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Developmental Biology

अस्टायनेक्स में अधिकतम प्रजनन और स्पॉनिंग के लिए वृद्धिशील तापमान परिवर्तन

Published: February 14, 2021 doi: 10.3791/61708
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, University of Maryland

Summary

यह लेख मैक्सिकन टेट्रा अस्टायनक्स मेक्सिकनसमें अधिकतम स्पॉन को प्रोत्साहित करने के लिए एक वृद्धिशील तापमान शासन के लिए बुनियादी प्रयोगशाला स्थितियों और प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है, जो विकासात्मक और विकासवादी अध्ययनों के लिए एक उभरता हुआ मॉडल है।

Abstract

मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax मैक्सिकनस,विकास और विकास में अध्ययन के लिए एक उभरती हुई मॉडल प्रणाली है। इस प्रजाति में आंखों की सतह (सतह मछली) और अंधी गुफा (गुफा मछली) रूपों का अस्तित्व रूपात्मक और व्यवहार विकास अंतर्निहित तंत्र से पूछताछ करने का अवसर प्रस्तुत करता है। गुफा मछली ने उपन्यास रचनात्मक और प्रतिगामी लक्षण विकसित किए हैं। रचनात्मक परिवर्तनों में स्वाद कलियों और जबड़े, पार्श्व रेखा संवेदी अंगों और शरीर की वसा में वृद्धि शामिल है। प्रतिगामी परिवर्तनों में आंखों का नुकसान या कमी शामिल है। मेलानिन पिगमेंटेशन, स्कूली शिक्षा व्यवहार, आक्रामकता, और नींद। प्रायोगिक रूप से इन परिवर्तनों से पूछताछ करने के लिए, बड़ी संख्या में पैदा किए गए भ्रूण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। चूंकि मूल ए मैक्सिकनस सतह मछली और गुफा मछली 1990 के दशक में टेक्सास और मेक्सिको में एकत्र किए गए थे, उनके वंशजों को नियमित रूप से जैफरी प्रयोगशाला में बड़ी संख्या में भ्रूण को नस्ल और अंडे देने के लिए प्रेरित किया गया है। हालांकि प्रजनन खाद्य बहुतायत और गुणवत्ता, प्रकाश अंधेरे चक्र, और तापमान द्वारा नियंत्रित किया जाता है, हमने पाया है कि वृद्धिशील तापमान परिवर्तन अधिकतम अंडे उत्तेजक में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । प्रजनन सप्ताह के पहले तीन दिनों में तापमान की क्रमिक वृद्धि 72 डिग्री एफ से 78 डिग्री एफ हो जाती है, जो उच्च गुणवत्ता वाले भ्रूणों की अधिकतम संख्या के साथ लगातार दो-तीन स्पॉन दिन प्रदान करता है, जिसके बाद स्पॉन सप्ताह के अंतिम तीन दिनों के दौरान तापमान में 78 डिग्री एफ से 72 डिग्री एफ तक धीरे-धीरे कमी आती है। इस वीडियो में दिखाई गई प्रक्रियाएं वृद्धिशील तापमान उत्तेजित स्पॉन के लिए प्रयोगशाला प्रजनन सप्ताह से पहले और उसके दौरान कार्यप्रवाह की रूपरेखा तैयार करती हैं।

Introduction

टेलीस्ट अस्टायनेक्स मैक्सिकनस में एक आंखों वाली सतह-निवास (सतह मछली) रूप है और कई अलग-अलग अंधे गुफा में रहने वाले (गुफा मछली) रूप1,2हैं। गुफा मछली सदा अंधेरे में और खाद्य सीमाओं के तहत विकसित हुई है, जिसके परिणामस्वरूप उपन्यास रचनात्मक और प्रतिगामी लक्षण3की उपस्थिति हुई है। रचनात्मक लक्षण स्वाद कलियों और जबड़े के आकार, पार्श्व रेखा के संवेदी अंगों, और वसा भंडार में वृद्धि शामिल हैं । प्रतिगामी लक्षणों में मेलेनिन पिगमेंटेशन, आंखों और व्यवहारों में कमी या कमी शामिल है, जैसे नींद, स्कूली शिक्षा और आक्रामकता। अस्टायनेक्स प्रणाली का एक गुण दोनों रूपों के बीच पूर्ण प्रजनन क्षमता है, जिससे रचनात्मक और प्रतिगामी विकास 4,5,6,7से जुड़े जीनोमिक क्षेत्र(एस)को निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक विशेषता लोकी (क्यूटीएल) मैपिंग का उपयोग करने की अनुमति है। ए मैक्सिकनस विकास का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद प्रणाली प्रदान करता है क्योंकि इसे प्रयोगशाला में अक्सर अंडे देने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। ए मैक्सिकनस के भ्रूण पारदर्शी होते हैं, जो बड़ी मात्रा में उत्पादित जेब्राफिश की तुलना में थोड़ा बड़े होते हैं, और लगभग 8-12 महीनों में यौन परिपक्व वयस्कों में विकसित होते हैं। उनकी अधिकतम स्पॉन क्षमता की अवधि लगभग 5 वर्ष है। यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट प्रजनन सप्ताह के दौरान ए मैक्सिकन संस्कृति सुविधा में आवश्यक कार्यप्रवाह का वर्णन करता है और इसमें मछली प्रणाली के रखरखाव और अधिकतम स्पॉन के लिए तापमान नियंत्रण व्यवस्था का विवरण शामिल है।

