הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Summary

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

Abstract

Tumorigenesis הוא תהליך רב שלבי שבו תאים לרכוש יכולות המאפשרות הצמיחה שלהם, הישרדות, והפצה בתנאים עוינים. בדיקות שונות מבקשות לזהות ולכרות סימני היכר אלה של תאים סרטניים; עם זאת, לעתים קרובות הם מתמקדים בהיבט אחד של טרנספורמציה תאית, ולמעשה, בדיקות מרובות נדרשות לאפיון הנכון שלהם. מטרת עבודה זו היא לספק לחוקרים סט של כלים להערכת טרנספורמציה תאית במבחנה מנקודת מבט רחבה, ובכך לאפשר להסיק מסקנות קול.

הפעלת איתות מתמשך היא התכונה העיקרית של רקמות הגידול והוא יכול להיות במעקב בקלות תחת תנאים במבחנה על ידי חישוב מספר הכפלות האוכלוסייה שהושגו לאורך זמן. חוץ מזה, הצמיחה של תאים בתרבויות 3D מאפשר האינטראקציה שלהם עם התאים שמסביב, דומה למה שקורה vivo. זה מאפשר הערכה של צבירת תאים, יחד עם תיוג immunofluorescent של סמנים תאיים ייחודיים, כדי לקבל מידע על תכונה רלוונטית אחרת של טרנספורמציה גידולית: אובדן ארגון תקין. מאפיין יוצא דופן נוסף של תאים שהשתנו הוא יכולתם לגדול ללא חיבור לתאים אחרים ולמטריצה החוץ-תאית, אותה ניתן להעריך באמצעות מבחני המעגן.

נהלים ניסיוניים מפורטים להערכת קצב צמיחת התאים, לביצוע תיוג immunofluorescent של סמני שושלת תאים בתרבויות 3D, ולבדוק צמיחת תאים עצמאית מעגן אגר רך מסופקים. מתודולוגיות אלה ממוטבות לתאי אפיתל ראשוניים בשד (BPEC) בשל הרלוונטיות שלה בסרטן השד; עם זאת, ניתן להחיל שגרות על סוגי תאים אחרים לאחר התאמות מסוימות.

Introduction

אירועים רצופים מרובים נדרשים לפיתוח neoplasm. בשנת 2011, חנהאן ויינברג תיארו 10 יכולות המאפשרות צמיחה, הישרדות והפצה של תאים שהשתנו: מה שמכונה "סימני ההיכר של הסרטן"¹. המתודולוגיה המתוארת כאן אוספת שלושה כלים שונים להערכת טרנספורמציה תאית במבחנה על ידי התמקדות בכמה מהתכונות הייחודיות של התאים הגידוליים. טכניקות אלה מעריכות את שיעור התפשטות התאים, את התנהגות התאים כאשר הם מתורבתים תלת-מימד ואת יכולתם ליצור מושבות עם עצמאות מעגן.

מודלים של תאים חיוניים לבדיקת השערה במבחנה. גישות שונות פותחו כדי ליצור מודלים ניסיוניים של טרנספורמציה תאית לחקר^{הסרטן 2,3,4}. מאז סרטן השד הוא הסרטן השכיק ביותר בקרב נשים ברחבי העולם והוא אחראי על כ 15% ממקרי המוות^{מסרטן בקרב נשים 5}, מתן מודלים תאיים מתאימים של תאי אפיתל חלבי הוא בעל חשיבות עליונה להמשך חקירה. במאמר זה, ימחצנו את הפוטנציאל של שלוש טכניקות כדי להעריך טרנספורמציה תאית באמצעות מודל ניסיוני של תאים אפיתל ראשי השד (BPECs) טרנספורמציה שתוארה בתחילה על ידי Ince ועמיתיו בשנת 2007⁶ ומאוחר יותר מיושם^{במעבדה שלנו 7}. מודל ניסיוני זה מבוסס על שינוי רציף של שלושה גנים ממוקדים (SV40 גדול T ואנטיגנים t קטנים המכונה Ttag, hTERT, ו HRAS) לגנום של BPECs שאינם טרנספורמציה. יתר על כן, השיטה המשמשת נגזרת BPECs מעדיף את התחזוקה של תאי אפיתל החלב עם סמנים זוהרים או myoepithelial, וכתוצאה מכך תרבות תאים הטרוגניים ששומרת על חלק מהתכונות הפיזיולוגיות של בלוטת החלב.

בבלוטות החלב, תאי אפיתל החלב הזוהר, האחראים על ייצור החלב, ממוקמים ליד לומן, ואילו תאים myoepithelial מסולקים סביב תאים זוהרים לטפל בתנועות התכווצות המוביל את החלב אל הפטמה. אובדן ארגון תקין בין שושלת תאים אלה הוא תכונה של^{טרנספורמציה גידולית 8} שניתן להעריך במבחנה לאחר זיהוי immunofluorescent של סמני שושלת ייחודיים בתרבויות תאים תלת-מימדיים. מאפיין מרכזי נוסף של תאים סרטניים הוא היכולת שלהם לגדול ללא קשר לתאים אחרים ולמטריצה החוץ תאית¹. כאשר תאים בריאים נאלצים לגדול בהשעיה, מנגנונים כגון anoikis \u2012 סוג של מוות תאי המושרה בתגובה ניתוק מן מטריצה חוץ תאית \u2012^{מופעלים 9}. התחמקות של מוות תאי הוא אחד סימני ההיכר הייחודיים של סרטן ולכן, תאים שהשתנו מסוגלים להשבית אנויקי ולשרוד באופן בלתי תלוי עוגן. יכולת זו ניתן להעריך במבחנה עם בדיקה עצמאית מעגן באמצעות אגר רך. יתר על כן, תכונה אינהרנטית של רקמות גידולי היא יכולת איתות מתמשך שלהם, אשר ניתן לפקח בקלות תחת תנאים במבחנה על ידי מדידת הגידול של מספר התא לאורך זמן, לא רק בהשעיה assays אלא גם על ידי ניטור קצב הצמיחה של תרבויות חסידות monolayer.

