Summary
تحدد هذه المقالة الشروط المختبرية الأساسية والبروتوكولات لنظام درجة الحرارة التدريجي لتحفيز التفريخ الأقصى في رباعية Astyanax المكسيكيةالمكسيكية ، وهو نموذج ناشئ للدراسات التنموية والتطورية.
Abstract
رباعية المكسيكية, Astyanax mexicanus, هو نظام نموذج الناشئة للدراسات في التنمية والتطور. وجود سطح العينين (الأسماك السطحية) وكهف أعمى (أسماك الكهوف) يتحول في هذا النوع يمثل فرصة لاستجواب الآليات الكامنة وراء التطور المورفولوجي والسلوكي. وقد تطورت أسماك الكهوف سمات بناءة وتراجعية جديدة. وتشمل التغييرات البناءة زيادات في براعم الذوق والفكين، والأعضاء الحسية الجانبية الخط، والدهون في الجسم. وتشمل التغييرات التراجعية فقدان العينين أو تقليلها. تصبغ الميلانين، والسلوك المدرسي، والعدوان، والنوم. لاستجواب هذه التغييرات تجريبيا، من المهم الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة التي ولدت. منذ أن تم جمع الأسماك السطحية الأصلية A. mexicanus وأسماك الكهوف في تكساس والمكسيك في التسعينيات ، تم تحفيز أحفادهم بشكل روتيني على تربية وتفريخ أعداد كبيرة من الأجنة كل شهرين في مختبر جيفري. على الرغم من أن يتم التحكم في التربية من خلال وفرة الغذاء والجودة، ودورات ضوء الظلام، ودرجة الحرارة، وجدنا أن التغيرات في درجة الحرارة الإضافية تلعب دورا رئيسيا في تحفيز التفريخ القصوى. وتوفر الزيادة التدريجية في درجة الحرارة من 72 درجة فهرنهايت إلى 78 درجة فهرنهايت في الأيام الثلاثة الأولى من أسبوع التكاثر يومين إلى ثلاثة أيام تفريخ متتالية مع أعداد قصوى من الأجنة عالية الجودة، ثم يتبع ذلك انخفاض تدريجي في درجة الحرارة من 78 درجة فهرنهايت إلى 72 درجة فهرنهايت خلال الأيام الثلاثة الأخيرة من أسبوع التفريخ. الإجراءات المبينة في هذا الفيديو تحدد سير العمل قبل وأثناء أسبوع تربية المختبر لدرجة الحرارة الإضافية حفز تفريخ.
Introduction
وteleost Astyanax mexicanus لديه العينين سطح المسكن (سطح السمك) شكل والعديد من مختلف أعمى كهف المسكن (كهف الأسماك) أشكال1،2. تطورت أسماك الكهوف في ظلام دائم وتحت قيود الغذاء ، مما أدى إلى ظهور سمات بناءة وتراجعية جديدة3. وتشمل الصفات البناءة زيادات في براعم الذوق وحجم الفك، والأعضاء الحسية للخط الجانبي، واحتياطيات الدهون. وتشمل الصفات التراجعية فقدان أو الحد من تصبغ الميلانين، والعينين، والسلوكيات، مثل النوم، والتعليم، والعدوان. سمة من سمات نظام Astyanax هي الخصوبة الكاملة بين الشكلين ، مما يسمح باستخدام رسم خرائط سمة كمية لتحديد المنطقة الجينومية المرتبطة بالتطور البناء والتراجعي4و5و6و7. A. mexicanus يقدم نظاما مفيدا لدراسة التنمية لأنه يمكن حث على تفريخ في كثير من الأحيان في المختبر. أجنة A. mexicanus شفافة ، أكبر قليلا من تلك التي من حمار وحشي ، تنتج بكميات كبيرة ، وتتطور إلى البالغين الناضجين جنسيا في حوالي 8-12 شهرا. فترة طاقة التفريخ القصوى حوالي 5 سنوات. يصف هذا البروتوكول سير العمل المطلوب في منشأة زراعة مكسيكية خلال أسبوع تربية نموذجي ويتضمن تفاصيل صيانة نظام الأسماك ونظام التحكم في درجة الحرارة للتفريخ الأقصى.