ए मैक्सिकनस एक उष्णकटिबंधीय मछली है जो चूना पत्थर के पठारों (सतह मछली) में और चूना पत्थर की गुफाओं (गुफा मछली)8में पूल में उत्पन्न नदियों में रहती है। चूना पत्थर कठिन पानी का उत्पादन करने के लिए घुल जाता है, और ए मैक्सिकनस कठिन पानी में पनपती है । कठिन पानी की स्थिति के अनुकूल मछली नमकीन स्थितियों की एक श्रृंखला बर्दाश्त कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर विशिष्ट लोगों में नस्ल9। स्पॉनिंग व्यवहार का प्रेरण कारकों के संयोजन से पूरा किया जाता है। क्योंकि मछली ठंडे खून वाले होते हैं और होमोसेस्टेसिस को बनाए रखने के लिए अपने पर्यावरण पर भरोसा करते हैं, इसलिए उनका चयापचय पर्यावरणीय परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील होता है और वे10तनाव ों पर अधिक तेजी से प्रतिक्रिया करते हैं। A. मेक्सिकन को जलीय प्रणालियों में पानी के प्रवाह, पीएच, चालकता, ऑस्मोटिक दबाव, प्रकाश व्यवस्था और पानी के तापमान की सावधानीपूर्वक विनियमित स्थितियों के तहत सुसंस्कृत किया जाना चाहिए।

जैफरी प्रयोगशाला में, मछली को दो रनिंग वॉटर सिस्टम में बनाए रखा जाता है: (1) यौन परिपक्वता से पहले युवा वयस्क मछली के लिए एक "बेबी सिस्टम" और (2) यौन परिपक्व, प्रजनन वयस्कों के लिए एक वयस्क (या मुख्य) प्रणाली। "बेबी सिस्टम" में 8 एल और 15 एल टैंक होते हैं जो चलने वाले पानी के साथ आपूर्ति करते हैं। "बेबी सिस्टम" को छोटे (1-10 एल) टैंकों में लार्वा से उगाए गए फ्राई और युवा कायापलट किशोरों द्वारा वरीयता प्राप्त है, जिसमें पानी का आदान-प्रदान साप्ताहिक किया जाता है। लार्वा, फ्राई और किशोर बेहद भोजन पर निर्भर हैं और जीवित रहने की उच्च दर सुनिश्चित करने के लिए दिन में एक बार लाइव भोजन (नमकीन झींगा) खिलाया जाना चाहिए। "बेबी सिस्टम" से युवा किशोरों के बारे में 1-1.5 साल के बाद वयस्क प्रणाली में रखा जाता है । सबसे पहले, उन्हें स्प्वेराइज्ड टेट्रा फ्लेक्स खिलाया जाता है, और आगे की वृद्धि के बाद उन्हें नियमित वयस्क भोजन शासन में स्थानांतरित कर दिया जाता है। यौन परिपक्वता का आकलन महिलाओं में पेट की मात्रा द्वारा किया जा सकता है, और सेक्स का निर्धारण करने के तरीकों को11वर्णित किया गया है। वयस्क प्रणाली में, 24 घंटे की अवधि के अनुसार 42 एल टैंकों में पानी का आदान-प्रदान स्वचालित रूप से 3 बार किया जाता है। वयस्क प्रणाली दृश्य निरीक्षण और स्वचालित तापमान, पीएच, और जांच से चालकता रीडिंग द्वारा दैनिक निगरानी की जाती है। इष्टतम पीएच 7.4 के आसपास है और 6.8-7.5 के बीच हो सकता है, सिस्टम का आधार तापमान 72/73 डिग्री एफ है, और आदर्श चालकता 600-800 एमएस के बीच होती है। स्वचालित रीडिंग एक नियंत्रक स्क्रीन पर प्रदर्शित की जाती है, और पूरे सिस्टम में वितरित पानी के दबाव की दृश्य जांच पढ़ी जाती है। पानी की गुणवत्ता पर स्वतंत्र जांच तापमान का परीक्षण और पीएच, अमोनिया, और नाइट्रेट के लिए पानी की गुणवत्ता मापदंडों को मापने के द्वारा साप्ताहिक किया जाता है एक कोलोरिमेट्रिक परीक्षण का उपयोग कर । अमोनिया और नाइट्रेट के स्तर को सिस्टम में लाभकारी बैक्टीरिया (जैसे, न्यूटिन चक्र) जोड़कर शून्य के करीब रखा जाता है। कमरे की रोशनी को 14 घंटे की रोशनी और 10 घंटे के अंधेरे समय में समायोजित टाइमर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। ऊपर उल्लिखित समग्र जल गुणवत्ता मापदंडों के अलावा, प्रजनन सप्ताह के दौरान निम्नलिखित विचारों पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है।