למרות המודל הטוב ביותר לבדיקת פוטנציאל tumorigenic הוא חיסון של תאים סרטניים במודלים מורין והערכת התפתחות הגידול במקום, חשוב למזער את מספר בעלי החיים המועסקים בהליכים ניסיוניים ככל האפשר. לכן, לאחר בדיקות מתאימות כדי להעריך את השינוי במבחנה היא בראש סדר העדיפויות. כאן, אנו מספקים קבוצה של כלים כדי להעריך את הפוטנציאל tumorigenic של תאים אפיתל השד שינוי חלקי לחלוטין שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות שעובדים עם מודלים טרנספורמציה הסלולר.

Protocol

דגימות אנושיות ששימשו בניסויים הבאים התקבלו מהפחתת mammoplasties שבוצעו ב Clínica פילאר סנט ג'ורדי (ברצלונה) בהסכמת הליך סטנדרטי. כל ההליכים מבוצעים בקבינט בטיחות ביולוגית מסוג II אלא אם צוין אחרת.

1. בתרבות במבחנה של תאי אפיתל של אמא אנושית ועלילה עקומת צמיחה הצטברות

1. בתרבות במבחנה של תאי אפיתל ראשוניים בשד (BPECs): מעבר תאים
   הערה: עבור נגזרת BPEC ותרבות תאים בצע את ההוראות המתוארות על ידי Ince et al., 2007⁶.
   1. הכנה בינונית.
      1. תוספת WIT בזל מוגדר בינוני עם תוספי P או T, המסופקים על ידי היצרן, בהתאם אם BPECs ראשי או השתנה הם מתורבתים.
      2. הוסף רעלן כולרה למדיום WIT בתוספת לריכוז סופי של 100 ננו/מ"ל עבור ראשי או 25 ng/mL עבור BPECs שהשתנו.
         התריעה: רעלן כולרה הוא קטלני אם נבלע. השתמש בציוד מגן אישי. הימנע משחרורו לסביבה.
   2. תחזוקת תרבות תאים והתעלות.
      הערה: עבור השלבים הבאים יש לזכור כי התאים גדלים בבקבוק T25. עם זאת, ניתן להתאים כמויות לתבניות אחרות של תרבות התאים תוך שמירה על המידתיות במונחים של שטח פנים.
      1. בדוק את הקונפדרציה הסלולרית כל יום. כאשר התרבות היא 90% confluent, לבצע מעבר תאים.
      2. לרכוש 1x PBS, טריפסין 3x, בינוני צינור חרוט 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) עבור כל בקבוקון.
      3. הסר את המדיום מן הבקבוק ולשמור אותו צינור חרוט 15 מ"ל המכיל FBS.
      4. יש לשטוף תאים באמצעות 1x PBS.
      5. נתק תאים מפני השטח על-ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין 3x. דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
      6. בדוק אם התאים נותקו. יש למרוח רעידות נמרצות אם התאים אינם מנותקים לחלוטין.
      7. בטל את ההפעלה של טריפסין על-ידי הוספת המדיה השמורה בתוספת FBS.
      8. לקצור את ההשעיה התאית ולמקום אותו צינור חרוט 15 מ"ל.
      9. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, לחסל את supernatant, ו resuspend את התאים גלולה על ידי הבהוב החלק התחתון של הצינור עם אצבע.
      10. הוסף 1-2 מ"ל של מדיה טרייה לכדור ולמדוד את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי או hemocytometer. נתונים אלה ישמשו מאוחר יותר לחישוב הכפלות האוכלוסיה ולציור עקומת הגידול. זרעים 12,000^{תאים/ס"מ 2} (לדוגמה, 300,000 תאים עבור בקבוק T25) בבקבוקי משטח של תרבות תאים מותאמים (ראה רשימת חומרים).
          הערה: לדלל את פתרון השעיית התא אם הריכוז גבוה מדי כדי להבטיח כימות נאות.
      11. הוסף בינוני לנפח סופי של 5 מ"ל והמדגר את התאים ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO_{2 אטמוספירה.}
      12. החלף את מדיום תרבות התא כל 48 שעות.
2. חישוב הכפלת אוכלוסיה ופריטים חזותיים של נתונים
   1. באמצעות נתוני ספירת התאים שהתקבלו בשלב 1.1.2.10, החל את הנוסחה הבאה כדי להשיג את ערכי הכפלת האוכלוסיה המצטברת (PD) :
      
      כאשר, PD_i מציין את מספר הכפלות האוכלוסיה שהושגו על-ידי התאים עד תת-תרבות הקודמת (הוא מתייחס PD שנצבר בתת-תרבות הקודמת), N_{h הוא} מספר התאים שנקטפו, ו- N_s הוא מספר התאים שנזרעו.
   2. ייצג נתונים עבור מרווח זמן מסוים באמצעות גרף XY שבומיוצגים מספר הימים בתרבות ( x-axis) וה- PD המצטבר (y-axis).
   3. קבל את הקו בכושר הטוב ביותר ואת משוואת ההתאמה:
      
      הערה: שיפוע מוגבר (ב) פירושו שיעור התפשטות מוגבר.

