Summary
Denne artikkelen skisserer de grunnleggende laboratorieforholdene og protokollene for et inkrementelt temperaturregime for å stimulere maksimal gyting i den meksikanske tetra Astyanax mexicanus, som er en ny modell for utviklingsmessige og evolusjonære studier.
Abstract
Den meksikanske tetra, Astyanax mexicanus, er et fremvoksende modellsystem for studier i utvikling og evolusjon. Eksistensen av øyeoverflate (overflatefisk) og blind hule (hulefisk) morphs i denne arten presenterer en mulighet til å forhøre mekanismene som ligger til grunn for morfologisk og atferdsmessig evolusjon. Hulefisk har utviklet nye konstruktive og regressive egenskaper. De konstruktive endringene inkluderer økning i smaksløker og kjever, laterale linjesensoriske organer og kroppsfett. De regressive endringene inkluderer tap eller reduksjon av øyne. melaninpigmentering, skolegang, aggresjon og søvn. For å eksperimentelt forhøre disse endringene, er det avgjørende å oppnå et stort antall gytede embryoer. Siden den opprinnelige A. mexicanus overflatefisk og hulefisk ble samlet i Texas og Mexico på 1990-tallet, har deres etterkommere rutinemessig blitt stimulert til å avle og gyte et stort antall embryoer tomånedert i Jeffery-laboratoriet. Selv om avl styres av matoverflod og kvalitet, lyse mørke sykluser og temperatur, har vi funnet ut at inkrementelle temperaturendringer spiller en nøkkelrolle i å stimulere maksimal gyting. Den gradvise temperaturøkningen fra 72 °F til 78 °F i de tre første dagene av en avlsuke gir to-tre påfølgende gytedager med maksimalt antall embryoer av høy kvalitet, som deretter etterfølges av en gradvis temperaturreduksjon fra 78 °F til 72 °F i løpet av de siste tre dagene av gyteuken. Prosedyrene som vises i denne videoen skisserer arbeidsflyten før og under en laboratorieavlsuke for trinnvis temperatur stimulert gyting.
Introduction
Teleost Astyanax mexicanus har en øye overflate-bolig (overflate fisk) form og mange forskjellige blinde hule-bolig (hule fisk) danner1,2. Hulefisk har utviklet seg i evig mørke og under matbegrensninger, noe som resulterer i utseendet på nye konstruktive og regressive egenskaper3. De konstruktive egenskapene inkluderer økning i smaksløker og kjevestørrelse, sensoriske organer i sidelinjen og fettreserver. De regressive egenskapene inkluderer tap eller reduksjon av melaninpigmentering, øyne og atferd, for eksempel søvn, skolegang og aggresjon. Et attributt for Astyanax-systemet er fullstendig fruktbarhet mellom de to formene, slik at bruk av kvantitativ egenskap loci (QTL) kartlegging for å bestemme genomiske regionen(e) knyttet til konstruktiv og regressiv evolusjon4,5,6,7. A. mexicanus tilbyr et fordelaktig system for å studere utvikling fordi det kan induseres til å gyte ofte i laboratoriet. Embryoene til A. mexicanus er gjennomsiktige, litt større enn sebrafisk, produsert i store mengder, og utvikler seg til seksuelt modne voksne på ca 8-12 måneder. Deres periode med maksimal gytekapasitet er ca 5 år. Denne protokollen beskriver arbeidsflyten som trengs i et A. meksikansk kulturanlegg i løpet av en typisk avlsuke og inkluderer detaljer om vedlikehold av fiskesystemet og temperaturkontrollregimet for maksimal gyting.
A. mexicanus er en tropisk fisk som bor i elver med opprinnelse i kalksteinsplatåer (overflatefisk) og i bassenger i kalksteinsgrotter (hulefisk)8. Kalkstein oppløses for å produsere hardt vann, og A. mexicanus trives i hardt vann. Fisk tilpasset harde vannforhold kan tolerere en rekke salte forhold, men generelt avle i spesifikke9. Induksjon av gyteadferd oppnås ved en kombinasjon av faktorer. Fordi fisk er kaldblodige og er avhengige av deres miljø for å opprettholde homeostase, er stoffskiftet følsomt for miljøendringer, og de reagerer raskere på stressorer10. A. mexicanus bør dyrkes i vannsystemer under nøye regulerte forhold for vannstrøm, pH, konduktivitet, osmotisk trykk, belysning og vanntemperaturer.
