Summary
Nous présentons une méthode in vitro à haut débit pour quantifier le dépôt pulmonaire régional au niveau du lobe à l’aide de modèles pulmonaires imprimés 3D dérivés de la Tomodensitométrie avec des profils de flux d’air tunable.
Abstract
Le développement de thérapies ciblées pour les maladies pulmonaires est limité par la disponibilité de méthodes d’essai précliniques avec la capacité de prédire l’administration régionale d’aérosols. En tirant parti de l’impression 3D pour générer des modèles pulmonaires spécifiques aux patients, nous décrivons la conception d’une configuration expérimentale in vitro à haut débit pour quantifier le dépôt pulmonaire lobulaire. Ce système est fabriqué avec une combinaison de composants imprimés disponibles dans le commerce et 3D et permet de contrôler indépendamment le débit à travers chaque lobe du poumon. La livraison d’aérosols fluorescents à chaque lobe est mesurée à l’aide d’une microscopie par fluorescence. Ce protocole a le potentiel de promouvoir la croissance de la médecine personnalisée pour les maladies respiratoires grâce à sa capacité à modéliser un large éventail de données démographiques des patients et les états de la maladie. La géométrie du modèle pulmonaire imprimé en 3D et le réglage du profil du flux d’air peuvent être facilement modulés pour refléter les données cliniques pour les patients dont l’âge, la race et le sexe varient. Les dispositifs d’administration de médicaments cliniquement pertinents, tels que le tube endotrachéal montré ici, peuvent être incorporés dans la configuration d’essai pour prédire plus exactement la capacité d’un dispositif à cibler l’accouchement thérapeutique à une région maladie du poumon. La polyvalence de cette configuration expérimentale lui permet d’être personnalisé pour refléter une multitude de conditions d’inhalation, améliorant la rigueur des tests thérapeutiques précliniques.
Introduction
De nombreuses maladies pulmonaires comme le cancer du poumon et la bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC) présentent des différences régionales dans les caractéristiques de la maladie; cependant, il y a un manque de techniques thérapeutiques disponibles pour cibler l’administration de drogue aux régions seulement maladies dupoumon 1. Plusieurs modèles de dynamique des fluides computationnels (CFD) ont démontré qu’il est possible de moduler les profils de dépôt de médicaments en identifiant des rationalisations spécifiques dansle poumon 2,3. Le développement d’inhalateurs et d’adaptateurs de tubes ensotrachés (ET) dotés de capacités de ciblage régional est en cours dans notre laboratoire pour contrôler la distribution des aérosols dans les régions pulmonaires touchées. L’extension de ces principes à l’utilisation clinique est limitée par la capacité actuelle d’essai préclinique. L’emplacement précis qu’un médicament dépose dans le poumon est connu pour être le meilleur prédicteur de l’efficacité; toutefois, les évaluations pharmaceutiques actuelles des traitements inhalables sont le plus souvent prédites à l’aide de corrélations in vitro-in vivo de la taille des particules à un dépôt approximatifsimple 4. Cette technique ne permet aucune analyse spatiale pour déterminer les effets des différentes géométries des voies respiratoires sur la distribution régionale à travers les différents lobes du poumon. De plus, ces tests n’ont pas de géométries pulmonaires anatomiquement précises, ce qui, selon les chercheurs, peut avoir un impact significatif sur les profils dedépôt 5. Certains efforts ont été faits pour intégrer des géométries pulmonaires spécifiques au patient dans les protocoles d’essai grâce à l’ajout des voies respiratoires supérieures; cependant, la plupart de ces approches échantillon aérosol livraison à différentes générations du poumon plutôt que chaque lobepulmonaire 6,7,8. Le protocole suivant présente une méthode à haut débit de génération de modèles pulmonaires spécifiques au patient avec la capacité de quantifier le dépôt relatif de particules dans chacun des cinq lobes du poumon9.
Les poumons modèles anatomiquement précis sont générés par des tomodensitogrammes calculés par le patient en 3D. Lorsqu’ils sont utilisés conjointement avec un système d’écoulement facilement assemblé, les débits relatifs à travers chacun des lobes du poumon modèle peuvent être contrôlés indépendamment et adaptés pour imiter ceux des différents états démographiques et/ou de la maladie des patients. Avec cette méthode, les chercheurs peuvent tester l’efficacité des méthodes thérapeutiques potentielles dans une géométrie pulmonaire pertinente et corréler la performance de chaque méthode avec la progression de la morphologie maladie. Ici, deux conceptions d’appareil développées dans notre laboratoire sont testées pour leur capacité à augmenter le dépôt dans un lobe pulmonaire désiré en contrôlant l’emplacement de la libération d’aérosols dans la bouche ou la trachée. Ce protocole a également le potentiel d’avoir un impact significatif sur le développement de procédures personnalisées pour les patients en facilitant la prédiction rapide de l’efficacité du traitement dans un poumon modèle spécifique aux données de tomodensitométrie de ce patient.
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Protocol
1. Préparation de composants expérimentaux imprimés en 3D
REMARQUE : Tous les logiciels utilisés dans le protocole sont indiqués dans le Tableau des matériaux. En outre, le logiciel de tranchage utilisé est spécifique à l’imprimante 3D répertoriée dans le Tableau des matériaux; toutefois, ce protocole peut être étendu à un large éventail d’imprimantes 3D stéréolithographie (SLA).