2. תרבות תלת מימדית (תלת מימדית) במטריצת קרום מרתף וזיהוי חלבונים immunofluorescent

1. תרבות תלת מימד במטריצת קרום מרתף
   הערה: פרוטוקול זה הותאם מ Debnath et al., 2003¹⁰ והוא מותאם עבור 24 צלחות באר (ראה רשימת חומרים).
   1. הכינו את החומר יום לפני הניסוי: מטריצת קרום מרתף טרום צמרמורת לילה ב 4 מעלות צלזיוס ולתת טיפים פיפטה, צינורות microcentrifuge, וצלחות גם להתקרר במקפיא.
      הערה: יש לשמור את המטריצה ב- -20 °C (60 °F) לאחסון לטווח ארוך. הפוך aliquots כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה מרובים.
   2. ביום הניסוי, מניחים חומר מקורר מראש על קרח.
   3. לשטוף בארות עם PBS סטרילי קר 1x על מנת להפחית את מתח פני השטח.
   4. מכסים את החלק התחתון של כל באר עם 100 μL של מטריצת קרום מרתף.
      הערה: לוותר על המטריצה לאט ולהפיץ אותו ברחבי באר; זה חיוני כדי למנוע היווצרות בועה בשכבה התחתונה כדי למנוע צמיחת תרבות תאים monolayer.
   5. מניחים את הצלחת באינקובטור, ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר לשכבת המטריצה להתגבש.
      הערה: בדרך כלל לוקח בערך 20 דקות להתגבש.
   6. בינתיים, טריפסין תאים כפי שהוסבר קודם לכן בשלב 1.1. צנטריפוגה התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות לשימוש חוזר בינוני. הכן השעיה של 400,000 תאים/מ"ל ופרק בעדינות כל גוש תא על-ידי צינורות.
   7. הכינו את המדיום עם מטריצת קרום מרתף של 8% וערבבו 1:1 (v/v) עם מתלים תאיים כדי לקבל פתרון של 200,000 תאים/מ"ל במטריצה של 4%.
      הערה: חשב את כמות המדיום הדרושה כדי למנוע פסולת מיותרת מטריצה.
   8. מניחים 500 μL של מתלי תא בת פתרון מטריצה על גבי שכבת מטריצה כבר מוצק לזרוע כמות כוללת של 100,000 תאים במדיום עם 4% מטריצת קרום מרתף.
   9. דגירה תאים ב 37 °C (69 °F) במשך כמה דקות ולאחר מכן, להוסיף 500 μL של המדיום עם 4% מטריצת קרום מרתף. אינקובט התאים ב 37 °C (69 °F) באינקובטור עם 5% CO₂ במשך 14 ימים. תאים זרעים יקבצו ויתרבו כדי שמקורם במבנים דמוייאדיני.
      הערה: תנועתיות התא וצבירה ניתן לפקח על ידי זמן לשגות במהלך תהליך היווצרות 3D. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות (לדוגמה, Fiji/ImageJ או Imaris) כדי להעריך אירועים אלה. המספר והגודל של האגני תלויים בתהליך הצבירה ובקצב ההתפשטות ועשויים להשתנות בין סוגי תאים. התאימו את ריכוז מטריצת הממברנה במרתף ותאים זרעים כדי להשיג מבנים תלת-מימדיים רצויים.
   10. הוסף 500 μL של המדיום עם 4% מטריצת קרום מרתף 2-3 פעמים בשבוע.
       הערה: הימנעו מהפרעה של השכבות הנושאות את הצלחת בעדינות במהלך המניפולציה.
   11. אם תרצה, ניתן למדוד את המספר והגודל של acini במהלך תקופת התרבות. לשם כך, צלם תמונות אקראיות בזמנים שונים לאחר הזריעה באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ הפוך של DIC. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי למדוד את הקוטר של 100–200 מבנים תלת-מימדיים.
2. חיסון
   הערה: תנאים סטריליים אינם נדרשים במהלך חלק זה של הפרוטוקול.
   1. הסר את מדיום התרבות.
   2. קרע את מטריצת קרום המרתף באמצעות קצה פיפטה p200 עם הקצה מנותק. מניחים ~ 50 μL של מטריצה מפוררת על גבי מגלשת זכוכית ומרוחים אותו באזור של 1-2 ס"מ².
