CT-scanning kan en patientspecifik lungemodel hurtigt 3D printes for at teste en potentiel terapeutisk leveringsmetode. Denne protokol vil ikke kun give en eksperimentel lab-skala tilgang til støtte design af nye inhalator enheder, men også skabe mulighed for on-demand personlige indånding enheder i klinisk praksis. Den hårde harpiks, der bruges i denne protokol, koster ~$0,12/mL; derfor hospitaler med eksisterende 3D-udskrivning infrastruktur kunne udskrive en lunge model for så lidt som $ 15 i materialer17 og samle en personlig luftveje på under en dag. Især trykkeritider og materialeomkostninger ved additiv fremstilling falder fortsat hurtigt, hvilket øger den overordnede gennemførlighed af denne tilgang. Vores eksperimentelle set-up kan let ændres for at afspejle en række luftstrømsforhold ved at bruge en anden lungemodel eller luftstrømsfordelingsindstilling efter den eksperimentelle validering, der er vist i figur 4. Forskelle i lunge flow profiler og geometrier på grund af egenskaber som alder, race og køn er veldokumenteret i litteraturen og kan let indarbejdes i vores modellering tilgang18,19,20. Specifikt kan geometriske variationer i strubehovedet, svælget og luftrøret af lungemodeller have en betydelig indvirkning på luftstrømmen og efterfølgende regionale aflejringsmønstre15,21,22, som denne protokol er veludstyret til at opdage. Således forventes inkorporering af denne personlige modelleringsmetode at have betydelig indflydelse på udviklingen af tilpassede inhalationsterapier.
Her blev lobe-strømningshastighederne ændret for at afspejle dem i en KOL-sygdomstilstand karakteriseret ved nedsat luftstrøm til de nederste lobes (Figur 4B), men KOL-patient-afledte CT-scanninger kunne også bruges til mere præcist at efterligne den syge lungearkitektur og mulige forhindringer23. Med et bibliotek af patient lunge modeller og flow profiler, kan virkningerne af sygdomsprogression på levering effektivitet undersøges. Der er en bred vifte af open source-scanninger tilgængelige fra organisationer, såsom National Institutes of Health (NIH) og Cancer Imaging Archive (TCIA)24. Mens disse modeller i øjeblikket kun kan kopiere patientens geometri op til anden eller tredje generation til tilstrækkeligt at måle lobe-niveau distribution, arbejdes der i øjeblikket på at udvikle ændringer, der kan indarbejde de lavere luftveje til mere detaljeret analyse. Denne protokol kan også omfatte klinisk relevante lægemiddelleveringsanordninger såsom et ET-rør som afbildet i figur 5B. Forskere kan evaluere flere leveringsenheder for at afsløre egenskaber, der kan øge eller mindske behandlingseffektiviteten. F.eks. reduceres målretningseffektiviteten, når man forsøgte i den fulde lungemodel i modsætning til den intuberede lungemodel (Figur 5). Denne forskel indikerer, at omgåelse af glottal regionen undgår områder med turbulent blanding, der mindsker målretning evne.