- Convertir les tomodensitogrammes des patients en objets 3D (fichiers.stl).
REMARQUE : Pour une discussion plus détaillée des caractéristiques géométriques du modèle pulmonaire spécifique utilisé dans ces études, reportez-vous à Feng et coll.5.- Rendre les tomodensitogrammes dans un objet 3D à l’aide d’un logiciel de tomodensitométrie (voir tableau des matériaux). Ouvrez la tomodensitométrie et créez un masque sur l’espace aérien à l’aide de l’outil Threshold avec un réglage de l’âge de -800 à -1000. À l’aide de l’outil Preview 3D, visualisez le rendu 3D et exportezl’objet (File | Exportation) comme un fichier .stl.
- L’importation des fichiers dans un logiciel d’édition en maille (voir tableau des matériaux),supprimer toutes les fonctionnalités déchiquetées à l’aide de l’outil Select (Sculpt | Brosses: « Shrink/Smooth » | Propriétés: Force (50), Taille (10), Profondeur (0)). Lisser la surface(Ctrl+A | Déformer | Lisse | Lissage (0,2), Balance de lissage (1)).
- Dans le logiciel d’édition en maille, étendre le mur de ces objets de 2 mm(Ctrl+A | Modifier | Offset), et permettre à l’objet intérieur de rester creux de telle sorte que seul le mur reste. Trancher l’objet(Sélectionnez | Modifier | Plane Cut) à la trachée pour former une entrée et aux générations 2 ou 3 où l’objet se ramifie à chaque lobe pour créer des points de vente (Figure 1A).
REMARQUE : L’épaisseur de 2 mm a été choisie en fonction des tailles de fonctionnalités acceptables spécifiées par le fabricant de l’imprimante 3D répertoriée dans le Tableau des matériaux. Cette épaisseur peut être ajustée en fonction des spécifications de l’imprimante 3D disponible si la géométrie intérieure du modèle est maintenue.
- Modifier les géométries de sortie du modèle pulmonaire du patient pour qu’elles soient compatibles avec les composants du bouchon de sortie du lobe précédemment conçus (figure 1B,C) énumérés dans le Tableau des matériaux.
- Importer l’objet 3D, qui reproduit le tomodensitogramme à l’intérieur, a une épaisseur de mur de 2 mm, et est ouvert à l’entrée et les prises, dans le logiciel de modélisation 3D (voir Tableau des matériaux) comme un corps solide (Open | Fichiers Mesh | Options | Corps solide).
- Créez un plan en fonction d’un visage à chacune des prises(Insérer | Géométrie de référence | Avion). À l’aide de l’outil d’épissage, tracez le mur intérieur et le mur extérieur de la prise dans un croquis sur le plan(Croquis | Spline).
- Loft un cylindre (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) pour se connecter à la paroi intérieure et extérieure du modèle, prolongeant ainsi la sortie pour être uniforme à chaque lobe(Caractéristiques | Lofted Boss/Base). Ajouter un cran autour du bord de la prise pour correspondre avec le bouchon(Caractéristiques | Coupe extrudée | Offset).
REMARQUE : Le bouchon (Figure 1D) est un cylindre creux correspondant aux dimensions des prises et ayant une étagère qui s’interconnecte avec l’encoche de la prise du modèle. Une extrémité du bouchon est bloquée de telle sorte que l’ID est plus petit que le reste de la pièce, ce qui assure un ajustement serré autour de la connexion de tubes barbelés (Figure 1E). La connexion de tubes barbelés est une forme de cône barbelé de telle sorte que le barbing s’adapte à travers l’ouverture du bouchon, mais le reste de la partie ne le fait pas, permettant à la connexion de tube de s’insérer solidement dans le bouchon. Ainsi, le capuchon s’adapte étroitement autour de la connexion de tube barbelé et le modèle pulmonaire (Figure 1F,G). - Modifier l’entrée du modèle pulmonaire en fonction des conditions expérimentales souhaitées. Les régions de la gorge et du glottal peuvent être incluses pour imiter un patient qui peut respirer par lui-même( figure 1B). Les régions au-dessus de la trachée peuvent être enlevées à l’aide d’une coupe extrudée pour imiter un patient intubé sur le supportdu ventilateur (caractéristiques | Coupe extrudée) (Figure 1C).
- Orientez et soutenez les composants expérimentaux dans le logiciel de tranchage fourni par le fabricant d’imprimantes 3D.
- Importer des fichiers de pièce 3D dans un logiciel de tranchage d’imprimante 3D et choisir la résine appropriée. Utilisez une résine dure pour imprimer les modèles pulmonaires et les connexions de tubes barbelés, et une résine douce pour imprimer les bouchons.
REMARQUE : La résine utilisée pour l’impression des bouchons doit avoir des propriétés élastiques pour lui permettre de s’étirer au-dessus de la sortie du lobe et de créer un joint hermétique. - Définissez l’orientation des parties de telle sorte que toutes les « îles » et les volumes non ventilés soient réduits au minimum. La meilleure orientation pour les modèles pulmonaires est avec les prises de lobe face à la plate-forme d’impression. Assurez-vous à la fois les connexions de tubes barbelés et les bouchons ont les parties plus larges face à la plate-forme d’impression.