   3. תן לדגימה להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר או להשתמש בצלחת חימום ב 37 °C (69 °F) כדי להאיץ את התהליך. לתקן דגימות עם מתנול:אצטון (1:1, v/v) ב -20 °C (60 °F) במשך 30 דקות.
      הערה: אות פלואורסצנטי של סמנים קודמים, כגון זה של חלבונים פלואורסצנטיים המובעים על ידי התאים, יימחק.
      התריעה: מתנול הוא דליק, רעיל אם הוא בשאיפה, בלע או במקרה שהוא בא במגע עם העור. ללבוש ציוד מגן אישי ולעבוד בתוך מכסה המנוע אדים.
   4. מחק את פתרון ההתקבעות והסר את העודף, אם קיים, על-ידי שכיבת השקופית על נייר סינון.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לאחר ייבוש, שקופיות ניתן לאחסן ב -20 °C (60 °F) במשך מספר חודשים.
   5. דגימות בלוק epitopes עם 5% סרום עזים נורמלי ו 0.1% טריטון-X-100 ב 1x PBS (פתרון חסימה) עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר.
   6. בינתיים, הכינו פתרונות עבודה לנוגדנים על ידי דילול נוגדנים ראשוניים או משניים בריכוז הרצוי בתסימת החסימה.
      הערה: ריכוז הנוגדנים חייב להיות מותאם במדויק בהתאם לסוג התא ולהפניית הנוגדנים. כמדריך, כדי לזהות תאים משושלת luminal ו myoepithelial ב BPEC, אנטי Cytokeratin העיקרי 14 ו נוגדנים נגד קלודין-IV (ראה רשימת חומרים) ניתן להשתמש. ריכוז פתרון העבודה המומלץ הוא 1:100 עבור נוגדנים ראשוניים אלה ו 1:500 עבור נוגדנים משניים נגד עכבר ואנטי ארנב (ראה רשימת חומרים).
   7. הוסף 30 μL של פתרון עובד נוגדנים ראשוניים לכסות אותו עם רצועה של סרט עטיפה במעבדה, כדי למנוע אידוי. דגירה לילה ב 4 °C (60 °F) בתא לח.
   8. לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS עבור 1 שעות כל אחד.
   9. חזור על שלב 2.2.7 לנוגדנים משניים. הדגירה צריכה להתבצע בחשיכה.
   10. לשטוף עם 1x PBS במשך 2 שעות.
       הערה: התאימו את ריכוז הנוגדנים, זמן הדגירה וקשיות הכביסה כדי לשפר את יחס האות/רעש לדגימות ספציפיות.
   11. הסר את PBS הנותרים, פעם יבש, נגדי עם DAPI ב 0.25 מיקרוגרם / מ"ל מדולל במדיום הרכבה נגד חיטוי. לכסות שקופיות עם כיסוי על ידי מתן לו להתיישב מבלי להפעיל לחץ. חותם עם לק ציפורניים.
       הערה: ניתן לאחסן דגימות ב-4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. לאחסון לטווח ארוך, שמרו עליהם ב-20°C-.
   12. נתח את התפלגות האותות הפלואורסצנטיים עבור כל אצינוס באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל.
       הערה: יש לקבוע במדויק את תצורת המיקרוסקופ הקונפוקל בהתאם לציוד המשמש ולנוגדנים המוחלים על הדגימה. כמדריך, עם הציוד והריגנטים המפורטים בטבלת החומרים, השתמש במטרה של 40x ובהגדרות הלייזר והגלאי הבאות: לשימוש ב- DAPI בעירור עם לייזר 405 (3%-5%), זיהוי באמצעות גלאי PMT (800V, היסט: -9) ורצועה ספקטרלית מ 410 ננומטר עד 500 ננומטר; עבור A488 (קלודין-IV) להשתמש בהרגשה עם לייזר 488 (7%-10%), זיהוי עם גלאי PMT (800V, היסט: -20) ורצועה ספקטרלית מ-490 ננומטר ל-550 ננומטר; ול-Cy3 (Cytokeratin 14) יש להשתמש בגירוש עם לייזר 555 (2%-10%), זיהוי באמצעות גלאי PMT (800V, היסט: -35) ורצועה ספקטרלית מ-560 ננומטר עד 600 ננומטר.