पहला विचार फोटोपीरियोड है, क्योंकि मछली (प्रयोगशाला में गुफा मछली) अपनी सर्कैडियन घड़ी स्थापित करने के लिए प्रकाश चक्रों पर निर्भर करती है। सर्कैडियन लय प्रजनन और भोजन से प्रतिरक्षा प्रणाली स्वास्थ्य12,13 तक सब कुछ प्रभावित कर सकते हैं और अधिकतम स्वास्थ्य लाभों के अनुरूप होना चाहिए। मछली को 14 घंटे की रोशनी और 10 घंटे डार्क फोटोपीरिड पर रनिंग-वॉटर सिस्टम में बनाए रखा जाता है । सतह मछली आम तौर पर एक घंटे के बाद सिस्टम अंधेरा हो गया है पैदा शुरू, और इस अवधि के दौरान शुरू की प्रकाश के साथ हस्तक्षेप और अंडे समाप्त कर सकते हैं । अंधी गुफा मछली के स्पॉन प्रकाश से कम परेशान होते हैं। सतह मछली पैदा करने की तुलना में, गुफा मछली पैदा करने में देरी हो रही है, आमतौर पर चार से पांच घंटे के बाद प्रणाली अंधेरा हो गया है शुरू ।

दूसरा विचार पोषण है। वयस्क मछली को आम तौर पर दिन में एक बार टेट्रा गुच्छे का आहार खिलाया जाता है। स्पॉनिंग से पहले, मछली को प्रोटीन युक्त आहार खिलाया जाता है जो टेट्रा गुच्छे और अन्य भोजन की अतिरिक्त मात्रा के साथ पूरक होता है: अंडे की जर्दी के गुच्छे और कभी-कभी कैलिफोर्निया ब्लैकवार्म(लुब्रिकुलस वेरगेटस)रहते हैं जो पिछले स्पॉनिंग चक्र के दौरान अंडे के उत्पादन के कारण प्रोटीन हानि की भरपाई करते हैं। प्रजनन सप्ताह के दौरान, मछली को प्रति दिन दो बार खिलाया जाता है, एक बार सुबह और फिर दोपहर/शाम में । दिन में केवल एक बार मछली खिलाने लेकिन भोजन के एक बहुत बड़े हिस्से के साथ बचा जाना चाहिए, क्योंकि इससे कुपोषण14हो सकता है ।

तीसरा विचार अंतरिक्ष है । अंतरिक्ष आवश्यकताओं को एक वयस्क के औसत शरीर द्रव्यमान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यवहार विचार, जैसे कि मछली स्कूली शिक्षा व्यवहार या आक्रामक व्यवहार है पर आधारित हैं । अधिक या कम भीड़ टैंक बढ़ आक्रामकता और लगातार तनाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, मछली अपने टैंक साथियों से चोट के लिए असुरक्षित बनाने और15अंडे में भाग लेने के लिए अनिच्छुक । हम आम तौर पर 42 एल टैंक प्रति 10-20 मछली घर।

चौथा विचार तापमान है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, मछली ठंडे खून वाले जानवर हैं और शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए पर्यावरण पर भरोसा करते हैं। क्योंकि तापमान मेटाबोलिक प्रक्रियाओं पर सीधा प्रभाव पड़ता है, तापमान में परिवर्तन मछली16में व्यवहार परिवर्तन को ट्रिगर कर सकते हैं । इस प्रजनन कार्यक्रम में तापमान में दो सप्ताह के चक्र होते हैं: पहले सप्ताह 78 डिग्री एफ के लिए एक तापमान स्पाइक का परिचय देता है, और अगले सप्ताह 72 डिग्री एफ के स्थिर तापमान को बनाए रखता है। पहले (प्रजनन) सप्ताह के दौरान, प्लास्टिक धार प्रजनन जाल हर शाम टैंकों के तल पर रखा जाता है । प्रजनन जाल टैंकों और अंडे में मछली के बीच एक बाधा के रूप में काम करते हैं, जो अन्यथा भस्म हो जाएगा। तापमान प्रति दिन 2 डिग्री एफ से मध्य सप्ताह तक अधिकतम 78 डिग्री एफ तक बढ़ाया जाता है, और इस सप्ताह की पहली 2-3 शाम में प्रकाश चक्र के अनुसार स्पॉन को प्रेरित किया जाता है। तब तापमान सप्ताह के शेष दिनों के दौरान 2 डिग्री एफ वेतन वृद्धि से 72 डिग्री एफ तक कम हो जाता है, और अगले प्रजनन सप्ताह की शुरुआत तक आधार तापमान बनाए रखा जाता है। प्रजनन आमतौर पर मछली के समय को ठीक करने की अनुमति देने के लिए महीने में दो बार से अधिक नहीं प्रेरित किया जाता है।

कुल मिलाकर, यह विधि लंबे समय तक उच्चतम गुणवत्ता वाले भ्रूणों की बड़ी मात्रा में पैदा करने की अनुमति देती है।