REMARQUE : Des tranches individuelles peuvent être visualisées pour vérifier l’apparence des « îles », sections de la pièce qui apparaissent d’abord dans une tranche sans être reliées au corps principal de la pièce. La fonction d’examen peut être utilisée pour vérifier les tranches avec des volumes non ventilés, les zones où la résine non durcie peut se coincer à l’intérieur de la pièce pendant l’impression. Les volumes « îles » et non ventilés diminuent la qualité de l’impression et pourraient entraîner une défaillance de l’impression. - En regardant chaque tranche individuellement, ajouter des supports à toutes les « îles » restantes dans la pièce ainsi que toutes les zones avec des surplombs importants. Exportez et visualisez les tranches pour l’impression afin de vérifier que toutes les zones sont correctement prises en charge.
- Importer des fichiers de pièce 3D dans un logiciel de tranchage d’imprimante 3D et choisir la résine appropriée. Utilisez une résine dure pour imprimer les modèles pulmonaires et les connexions de tubes barbelés, et une résine douce pour imprimer les bouchons.
- Imprimez des composants expérimentaux et terminez le post-traitement selon les instructions du fabricant.
REMARQUE : Toutes les étapes de post-traitement décrites ci-dessous sont spécifiques à l’imprimante 3D répertoriée dans le Tableau des matériaux. Lorsque vous utilisez d’autres imprimantes ou matériaux, ajustez ces étapes pour refléter les instructions du fabricant.- Pour les pièces imprimées en résine molle, laver avec ≥ de l’alcool isopropylique de pureté de 99 % (IPA) pour éliminer l’excès de résine non durcie et la cure thermique dans un four à convection de 8 h selon les spécifications du fabricant.
REMARQUE : Les pièces imprimées en résine douce peuvent être très délicates immédiatement après l’impression, de sorte qu’un soin particulier doit être pris pendant les étapes de nettoyage. L’exposition à l’API doit être maintenue en deçà de la limite d’exposition aux solvants du matériau afin d’éviter la dégradation des parties. - Pour les pièces imprimées en résine dure, laver avec de l’IPA pour enlever l’excès de résine non durcie et guérir dans un four UV (365 nm de lumière à 5-10 mW/cm2)pendant 1 min de chaque côté.
REMARQUE : Pour évaluer l’exactitude de la réplique imprimée en 3D, il est recommandé d’utiliser la numérisation μCT de la pièce imprimée et du logiciel de balayage CT pour comparer, quantitativement, les variations entre le rendu 3D original et la réplique imprimée en 3D.
- Pour les pièces imprimées en résine molle, laver avec ≥ de l’alcool isopropylique de pureté de 99 % (IPA) pour éliminer l’excès de résine non durcie et la cure thermique dans un four à convection de 8 h selon les spécifications du fabricant.
2. Assemblage du système de tubes pour le contrôle des débits
- Vis 1/4 " raccords de tube barbelé dans le côté du collecteur avec 6 ports (Figure 2A-6) et un tube barbelé de 3/8 " raccord dans le port restant.
- Coupez le tube de 1/4 " aux longueurs désirées et insérez dans chaque extrémité des vannes push-to-connect(figure 2A-5). Attachez chaque vanne à l’un des raccords de 1/4 » insérés dans le collecteur.
- Connectez un débitmètre (figure 2A-4) à l’autre extrémité de chaque soupape.
- Placez le système de tuyaux sur le dessus de la planche en bois de sorte que le raccord unique du collecteur de 3/8 " s’étend au-delà du bord de la planche. Pour fixer en place, ajouter deux vis sur le côté de la planche de bois et attacher le collecteur aux vis à l’aide de fil.
- Ajouter quatre vis placées autour de chacune des vannes et des compteurs d’écoulement et utiliser du fil pour fixer chacune d’entre elles à la planche de bois (figure 2E).
- Avec environ 6 " de tube d’identification de 3/8 », connectez le collecteur à un filtre de qualité vide en ligne de 0,1 μm de taille pore. Connectez l’autre extrémité du filtre au contrôleur de débit à l’aide d’un autre tube d’identification de 6 " de 3/8 »
REMARQUE : Le système de tubes n’a besoin d’être assemblé qu’une seule fois.
3. Assemblage des chapeaux de sortie de lobe avec le modèle patient de poumon
REMARQUE : Cette partie du protocole doit être complétée avant chaque course expérimentale.
- Insérez la connexion de tube barbelé dans le bouchon avec la buse qui dépasse à travers l’ouverture dans la base du bouchon. Tout d’abord, insérez une extrémité de la base ovale de raccordement de tube barbelé dans le chapeau. Ensuite, étirez soigneusement le capuchon flexible à l’autre extrémité de la base ovale, en prenant un soin particulier à ne pas casser la base mince.
REMARQUE : Les bouchons nouvellement imprimés peuvent être plus rigides que désiré et peuvent être étirés en exécutant deux doigts le long de l’intérieur du capuchon. - Coupez du papier filtre de 10 μm de sorte qu’il soit légèrement plus grand que la zone de sortie. Pliez le papier filtre sur la sortie du lobe et maintenez-le en place d’une seule main.