3. בדיקה עצמאית של אנקורג', כתמי MTT וכמיות מושבה אוטומטי

1. בדיקה עצמאית של אנקורג': ציפוי אגר ותלייה סלולרית
   הערה: פרוטוקול הותאם מ Borowicz ואח ', 2014¹¹ לבצע ניסויים BPECs.
   1. הכינו תסכולת אגר 1.2% מדוללת במים אולטרה-חמים בבקבוק סטרילי. לבודד את הפתרון ולתחזק אותו ב 42 °C (69 °F) במהלך הניסוי. פתרון אגר ניתן לאחסן ב 4 °C (60 °F); כאשר נדרש, לחמם את פתרון אגר עד שהוא נוזלי שוב.
      התר לב: השתמש בכפפות עמידות בחום כדי למנוע כוויה לאחר שמירה אוטומטית.
      הערה: מעתה והלאה, יש לשמור על תנאים סטריליים.
   2. הכינו פתרון אגר של 0.6% על ידי ערבוב 1:1 (v/v) בינוני מחומם מראש עם 1.2% פתרון אגר. יש לשמור על 42 מעלות צלזיוס כדי למנוע התגבשות מוקדמת.
      הערה: בינוני ניתן להוסיף בעבר כפול כדי לקבל תוספת מלאה 0.6% אגר + פתרון בינוני פעם מעורבב.
   3. מכסים את החלק התחתון של באר 35 מ"מ עם 1.5 מ"ל של 0.6% אגר בתמצית בינונית ולתת לו להתגבש בטמפרטורת החדר. ודא כי החלק התחתון של הצלחת מכוסה לחלוטין לפני התגבשות אגר, אחרת, תאים עשויים לדבוק בצלחת לגדול monolayer.
      הערה: ניתן להשתמש לוחות משטח חסידים ולא חסידים.
   4. בינתיים, לחץ על תאים, פעם צנטריפוגה ו resuspended במדיום, להכין פתרון 50,000 תאים / מ"ל בעדינות לפרק כל גוש תא על ידי צינורות שוב ושוב.
   5. הכן 0.3% אגר + תא השעיה במדיום בריכוז סופי של 25,000 תאים / מ"ל.
      הערה: ריכוז תאים אופטימלי עשוי להיות שונה בין סוגי תאים. נסה ריכוזים שונים עד שנוצרות מושבות אינדיבידואליות.
      1. מניחים מסנן מסננת 40 מיקרומטר על גבי צינור סטרילי 50 מ"ל ולסנן את פתרון 50,000 תאים / מ"ל ומאפשר לו לרדת לתחתית הצינור.
      2. הסר את המסנן מן הצינור סטרילי 50 מ"ל, להטות את הצינור המכיל תאים לזווית של 45 ° ולשחרר את אותו נפח של 0.6% אגר + פתרון בינוני לשפוך אותו דרך הקיר הפנימי של הצינור. זה יאפשר פתרון אגר להתקרר בדיוק מספיק כדי לא לפגוע בתאים ולהימנע התמצגות מוקדמת שלה.
   6. הומוגניזציה של התערובת והפקדה 1 מ"ל של 0.3% אגר + השעיית תא במדיום (המכיל 25,000 תאים) על גבי שכבת אגר התחתון מוצק בעבר.
   7. דמיין תאים זרעים באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים מותאמים אישית. אחרת, הניסוי צריך לחזור על עצמו.
   8. המתן עד שכבת אגר הוא מוצק לחלוטין, ולאחר מכן בזהירות להוסיף 1 מ"ל של המדיום הטרי על גבי מבלי להפריע שכבות אגר עדין מתחת.
   9. הדגירה את התאים ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO₂ באינקובטור במשך 3 שבועות.
      הערה: הזמן הנדרש להיווצרות מושבה יכול להשתנות בין סוגי תאים שונים, אך בדרך כלל 3 שבועות מספיקים.
   10. שינוי בינוני פעמיים בשבוע. כדי לעשות זאת, בעדינות להטות את הצלחת לכיוון שלך, שאף בינוני בפינה התחתונה, ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום טרי.
       הערה: הימנע מנגיעה בשכבות אגר כפי שהם בקלות להתנתק מהצלחת.
2. כתמי MTT
   1. הכינו את פתרון המלאי Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) ב-6 מ"ג/מ"ל במים אולטרה-חיוורים בבקבוק סטרילי ופתרון סינון באמצעות מסנני μm 0.2. פתרון MTT זה ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 °C (69 °F).
      התראה: MTT עלול לגרום לגירוי והוא חשוד בגרימת פגמים גנטיים. השתמש במשקפי בטיחות, כפפות ומסנן נשימה.
      הערה: הימנע ממחזורי הפשרה חוזרים ונשנים.
   2. הכן פתרון עבודה של MTT ב 1 מ"ג / מ"ל על ידי דילול פתרון המלאי עם מים סטריליים ultrapure.
   3. לאחר תקופת היווצרות המושבה הסתיימה, להסיר את המדיום מהצלחת ולהוסיף 1 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל MTT לכל באר.
   4. דגירה במשך 24 שעות באינקובטור. הסר את פתרון MTT על-ידי שאספירה עדין. צלחות ניתן לאחסן ב 4 °C (60 °F) במשך מספר שבועות.
      הערה: הימנע מחשיפה לאור כדי למנוע היווצרות גבישים לא ספציפית.
3. כימות המושבה
   1. השג תמונות של כל לוח באמצעות מיקרוסקופ הפוך. התאם את ההגדלה כדי להשיג את שדה התצוגה המרבי עם פחות תמונות ועדיין להיות מסוגל לזהות מושבות קטנות (בדרך כלל 4x או 10x מטרות).
      הערה: ודא שהתמונות מציגות רקע הומוגני. לא נדרשת ניגודיות פאזה ולא ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית מכיוון שלא יתכרתו מושבות שאינן מוכתמות.
   2. העלה תמונות לתוכנת ImageJ/Fiji¹² כדי לספור את מספר המושבות ואת האזור של כל מושבה חיובית MTT.
      הערה: קובץ Script לכמות אוטומטי מסופק כקובץ משלים. כדי לבצע את הקוד, הדבק אותו בעורך המאקרו (תוספים | דף | מאקרו) ובצע את ההוראות.
      1. השג מסיכה בינארית באמצעות סף התמונה המקורית (תמונה | התאם | סף) כדי להשיג מושבות מופרדות היטב (איור 1).
         הערה: תמונות של 8 או 16 סיביות נדרשות בדרך כלל לביצוע שלב זה. מומלץ להשתמש בשיטה "סף מינימלי".
      2. הפעל את מנתח החלקיק המורחבת מ תוסף Biovoxxel¹³ (תוספים | ביובוסל | מנתח חלקיקים מורחב ) לזיהוימושבות חיוביות MTT (איור 2). תנאי הנחיה ראשוניים: גודל (μm²) = 250–אינסוף; מוצקות = 0.75–1.00.
   3. להעריך את הקוטר הממוצע (D) מכל ערך אזור מושבה (A) בהתאם לנוסחה:
      
   4. סנן תוצאות על-ידי אי-הכללת מושבות בעלות תפוצה נמוכה (לדוגמה, קוטר נמוך).
      1. בחר מספר מינימלי של חטיבות בשבוע (m) שיש לקחת בחשבון (לדוגמה, 1).
      2. הערך את הרדיוס של מושבה (R) עם n תאים בהתאם לנוסחה הבאה:
         
         איפה, r הוא הרדיוס הממוצע של תאים בודדים בהשעיה, n הוא מספר התאים ויוצרים מושבה שסבלה מחלוקות m בכל שבוע במהלך w שבועות בתרבות. בצמיחה מעריכית: n = 2^{(m * w)}. ρ היא יעילות האריזה. שים לב כי, בתנועה אקראית, יעילות האריזה היא ~ 0.64 ואת שבר האריזה הצפוף ביותר האפשרי עבור כדורים זהים הוא 0.74¹⁴.
      3. השלך את כל המושבות להציג קוטר נמוך מ 2R כמו התאים שלהם לא השיגו את המספר המינימלי של חטיבות נחשב בשלב 3.3.4.1.