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Protocol

इस प्रक्रिया को मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क (वर्तमान में IACUC 469 #R-NOV-18-59 के संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित किया गया है; परियोजना 1241065-1)

Figure 1
चित्रा 1. एक प्रजनन सप्ताह और एक गैर प्रजनन सप्ताह के दौरान कैलेंडर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. सोमवार

  1. सुबह 9-10 बजे, पानी की जांच करें और नीचे 1.1.1-4 कदम करें।
    1. थर्मामीटर का उपयोग करके कमरे, टैंक और जलाशय के तापमान को रिकॉर्ड करें।
    2. एक कोलोरिमेट्रिक टेस्ट किट के साथ अमोनिया, नाइट्रेट और नाइट्रेट के स्तर को रिकॉर्ड करें।
    3. मॉनीटरिंग सिस्टम के साथ-साथ कोलोरमेट्रिक टेस्ट किट से पीएच रिकॉर्ड करें।
    4. कारबॉय मॉनिटर और मुख्य प्रणाली मॉनिटर से चालकता रिकॉर्ड करें।
  2. सुबह 10 बजे से शुरू होकर सभी मछलियों को खिलाएं।
    1. वयस्क प्रणाली में सभी मछलियों को टेट्रा गुच्छे के साथ खिलाएं, युवा मछली के साथ टैंकों में गुच्छे को कुचलें। मछली के एक टैंक के रूप में केवल कई गुच्छे के रूप में फ़ीड 3-5 मिनट में पूरी तरह से भस्म कर सकते हैं, एक "उंगली चुटकी" के बारे में ।
  3. भ्रूण के विकास के फिंगरबाउल घर और जरूरत पड़ने पर पानी बदलने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले इनक्यूबेटर की जांच करें ।
    1. भ्रूण इनक्यूबेटर खोलें और सभी जलाशयों में जल स्तर की जांच करें। यदि वे पानी पर कम चल रहे हैं, तो सिस्टम पानी जोड़ें। इनक्यूबेटर तापमान सेटिंग्स की जांच करें। 73-77 डिग्री एफ (23-25 डिग्री सेल्सियस) पर भ्रूण बढ़ाएं।
  4. लाइव फीड को साफ करें।
    1. ब्लैकवार्म को साफ करने के लिए, लाइव फीड रेफ्रिजरेटर से अपनी संस्कृतियों वाले खुले टपरवेयर बेसिनों को हटा दें और सिंक में कीड़ा समूहों के ऊपर अतिरिक्त पानी डाल दें। आसुत पानी का उपयोग करना, जब तक डालना-बंद पानी स्पष्ट नहीं होता है तब तक बार-बार कीड़े को निलंबित और कुल्ला करें।
    2. पर्याप्त साफ पानी जोड़ें ताकि कीड़ा समूह लगभग आधे कवर हों। लाइव फीड रेफ्रिजरेटर में शेष कीड़े को बदलें, खुला।
  5. मछली खिलाओ।
    1. पहले खिलाने के बाद कम से कम 30 मिनट, टैंकों में मछली खिलाएं जिसमें प्रजनन अंडे की जर्दी के गुच्छे, काले कीड़े या दोनों के साथ वांछित है। टैंक प्रति जर्दी गुच्छे का एक "फिंगरपिंक" जोड़ें। टैंक में प्रत्येक मछली को लगभग 5-10 कीड़े का उपभोग करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त ब्लैकवार्म क्लस्टर जोड़ें।
  6. सुबह 10 बजे से दोपहर 1 बजे तक पानी का तापमान 74 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचा।
  7. आवश्यकतानुसार प्रजनन टैंकों को स्क्रब करें और प्रजनन जाल सेट करें।
  8. टंकियों को साफ करें और आखिरी फीडिंग के कम से कम एक घंटे बाद जाल रखें। उन सभी टैंकों को साफ करें जो जाल पहले से रखे जाते हैं। प्रजनन जाल को सावधानी से सेट करें ताकि टैंक को हवा की आपूर्ति में हस्तक्षेप न किया जा सके।