I Jeffery-laboratoriet opprettholdes fisk i to rennende vannsystemer: (1) et "babysystem" for ung voksenfisk før seksuell modenhet og (2) et voksent (eller hoved) system for seksuelt modne, avl voksne. "Babysystemet" består av 8 L og 15 L tanker som leveres med rennende vann. "Babysystemet" er sådd av yngel og unge metamorfoserte ungdommer dyrket fra larver i mindre (1-10 L) tanker, hvor vann utveksles ukentlig. Larver, yngel og ungdommer er ekstremt matavhengige og må mates levende mat (saltlake reker) en gang om dagen for å sikre en høy overlevelse. Unge ungdommer fra "babysystemet" plasseres i voksensystemet etter ca 1-1,5 år. Først blir de matet pulveriserte tetraflak, og etter videre vekst overføres de til det vanlige voksenfôringsregimet. Seksuell modenhet kan vurderes ved abdominal volum hos kvinner, og metoder for å bestemme kjønn har blitt beskrevet11. I voksensystemet byttes vann automatisk i 42 L tanker 3 ganger per 24-timers periode. Voksensystemet overvåkes daglig ved visuell inspeksjon og automatisk temperatur, pH og konduktivitetsavlesninger fra sonder. Den optimale pH er rundt 7,4 og kan variere mellom 6,8-7,5, systemets basistemperatur er 72/73 °F, og de ideelle ledningsevneområdene mellom 600-800 mS. Automatiske avlesninger vises på en kontrollerskjerm, og visuelle kontroller av vanntrykk leses ved strømningsmålere fordelt over hele systemet. Uavhengige kontroller av vannkvaliteten gjøres ukentlig ved å teste temperatur og måle vannkvalitetsparametere for pH, ammoniakk og nitrat ved hjelp av en kolorimetrisk test. Ammoniakk- og nitratnivåer holdes på eller nær null ved å tilsette gunstige bakterier (f.eks. Nutafin Cycle) til systemet. Rombelysning styres av en timer justert til 14-timers lys og 10-timers mørke perioder. I tillegg til de generelle vannkvalitetsparametrene nevnt ovenfor, trenger følgende hensyn spesiell oppmerksomhet i løpet av en avlsuke.
Den første vurderingen er fotoperiod, da fisk (til og med hulefisk i laboratoriet) er avhengig av lyssykluser for å stille inn døgnklokken. Døgnrytmer kan påvirke alt fra avl og fôring til immunsystemhelse12,13 og må være konsistent for maksimale helsemessige fordeler. Fisk opprettholdes i et rennende vannsystem på en 14-timers lys og 10-timers mørk fotoperiod. Overflatefisken begynner vanligvis å gyte en time etter at systemet er mørklagt, og lys introdusert i denne perioden kan forstyrre og avslutte gyting. Gytingen av blind hulefisk er mindre forstyrret av lys. Sammenlignet med gyting av overflatefisk, er hulefiskgyting forsinket, vanligvis begynner fire til fem timer etter at systemet har blitt mørkt.
Den andre vurderingen er ernæring. Voksenfisk blir normalt matet en diett av tetraflak en gang om dagen. Før gyting blir fisk matet et proteinrikt kosthold supplert med ekstra mengder tetraflak og annen mat: eggeplommeflak og av og til levende California blackworms (Lumbriculus variegatus) for å kompensere for proteintap på grunn av eggproduksjon i løpet av forrige gytesyklus. I avlsuken blir fisk matet to ganger per dag, en gang om morgenen og igjen om ettermiddagen / kvelden. Fiskefôring bare en gang om dagen, men med en enkelt veldig stor del av maten bør unngås, da dette kan forårsake underernæring14.
Det tredje hensynet er plass. Plasskravene er basert på den gjennomsnittlige kroppsmassen til en voksen, samt atferdshensyn, for eksempel om fisken har skolegangsadferd eller aggressiv oppførsel. Over- eller under-crowding tanker kan føre til økt aggresjon og konstant stress, noe som gjør fisk sårbar for skade fra sine tankkamerater og motvillig til å delta i gyting15. Vi huser vanligvis 10-20 fisk per 42 L tank.