- D’autre part, utilisez des pinces à épiler pour étirer le bouchon avec une connexion de tubes barbelés au-dessus de la sortie. Appuyez sur le bouchon jusqu’à ce que l’encoche du bouchon corresponde à l’encoche correspondante sur la sortie du lobe (Figure 2C).
REMARQUE : Déchirer le papier filtre dans cette étape peut invalider les résultats, de sorte qu’un soin particulier doit être pris pour éviter une force excessive lorsque vous appuyez sur le bouchon sur la prise. - Répétez l’répéter pour tous les points de vente restants de lobe( Figure 2D).
4. Génération d’un profil de flux d’air cliniquement pertinent
REMARQUE : Cette partie du protocole doit être complétée avant chaque course expérimentale.
- Connectez chaque sortie de lobe de modèle pulmonaire au tube du compteur d’écoulement et de la valve correspondants, en prenant soin de ne pas appliquer trop de pression latérale à la connexion barbelée de tube. Fixez le compteur d’écoulement électronique à l’entrée de bouche du modèle pulmonaire pour mesurer le débit total d’air du modèle pulmonaire.
- Allumez le contrôleur de débit (figure 2A-7) et la pompe à vide (figure 2A-8). Sélectionnez leparamètre « configuration de test» sur le contrôleur de débit et augmentez lentement le débit jusqu’à ce que le débit électronique affiche le débit total désiré.
- À l’aide des valves(figure 2E-5),ajuster le débit à travers chacun des cinq lobes pulmonaires : supérieur droit (RU), milieu droit (RM), bas droit (RL), supérieur gauche (LU) et bas gauche (LL). Une fois que les débits de lobe indiqués sur les débitomètres (figure 2E-4) sont stables à la valeur désirée, vérifiez à nouveau le débit global sur le débit électronique pour vérifier qu’il n’y a pas de fuites dans le système.
- S’il y a un écart dans le débit total, abaissez le débit avec le contrôleur de débit, réglez toutes les vannes à la configuration entièrement ouverte et répétez les étapes 4.2 et 4.3.
REMARQUE : Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide de profils de débit d’air basés sur les données rapportées par Sul et coll.10 Ces fractions de débit lobar ont été calculées à l’aide d’images de tomographie calculée en fines tranches des poumons des patients à pleine inspiration et expiration, comparant les changements relatifs dans le volume de chaque lobe pulmonaire. Les résultats sont présentés pour deux conditions d’écoulement distinctes, à la fois à un débit global d’entrée de 1 L/min. Le profil sain d’écoulement de sortie de lobe de poumon est distribué à chaque sortie par le pourcentage suivant du flux d’entrée : LL-23.7%, LU-23.7%, RL-18.7%, RM-14.0%, RU-20.3%. Le profil de débit de sortie du lobe COPD est réparti entre chaque prise par le pourcentage suivant du flux d’entrées : LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%9,10.
- S’il y a un écart dans le débit total, abaissez le débit avec le contrôleur de débit, réglez toutes les vannes à la configuration entièrement ouverte et répétez les étapes 4.2 et 4.3.
- Quittez la fonction« configuration detest » du contrôleur d’écoulement, mais laissez la pompe à vide en place.
REMARQUE : L’éteignement de la pompe à vide entre le réglage des débits et l’exécution de l’expérience de dépôt peut entraîner des inexactitudes dans le profil d’écoulement généré. Il est recommandé de laisser la pompe à vide sur une fois que les débits souhaités sont réglés pour compléter les essais de dépôt d’aérosols.
5. Livraison d’aérosol au modèle pulmonaire
REMARQUE : Les expériences doivent être effectuées dans un capot de fumée avec la ceinture fermée pour minimiser l’exposition aux aérosols générés par le nébuliseur.
- Remplissez le nébuliseur avec la solution des particules fluorescentes désirées (figure 2A-1) et connectez-vous à l’entrée du modèle pulmonaire (Figure 2B).
REMARQUE : Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide de 30 mL d’une dilution de 1 100 de particules fluorescentes de polystyrène de μm dans le méthanol.- Pour valider la configuration expérimentale, connectez le nébuliseur directement à l’entrée du modèle pulmonaire sans aucun dispositif de ciblage.
- Pour mesurer l’efficacité d’un dispositif de ciblage, connectez le nébuliseur à l’appareil et insérez l’appareil dans le modèle pulmonaire.
- Connectez la ligne d’air comprimé au nébuliseur et fermez autant que possible la ceinture du capot de fumée.
- Réglez le contrôleur de débit pour exécuter pour un essai de 10 s. Avant de presser le démarrage, ouvrez légèrement la soupape d’air comprimé pour commencer à produire un aérosol à l’intérieur du nébuliseur.
- Appuyez sur démarrer sur le contrôleur de débit et ouvrez immédiatement la soupape d’air comprimé complètement. Une fois que le contrôleur de débit atteint environ 9 s, commencez à fermer la soupape d’air comprimé.
- Une fois que la vanne d’air comprimé est complètement fermée, déconnecter le nébuliseur de la ligne d’air comprimé, fermer complètement la ceinture du capot de fumée, éteindre la pompe à vide et laisser les aérosols se dégager du capot de fumée pendant environ 10 minutes.