أ. المكسيكية هي سمكة استوائية تعيش في الأنهار التي تنشأ في الهضاب الجيرية (الأسماك السطحية) وفي برك في كهوف الحجر الجيري (أسماك الكهوف)8. يذوب الحجر الجيري لإنتاج المياه الصلبة، و A. mexicanus يزدهر في الماء الصلب. الأسماك تتكيف مع ظروف المياه الصلبة يمكن أن تتسامح مع مجموعة من الظروف المالحة، ولكن تولد عموما في تلك محددة9. يتم تحقيق تحريض سلوك التفريخ من خلال مجموعة من العوامل. لأن الأسماك بدم بارد وتعتمد على بيئتها للحفاظ على التوازن، والتمثيل الغذائي لها حساسة للتغيرات البيئية وأنها تتفاعل بسرعة أكبرللضغوطات 10. A. يجب أن تكون مثقفة المكسيكي في النظم المائية في ظل ظروف منظمة بعناية من تدفق المياه، درجة الحموضة، الموصلية، الضغط التناضحي، والإضاءة، ودرجات حرارة المياه.
في مختبر جيفري، يتم الحفاظ على الأسماك في نظامين للمياه الجارية: (1) "نظام الطفل" للأسماك البالغة الصغيرة قبل النضج الجنسي و (2) نظام الكبار (أو الرئيسي) للبالغين الناضجين جنسيا. ويتكون "نظام الأطفال" من خزانات 8 لتر و 15 لتر مزودة بالمياه الجارية. يتم زرع "نظام الطفل" عن طريق الزريعة والأحداث الشباب المتحولين الذين يزرعون من اليرقات في خزانات أصغر (1-10 لتر) ، حيث يتم تبادل المياه أسبوعيا. تعتمد اليرقات والقلي والأحداث بشكل كبير على الطعام ويجب إطعامهم طعاما حيا (جمبري ملحي) مرة واحدة في اليوم لضمان معدل عال من البقاء على قيد الحياة. ويوضع الأحداث الصغار من "نظام الأطفال" في نظام البالغين بعد حوالي سنة إلى 1.5 سنة. في البداية ، يتم إطعامهم رقائق رباعية المسحوق ، وبعد مزيد من النمو يتم نقلهم إلى نظام تغذية البالغين العادي. ويمكن تقييم النضج الجنسي من خلال حجم البطن في الإناث، وقد وصفت أساليب لتحديد الجنس11. في نظام البالغين، يتم تبادل المياه تلقائيا في 42 خزان لتر 3 مرات لكل 24 ساعة. يتم مراقبة نظام البالغين يوميا من خلال الفحص البصري ودرجة الحرارة التلقائية ودرجة الحموضة وقراءات التوصيلية من المسابير. درجة الحموضة المثلى حوالي 7.4 ويمكن أن تتراوح بين 6.8-7.5، ودرجة الحرارة الأساسية للنظام هو 72/73 درجة فهرنهايت، والموصلية المثالية تتراوح بين 600-800 متر. يتم إجراء فحوصات مستقلة على جودة المياه أسبوعيا من خلال اختبار درجة الحرارة وقياس معايير جودة المياه لhh والأمونيا والنترات باستخدام اختبار colorimetric. يتم الاحتفاظ مستويات الأمونيا والنترات عند أو بالقرب من الصفر بإضافة البكتيريا المفيدة (مثل، دورة نوتافين) إلى النظام. يتم التحكم في إضاءة الغرفة بواسطة مؤقت يتم ضبطه على فترات ضوئية مدتها 14 ساعة و10 ساعات مظلمة. بالإضافة إلى معايير جودة المياه الشاملة المذكورة أعلاه، فإن الاعتبارات التالية تحتاج إلى اهتمام خاص خلال أسبوع التربية.