Det fjerde hensynet er temperatur. Som nevnt ovenfor er fisk kaldblodige dyr og er avhengige av miljøet for å opprettholde kroppstemperaturen. Fordi temperatur har en direkte effekt på metabolske prosesser, kan temperaturendringer utløse atferdsendringer hos fisk16. Dette avlsprogrammet består av to ukers sykluser i temperatur: Den første uken introduserer en temperaturøkning til 78 °F, og neste uke opprettholder en statisk temperatur på 72 °F. I løpet av den første (avls) uken plasseres plastkantede avlsnett på bunnen av tankene hver kveld. Avlsnettene tjener som en barriere mellom fisken i tankene og de gytede eggene, som ellers ville bli konsumert. Temperaturen økes med 2 °F per dag til maksimalt 78 °F innen midten av uken, og gytingen induseres i henhold til lyssyklusen de første 2-3 kveldene denne uken. Temperaturen senkes deretter med trinn på 2 °F til 72 °F i løpet av de resterende dagene i uken, og basistemperaturen opprettholdes til begynnelsen av neste avlsuke. Avl stimuleres vanligvis ikke mer enn to ganger i måneden for å gi fisken tid til å gjenopprette.
Totalt sett tillater denne metoden gyting av store mengder av embryoer av høyeste kvalitet over en lengre periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne prosedyren er godkjent av institusjonelle retningslinjer for dyrepleie ved University of Maryland, College Park (For tiden IACUC 469 #R-NOV-18-59; Prosjekt 1241065-1).
Figur 1. Kalendere i løpet av en avlsuke og en ikke-avlsuke. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. mandag
- Kl. 09.10 utfører du vannprøver og trinn 1.1.1-4 nedenfor.
- Registrer rom-, tank- og reservoartemperaturer ved hjelp av et termometer.
- Registrer ammoniakk-, nitrat- og nitratnivåene med et kolorimetrisk testsett.
- Registrer pH fra overvåkingssystemet så vel som det kolorimetriske testsettet.
- Registrer ledningsevnen fra karboymonitoren og hovedsystemmonitoren.
- Fra kl. 10.00, mate all fisk.
- Fôr all fisk i voksensystemet med tetraflak, knuse flakene i tankene med ung fisk. Fôr bare så mange flak som en fisketank kan konsumere helt på 3-5 minutter, om en "fingerklemme".
- Kontroller inkubatoren som brukes til å huse fingerbowls av å utvikle embryoer og endre vannet om nødvendig.
- Åpne embryoinkubatoren og kontroller vannstanden i alle reservoarer. Hvis de har lite vann, tilsett systemvann. Kontroller innstillingene for inkubatortemperatur. Hev embryoer ved 23-25 °C.
- Rengjør levende fôr.
- For å rengjøre blackworms, fjern de avdekkede Tupperware-bassengene som inneholder deres kulturer fra levende fôrkjøleskap og hell av overflødig vann over ormklyngene i vasken. Bruk destillert vann, suspender og skyll ormene gjentatte ganger til avstøtende vann er klart.
- Tilsett nok rent vann slik at ormeklyngene er omtrent halvparten dekket. Erstatt gjenværende ormer i levende matekjøleskap, avdekket.
- Fôr fisk.
- Minst 30 min etter den første fôringen, mate fisk i tankene der avl er ønsket med eggeplommeflak, blackworms eller begge deler. Tilsett en "fingerpinch" av eggeplommeflak per tank. Legg til nok blackworm-klynger slik at hver fisk i tanken kan konsumere ca 5-10 ormer.
- Ved 10.00-13.00 setter du vanntemperaturen til 74 °F.
- Skrubb avlstankene etter behov og sett avlsnettene.
- Rengjør tankene og legg garnene minst en time etter siste fôring. Rengjør alle tanker som nettene er plassert i på forhånd. Sett avlsnett forsiktig for ikke å forstyrre lufttilførselen til tanken.
2. tirsdag
- Samle embryoer og vask alle avlsnett.
- Ved 9-10 AM, fjern avlsnettene fra bunnen av voksne systemtanker. Skyll embryoene forsiktig inn i et håndholdt nett ved hjelp av slangen som er festet til kargutten, og snu det håndholdte nettet til en fingerbowl av rent systemvann for å utvise embryoene.