2. मंगलवार

  1. भ्रूण ले लीजिए और सभी प्रजनन जाल धो लें।
    1. सुबह 9-10 बजे, वयस्क प्रणाली टैंकों के नीचे से प्रजनन जाल हटा दें। धीरे से एक हाथ में भ्रूण कुल्ला-कारबॉय से जुड़ी नली का उपयोग कर नेट आयोजित, और हाथ से आयोजित शुद्ध साफ प्रणाली पानी की एक उंगली में भ्रूण को निष्कासित करने के लिए उलटा ।
    2. भ्रूण के प्रत्येक सेट को इकट्ठा करें और धोएं, और फिर 0.00003% मेथिलीन ब्लू (नीला पानी) युक्त स्वच्छ प्रणाली पानी की एक उंगली में रखें। यदि एक ही टैंक से असाधारण रूप से बड़ी संख्या में भ्रूण है, तो उन्हें कई कटोरे में अलग करें। जीवित भ्रूण की एकाग्रता प्रत्येक उंगली के मुर्गे में नीले पानी के प्रति 200 एमएल के बारे में 100 होनी चाहिए।
    3. प्रकाशित ए मैक्सिकन विकासात्मक समय सारणी17का उपयोग करते हुए एक माइक्रोस्कोप के नीचे भ्रूण का मंचन करके निषेचन के समय का अनुमान लगाएं ।
    4. अक्सर भ्रूण युक्त उंगलियों की निगरानी करें। एक पाश्चर पिपेट के साथ मृत या विकृत भ्रूण और मलबे, जैसे कि बिना खाए भोजन या मल को हटा दें। उंगलियों के मुर्गों में नीला पानी बार-बार बदलें।
    5. फिंगरबाउंस को 5-7 दिनों तक इनक्यूबेटर में रखें। इस समय, जर्दी का उपयोग किया गया है और आगे के विकास के लिए जीवित नमकीन झींगा के साथ संस्कृतियों को खिलाना आवश्यक है।
  2. स्पॉन डेटा लें।
    1. भ्रूण को छोड़ने वाले हर टैंक के लिए, निम्नलिखित जानकारी रिकॉर्ड करें।
      1. तारीख और टंकी नंबर रिकॉर्ड करें।
      2. गिरा भ्रूण की अनुमानित संख्या रिकॉर्ड(चित्रा 2):
        उच्च (500+)
        मध्यम (200-500)
        कम (<200)
      3. रिकॉर्ड भ्रूण की गुणवत्ता गिरा दिया(चित्रा 2):
        उच्च (>75% जीवित)
        मध्यम (25-50% जीवित)
        कम (<25% जीवित)
      4. एस्टायनेक्स मेक्सिकन स्टेजिंग टेबल17से परामर्श करके मूल स्पॉनिंग समय का अनुमान लगाएं।
      5. जब मछली पैदा की थी तो सिस्टम को उस तापमान को रिकॉर्ड करें।
  3. सभी मछलियों को खिलाएं।
  4. पानी का तापमान 76 डिग्री एफ तक सेट करें।
  5. लाइव फीड तैयार करें।
  6. मछली #2 खिलाएं।
  7. जाल रीसेट करने से पहले टैंक और स्क्रब से अतिरिक्त भोजन और मलबे स्कूप करें।

3. बुधवार

  1. चरण 2.1-2.2 दोहराएं। भ्रूण ले लीजिए और सभी प्रजनन जाल धोने।
  2. पहले की तरह स्पॉनिंग डेटा लें।
  3. पहले की तरह पानी की जांच करें।
  4. सभी मछलियों को खिलाएं।
  5. पानी का तापमान 78 डिग्री एफ तक सेट करें।
  6. लाइव फीड तैयार करें।
  7. इनक्यूबेटर में भ्रूण की जांच करें।
    1. साफ और उंगलियों में भ्रूण के पानी को बदलने के लिए कि अंततः सामान्य वयस्क प्रजनन स्टॉक की भरपाई के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। मेथिलीन ब्लू-ट्रीटेड सिस्टम पानी का इस्तेमाल करें।
  8. मछली को फिर से खिलाएं।
  9. जरूरत के अनुसार टैंक साफ करें और जाल रीसेट करें।

4. गुरुवार

  1. चरण 2.1-2.2 दोहराएं। भ्रूण ले लीजिए और प्रजनन जाल धोने और स्टोर करें।
  2. पहले की तरह स्पॉनिंग डेटा लें।
  3. पानी का तापमान 76 ° F तक सेट करें।
  4. लाइव फीड को साफ करें।
  5. सभी अलग-अलग टैंकों को साफ करें।
  6. इनक्यूबेटर में भ्रूण की जांच करें।
  7. मछली #2 खिलाएं।

5. शुक्रवार

  1. सभी मछलियों को खिलाएं।
  2. पानी का तापमान 74 डिग्री एफ तक सेट करें।
  3. लाइव फीड को साफ करें।
  4. इनक्यूबेटर में भ्रूण की जांच करें।

6. शनिवार

  1. मछली खिलाओ।

7. रविवार

  1. मछली खिलाओ।

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Representative Results

हम आम तौर पर नस्ल और सतह मछली के वंशज मूल रूप से सैन लुइस Potosi में Nacimiento डेल रियो Choy में एकत्र अंडे, मेक्सिको (रियो Choy सतह मछली) और सैन सोलोमन स्प्रिंग्स बालनोर्हिया राज्य पार्क, टेक्सास (टेक्सास सतह मछली) और गुफा मछली से व्युत्पन्न Cueva de El Pachón (Pachón गुफा मछली) Tamaulipas, मेक्सिको में, और Cueva de लॉस Sabinos (लॉस Sabinos गुफा मछली) और Sotano डे ला Tinaja (Tinaja गुफा मछली) सैन लुइस पोटोसी में मेक्सिको।