الاعتبار الأول هو photoperiod ، والأسماك (حتى الأسماك كهف في المختبر) تعتمد على دورات الضوء لضبط الساعة circadian بهم. يمكن أن تؤثر الإيقاعات الإيقاعية على كل شيء من التربية والتغذية إلى صحة الجهاز المناعي12و13 ويجب أن تكون متسقة لتحقيق أقصى قدر من الفوائد الصحية. يتم الحفاظ على الأسماك في نظام المياه الجارية على ضوء 14 ساعة و 10 ساعة ضوئية داكنة. تبدأ الأسماك السطحية بشكل عام في التفريخ بعد ساعة من سواد النظام ، ويمكن للضوء الذي تم إدخاله خلال هذه الفترة أن يتداخل مع التفريخ وينهيه. تفريخ أسماك الكهوف العمياء أقل إزعاجا من الضوء. وبالمقارنة مع تفريخ الأسماك السطحية، يتأخر تفريخ أسماك الكهوف، وعادة ما يبدأ بعد أربع إلى خمس ساعات من سواد النظام.
والاعتبار الثاني هو التغذية. وعادة ما تتغذى الأسماك البالغة اتباع نظام غذائي من رقائق رباعية مرة واحدة في اليوم. قبل التفريخ، يتم تغذية الأسماك بنظام غذائي غني بالبروتين تكمله كميات إضافية من رقائق رباعية وغيرها من المواد الغذائية: رقائق صفار البيض والديدان السوداء كاليفورنيا الذين يعيشون في بعض الأحيان(Lumbriculus variegatus)للتعويض عن فقدان البروتين بسبب إنتاج البيض خلال دورة التفريخ السابقة. خلال أسبوع التربية، يتم تغذية الأسماك مرتين في اليوم، مرة في الصباح ومرة أخرى في فترة ما بعد الظهر / المساء. وينبغي تجنب تغذية الأسماك مرة واحدة فقط في اليوم ولكن مع جزء واحد كبير جدا من الغذاء، لأن هذا يمكن أن يسبب سوء التغذية14.
الاعتبار الثالث هو الفضاء. وتستند متطلبات الفضاء على متوسط كتلة الجسم من الكبار، فضلا عن الاعتبارات السلوكية، مثل ما إذا كان الأسماك لديها سلوك التعليم أو السلوك العدواني. يمكن أن تؤدي الدبابات المفرطة أو الناقصة إلى زيادة العدوان والإجهاد المستمر ، مما يجعل الأسماك عرضة للإصابة من زملائها في الدبابات ومترددة في المشاركة في تفريخ15. نحن عادة منزل 10-20 الأسماك لكل خزان 42 لتر.
النظر الرابع هو درجة الحرارة. كما ذكر أعلاه، الأسماك بدم بارد وتعتمد على البيئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. لأن درجة الحرارة لها تأثير مباشر على عمليات التمثيل الغذائي، يمكن أن تؤدي التغيرات في درجة الحرارة إلى تغييرات سلوكية في الأسماك16. يتكون برنامج التربية هذا من دورات لمدة أسبوعين في درجة الحرارة: الأسبوع الأول يدخل ارتفاع درجة الحرارة إلى 78 درجة فهرنهايت ، ويحافظ الأسبوع التالي على درجة حرارة ثابتة تبلغ 72 درجة فهرنهايت. خلال الأسبوع الأول (التربية) ، يتم وضع شبكات التربية ذات الحواف البلاستيكية في الجزء السفلي من الخزانات كل مساء. وتستخدم شباك التربية كحاجز بين الأسماك الموجودة في الخزانات والبيض المفرخ، الذي كان سيستهلك لولا ذلك. يتم رفع درجة الحرارة بمقدار درجتين فهرنهايت في اليوم إلى 78 درجة فهرنهايت كحد أقصى بحلول منتصف الأسبوع ، ويتم تحريض التفريخ وفقا لدورة الضوء في أول 2-3 أمسيات من هذا الأسبوع. ثم يتم تخفيض درجة الحرارة بمقدار درجتين فهرنهايت إلى 72 درجة فهرنهايت خلال الأيام المتبقية من الأسبوع، ويتم الحفاظ على درجة الحرارة الأساسية حتى بداية أسبوع التكاثر التالي. وعادة ما يتم تحفيز تربية ما لا يزيد عن مرتين في الشهر للسماح للأسماك الوقت لاسترداد.