- Samle og vask hvert sett med embryoer, og legg deretter i en fingerbowl av rent systemvann som inneholder 0,00003% metylenblå (blått vann). Hvis det er et eksepsjonelt stort antall embryoer fra en enkelt tank, separer dem i flere boller. Konsentrasjonen av levende embryoer skal være ca 100 per 200 ml blått vann i hver fingerbowl.
- Beregn tidspunktet for befruktning ved å iscenesette embryoene under et mikroskop ved hjelp av den publiserte A. mexicanus utviklingstidstabell17.
- Overvåk fingerbowlene som inneholder embryoer ofte. Fjern døde eller deformerte embryoer og rusk, for eksempel uoppløst mat eller avføring, med en Pasteur pipette. Bytt det blå vannet ofte i fingerbowls.
- Plasser fingerbowlene i en inkubator i 5-7 dager. På dette tidspunktet har eggeplommen blitt brukt opp og fôringskulturer med levende saltlake reker er nødvendig for videre utvikling.
- Ta gytedata.
- For hver tank som slipper embryoer, registrer følgende informasjon.
- Registrer datoen og tanknummeret.
- Registrer omtrentlig antall embryoer som er sluppet (Figur 2):
Høy (500+)
Middels (200-500)
Lav (<200) - Registrer kvaliteten på embryoer som slippes (Figur 2):
Høy (>75% i live)
Middels (25-50% levende)
Lav (<25 % i live) - Beregn den opprinnelige gytetiden ved å konsultere Astyanax mexicanus iscenesettelsestabell17.
- Registrer temperaturen som systemet ble satt på da fisken gytet.
- For hver tank som slipper embryoer, registrer følgende informasjon.
- Fôr all fisk.
- Sett vanntemperaturen til 76 °F.
- Forbered live feed.
- Fôr fisk #2.
- Øs overflødig mat og rusk fra tanker og skrubb før du tilbakestiller garn.
3. onsdag
- Gjenta trinn 2.1-2.2. Samle embryoer og vask alle avlsnett.
- Ta gytedata som før.
- Utfør vannprøver som før.
- Fôr all fisk.
- Sett vanntemperaturen til 78 °F.
- Forbered live feed.
- Sjekk embryoer i inkubatoren.
- Rengjør og bytt vannet i embryoene i fingerbowls som til slutt vil bli brukt til å fylle opp den generelle voksne avlsmassen. Bruk metylenblåbehandlet systemvann.
- Fôr fisk igjen.
- Rengjør tankene etter behov og tilbakestill nettene.
4. torsdag
- Gjenta trinn 2.1-2.2. Samle embryoer og vask og lagre avlsnett.
- Ta gytedata som før.
- Sett vanntemperaturen til 76 °F.
- Rengjør live feed.
- Rengjør alle individuelle tanker.
- Sjekk embryoer i inkubatoren.
- Fôr fisk #2.
5. fredag
- Fôr all fisk.
- Sett vanntemperaturen til 74 °F.
- Rengjør live feed.
- Sjekk embryoer i inkubatoren.
6. lørdag
- Fôr fisk.
7. søndag
- Fôr fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi avler og gyter vanligvis etterkommerne av overflatefisk som opprinnelig ble samlet på Nacimiento del Rio Choy i San Luis Potosi, Mexico (Rio Choy overflatefisk) og San Solomon Springs i Balmorhea State Park, Texas (Texas overflatefisk) og hulefisk avledet fra Cueva de El Pachón (Pachón hulefisk) i Tamaulipas, Mexico og Cueva de los Sabinos (Los Sabinos hulefisk) og Sotano de la Tinaja (Tinaja hulefisk) i San Luis Potosi Mexico.
Gjennom en avlsuke samles det inn data for ulike tanker. De gytede embryoene i hver tank observeres for kvantitet og kvalitet. Antallet registreres som høyt, middels eller lavt. En mengde høy registreres hvis antall embryoer som slippes er over 500, en mengde medium registreres hvis antall embryoer som slippes er mellom 200-500, og en mengde lavt registreres hvis antall embryoer som slippes er mindre enn 200. Kvaliteten registreres på samme måte som høy, middels eller lav. En høy kvalitet registreres hvis mer enn 75% av embryoene i bollen er i live, en middels kvalitet registreres hvis ca 25% til 75% av embryoene i bollen er i live, og en kvalitet på lav registreres hvis mindre enn 25% av embryoene er i live. Disse indikasjonene på mengde og kvalitet tilordnes deretter et tall med høy er 3, middels 2 og lav er 1. Hvis det ikke var noen embryoer gytet eller ingen levende embryoer i gytingen, tildeles et antall 0.