Denne protokol er begrænset af dens manglende evne til præcist at efterligne den biologiske luftvæskegrænseflade. Som følge heraf kan aerosoler, der normalt deponeres ved inertiel påvirkning, i stedet hoppe af de stive vægge i lungemodellen25. For at forbedre dette omfatter fremtidige retninger udforskning af overfladeændringer og belægninger for at efterligne lungeepitelets slimhindelag. Belægninger som siliciumolie og glycerin er blevet undersøgt for at forhindre partikel bounce i en NGI og kunne let indarbejdes på 3D-trykte lungemodeller26. Andre teknikker såsom bioprint og dyrkning af celler på 3D-trykte modeller undersøges for deres evne til at indarbejde en cellulær reaktion i protokol27. Derudover bruger denne protokol udstyr, der er optimeret til strømningshastigheder på 1-15 L/min. i fremtiden kan højere strømningshastigheder på 30-60 L/min, det normale interval af maksimale inspiratoriske strømningshastigheder, anvendes ved at skifte kontrolventilerne og strømningsmålerne ud for dem, der passer til det ønskede strømningshastighedsområde28,29. Med flow controller model, der anvendes, er systemet kun i stand til modellering inspiration snarere end en fuld cyklisk vejrtrækning cyklus. Inkorporering af forbigående vejrtrækningsmønstre ved hjælp af en ventilator eller et mere komplekst strømningssystem vil sandsynligvis forbedre nøjagtigheden af forsøgsresultater med hensyn til partikelaflejringseffektivitet30. Endelig er depositionsforsøg kun blevet udført med monodisperse fluorescerende polystyrensfærer i størrelse fra 1-5 μm. Aflejringskvantificeringen er baseret på aerosolfluorescens, så anvendelsen af denne protokol med ikke-fluorescerende aerosoler kan kræve, at der indsættes en fluorescerende etiket som f.eks. Der kan dog anvendes yderligere analyseteknikker til at analysere filteret afhængigt af aerosolsammensætningen, såsom højtydende væskekromatografi (HPLC) og eller massespektrometri.
Vores protokol demonstrerer det første in vitro eksperimentelle setup med evnen til at kvantificere lobular lungeaflejring i en patientspecifik lungegeometri. Opnåelse af kontrolleret lobe-niveau distribution forventes at øge den terapeutiske effekt af indånding terapeutiske, som kun vil blive opnået gennem fremskridt i in vitro hele dosis målinger. Med den stigende interesse for personlig medicin, denne protokol har potentiale til at anspore udviklingen af nye målrettede lunge behandlinger ved at give mulighed for mere præcise forudsigelser af potentielle behandling effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Yu Feng, Dr. Jenna Briddell, Ian Woodward, og Lucas Attia for deres nyttige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
- Goel, A., Baboota, S., Sahni, J. K., Ali, J. Exploring targeted pulmonary delivery for treatment of lung cancer. International Journal of Pharmaceutical Investigation. 3 (1), 8-14 (2013).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Li, Z., Roberts, W. L., Rojas, C. A new methodology for targeting drug-aerosols in the human respiratory system. International Journal of Heat and Mass Transfer. 51 (23), 5578-5589 (2008).
- Feng, Y., Chen, X., Yang, M. An In Silico Investigation of a Lobe-Specific Targeted Pulmonary Drug Delivery Method. Design of Medical Devices Conference. , (2018).
- Marple, V. A., et al. Next generation pharmaceutical impactor (a new impactor for pharmaceutical inhaler testing). Part I: Design. Journal of Aerosol Medicine. 16 (3), 283-299 (2003).
- Feng, Y., Zhao, J., Chen, X., Lin, J. An In Silico Subject-Variability Study of Upper Airway Morphological Influence on the Airflow Regime in a Tracheobronchial Tree. Bioengineering. 4 (4), 90 (2017).
- Huynh, B. K., et al. The Development and Validation of an In Vitro Airway Model to Assess Realistic Airway Deposition and Drug Permeation Behavior of Orally Inhaled Products Across Synthetic Membranes. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 31 (2), 103-108 (2018).
- Lizal, F., Elcner, J., Hopke, P. K., Jedelsky, J., Jicha, M. Development of a realistic human airway model. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 226 (3), 197-207 (2011).
- Wei, X., Hindle, M., Delvadia, R. R., Byron, P. R. In Vitro Tests for Aerosol Deposition. V: Using Realistic Testing to Estimate Variations in Aerosol Properties at the Trachea. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 30 (5), 339-348 (2017).
- Kolewe, E. L., Feng, Y., Fromen, C. A. Realizing Lobe-Specific Aerosol Targeting in a 3D-Printed In Vitro Lung Model. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. , (2020).
- Sul, B., et al. Assessing Airflow Sensitivity to Healthy and Diseased Lung Conditions in a Computational Fluid Dynamics Model Validated In Vitro. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Martonen, T. B., Katz, I. Deposition Patterns of Polydisperse Aerosols Within Human Lungs. Journal of Aerosol Medicine. 6 (4), 251-274 (1993).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Nichols, S. C., et al. A Multi-laboratory in Vitro Study to Compare Data from Abbreviated and Pharmacopeial Impactor Measurements for Orally Inhaled Products: a Report of the European Aerosol Group (EPAG). AAPS PharmSciTech. 17 (6), 1383-1392 (2016).