وعموما، تسمح هذه الطريقة بتكاثر كميات كبيرة من الأجنة عالية الجودة على مدى فترة زمنية أطول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوان من جامعة ميريلاند، كوليدج بارك (حاليا IACUC 469 #R-NOV-18-59؛ المشروع 1241065-1).
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 التقويمات خلال أسبوع التكاثر وأسبوع غير التكاثر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. الاثنين
- في الساعة 9-10 صباحا، قم بإجراء اختبارات المياه والخطوات 1.1.1-4 أدناه.
- سجل درجات حرارة الغرفة والخزان والخزان باستخدام ميزان الحرارة.
- سجل مستويات الأمونيا والنترات والنترات باستخدام عدة اختبار قياس الألوان.
- سجل الرقم القياسي من نظام المراقبة وكذلك مجموعة اختبار قياس الألوان.
- تسجيل الموصلية من شاشة carboy ومراقبة النظام الرئيسي.
- ابتداء من الساعة 10 صباحا، إطعام جميع الأسماك.
- إطعام جميع الأسماك في نظام الكبار مع رقائق رباعية، وسحق رقائق في الدبابات مع الأسماك الصغيرة. إطعام فقط العديد من رقائق مثل خزان من الأسماك يمكن أن تستهلك تماما في 3-5 دقائق، حول "قرصة إصبع".
- تحقق من الحاضنة المستخدمة لإيواء الإصبع من الأجنة النامية وتغيير الماء إذا لزم الأمر.
- فتح حاضنة الأجنة والتحقق من مستويات المياه في جميع الخزانات. إذا كانت تنفد المياه، أضف مياه النظام. تحقق من إعدادات درجة حرارة الحاضنة. رفع الأجنة عند 73-77 درجة فهرنهايت (23-25 درجة مئوية).
- بث حي نظيف.
- لتنظيف الديدان السوداء، قم بإزالة أحواض Tupperware المكشوفة التي تحتوي على ثقافاتها من ثلاجة الأعلاف الحية وصب المياه الزائدة فوق مجموعات الديدان في الحوض. باستخدام الماء المقطر، تعليق وشطف الديدان مرارا وتكرارا حتى الماء صب قبالة واضحة.
- إضافة ما يكفي من المياه النظيفة بحيث يتم تغطية مجموعات دودة حوالي نصف. استبدال الديدان المتبقية في ثلاجة الأعلاف الحية، وكشف.
- إطعام الأسماك.
- على الأقل 30 دقيقة بعد التغذية الأولى، تغذية الأسماك في الخزانات التي يتم فيها تربية المطلوب مع رقائق صفار البيض، الديدان السوداء، أو كليهما. إضافة "إصبع" من رقائق صفار لكل دبابة. إضافة ما يكفي من مجموعات الدودة السوداء للسماح لكل سمكة في الخزان تستهلك حوالي 5-10 ديدان.
- في 10 صباحا - 1 بعد الظهر، تعيين درجة حرارة المياه إلى 74 درجة فهرنهايت.
- فرك خزانات التربية حسب الحاجة وتعيين شبكات التربية.
- تنظيف الخزانات ووضع الشباك ساعة واحدة على الأقل بعد التغذية الأخيرة. تنظيف جميع الخزانات التي يتم وضع الشباك في مسبقا. تعيين شبكات التربية بعناية حتى لا تتداخل مع إمدادات الهواء إلى الخزان.
2. الثلاثاء
- جمع الأجنة وغسل جميع الشباك تربية.
- في 9-10 صباحا، قم بإزالة شبكات التربية من قاع خزانات نظام البالغين. شطف بلطف الأجنة في شبكة باليد باستخدام خرطوم تعلق على كاربوي، وعكس الشبكة باليد في إصبع من مياه النظام النظيف لطرد الأجنة.