Avlsdataene fra juli 2017 til mars 2020 for Rio Choy og Texas overflatefisk og Los Sabinos, Tinaja og Pachón hulefisk er vist i figur 2. Dataene ble analysert av avlsuken og ved å beregne gjennomsnittet av tallene som følge av hver dag for innsamling av embryoer i løpet av en enkelt avlsuke. Dataene indikerer at avl var kontinuerlig gjennom hele året i Rio Choy og Texas overflatefisk og i Pachón hulefisk. Mengden og kvaliteten på de fleste Rio Choy overflatefisk var mellom lav og høy, mens mengden og kvaliteten på de fleste Texas overflatefisk og Pachón hulefisk var mellom lav og middels. Forekomsten av gyting var ikke kontinuerlig i Tinaja eller Los Sabinos hulefisk: gyting var lav eller ikke-eksisterende på sensommeren (juli) til høsten (oktober). Selv om de laveste nivåene av gyting ble registrert for Los Sabinos hulefisk, var kvaliteten på embryoer den beste. Generelt viser overflatefisk bedre gytemengde og kvalitet enn hulefisk.
Figur 2. Avlsdata for ulike overflatefisk- og hulefiskbestander fra juli 2017 til mars 2020. Fra topp til bunn er Rio Choy overflatefisk, Texas overflatefisk, Pachón hulefisk, Tinaja hulefisk og Los Sabinos hulefisk. Ubrutte linjer: kvalitet på gyte. Brutte linjer: mengde gyte. Uker uten linjer representerer perioder der gyting ikke ble forsøkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Astyanax mexicanus er en ny biologisk modell som gyter ofte og kan avles lett i laboratoriet1,2. Fordi vi er interessert i utviklingsmekanismene som ligger til grunn for evolusjonære endringer i A. mexicanus hulefisk, er produksjon og bruk av embryoer avgjørende for våre forskningsmål. Hovedformålet med å opprettholde en voksen bestand av fisk er produksjon av embryoer og ung yngel til bruk i utviklingseksperimenter og for etterfylling av voksne avlsbestander. Noen ganger kan voksne også brukes til fysiologi, atferdsmessige eller genetiske eksperimenter. Genetiske eksperimenter krever parret parring eller in vitro befruktning18. For in vitro befruktning kan dyr som utviser gyteatferd19 fjernes fra tanker og brukes til kryss under temperaturindusert avlsregime.
For å maksimere kvaliteten og mengden embryoer til forskning, er det operasjonelle detaljer som krever oppmerksomhet før avlsuken. Når du manipulerer fisk i tankene, bruk bare utpekte håndholdte garn, senk dem ned i en nett soaking løsning mellom hver bruk, og skyll dem med varmt vann fra springen mellom bruksområder for å forhindre forurensning mellom tankene. Vask og desinfiser forsiktig alle instrumenter som brukes til å ta vare på fisken. Fjern og rengjør avlsnettene i systemvann før du erstatter dem i tankene. I slutten av uken lagres alle avlsnett tørre på hyller i fiskerommet. I løpet av en avlsuke, sjekk hver tank for embryoer i avlsnettene eller for fisk som utviser gyteadferd (dvs. svømming rundt i sirkler parret mot hverandre), da hunnene i disse tankene sannsynligvis er klare til å gyte. Dette bør gjøres ved hjelp av rødt lys i de mørke timene på fotoperiod. A. mexicanus gyter i mørket ved å spre egg og sæd i skyer. En tank med en befolkning på ca 10-20 fisk og et mannlig til kvinnelig forhold på ca 1:1 kan produsere opptil 500 befruktede embryoer i en gyte per tank, og hver fisketank kan gyte to eller tre ganger i løpet av en enkelt avlsuke. I en god gyte vil de fleste embryoer overleve gjennom klekking, et kritisk stadium. Kulturer bør kontrolleres ofte og unfertilized egg, døde eller deformerte embryoer, eller rusk, inkludert matrester eller parasitter, bør fjernes. Kulturer med for det meste levende embryoer bør "rengjøres" noen få timer i løpet av de embryonale og tidlige larveperiodene ved å manuelt fjerne døde eller unormale embryoer (som til slutt vil dø) og rusk ved hjelp av en Pasteur pipette. Kulturer med en stor andel døde embryoer kan fortsatt brukes ved å overføre de normalt utviklende embryoene til nye fingerbowls med friskt blått vann. Vanligvis må denne prosessen gjentas flere ganger for å oppnå de reneste kulturene av levende embryoer. I begge tilfeller er en endelig konsentrasjon på ca 100 embryoer per 200 ml ideell fordi trengsel av embryoer kan påvirke utviklingen, spesielt for hulefisk. Kulturer bør rengjøres ytterligere over tid ved å periodisk fjerne det meste av vannet fra fingerbowls og erstatte med det med friskt blått vann. Kulturer "rengjort" gir ofte den høyeste kvaliteten på embryoer.