Representative Results

מודל ניסיוני של טרנספורמציה תאית עם כניסתה של שלושה אלמנטים גנטיים ב- BPECs נבחר להפיק תוצאות מייצגות^{של טרנספורמציה אונקוגנית 6,7} (איור 3). BPECs שאינם משתנים (N) נגזרו רקמת שד ללא מחלות כפי שתואר על ידי Ince^{ועמיתיו 6} ותרבותי בעקבות הפרוטוקול המצוין כאן. לאחר התגברות על STASIS (מתח או חריג איתות המושרה-senescence, תופעה שנצפתה בדרך כלל בתאי אפיתל ממארי במבחנה כי הוא להתגבר על כ 4 שבועות לאחר הקמת תרבות התא), תאים היו מתומרים ברציפות עם חלקיקים lentiviral pRRL-CMV-Ttag-IRES-eGFP ו pRRL-CMV-TERT-IRES-CherryFP כדי להשיג תאים שעברו טרנספורמציה חלקית (כפול מתמר; D). ביטוי של הטאג הנגיפי מעכב את תפקוד p53 ו רטינובלסטומה, וביטוי חוץ רחמי של הגן hTERT מפצה על התשה תלוית התפשטות אורך הטלומר. לאחר בחירת פלואורסצנט לפי מיון תאים, התאים התמרנו עם pLenti-CMV / TORasV12-Puro, אשר מעניק אות מיטוגני מתמשך, ולאחר מכן צמיחה בנוכחות אנטיביוטיקה כדי לבחור תאים מתמר (מתמר משולש; T),אשר השתנו באופן מלא על פי Ince ועמיתיו⁶.

כפי שמוצג איור 4, עלייה במדרון של קו הרגרסיה (פרמטר b במשוואה 1.2.3) נצפית עם המספר ההולך וגדל של שינויים גנטיים שהוכנסו ב- BPEC (N: 0.47, D: 0.93, T: 1.13). במשך מרווח זמן מסוים, תאים בעליטרנספורמציהחלקית ( D ) ו-T) השיגו מספר גבוה יותר של הכפלות אוכלוסיה בהשוואה לתאים שאינם משתנים (N), ולכן קצב חלוקת התאים הוגדל עם תהליך הטרנספורמציה. אותה תוצאה יכולה לבוא לידי ביטוי גם כזמן הדרוש כדי לשכפל את אוכלוסיית התאים (t_d), אשר ניתן להשיג לאחר החלפת y על ידי 1 (PD) במשוואה y = bx, ובכך t_d = 1/b. בניגוד למדרון, t_{d פוחת} עם טרנספורמציה. בעוד שתאים שאינם מומרים היו זקוקים ליותר מיומיים כדי לשכפל את האוכלוסיה שלהם (N:_{t d} = 2.13 ימים), תאים שהשתנו חלקית עשו זאת במחצית הזמן (D:_{t =} 1.08 ימים). התוספת של HRAS תחת רגולציה של מקדם מכאני הובילה לפעילות התפשטות מוגברת ותאים הדרושים פחות מיום אחד כדי לשכפל (T:_{t d} = 0.89 ימים) בהסכמה עם הפעילות המיטוגנית של אונקוגן זה.

בעוד שתרבות התאים המונוליארים היא כלי שימושי לחקר התנהגות תאי החוץ, זוהי גישה מוגבלת מאוד מכיוון שהיא אינה יכולה לשחזר את רוב התנאים הפיזיולוגיים. במקום זאת, טכניקת תרבות התא התלת מימדית המתוארת כאן מאפשרת לתאים משושלת שונה לצבור ולנוע בחופשיות בסביבה תלת-ממדית ויוצרת מבנים acinar הודות ליצירת צומת תא-תא ומטריצת תאים (איור 5A. זמן לשגות). במהלך השבועיים הבאים, התאים מתפשטים בהתאם לתפקוד הרקמה המקורי שלהם ומתרבים ומגדילים את גודל האגני (איור 5B). את הקיטוב הנכון של כל אצינוס ניתן להעריך במדויק הודות לשילוב של זיהוי immunofluorescent של לומינלית (קלודין-IV) ו myoepithelial (Cytokeratin 14) סמני שושלת עם מיקום אות תלת מימדי על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 6A). בעוד כל acini נוצר על ידי BPECs שאינם טרנספורמציה היו מאורגנים כראוי (קלודין-IV תאים חיוביים מוקפים Cytokeratin 14 תאים חיוביים; איור 6Ai), אובדן הקיטוב (איור 6Aii) נצפה באצ'יני שנוצר על ידי BPECs שהשתנו באופן חלקי ומוחל (איור 6B).

אחד המאפיינים העיקריים של תא שהשתנה הוא יכולתו לצמוח עם עצמאות הקשר עם למינה הבסיסית. נכס זה הוערך על ידי גידול התאים המוטמעים על אגר במשך 3 שבועות, תוך הימנעות מעגן שלו לפני השטח (איור 7A). במהלך 3 השבועות הבאים, תאים אלה עם יכולת צמיחה עצמאית מעגן הוליד מושבות המורכבות תאים מרובים. כפי שמוצג איור 8, יומיים לאחר שנזרע אגר, חלק מהתאים כבר סבלו 2-3 חטיבות. לאחר שבוע, תאים עם מורפולוגיה דמוית מוות ניתן לראות המציין כי התאים שאינם מסוגלים לשרוד בתנאים אלה בסופו של דבר מתו, ככל הנראה על ידי אנוקיס. עם זאת, חלק מהתאים ממשיכים להתחלק ו ליצור מושבות קטנות הגדלות במהלך השבוע השני והשלישי של התרבות.