- جمع وغسل كل مجموعة من الأجنة، ومن ثم وضع في fingerbowl من مياه النظام النظيفة التي تحتوي على 0.00003٪ الميثيلين الأزرق (المياه الزرقاء). إذا كان هناك عدد كبير بشكل استثنائي من الأجنة من خزان واحد، وفصلها إلى أوعية متعددة. يجب أن يكون تركيز الأجنة الحية حوالي 100 لكل 200 مل من الماء الأزرق في كل إصبع.
- تقدير وقت الإخصاب عن طريق تنظيم الأجنة تحت المجهر باستخدام الجدول الزمني للتنمية A. mexicanus المنشورة 17.
- مراقبة الإصبع الذي يحتوي على الأجنة بشكل متكرر. إزالة الأجنة الميتة أو المشوهة والحطام، مثل الطعام أو البراز غير المأكول، مع ماصة باستور. تغيير المياه الزرقاء في fingerbowls في كثير من الأحيان.
- ضع الإصبع في حاضنة لمدة 5-7 أيام. في هذا الوقت، وقد استخدمت صفار حتى وتغذية الثقافات مع الروبيان المالحة الحية ضروري لمزيد من التنمية.
- خذ بيانات التفريخ.
- لكل خزان يسقط الأجنة، سجل المعلومات التالية.
- سجل التاريخ ورقم الخزان.
- سجل العدد التقريبي للأجنة التي تم إسقاطها (الشكل 2):
مرتفع (500+)
متوسط (200-500)
منخفض(<200) - تسجيل جودة الأجنة انخفض (الشكل 2):
مرتفع (>75٪ على قيد الحياة)
متوسطة (25-50٪ على قيد الحياة)
منخفض (<25٪ على قيد الحياة) - تقدير وقت التفريخ الأصلي عن طريق استشارة المكسيكي Astyanax الجدولالتدريج 17.
- سجل درجة الحرارة التي تم تعيين النظام عند ظهور الأسماك.
- لكل خزان يسقط الأجنة، سجل المعلومات التالية.
- أطعم كل الأسماك
- تعيين درجة حرارة الماء إلى 76 درجة فهرنهايت.
- إعداد البث المباشر.
- إطعام #2 السمك.
- يغرف الطعام الزائد والحطام من الخزانات وفرك قبل إعادة تعيين الشباك.
3. الأربعاء
- كرر الخطوات 2.1-2.2. جمع الأجنة وغسل جميع الشباك تربية.
- خذ بيانات التفريخ كما كان من قبل.
- إجراء اختبارات المياه كما كان من قبل.
- أطعم كل الأسماك
- تعيين درجة حرارة الماء إلى 78 درجة فهرنهايت.
- إعداد البث المباشر.
- تحقق من الأجنة في الحاضنة.
- تنظيف وتغيير المياه من الأجنة في fingerbowls التي ستستخدم في نهاية المطاف لتجديد المخزون العام تربية الكبار. استخدام مياه النظام المعالجة باللون الأزرق الميثيلين.
- إطعام الأسماك مرة أخرى.
- تنظيف الخزانات حسب الحاجة وإعادة تعيين الشباك.
4. الخميس
- كرر الخطوات 2.1-2.2. جمع الأجنة وغسل وتخزين الشباك تربية.
- خذ بيانات التفريخ كما كان من قبل.
- تعيين درجة حرارة الماء إلى 76 درجة فهرنهايت.
- تنظيف البث المباشر.
- تنظيف جميع الدبابات الفردية.
- تحقق من الأجنة في الحاضنة.
- إطعام #2 السمك.
5. الجمعة
- أطعم كل الأسماك
- تعيين درجة حرارة الماء إلى 74 درجة فهرنهايت.
- تنظيف البث المباشر.
- تحقق من الأجنة في الحاضنة.
6. السبت
- إطعام الأسماك.