एक प्रजनन सप्ताह के दौरान, विभिन्न टैंकों के लिए डेटा एकत्र किया जाता है। प्रत्येक टैंक में पैदा किए गए भ्रूण मात्रा और गुणवत्ता के लिए मनाए जाते हैं। इसकी मात्रा उच्च, मध्यम या कम दर्ज की जाती है। उच्च की मात्रा दर्ज की जाती है यदि गिराए गए भ्रूणों की संख्या 500 से अधिक है, तो यदि गिराए गए भ्रूणों की संख्या 200-500 के बीच है, तो कम की मात्रा दर्ज की जाती है यदि गिराए गए भ्रूणों की संख्या 200 से कम है। गुणवत्ता इसी तरह उच्च, मध्यम या निम्न के रूप में दर्ज की गई है। उच्च की एक गुणवत्ता दर्ज की जाती है अगर कटोरे में भ्रूण के ७५% से अधिक जीवित हैं, मध्यम की एक गुणवत्ता दर्ज की जाती है अगर कटोरे में भ्रूण के बारे में 25% से ७५% जीवित हैं, और कम की गुणवत्ता दर्ज की जाती है अगर भ्रूण के 25% से कम जीवित हैं । मात्रा और गुणवत्ता के इन संकेतों को तब उच्च 3, मध्यम 2 होने और कम होने के साथ एक संख्या सौंपी जाती है। यदि कोई भ्रूण पैदा नहीं किया गया था या कोई जीवित भ्रूण पैदा में, 0 की एक संख्या सौंपा है ।

रियो चोय और टेक्सास सतह मछली और लॉस सबिनोस, तिनाजा, और Pachón गुफा मछली के लिए २०२० के मार्च के माध्यम से २०१७ के जुलाई से प्रजनन डेटा चित्रा 2में दिखाया गया है । डेटा प्रजनन सप्ताह द्वारा विश्लेषण किया गया और एक ही प्रजनन सप्ताह के दौरान भ्रूण इकट्ठा करने के प्रत्येक दिन से जिसके परिणामस्वरूप संख्या औसत द्वारा । डेटा इंगित करता है प्रजनन रियो Choy और टेक्सास सतह मछली में और Pachón गुफा मछली में साल भर में निरंतर था । मात्रा और सबसे रियो Choy सतह मछली की गुणवत्ता कम और उच्च के बीच था, जबकि मात्रा और सबसे टेक्सास सतह मछली और Pachón गुफा मछली की गुणवत्ता कम और मध्यम के बीच था । स्पॉन की घटना तिनाजा या लॉस सबिनोस गुफा मछली में निरंतर नहीं थी: देर से गर्मियों (जुलाई) से शरद ऋतु (अक्टूबर) के दौरान स्पॉन कम या न के बराबर था। हालांकि स्पॉन का निम्नतम स्तर लॉस सबिनोस गुफा मछली के लिए दर्ज किया गया था, लेकिन भ्रूण की गुणवत्ता सबसे अच्छी थी। सामान्य तौर पर, सतह मछली गुफा मछली की तुलना में बेहतर मात्रा और गुणवत्ता दिखाती है।

Figure 2
चित्रा 2। २०१७ के जुलाई से २०२० के मार्च तक विभिन्न सतह मछली और गुफा मछली आबादी के लिए प्रजनन डेटा । ऊपर से नीचे तक रियो चोय सतह मछली, टेक्सास सतह मछली, पचोन गुफा मछली, टीनाजा गुफा मछली, और लॉस सबिनोस गुफा मछली है। अटूट लाइनें: अंडे की गुणवत्ता। टूटी हुई रेखाएं: अंडे की मात्रा। कोई लाइनों के साथ सप्ताह अवधि में पैदा करने का प्रयास नहीं किया गया था प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अस्टायनेक्स मेक्सिकनस एक उपन्यास जैविक मॉडल है जो अक्सर पैदा होता है और प्रयोगशाला में आसानी से पैदा किया जा सकता है1,2. क्योंकि हम विकास तंत्र है कि ए मैक्सिकन गुफा मछली में विकासवादी परिवर्तन आबाद में रुचि रखते हैं, उत्पादन और भ्रूण के उपयोग हमारे अनुसंधान लक्ष्यों के लिए महत्वपूर्ण है । मछली के एक वयस्क स्टॉक को बनाए रखने का प्राथमिक उद्देश्य भ्रूण और विकासात्मक प्रयोगों में उपयोग के लिए युवा भून के उत्पादन और वयस्क प्रजनन स्टॉक की भरपाई के लिए है । कभी-कभी, वयस्कों का उपयोग शरीर विज्ञान, व्यवहार या आनुवंशिक प्रयोगों के लिए भी किया जा सकता है। आनुवांशिक प्रयोगों के लिए युग संभोग या इन विट्रो निषेचनकीआवश्यकता होती है । इन विट्रो निषेचन जानवरों के लिए स्पॉन व्यवहार का प्रदर्शन19 टैंकों से हटाया जा सकता है और तापमान प्रेरित प्रजनन शासन के दौरान पार करने के लिए इस्तेमाल किया ।