REMARQUE : Il est important d’éteindre la pompe à vide après avoir terminé une course afin d’éviter qu’un vide ne s’insurisse dans le système de tuyaux. - Après avoir attendu un temps suffisant, déconnecter le modèle pulmonaire du système de tubes, en prenant un soin particulier à ne pas casser les connexions de tubes barbelés.
- Retirez les bouchons de sortie du lobe en exécutant une pince à épiler sous le bord du capuchon et soulevez-le doucement du modèle pulmonaire.
- Retirez le papier filtre du bouchon et placez-le dans une plaque de puits 24 avec le côté sur lequel les particules déposées étant sur le fond face au puits de la plaque. Répétez l’répétition pour les points de vente restants et étiquetez le puits correspondant à chaque lobe.
REMARQUE : Pour éviter que tout dépôt de particules résiduelles n’ait un impact sur les expériences subséquentes, il est important de rincer à la fois le modèle pulmonaire et les composants du capuchon avec de l’API ou du solvant approprié entre les séries. Cela peut être recueilli et inclus dans l’analyse comme vous le souhaitez. En outre, un journal est conservé pour s’assurer que toutes les répliques utilisées ont été minimalement exposées à l’API pour maintenir l’intégrité des parties, et l’inspection des parties visuelles est recommandée avant utilisation.
6. Imagerie de papier filtre de sortie
- Placez la plaque de puits dans le microscope à fluorescence numérique et réglez le microscope au grossissement 4x et au canal de fluorescence approprié.
- Identifiez visuellement le papier filtre du lobe qui a la plus grande quantité de dépôt de particules et utilisez lafonction « Auto Expose». Prenez note des valeurs de temps d’exposition et d’intégration qui en résultent.
- Appliquez cette exposition à tous les filtres pour la course et évaluez si le paramètre produit une image satisfaisante pour toutes les zones de dépôt élevé des filtres.
REMARQUE : Les paramètres de mise au point peuvent être modifiés d’un filtre à l’autre; toutefois, tous les filtres d’une course donnée doivent être analysés dans les mêmes paramètres d’exposition. Il n’est possible d’avoir qu’un seul cadre de mise au point à la fois, de sorte que les plis ou les déchirures dans le papier filtre peuvent empêcher toutes les particules déposées dans la vue d’être au point. Ceci peut être évité en s’assurant que le papier filtre est plat contre le fond de la plaque de puits. - Prenez au moins trois images du papier filtre de chaque lobe à des endroits aléatoires et enregistrez comme .tiff fichiers.
7. Quantification des dépôts de particules
- Importez toutes les images papier filtre pour une course donnée dans une session ImageJ.
- Changez le type de chaque image en 8 bits en sélectionnant image | Type | 8-bit.
- Ouvrez l’image avec la fluorescence la plus élevée et sélectionnez Image | Ajuster | Seuil pour ouvrir une fenêtre de seuil. Ajustez les valeurs de seuil pour minimiser le signal de fond du papier filtre et définissez clairement les bords des particules. Voir la figure 3 pour les représentations de seuils de bonne qualité et de mauvaise qualité.
REMARQUE : Pour les filtres ayant des niveaux élevés de dépôt, une « couronne » de fluorescence, causée par la diffraction de la lumière par les fibres de papier filtre, peut être observée autour de grands groupes de particules. Lors du seuil de ces images, une plage trop grande affiche de petits points ou des formes « plumes » autour de ces groupements, comme on l’observe dans les images seuil « pauvres » de la figure 3. Cela peut être amélioré en augmentant progressivement la limite inférieure du seuil jusqu’à ce que le signal des fibres de papier filtre soit minimisé sans obscurcir le signal des particules elles-mêmes. - Propagez les paramètres de seuil de l’image de fluorescence la plus élevée à toutes les autres images.
- Quantifier le nombre de particules et la surface fluorescente totale en sélectionnant Analyser | Analyser les particules.
REMARQUE : Les ensembles de données sont comparés à l’aide du test de comparaisons multiples de Sidak et d’un ANOVA dans les deux sens. En outre, le dépôt dans le lobe d’intérêt est comparé à l’aide d’un test T étudiant en supposant une variance égale.
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Representative Results
Les particules de cette taille (1-5 μm) et les conditions d’écoulement (1-10 L/min) suivent les lignes de flux fluides en fonction à la fois de leur nombre théorique de Stokes et des données in vivo; par conséquent, en l’absence d’un dispositif de livraison ciblé, les particules libérées dans le modèle pulmonaire devraient se déposer en fonction du pourcentage du flux total d’air détourné vers chaque lobe. Les quantités relatives d’administration de particules à chaque lobe peuvent ensuite être comparées aux données cliniques sur le débit du lobe obtenues en analysant les tomodensitogrammes à haute résolution (HRCT) spécifiques au patient10. Une mise en place expérimentale validée donnera un profil de dépôt de particules non ciblé qui n’a aucune différence statistiquement significative par rapport au profil clinique du flux d’air. Les données de validation sont présentées pour deux conditions d’écoulement distinctes : 1 L/min dans un poumon sain (figure 4A) et 1 L/min dans un poumon affecté par la MPOC (figure 4B). Dans ces deux conditions, le profil de dépôt déterminé expérimentalement n’était pas statistiquement différent des données cliniques, démontrant que la mise en place imite avec précision la distribution du flux d’air à chacun des lobes pulmonaires. Ces profils de dépôt de base ont servi de contrôle contre lequel les profils ciblés de dépôt de particules sont comparés.