7. الأحد
- إطعام الأسماك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن عموما تولد وتفرخ أحفاد الأسماك السطحية التي تم جمعها أصلا في Nacimiento ديل ريو تشوي في سان لويس بوتوسي، المكسيك (أسماك سطح ريو تشوي) وسان سولومون سبرينغز في حديقة ولاية بالمورهيا، تكساس (أسماك سطح تكساس) وأسماك الكهوف المستمدة من كويفا دي إل باشون (أسماك كهف باشون) في تاماوليباس، المكسيك، وكويفا دي لوس سابينوس (أسماك كهف لوس سابينوس) وسوتانو دي لا تيناجا (أسماك كهف تيناخا) في سان لويس بوتوسي المكسيك.
طوال أسبوع التربية، يتم جمع البيانات لمختلف الدبابات. لوحظ الأجنة التي ولدت في كل دبابة للكمية والنوعية. يتم تسجيل الكمية على أنها عالية أو متوسطة أو منخفضة. يتم تسجيل كمية عالية إذا كان عدد الأجنة انخفض أكثر من 500، يتم تسجيل كمية من المتوسطة إذا كان عدد الأجنة انخفض بين 200-500، ويتم تسجيل كمية منخفضة إذا كان عدد الأجنة انخفض أقل من 200. كما يتم تسجيل الجودة على أنها عالية أو متوسطة أو منخفضة. يتم تسجيل جودة عالية إذا كان أكثر من 75٪ من الأجنة في الوعاء على قيد الحياة، ويتم تسجيل نوعية متوسطة إذا كان حوالي 25٪ إلى 75٪ من الأجنة في الوعاء على قيد الحياة، ويتم تسجيل جودة منخفضة إذا كان أقل من 25٪ من الأجنة على قيد الحياة. ثم يتم تعيين هذه المؤشرات من الكمية والنوعية رقم مع ارتفاع يجري 3، المتوسطة يجري 2، وانخفاض يجري 1. إذا لم تكن هناك أجنة ولدت أو لا أجنة حية في التفريخ ، يتم تعيين عدد من 0.
تظهر بيانات التربية من يوليو 2017 حتى مارس من عام 2020 لأسماك ريو تشوي وتكساس السطحية وأسماك كهف لوس سابينوس وتيناجا وباتشون في الشكل 2. تم تحليل البيانات حسب أسبوع التكاثر ومتوسط الأرقام الناتجة عن كل يوم من جمع الأجنة خلال أسبوع تربية واحد. وتشير البيانات إلى أن التكاثر كان مستمرا على مدار السنة في أسماك ريو تشوي وتكساس السطحية وفي أسماك كهف باشون. وكانت كمية ونوعية معظم أسماك سطح ريو تشوي بين منخفضة وعالية، في حين أن كمية ونوعية معظم الأسماك السطحية في تكساس وأسماك كهف باشون كانت بين منخفضة ومتوسطة. لم يكن حدوث التفريخ مستمرا في أسماك كهف تيناجا أو لوس سابينوس: كان التفريخ منخفضا أو غير موجود خلال أواخر الصيف (يوليو) إلى الخريف (أكتوبر). على الرغم من أن أدنى مستويات التفريخ سجلت لأسماك كهف لوس سابينوس، كانت نوعية الأجنة هي الأفضل. بشكل عام، تظهر الأسماك السطحية كمية ونوعية تفريخ أفضل من أسماك الكهوف.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم بيانات تربية الأسماك السطحية المختلفة وتجمعات أسماك الكهوف من يوليو من عام 2017 حتى مارس من عام 2020. من أعلى إلى أسفل هو ريو تشوي الأسماك السطحية، تكساس الأسماك السطحية، باكون كهف الأسماك، تيناجا كهف الأسماك، ولوس سابينوس كهف الأسماك. خطوط غير منقطعة: نوعية تفرخ. خطوط مكسورة: كمية من تفرخ. تمثل الأسابيع التي لا توجد خطوط الفترات التي لم تتم فيها محاولة التفريخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Astyanax mexicanus هو نموذج بيولوجي جديد يولد بشكل متكرر ويمكن تربيته بسهولة في المختبر1،2. ولأننا مهتمون بالآليات التنموية التي تكمن وراء التغيرات التطورية في أسماك كهف أ. المكسيكية، فإن إنتاج واستخدام الأجنة أمر حيوي لأهدافنا البحثية. والغرض الرئيسي من الحفاظ على مخزون بالغ من الأسماك هو إنتاج الأجنة والقلي الصغير لاستخدامه في التجارب التنموية وتجديد مخزونات تربية البالغين. في بعض الأحيان، يمكن استخدام البالغين أيضا في إجراء التجارب الفسيولوجية أو السلوكية أو الجينية. التجارب الجينية تتطلب التزاوج المقترن أو الإخصاب في المختبر18. للحيوانات الإخصاب في المختبر تظهر سلوك التفريخ19 يمكن إزالتها من الدبابات واستخدامها للعبان خلال نظام التربية الناجمة عن درجة الحرارة.