לאחר הוספת MTT לתרבות, רק תאים אלה פעילים באופן מטבולי, כלומר, בחיים, מסוגלים לחשוף את טבעת הטטרזוליום של MTT וכתוצאה מכך גבישי MTT formazan סגולים 24 שעות מאוחר יותר (איור 7B). עם זאת, גבישים אלה נוצרים לא רק על ידי מושבות עם תאים חיים, אלא גם על ידי תאים בודדים שעדיין בחיים לאחר 3 שבועות אגר (איור 9). מכיוון שמטרת טכניקה זו היא לקבוע את היכולת של תאים להתרבות באופן עצמאי מצע, יש להעריך את גודל המושבות החיוביות של MTT. מדידה של קוטר המושבה ניתן להעריך על ידי ניתוח תמונה אוטומטי (איור 7C) כך מושבות קטנות או תאים בודדים ניתן לסנן. כפי שמוצג איור 10, נקודות אפורות תואמות למושבות שסבלו פחות משלוש חטיבות בשלושה שבועות ובכך מודדות פחות מ-65 מיקרומטר קוטר. אירועים אלה נכללו בהדמיית הנתונים אך לא נכללו לכמות הסופי.

בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על כך שעצמאות מעגנות מאפשרת אפליה בין דרגות שונות של טרנספורמציה (איור 10). מספר המושבות שנוצרו על ידי BPECs שאינם משתנים היה זניח בהשוואה לאלה שנוצרו על ידי BPECs שהשתנו באופן חלקי ומחזור מלא (מספר מושבה: N = 3; ד = 278; T = 243). כמו כן, כאשר גודל המושבה נחשב, ההבדלים בין מצבי שינוי חלקי לחלוטין התברר (גודל חציוני המושבה: N = 70 מיקרומטר; D = 83 מיקרומטר; T = 114 מיקרומטר). אם לוקחים בחשבון את גודל המושבה מספק מידע מדויק יותר לגבי הפוטנציאל tumorigenic של קווי תאים שנחקרו ולכן מומלץ מאוד לשקול את זה.

איור 1: צילום מסך המדגים את סף התמונה לאחר הכתמת MTT באמצעות תוכנת פיג'י. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: צילום מסך של מנתח החלקיק המורחב מתנאי התוסף Biovoxxel והתוצאה בתוכנת פיג'י. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ייצוג סכמטי של המודל הניסיוני של טרנספורמציה תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שיעור ההתפשטות ב-BPECs שאינם משתנים, משתנים באופן חלקי ומשוחזר לחלוטין. מוצגים קווים בכושר הטוב ביותר ורצועות ביטחון של 95% (קווים מנוקדים) של הרגרסיה הליניארית. ANCOVA עבור מודל רגרסיה ליניארי הוחל על ההשוואה בין התנאים; * ערך p< 0.0001. נתון זה הותאם מ Repullés ואח '. 2019⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: היווצרות וצמיחה של Acini לאחר זריעת BPECs במטריצת קרום המרתף. (A)תמונות מייצגות של זמן לשגות עבור הזמנים הראשונים (מ 0 עד 7 שעות) לאחר זריעת BPECs במטריצת קרום מרתף. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.(B) גודל Acini לאורך 14 ימי התרבות במטריצת קרום המרתף עבור BPEC שאינו משתנה, חלקית, והפך לחלוטין. קווי שגיאה מציינים SEM. אין הבדלים סטטיסטיים בין התנאים ביום 14 (תיקון ANOVA חד-כיוון ותיקון טוקי; p-value > 0.05). נתון זה הותאם מ Repullés ואח '. 2019⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: קיטוב Acini ב- BPECs שאינםמשתנים,חלקית ( D ), וטרנספורמציה מלאה (T) BPECs לאחר תרבות תלת-מימד במטריצת קרום המרתף. (A)תמונות מייצגות של סינוס מקוטב ולא מקוטב לאחר Cytokeratin 14 (K14, אדום) וקלודין-IV (Cl-IV, ירוק) immunofluorescence. acini מקוטב (i) נחשבו כאשר Cytokeratin 14-תאים חיוביים הקיפו תאים חיוביים קלודין-IV; אחרת, acini נחשבו לא מקוטבים מאז Cytokeratin 14 ו קלודין-IV תאים חיוביים היו ממוקמים הן באמצע המיקומים ההיקפיים (ii). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (B) אחוז acini מקוטב. מספר מינימלי של 10 acini נותחו עבור כל תנאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: ייצוג סכמטי של השלבים השונים המשמשים להסטת הצמיחה הבלתי תלויה בעיגון ב- BPECs. התאים היו מתורבתים במשך 3 שבועות אגר רך (A) ולאחר מכן הכתמת MTT הוחלה (B). סרגל קנה מידה = 5 מ"מ.(C)מושבות חיוביות MTT כומתו באמצעות תוכנת פיג'י. שלבים שונים בעיבוד תמונה מסומנים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: התפתחות צמיחת התאים במשך 3 שבועות לאחר זריעת תאים מותאמים אישית ב-0.3% אגר. תמונות נרכשות מתרבות BPEC שהשתנתה חלקית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: תמונות מייצגות של הכתמים והכתמים של MTT. מוצגות דוגמאות עם מושבה חיובית MTT (שורה 1), שתי מושבות MTT שליליות (שורה 2) ותאים בודדים חיוביים או שליליים עבור כתמי MTT (שורה 3). A מציין את האזור של המושבה או התא החיוביים של MTT. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: כימות המושבה לאחר בדיקה עצמאית של מעגן ב-BPECsשאינם שעברו טרנספורמציה ( N ), חלקית(D) ו- BPECs שעברו טרנספורמציה מלאה . (א)מספר וקוטר המושבות שהושגו עבור התנאים השונים. כל נקודה מתאימה למושבה אחת. נקודות אפורות רכות מייצגות מושבות חיוביות של MTT, שלא נכללו בתוצאות מכיוון שהקטר שלהן היה נמוך מ- 65 מיקרומטר (גודל מינימלי נחשב לאחר החלת המשוואה מספר 4 ובהתחשב בחלוקה אחת לפחות בשבוע). הקו האדום מציין את קוטר המושבה החציוני עבור כל קבוצה. שני עותקים משוכפלים עצמאיים בוצעו עבור כל תנאי. אותיות שונות (a, b, c) מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית במספר המושבות (המבחן המדויק של פישר; p-value < 0.05) ועל הקוטר החציוני שלהם (מבחן Kruskal-Wallis עם תיקון השוואות מרובות; p-value < 0.05). גרף זה הותאם מ Repullés ואח '. 2019⁷. (B)תמונות מייצגות של בארות שלמות לאחר הכתמת MTT. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ; סרגל קנה מידה Inset = 2.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