Pour illustrer la capacité de ce protocole à quantifier les changements dans le dépôt pulmonaire régional, des données ont été incluses pour l’essai de deux dispositifs de ciblage différents : un tube enthotrachéal modifié (ET) (figure 5B) et un dispositif de cylindre concentrique (figure 5E). Ces deux dispositifs comportaient une prise d’identification de 2 mm avec emplacement tunable pour la libération ciblée de particules. Le tube ET modifié a été évalué avec le modèle pulmonaire intubé pour sa capacité à cibler le dépôt de particules au lobe inférieur gauche (LL) et au lobe inférieur droit (LRL). Par rapport au profil de dépôt de particules non ciblé, cet appareil a généré une augmentation de près de quatre fois la livraison du lobe LL (T-test p=0,004, n=3) en plus de détourner plus de 96 % des particules livrées vers le poumon gauche (T-test p=0,0001, n=3) (figure 5A). Modifiant le réglage de l’emplacement de libération pour cibler le lobe RL, cet appareil a généré plus de deux livraisons de particules au lobe RL (T-test p=0,02, n=3) et détourné 94 % des particules livrées vers le poumon droit (T-test p=0,0005, n=3) (figure 5C). Cela indique que l’appareil est très réussi à produire la modulation prévue profil de dépôt. Le dispositif concentrique de cylindre a été examiné dans le modèle plein de poumon avec une cible prévue du lobe supérieur gauche (LU). Par rapport au profil de dépôt de particules non ciblé, cet appareil a causé une augmentation de près de trois fois la livraison du lobe LU (T-test p=0,0003, n=3) en plus de détourner plus de 87 % des particules livrées vers le poumon gauche (T-test p=0,002, n=3) (figure 5D). L’efficacité de ciblage peut également être observée qualitativement en comparant les images du filtre de lobe cible aux autres filtres de sortie. Comme le montre la figure 3, la méthode de ciblage la plus efficace donnera lieu à un dépôt élevé de particules au lobe d’intérêt prévu et à un faible dépôt aux points de vente restants du lobe. Pour d’autres démonstrations des capacités de ce protocole, veuillez voir les expériences réalisées par Kolewe et coll.9.
Figure 1 : Composants expérimentaux imprimés en 3D. (A) Tomodensitométrie du patient converti en fichier de pièce 3D à l’aide d’un logiciel de tomodensitométrie et d’édition en maille. (B) Modèle pulmonaire avec des modifications de sortie de lobe apportées dans l’édition de maille et le logiciel de modélisation 3D. (C) Modèle pulmonaire avec entrée modifiée dans un logiciel de modélisation 3D pour refléter un patient intubé. (D) Connexion de tubes barbelés et (E) bouchon conçu dans le logiciel de modélisation 3D. (F) Coupe transversale du modèle 3D représentant la nature imbriquée des prises de modèle pulmonaire avec le capuchon et la connexion de tubes barbelés. (G) Vue explosée de l’assemblage de bouchon de sortie de modèle de poumon. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Assemblage de configuration expérimentale. (A) Schéma de configuration expérimentale comprenant (1) nébuliseur, (2) modèle pulmonaire, (3) bouchons de sortie, (4) compteurs d’écoulement, (5) soupapes, (6) collecteur, (7) contrôleur de débit et (8) pompe à vide. (B) Configuration entièrement assemblée. (C) Gros plan de sortie de lobe avec capuchon assemblé. (D) Modèle pulmonaire avec toutes les casquettes ajoutées. (E) Gros plan du réseau de tubes pour fixer les débits de sortie du lobe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Filtrer le traitement de l’image papier. Les images brutes présentées ont été recueillies au cours d’une expérience pour cibler le poumon gauche à l’aide de particules fluorescentes de polystyrène de 1 μm à 1 L/min sous un profil respiratoire sain. Les images de dépôt « hautes » et « basses » représentent respectivement les filtres LL et RU Lobe. Le « bon » seuil, appliqué avec une fourchette de 43 à 255, maintient des bords définis entre les particules individuelles et évite la détection de fibres de papier filtre. Le seuil « pauvre », appliqué avec une fourchette de 17 à 255, obscurcit les bordures individuelles de particules et surestime la zone fluorescente du filtre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Validation expérimentale de la configuration. (A) Résultats de validation pour les patients en bonne santéet ( B) un patient atteint de MPOC à 1 L/min. Toutes les données présentées sont des ± SD avec trois répliques (à l’exception des données cliniques de COPD, où seulement un patient a été rapporté). Des données cliniques de référence pour des patients en bonne santé et copd ont été obtenues de Sul, et autres10. Les ensembles de données ont été comparés à l’aide du test de comparaisons multiples de Sidak, et toutes les différences ne sont pas significatives. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Exemples de données pour cibler des expériences. (A) Lobe inférieur gauche et ( C )rivedroite lobe inférieur ciblage atteint à l’aide (B) un système modifié de livraison de tube ET. (D) Ciblage gauche du lobe supérieur réalisé à l’aide (E) d’un système concentrique de livraison de tubes. Pour les trois ensembles de données, l’anneau intérieur représente le profil de dépôt non ciblé obtenu lors de la validation de configuration, et l’anneau externe représente le profil de dépôt produit avec l’ajout du dispositif de ciblage indiqué. Les moyens de trois répliques pour chaque configuration sont affichés. Les ensembles de données ont été comparés à l’aide du test de comparaisons multiples de Sidak et d’un test T étudiant en supposant une variance égale. Les trois configurations ont produit une augmentation significative de la livraison au lobe d’intérêt : LL Lobe (T-test p=0,004, n=3), Lobe RL (T-test p=0,02, n=3), et LU Lobe (T-test p=0,0003, n=3). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le dispositif actuel de pointe pour les essais pharmaceutiques pulmonaires d’une dose complète d’inhalation est le Next Generator Impactor (NGI), qui mesure le diamètre aérodynamique d’un aérosol4. Ces données de dimensionnement sont ensuite utilisées pour prédire la génération pulmonaire à laquelle l’aérosol se déposera en fonction d’une corrélation développée pour un mâle adulteen bonne santé 11. Malheureusement, cette méthode est limitée dans sa capacité d’évaluer les différences dans le dépôt pulmonaire régional, de déterminer les effets des conditions de la maladie sur l’administration pharmaceutique et de prédire les profils de dépôt pour divers groupes d’âge, races etsexes 12,13,14. Le protocole décrit ici a la capacité de répondre à ces besoins d’essai en permettant aux chercheurs de générer des modèles pulmonaires thonbles et anatomiquement précis avec la capacité de quantifier le dépôt relatif au niveau du lobe, basé sur le comportement de flux fluide précédemment démontré dans les modèles informatiques3,5,15. À l’aide de cette méthode, la posologie et l’administration pharmaceutiques peuvent être mieux évaluées pour les géométries pulmonaires pédiatriques et maladies avant de participer aux essais cliniques.
Comme le montrent les figures 4 et 5,le dépôt au niveau du lobe peut être mesuré avec précision et rapidement pour les aérosols d’inhalation ciblés et non ciblés. En l’absence d’un dispositif de ciblage, les particules de cette taille (1-5 μm) et les conditions d’écoulement (1-10 L/min) suivent le fluide rationalise et le profil total de flux d’air détourné vers chaque lobe (figure 4). Notamment, divers dispositifs d’inhalateur et fixations de tube ET peuvent être développés pour concentrer les médicaments inhalés aux emplacements contrôlés de lobe. Comme décrit dans nos travaux récents et ceux d’autres, de nombreuses caractéristiques de l’inhalateur, profil d’écoulement, et la géométrie des voies respiratoires contribuent à un comportement de dépôtciblé 2,3,9,16. En général, un ciblage régional efficace, comme le démontrent nos modèles in vitro uniques, nécessite une distribution étroite de la taille des aérosols et de faibles débits d’inhalation afin d’éviter la turbulence des voies respiratoires que l’on retrouve spécifiquement dans la trachée. L’inclusion des voies aériennes supérieures complètes dans notre modèle in vitro permet de recréer avec précision ces modèles de flux d’air qui sont connus pour influencer la distribution au niveau du lobeen aval 9. En raison de ces flux complexes, des travaux récents ont démontré un ciblage accru à partir du dessous de la glottis9. Nos résultats à la figure 5 mettent spécifiquement en évidence l’avantage d’utiliser un adaptateur de tube ET pour cibler régionalement les lobes individuels de la libération en dessous de la glotte, avec un ciblage efficace spécifique au lobe montré pour les lobes des poumons droit et gauche à des efficacités allant de 62 à 74% de la dose totale. Il s’agit d’une augmentation par rapport aux gains d’efficacité du ciblage régional des rejets buccaux précédemment signalés expérimentalement et constitue une voie importante pour la mise en œuvre clinique decette approche 9. Fait important, le protocole permet des mesures expérimentales de distribution du lobe d’une dose pharmaceutique complète à partir d’un large éventail de dispositifs potentiels de ciblage régional au-delà de ceux démontrés ici.
Avec seulement un tomodensitogramme, un modèle pulmonaire spécifique au patient peut être rapidement imprimé en 3D pour tester une méthode potentielle d’administration thérapeutique. Ce protocole fournira non seulement une approche expérimentale à l’échelle du laboratoire pour soutenir la conception de nouveaux dispositifs inhalateurs, mais créera également des possibilités pour les dispositifs d’inhalation personnalisés à la demande dans la pratique clinique. La résine dure utilisée dans ce protocole coûte ~$0.12/mL ; par conséquent, les hôpitaux avec l’infrastructure d’impression 3D existante pourraient imprimer un modèle de poumon pour aussi peu que $15 dans les matériaux17 et assembler une voie aérienne personnalisée en moins d’une journée. Notamment, les temps d’impression et les coûts des matériaux dans la fabrication additive continuent de diminuer rapidement, augmentant ainsi la faisabilité globale de cette approche. Notre configuration expérimentale peut être facilement modifiée pour refléter un certain nombre de conditions de flux d’air en utilisant un modèle pulmonaire différent ou un réglage de distribution du débit d’air, à la suite de la validation expérimentale indiquée à la figure 4. Les différences dans les profils et les géométries du flux pulmonaire en raison de caractéristiques telles que l’âge, la race et le sexe sont bien documentées dans la littérature et peuvent être facilement incorporées dans notre approche demodélisation 18,19,20. Plus précisément, les variations géométriques du larynx, du pharynx et de la trachée des modèles pulmonaires peuvent avoir un impact significatif sur le flux d’air et les modèles de dépôtsrégionaux subséquents 15,21,22, que ce protocole est bien équipé pour détecter. Ainsi, l’incorporation de cette approche de modélisation personnalisée devrait avoir un impact significatif sur le développement de thérapeutiques personnalisées par inhalation.