لتعظيم جودة وكمية الأجنة للبحوث، هناك تفاصيل العمليات التي تتطلب الاهتمام قبل أسبوع التكاثر. عند التلاعب بالأسماك في الخزانات، استخدم فقط الشباك المعينة باليد، وغمرها في محلول نقع الشبكة بين كل استخدام، وشطفها بمياه الصنبور الساخنة بين الاستخدامات لمنع التلوث بين الخزانات. غسل وتطهير جميع الأدوات المستخدمة بعناية لرعاية الأسماك. إزالة وتنظيف شبكات التربية في مياه النظام قبل استبدالها في الخزانات. في نهاية الأسبوع، يتم تخزين جميع شباك التربية الجافة على الرفوف في غرفة الأسماك. خلال أسبوع التكاثر، تحقق من كل خزان بحثا عن أجنة في شباك التربية أو بحثا عن سلوك تفريخ الأسماك (أي السباحة في دوائر مقترنة ببعضها البعض)، حيث من المرجح أن تكون الإناث في تلك الخزانات مستعدات للتفريخ. وينبغي أن يتم ذلك باستخدام الضوء الأحمر خلال الساعات المظلمة من photoperiod. A. المكسيكي تفرخ في الظلام عن طريق نثر البيض والحيوانات المنوية في الغيوم. ويمكن للدبابة التي يبلغ عدد سكانها حوالي 10-20 سمكة ونسبة الذكور إلى الإناث التي تبلغ حوالي 1:1 أن تنتج ما يصل إلى 500 جنين مخصب في تفريخ واحد لكل خزان، وقد تفرخ كل خزان من الأسماك مرتين أو ثلاث مرات على مدار أسبوع واحد للتكاثر. في تفرخ جيدة، ومعظم الأجنة البقاء على قيد الحياة من خلال الفقس، وهي مرحلة حرجة. وينبغي فحص الثقافات بشكل متكرر وإزالة البويضات غير المخصبة أو الأجنة الميتة أو المشوهة أو الحطام، بما في ذلك أي بقايا غذائية أو طفيليات. يجب "تنظيف" الثقافات التي تحتوي على أجنة حية في الغالب كل بضع ساعات خلال فترات اليرقات الجنينية والمبكرة عن طريق إزالة الأجنة الميتة أو غير الطبيعية يدويا (والتي ستموت في نهاية المطاف) والحطام باستخدام ماصة باستور. لا يزال من الممكن استخدام الثقافات التي لديها نسبة كبيرة من الأجنة الميتة عن طريق نقل الأجنة النامية عادة إلى أقواس أصابع جديدة مع الماء الأزرق النقي. عادة، يجب تكرار هذه العملية عدة مرات للحصول على أنقى الثقافات من الأجنة الحية. وفي كلتا الحالتين، فإن التركيز النهائي لحوالي 100 جنين لكل 200 مل مثالي لأن تزاحم الأجنة يمكن أن يؤثر على النمو، وخاصة بالنسبة لأسماك الكهوف. وينبغي زيادة "تنظيف" الثقافات بمرور الوقت عن طريق إزالة معظم المياه من الأصابع بشكل دوري واستبدالها بالمياه الزرقاء العذبة. الثقافات "تنظيف" في كثير من الأحيان عادة ما توفر أعلى مستويات الجودة من الأجنة.