- Yoshida, H., Kuwana, A., Shibata, H., Izutsu, K. I., Goda, Y. Comparison of Aerodynamic Particle Size Distribution Between a Next Generation Impactor and a Cascade Impactor at a Range of Flow Rates. AAPS PharmSciTech. 18 (3), 646-653 (2017).
- Feng, Y., et al. An in silico inter-subject variability study of extra-thoracic morphology effects on inhaled particle transport and deposition. Journal of Aerosol Science. 123, 185-207 (2018).
- Kleinstreuer, C., Seelecke, S. Inhaler system for targeted maximum drug-aerosol delivery. United States patent. , (2005).
- Pietila, T. How Medical 3D Printing is Gaining Ground in Top Hospitals. , Available from: https://www.materialise.com/en/blog/3d-printing-hospitals (2019).
- Weber, P. W., Price, O. T., McClellan, G. E. Demographic Variability of Inhalation Mechanics: A Review. Defense Threat Reduction Agency. , (2016).
- Jiang, Y. Y., Xu, X., Su, H. L., Liu, D. X. Gender-related difference in the upper airway dimensions and hyoid bone position in Chinese Han children and adolescents aged 6-18 years using cone beam computed tomography. Acta Odontologica Scandinavica. 73 (5), 391-400 (2015).
- Martin, S. E., Mathur, R., Marshall, I., Douglas, N. J. The effect of age, sex, obesity and posture on upper airway size. European Respiratory Journal. 10 (9), 2087 (1997).
- Xi, J., Longest, P. W., Martonen, T. B. Effects of the laryngeal jet on nano- and microparticle transport and deposition in an approximate model of the upper tracheobronchial airways. Journal of Applied Physiology. 104 (6), 1761-1777 (2008).
- Zhao, J., Feng, Y., Fromen, C. A. Glottis motion effects on the particle transport and deposition in a subject-specific mouth-to-trachea model: A CFPD study. Computers in Biology and Medicine. 116, 103532 (2020).
- Kim, S. S., et al. Chronic obstructive pulmonary disease: lobe-based visual assessment of volumetric CT by Using standard images--comparison with quantitative CT and pulmonary function test in the COPDGene study. Radiology. 266 (2), 626-635 (2013).
- The Cancer Imaging Archive. , Available from: https://www.cancerimagingarchive.net/ (2020).
- Li, A., Ahmadi, G. Computer Simulation of Deposition of Aerosols in a Turbulent Channel Flow with Rough Walls. Aerosol Science and Technology. 18 (1), 11-24 (1993).
- Khalili, S. F., Ghanbarzadeh, S., Nokhodchi, A., Hamishehkar, H. The effect of different coating materials on the prevention of powder bounce in the next generation impactor. Research in Pharmaceutical Sciences. 13 (3), 283-287 (2018).
- Galliger, Z., Vogt, C. D., Panoskaltsis-Mortari, A. 3D bioprinting for lungs and hollow organs. Translational Research. 211, 19-34 (2019).
- Schwarz, K., Biller, H., Windt, H., Koch, W., Hohlfeld, J. M. Characterization of exhaled particles from the healthy human lung--a systematic analysis in relation to pulmonary function variables. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23 (6), 371-379 (2010).
- Patton, J. S., Byron, P. R. Inhaling medicines: delivering drugs to the body through the lungs. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (1), 67-74 (2007).
- Zhang, Z., Kleinstreuer, C., Kim, C. S. Cyclic micron-size particle inhalation and deposition in a triple bifurcation lung airway model. Journal of Aerosol Science. 33 (2), 257-281 (2002).
- Ju, Y., et al. Engineering of Nebulized Metal-Phenolic Capsules for Controlled Pulmonary Deposition. Advanced Science. 7 (6), 1902650 (2020).