अनुसंधान के लिए भ्रूण की गुणवत्ता और मात्रा को अधिकतम करने के लिए, वहां परिचालन विवरण है कि प्रजनन सप्ताह से पहले ध्यान देने की आवश्यकता है । टैंकों में मछली में हेरफेर करते समय, केवल नामित हाथ से आयोजित जाल का उपयोग करें, उन्हें प्रत्येक उपयोग के बीच एक शुद्ध भिगोने वाले समाधान में विसर्जित करें, और टैंकों के बीच संदूषण को रोकने के लिए उपयोगों के बीच गर्म नल के पानी से उन्हें कुल्लाएं। मछली की देखभाल के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को सावधानी से धोएं और कीटाणुरहित करें। टैंकों में बदलने से पहले सिस्टम के पानी में प्रजनन जाल निकालें और साफ करें। सप्ताह के अंत में, सभी प्रजनन जाल मछली के कमरे में अलमारियों पर सूखी संग्रहीत कर रहे हैं । एक प्रजनन सप्ताह के दौरान, प्रजनन जाल में भ्रूण के लिए प्रत्येक टैंक की जांच करें या मछली का प्रदर्शन करने के लिए स्पॉन व्यवहार (यानी, एक दूसरे के खिलाफ बनती हलकों में चारों ओर तैराकी), के रूप में उन टैंकों में महिलाओं की संभावना अंडे के लिए तैयार हैं । यह फोटोपीरियोड के अंधेरे घंटों के दौरान लाल बत्ती का उपयोग करके किया जाना चाहिए। A. मेक्सिकनस बादलों में अंडे और शुक्राणु बिखरने से अंधेरे में अंडे। के बारे में 10-20 मछली की आबादी के साथ एक टैंक और के बारे में 1:1 के महिला अनुपात के लिए एक पुरुष के लिए एक टैंक प्रति स्पॉन में ५०० निषेचित भ्रूण का उत्पादन कर सकते हैं, और मछली के प्रत्येक टैंक एक प्रजनन सप्ताह के दौरान दो या तीन बार अंडे हो सकता है । एक अच्छा अंडे में, अधिकांश भ्रूण हैचिंग, एक महत्वपूर्ण चरण के माध्यम से जीवित रहेंगे। संस्कृतियों की अक्सर जांच की जानी चाहिए और किसी भी खाद्य अवशेष या परजीवी सहित मृत या विकृत भ्रूण, या मलबे को हटा दिया जाना चाहिए। ज्यादातर जीवित भ्रूण के साथ संस्कृतियों को मैन्युअल रूप से मृत या असामान्य भ्रूण (जो अंततः मर जाएगा) और एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके मलबे को हटाने के द्वारा भ्रूण और प्रारंभिक लार्वा अवधि के दौरान हर कुछ घंटों में "साफ" किया जाना चाहिए। मृत भ्रूण के एक बड़े हिस्से के साथ संस्कृतियों अभी भी ताजा नीले पानी के साथ नई उंगलियों के लिए आम तौर पर विकसित भ्रूण स्थानांतरित करके इस्तेमाल किया जा सकता है । आमतौर पर, इस प्रक्रिया को कई बार दोहराया जाना चाहिए जीवित भ्रूण की शुद्धतम संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए । या तो मामले में, प्रति 200 एमएल लगभग 100 भ्रूणों की अंतिम एकाग्रता आदर्श है क्योंकि भ्रूण की भीड़ विकास को प्रभावित कर सकती है, विशेष रूप से गुफा मछली के लिए। संस्कृतियों को समय-समय पर उंगलियों से अधिकांश पानी को हटाकर और ताजे नीले पानी के साथ इसके साथ बदलने के द्वारा समय के साथ "साफ" किया जाना चाहिए। संस्कृतियों "साफ" अक्सर आमतौर पर भ्रूण की उच्चतम गुणवत्ता प्रदान करते हैं ।

प्राकृतिक प्रजनन के अलावा, हार्मोनल उत्तेजना20 या इन विट्रो निषेचन18 भी भ्रूण प्राप्त करने में संभावित रूप से उपयोगी है। इन उद्देश्यों के लिए, हालांकि, मछली स्वस्थ और प्राकृतिक स्पॉनिंग (स्पॉनिंग व्यवहार का प्रदर्शन) के लिए तैयार होना चाहिए, और तापमान-प्रेरित स्पॉन की स्थिति के तहत प्राप्त की तुलना में भ्रूण की एक बहुत छोटी उपज की उम्मीद की जानी चाहिए।