بالإضافة إلى التكاثر الطبيعي، التحفيز الهرموني20 أو الإخصاب في المختبر18 هو أيضا يحتمل أن تكون مفيدة في الحصول على الأجنة. ولكن لهذه الأغراض، يجب أن تكون الأسماك صحية وجاهزة للتفريخ الطبيعي (إظهار سلوك التفريخ)، وينبغي توقع غلة أقل بكثير من الأجنة التي تم الحصول عليها في ظل ظروف التفريخ الناجمة عن درجة الحرارة.
ومن القيود المفروضة على التكاثر الناجم عن درجة الحرارة في ظل الظروف المذكورة أعلاه أن الأسماك السطحية وأسماك الكهوف تتكاثر في أوقات مختلفة، الأولى خلال المساء الباكر والثانية من بعد منتصف الليل حتى الصباح الباكر. ولا يمكن تجنب هذا الوضع عن طريق تغيير الضوابير الضوئية لأن التغذية المنتظمة وصيانة نظام السمك عادة ما تحتاج إلى القيام بها خلال فترة الضوء (النهار) من الدورة. غير أنه يمكن من حيث المبدأ تعديل الجداول الزمنية بحيث تتكاثر الأسماك في أوقات مماثلة عن طريق الحفاظ على المورفتين على دورات مختلفة من الظلام الفاتح (وفي نظم مختلفة لتربية الأسماك) للتفريخ شبه المتزامن. وعلاوة على ذلك، إذا توفر نظامان للتحكم في درجة الحرارة، يمكن استزراع الأسماك في نظم مختلفة، ومن خلال التناوب بين ارتفاع درجات الحرارة أسبوعيا، يمكن أن يتم التفريخ وفقا لجدول أسبوعي وليس نصف شهري، مما يضاعف القدرة على الحصول على الأجنة.
سواء كانت تستخدم للبحث العلمي، والتدريس، أو التكنولوجيا الحيوية، A. mexicanus هو نظام نموذج ممتاز لاستكشاف الأسئلة الرائعة المحيطة تطور التنمية. للبحث العلمي، وهذا النظام مفيد للتحقيق في الآليات الجزيئية والوراثية والتطورية لتنمية العين والمرض. العين هي جهاز غير عادي من حيث هيكلها، وظيفة، والتنمية. يتم الحصول على الرؤية أثناء النمو الجنيني نتيجة لتشكيل منسق ونمو العديد من أنسجة العين المختلفة. ولا تزال الآليات الدقيقة التي يحدث بها ذلك غير معروفة إلى حد كبير. هيكل عيون الثدييات والأسماك متشابهة. الأنماط الظاهرية للعين الطبيعية من A. mexicanus هو نظام نموذج ممتاز لاستكشاف الآليات الجزيئية والخلوية والمسارات الوراثية المشاركة في نمو العين وانحطاط21،22. ويمكن استخدام هذه المعرفة لوضع استراتيجيات الوقاية والعلاجات لأمراض العين الموروثة. دراسات التصبغ هو مجال آخر في أي A. mexicanus هو تقديم مساهمة قيمة23. في التدريس، يمكن استخدام أجنة أ. مكسيكوس لتوضيح المبادئ العامة للتطور الجنيني وفي التجارب التعليمية للطلاب المبتدئين. في مجال التكنولوجيا الحيوية، مع التطور الأخير لتحرير الحمض النووي الجينومي24 وخاصة CRISPR/Cas-9 تكنولوجيا الهندسة الجينومية25،أ. الأجنة المكسيكية هي مورد قيم لاستكشاف وظائف الجينات. ويساعد على كل من هذه التطبيقات تفريخ كميات كبيرة من الأجنة عالية الجودة، وهو ما يمكن تحقيقه من خلال نظام تربية درجات الحرارة التدريجي الموصوف في هذا البلاغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر ديفيد مارتاسيان، ديدري هيسر، إيمي باركهورست، كريغ فوت، وماندي نغ على المساهمات القيمة في مختبر جيفري A. mexicanus مرفق الثقافة. ويدعم البحث في مختبر جيفري حاليا من قبل المعاهد القومية للصحة منحة EY024941.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