I tillegg til naturlig avl er hormonell stimulering20 eller in vitro befruktning18 også potensielt nyttig for å skaffe embryoer. For disse formål må fisken imidlertid være sunn og klar for naturlig gyting (viser gyteadferd), og et mye mindre utbytte av embryoer enn oppnådd under de temperaturinduserte gyteforholdene bør forventes.
En begrensning av temperaturindusert avl under forholdene beskrevet ovenfor er at overflatefisk og hulefisk gyter på forskjellige tidspunkter, førstnevnte tidlig på kvelden og sistnevnte fra etter midnatt til tidlig morgen. Denne situasjonen kan ikke unngås ved å skifte fotoperiod fordi regelmessig fôring og vedlikehold av fiskesystemet vanligvis må utføres i løpet av syklusens lys (dagtid). I prinsippet kan imidlertid tidsplaner justeres slik at fisken gyter på lignende tidspunkter ved å opprettholde de to morphs på forskjellige lys-mørke sykluser (og i forskjellige fiskeoppdrettssystemer) for nær-til-samtidig gyting. Videre, hvis to temperaturkontrollsystemer er tilgjengelige, kan fisk dyrkes i forskjellige systemer, og ved å veksle ukentlige temperaturøkninger, kan gyting gjøres på en ukentlig i stedet for to-månedlig tidsplan, og doble kapasiteten for å skaffe embryoer.
Enten det brukes til vitenskapelig forskning, undervisning eller bioteknologi, er A. mexicanus et utmerket modellsystem for å utforske de fascinerende spørsmålene rundt utviklingen av utvikling. For vitenskapelig forskning er dette systemet nyttig for å undersøke molekylære, genetiske og evolusjonelle mekanismer for øyeutvikling og sykdom. Øyet er et ekstraordinært organ når det gjelder struktur, funksjon og utvikling. Visjon er oppnådd under embryonal utvikling som følge av koordinert dannelse og vekst av flere forskjellige øyevev. De presise mekanismene som dette skjer ved, er fortsatt stort sett ukjente. Strukturen av pattedyr og fiskeøyne er lik. De naturlige øye fenotyper av A. mexicanus er et utmerket modellsystem for å utforske molekylære og cellulære mekanismer og genetiske veier involvert i øyeutvikling og degenerasjon21,22. Denne kunnskapen kan brukes til å utvikle forebyggingsstrategier og behandlinger for arvelige øyesykdommer. Pigmentering studier er et annet område der A. mexicanus gjør et verdifullt bidrag23. I undervisningen kan A. mexicanus embryoer brukes til å illustrere de generelle prinsippene for embryonal utvikling og i instruksjonseksperimentering for begynnende studenter. I bioteknologi, med den nylige utviklingen av genomisk DNA-redigering24 og spesielt CRISPR / Cas-9 genomisk ingeniørteknologi25, A. meksikanskus embryoer er en verdifull ressurs for å utforske genfunksjoner. Hver av disse applikasjonene er hjulpet av gyting av store mengder høykvalitets embryoer, som kan oppnås ved det inkrementelle temperaturavlsregimet beskrevet i denne kommunikasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote og Mandy Ng for verdifulle bidrag til Jeffery-laboratoriet A. mexicanus kulturanlegg. Forskningen i Jeffery-laboratoriet støttes for tiden av NIH grant EY024941.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