ऊपर वर्णित शर्तों के तहत तापमान प्रेरित प्रजनन की एक सीमा यह है कि सतह मछली और गुफा मछली अलग समय पर अंडे, जल्दी शाम के दौरान पूर्व और आधी रात के बाद से सुबह तक बाद । फोटोपीरियोड को स्थानांतरित करके इस स्थिति से बचा नहीं जा सकता क्योंकि नियमित रूप से खिलाने और मछली प्रणाली रखरखाव को आमतौर पर चक्र की प्रकाश (दिन-समय) अवधि के दौरान किया जाना चाहिए। सिद्धांत रूप में, हालांकि, कार्यक्रम को समायोजित किया जा सकता है ताकि मछली एक साथ-साथ स्पॉन के लिए विभिन्न प्रकाश-अंधेरे चक्रों (और विभिन्न मछली पालन प्रणालियों में) पर दो रूपों को बनाए रखकर समान समय पर अंडे दे। इसके अलावा, यदि दो तापमान नियंत्रण प्रणाली उपलब्ध हैं, मछली विभिंन प्रणालियों में सुसंस्कृत किया जा सकता है, और साप्ताहिक तापमान उगता बारी से, स्पॉन एक साप्ताहिक के बजाय द्विमासिक अनुसूची पर किया जा सकता है, भ्रूण प्राप्त करने के लिए क्षमता दोगुनी ।

चाहे वैज्ञानिक अनुसंधान, शिक्षण, या जैव प्रौद्योगिकी के लिए इस्तेमाल किया, ए मैक्सिकन विकास के विकास के आसपास के आकर्षक सवालों की खोज के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है । वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए, यह प्रणाली आंखों के विकास और रोग के आणविक, आनुवंशिक और विकासात्मक तंत्र की जांच के लिए उपयोगी है। आंख अपनी संरचना, कार्य और विकास के मामले में एक असाधारण अंग है। दृष्टि कई अलग आंखों के ऊतकों के समन्वित गठन और विकास का एक परिणाम के रूप में भ्रूण के विकास के दौरान प्राप्त किया जाता है। सटीक तंत्र जिसके द्वारा यह होता है अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं । स्तनधारी और मछली आंखों की संरचना समान है। ए मैक्सिकनस की प्राकृतिक आंखों के फेनोटाइप एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है जो आंखों के विकास और पतन21,22में शामिल आणविक और सेलुलर तंत्र और आनुवंशिक मार्गों का पता लगाने के लिए है । इस ज्ञान का उपयोग विरासत में मिली आंखों की बीमारियों के लिए रोकथाम रणनीतियों और उपचार विकसित करने के लिए किया जा सकता है। पिगमेंटेशन अध्ययन एक अन्य क्षेत्र है जिसमें ए मैक्सिकन एसएक मूल्यवान योगदान कर रहा है23. शिक्षण में, ए मैक्सिकन भ्रूण भ्रूण के विकास के सामान्य सिद्धांतों को समझाने के लिए और शुरुआत छात्रों के लिए अनुदेशात्मक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता है। जैव प्रौद्योगिकी में, जीनोमिक डीएनए संपादन24 और विशेष रूप से CRISPR/कैस-9 जीनोमिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी25, ए मैक्सिकन भ्रूण जीन कार्यों का पता लगाने के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं के हाल के विकास के साथ । इन अनुप्रयोगों में से प्रत्येक उच्च गुणवत्ता वाले भ्रूण की बड़ी मात्रा के अंडे से सहायता प्राप्त है, जो इस संचार में वर्णित वृद्धिशील तापमान प्रजनन शासन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डेविड मार्टासियन, डेड्रे हेसर, एमी पार्कहर्स्ट, क्रेग फुटे और मैंडी एनजी को जेफरी प्रयोगशाला ए मैक्सिकनस संस्कृति सुविधा में मूल्यवान योगदान के लिए धन्यवाद देते हैं। जैफरी प्रयोगशाला में अनुसंधान वर्तमान में NIH अनुदान EY024941 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blackworms Eastern Aquatics, Lancaster, PA None
Breeding Nets Custom made
Brine shrimp eggs AquaCave Lake Forest, IL. None
Colorimetric test kit Petco SKU:11916 API Freshwater pH Test Kit
Egg yolk flakes Pentair, Minneapolis, MN None
Fingerbowls Carolina Biological Supply 741004 Culture dishes, 4.5 in, 250 mL
Hand held nets Any Pet Store
Incubator for embryos Fisher Scientific 51-029-321HPM 405 L
Instant Ocean sea salts Spectrum Brands, Blacksburg, VA None
Methylene Blue Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M9140
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-20 5.75 in.
Net soaking solution Any Pet Store
Nutrafin Cycle Amazon None Bacterial boost
Refrigerator for live feed Any source
Stereomicroscope Any source
Thermometer Any source
Tetra Tropical Crisps Spectrum Brands, Blacksburg, VA None

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References

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रिऐक्शन अंक 168 अस्टायनक्स मेक्सिकनस,वृद्धिशील तापमान गुफा मछली सतह मछली प्रजनन अधिकतम स्पॉनिंग भ्रूण विकासात्मक अध्ययन
<em>अस्टायनेक्स</em> में अधिकतम प्रजनन और स्पॉनिंग के लिए वृद्धिशील तापमान परिवर्तन
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Ma, L., Dessiatoun, R., Shi, J.,… More

Ma, L., Dessiatoun, R., Shi, J., Jeffery, W. R. Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus. J. Vis. Exp. (168), e61708, doi:10.3791/61708 (2021).

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