Ici, les taux d’écoulement du lobe ont été modifiés pour refléter ceux d’un état de mpoc caractérisé par une diminution du débit d’air vers les lobes inférieurs (figure 4B), mais les tomodensitogrammes dérivés des patients mpoc pourraient également être utilisés pour imiter plus précisément l’architecture pulmonaire malade et les obstructions possibles23. Avec une bibliothèque de modèles pulmonaires et de profils d’écoulement des patients, les effets de la progression de la maladie sur l’efficacité de l’accouchement peuvent être étudiés. Il existe un large éventail d’analyses open source disponibles auprès d’organisations telles que les National Institutes of Health (NIH) et le Cancer Imaging Archive (TCIA)24. Bien que ces modèles ne puissent actuellement reproduire la géométrie du patient que jusqu’à la deuxième ou la troisième génération pour mesurer adéquatement la distribution au niveau du lobe, des travaux sont en cours pour développer des modifications qui peuvent intégrer les voies respiratoires inférieures pour une analyse plus détaillée. Ce protocole peut également intégrer des dispositifs d’administration de médicaments cliniquement pertinents tels qu’un tube ET tel que décrit dans la figure 5B. Les chercheurs peuvent évaluer plusieurs dispositifs d’administration pour révéler des caractéristiques qui peuvent augmenter ou diminuer l’efficacité du traitement. Par exemple, l’efficacité du ciblage est réduite lorsqu’on tente de le faire dans le modèle pulmonaire complet plutôt que dans le modèle pulmonaire intubé (figure 5). Cette différence indique que le contournement de la région glottale évite les zones de mélange turbulent qui diminuent la capacité de ciblage.
Ce protocole est limité par son incapacité à imiter avec précision l’interface air-liquide biologique. Par conséquent, les aérosols qui se déposent normalement par impaction inertielle peuvent plutôt rebondir sur les parois rigides du modèlepulmonaire 25. Pour améliorer cela, les directions futures comprennent l’exploration des modifications de surface et des revêtements pour imiter la couche muqueuse de l’épithélium pulmonaire. Des revêtements tels que l’huile de silicium et la glycérine ont été étudiés pour la prévention du rebond des particules dans un NGI et pourraient facilement être incorporés sur les modèles pulmonaires imprimés en 3D26. D’autres techniques telles que la bioimpression et la culture des cellules sur les modèles imprimés en 3D sont à l’étude pour leur capacité à intégrer une réponse cellulaire dans leprotocole 27. En outre, ce protocole utilise l’équipement optimisé pour des débits de 1-15 L/min; à l’avenir, des débits plus élevés de 30 à 60 L/min, la plage normale des débits inspiratoires de pointe, pourraient être utilisés en éteptant les soupapes de commande et les compteurs d’écoulement pour ceux qui conviennent à la plage de débitsouhaitée 28,29. Avec le modèle de contrôleur de flux utilisé, le système n’est capable de modéliser l’inspiration plutôt que d’un cycle de respiration cyclique complet. L’incorporation de modèles respiratoires transitoires par l’utilisation d’un ventilateur ou d’un système d’écoulement plus complexe améliorerait probablement l’exactitude des résultats expérimentaux en ce qui concerne l’efficacité des dépôts departicules 30. Enfin, des expériences de dépôt n’ont été réalisées qu’avec des sphères de polystyrène fluorescent monodisperse dont la taille est comprise entre 1 et 5 μm. La quantification des dépôts repose sur la fluorescence des aérosols, de sorte que l’utilisation de ce protocole avec des aérosols non fluorescents peut nécessiter l’incorporation d’une étiquette fluorescente comme l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pourl’analyse 31. Toutefois, d’autres techniques d’analyse pourraient être appliquées pour analyser le filtre en fonction de la composition des aérosols, comme la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse.
Notre protocole démontre la première configuration expérimentale in vitro avec la capacité de quantifier le dépôt pulmonaire lobulaire dans une géométrie pulmonaire patient-spécifique. On s’attend à ce que la distribution contrôlée de lobe-niveau augmente l’efficacité thérapeutique des thérapeutiques d’inhalation, qui ne seront réalisées que par des avances dans les mesures in vitro de dose entière. Avec l’intérêt croissant pour la médecine personnalisée, ce protocole a le potentiel de stimuler le développement de nouvelles thérapies pulmonaires ciblées en permettant des prédictions plus précises de l’efficacité potentielle du traitement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Yu Feng, le Dr Jenna Briddell, Ian Woodward et Lucas Attia pour leurs discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
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