Discussion

הפרוטוקולים הניסיוניים המתוארים במאמר זה מספקים כלים שימושיים להערכת השינוי האונקוגני של תאים מתורבתים במבחנה. כל טכניקה מעריכה היבטים ספציפיים של תהליך השינוי, ולכן יש להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת סיוק מסקנות מניתוח יחיד. הצטברות עקומות צמיחה היא גישה הדורשת מידע שכבר זמין בעת culturing תאים למטרות אחרות. זה עושה טכניקה זו זול יותר וקל יותר ליישם בהשוואה לתהלוכה התפשטות תאים אחרים. עם זאת, כדי להשיג תוצאות תקפות, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת ספירה ותאי זריעה בכל פעם שהם subcultured. קצב צמיחה מוגבר מעיד על^{טרנספורמציה תאית 1}, אבל זה לא אמור לשמש לבד כי גורמים אקסוגניים אחרים, כגון תוספת / הסרה של חומרים אנטיביוטיים ופחפניים או וריאציה בתנאי תרבות (למשל, טמפרטורה, CO 2 )_{יכול גם}להשפיע על חלוקת הסלולר. חשוב גם לקחת בחשבון כי ההתמרה או הטיפול בתאים עם תרופות עשוי להשפיע על קצב הצמיחה שלהם בימים או בשבועות הקרובים ובכך לתת תצוגה מעוותת של יכולת התפשטות לטווח ארוך. בהקשר זה, יש לבצע פקדים מתאימים.

תרבות 3D במטריצת קרום מרתף מאפשרת הערכה של חלוקת תאים בתוך ישות פונקציונלית שלמה, acinus. ארגון שהשתנה מעיד על ליקוי תקשורת בין תאי שעלול להוביל לאובדן תפקוד, מאפיין של רקמות גידוליות. העובדה שחלק מהארגון הלא מקוטב הנוכחי מצביעה על כך שתאים מסוימים יזמו את תהליך הטרנספורמציה. לגבי בעיות טכניות, חשוב לקבוע במדויק את הריכוז האופטימלי של תאים זרעים ואת ריכוז המטריצה. שני פרמטרים אלה יכולים להשפיע על המספר והגודל של acini וכתוצאה מכך זה יכול להפריע היכולת הארגונית שלהם. כמו כן, מניפולציה של מטריצת קרום מרתף דורשת מידה מסוימת של ניסיון כפי שהוא חייב להיות מטופל בעדינות. למרות היותו טכניקה מייגעת, הצמיחה של תאים בשלושה ממדים דומה להקשר הפיזיולוגי של תאים אלה ומאפשרת הערכה לא רק של התפלגות^{סמני שושלת השד 7},^{15, אלא} גם של מבנים אחרים המספקים מידע על תכונות גידוליות, כגון שיבוש קרום^{המרתף 16}. תרבויות תאים תלת-מימדיות מייצגות את העתיד במחקר על תרבות התאים. למעשה, גידולים תלת מימדיים יכולים להפוך ממצאים פיזיולוגיים ומעניינים יותר תוך לקיחת בחשבון אלמנטים microenvironment ולספק לנו הרבה מחקרים שונים, כמו גם זיהוי והערכה של מטרות טיפוליות, אינטראקציות תא לתא, או חקירות תאי גזע.

צמיחה בלתי תלויה באנקורג' של תאים חסידיים היא פינוק חד משמעי של תהליך הטרנספורמציה. בעוד כמה BPECs שהשתנו חלקית ובאופן מלא עדיין הצליחו ללדת acinus מובנה, הם מבטאים את יכולתם ליצור מושבות כאשר נאלצו לגדול בנפרד בהשעיה. ברמה הטכנית, המשגיח מעגן הוא גם מורכב מאז וריאציות קטנות במהלך מניפולציה אגר (למשל, טמפרטורה גבוהה) או במהלך disaggregation של תאים לאחר טריפסיניזציה יכול לשמצה להשפיע על היווצרות מושבת התא. עם זאת, החומר הנדרש זול יותר מטריצת קרום מרתף המשמשת לתרבויות תאים תלת-מימדיות מה שהופך את הערכת הצמיחה העצמאית לעגן לזולה יותר. כמו כן, לפני תוספת MTT, מושבות בודדות ניתן לבחור מותר לגדול מתוך אגר בצלחות עם משטח חסיד. מושבות אלה עלולות לגרום קווי תאים שיבוט שעשויים להמשיך לגדול בהשעיה או לדבוק שוב. DNA, RNA, ו /או חלבון ניתן לחלץ מתרבויות תאים אלה לניתוחים נוספים.

יש מגבלה כללית לגבי השיטות המתוארות כאן: הם מאוד זמן רב, וזה לוקח כמה שבועות כדי להשיג את התוצאות. עם זאת, מאז כל בדיקה מעריכה מאפיין גידול ספציפי, מסקנות שנעשו בהתחשב בכל קבוצה של תוצאות הם מאוד קול. לכן, כל שלושת המבחנים יחד הם אינדיקטורים חזקים של טרנספורמציה תאית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture