In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Summary

Detta protokoll ger experimentella in vitro-verktyg för att utvärdera omvandlingen av mänskliga bröstceller. Detaljerade steg för att följa upp cell spridningshastighet, anchorage-oberoende tillväxt kapacitet och fördelning av cellen härstamningar i 3D kulturer med källare membran matris beskrivs.

Abstract

Tumorigenesis är en flerstegsprocess där celler förvärva kapacitet som tillåter deras tillväxt, överlevnad, och spridning under fientliga förhållanden. Olika tester försöker identifiera och kvantifiera dessa kännetecken för cancerceller; emellertid, de fokuserar ofta på en enda aspekt av cellulära omvandling och, i själva verket, flera tester krävs för deras korrekt karakterisering. Syftet med detta arbete är att ge forskarna en uppsättning verktyg för att bedöma cellulär transformation in vitro ur ett brett perspektiv och därigenom göra det möjligt att dra sunda slutsatser.

En ihållande proliferative signalering aktivering är den viktigaste funktionen för tumoral vävnader och kan lätt övervakas under in vitro-förhållanden genom att beräkna antalet befolkningen fördubblingar uppnås över tiden. Förutom, tillväxten av celler i 3D-kulturer tillåter deras interaktion med omgivande celler, som liknar vad som sker in vivo. Detta möjliggör utvärdering av cellulära aggregering och, tillsammans med immunofluorescent märkning av särskiljande cellulära markörer, att få information om en annan relevant egenskap av tumoral omvandling: förlusten av korrekt organisation. En annan anmärkningsvärd egenskap hos transformerade celler är deras förmåga att växa utan fastsättning till andra celler och till den extracellulära matrisen, som kan utvärderas med förankringsanalysen.

Detaljerade experimentella förfaranden för att utvärdera celltillväxthastighet, att utföra immunofluorescent märkning av cell härstamning markörer i 3D kulturer, och att testa förankringsoberoende celltillväxt i mjuk agar tillhandahålls. Dessa metoder är optimerade för Breast Primary Epitelial Cells (BPEC) på grund av dess relevans vid bröstcancer; kan dock procedurer tillämpas på andra celltyper efter vissa justeringar.

Introduction

Flera på varandra följande händelser krävs för neoplasm utveckling. År 2011 beskrev Hanahan och Weinberg 10 kapaciteter som möjliggör transformerade cellers tillväxt, överlevnad och spridning: den så kallade "Kontrollstämplar av cancer"¹. Den metodik som beskrivs här sammanställer tre olika verktyg för att utvärdera in vitro cellulära omvandling genom att fokusera på några av de tumoral cellernas särskiljande egenskaper. Dessa tekniker bedömer cellproliferationshastigheten, cellernas beteende när de odlas i 3D och deras förmåga att bilda kolonier med förankringsavhängighet.

Cellmodeller är avgörande för att testa hypotes in vitro. Olika tillvägagångssätt har utvecklats för att generera experimentella modeller av cellulär omvandling för studiet av cancer^2,3,4. Eftersom bröstcancer är den vanligaste cancerformen bland kvinnor världen över och ansvarar för cirka 15% av dödsfall i cancer bland kvinnor⁵, att tillhandahålla lämpliga cellulära modeller av bröst epitelceller är av yttersta vikt för vidare utredning. I den här artikeln har vi illustrerat potentialen i tre tekniker för att utvärdera cellulär omvandling med hjälp av en experimentell modell av Breast Primary Epitelial Cells (BPECs) omvandling som ursprungligen beskrevs av Ince och kollegor i 2007⁶ och senare genomförs i vårt laboratorium⁷. Denna experimentella modell bygger på sekventiell förändring av tre riktade gener (SV40 Large T och små t antigener häri benämns Ttag, hTERT, och HRAS) till arvsmassan hos icke-transformerade BPECs. Dessutom gynnar den metod som används för BPECs härledning underhåll av bröst epitelceller med luminal eller myoepithelial markörer, vilket resulterar i en heterogen cellkultur som behåller några av bröstkörteln fysiologiska drag.

I bröstkörteln ligger luminal bröstepitelceller, som ansvarar för mjölkproduktionen, nära lumen, medan myoepithelialceller avyttras runt luminala celler och tar hand om sammandragningsrörelser som leder mjölken till bröstvårtan. Förlusten av korrekt organisation mellan dessa cell härstamningar är en funktion av tumoral omvandling⁸ som kan bedömas in vitro efter immunofluorescent upptäckt av särskiljande härstamning markörer i 3D cellkulturer. En annan stor egenskap hos tumörceller är deras förmåga att växa utan fastsättning till andra celler och till den extracellulära^{matrisen 1}. När friska celler tvingas växa i suspension, mekanismer såsom anoikis \u2012 en typ av celldöd inducerad som svar på lossnar från extracellulära matris \u2012 aktiveras⁹. Undandragandet av celldöd är ett av de utmärkande kännetecknen för cancer och därmed är transformerade celler kapabla att inaktivera anoikis och överleva på ett ankare-oberoende sätt. Denna kapacitet kan utvärderas in vitro med den förankringsoberoende analysen med hjälp av mjuk agar. Vidare är en inneboende egenskap hos tumoral vävnader deras ihållande proliferative signalering kapacitet, som lätt kan övervakas under in vitro-förhållanden genom att mäta ökningen av cell antal längs tid, inte bara i suspension analyser utan också genom att övervaka tillväxttakten för monolayer anhängare kulturer.

Trots den bästa modellen för att testa tumorigenic potential är inokulering av tumoral celler i murine modeller och utvärdering av tumörutveckling in situ, är det viktigt att minimera antalet djur som används i experimentella förfaranden så mycket som möjligt. Därför är det högsta prioritet att ha lämpliga tester för att bedöma omvandling in vitro. Här tillhandahåller vi en uppsättning verktyg för att utvärdera den tumorigenic potentialen av delvis och helt omvandlade bröst epitelceller som lätt kan genomföras i de flesta av de laboratorier som arbetar med cellulära omvandling modeller.

Protocol

Humanprover som användes i följande experiment erhölls från reduktion mammoplasties som utförts på Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) enligt standardförfarande samtycke. Alla procedurer utförs i ett klass II Biologiskt säkerhetsskåp om inget annat anges.

1. In vitro-kultur av mänskliga bröst epitelceller och tillväxtkurva tomt uppbyggnad

1. In vitro-odling av bröst primära epitelceller (BPECs): cell passaging
   OBS: För BPEC härledning och cellodling följ instruktioner som beskrivs av Ince et al., 2007⁶.
   1. Medelhög förberedelse.
      1. Komplettera WIT basal definierade medium med P eller T-tillägg, som tillhandahålls av tillverkaren, beroende på om primära eller omvandlas BPECs odlas.
      2. Tillsätt koleratoxin till det kompletterade WIT-mediet till en slutkoncentration på 100 ng/mL för primär eller 25 ng/mL för transformerade BPECs.
         FÖRSIKTIGHET: Koleratoxin är dödligt vid förtäring. Använd personlig skyddsutrustning. Undvik dess release till miljön.
   2. Cellodling underhåll och passaging.
      OBS: För följande steg tänk på att celler växer i en T25 kolv. Icke desto mindre kan volymerna anpassas till andra cellkulturformat som bibehåller proportionaliteten vad gäller yta.
      1. Kolla på cellkonfluensen varje dag. När kulturen är 90% konfluent, utför cellpassning.
      2. Förvärva 1x PBS, 3x trypsin, medium och ett 15 mL koniskt rör som innehåller 2 mL av Fetal Bovine Serum (FBS) för varje kolv.
      3. Ta bort mediet från kolven och förvara det i det koniska röret på 15 mL som innehåller FBS.
      4. Skölj celler med 1x PBS.
      5. Lossa celler från ytan genom att lägga till 1 mL av 3x trypsin. Inkubera i 5 min vid 37 °C.
      6. Kontrollera om celler har lossnat. Applicera kraftig skakning om celler inte är helt lossnat.
      7. Inaktivera trypsin genom att lägga till det reserverade mediet kompletterat med FBS.
      8. Skörda cellulär fjädring och placera den i 15 mL koniska röret.
      9. Centrifugera i 500 x g i 5 min, eliminera supernatanten, och återanvända de pelleterade cellerna genom att snärta ner rörets botten med ett finger.
      10. Tillsätt 1–2 mL färska medier till pelleten och mät cellkoncentrationen med hjälp av en automatisk cellräknare eller en hemocytometer. Dessa data kommer senare att användas för att beräkna befolkningsdubblingarna och dra tillväxtkurvan. Utsäde 12 000 celler/cm² (t.ex. 300 000 celler för en T25-kolv) i modifierad cellodlingsytakolvar (se Tabell över material).
          OBS: Späd cellupphängningslösningen om koncentrationen är för hög för att säkerställa korrekt kvantifiering.
      11. Tillsätt medium till en slutlig volym på 5 mL och inkubera cellerna vid 37 °C och 5 % CO_2-atmosfär.
      12. Byt ut cellodlingsmediet var 48:e timme.
2. Befolkningsfördubblingsberäkning och datavisualisering
   1. Med hjälp av data av det cellantal som erhålls i steg 1.1.2.10, tillämpa följande formel för att erhålla de ackumulerade populationsdubblingsvärden (PD) värden:
      
      Där, PD_i betecknar antalet befolkningsdubblingar uppnås av cellerna fram till föregående subkultur (det hänvisar till PD ackumuleras på föregående subkultur), N_h är antalet skördade celler, och N_s är antalet seedade celler.
   2. Representera data för ett specifikt tidsintervall med hjälp av en XY-graf där antalet dagar i kultur (x-axel) och det ackumulerade PD (y-axis) representeras.
   3. Få den bäst passande linjen och den passande ekvationen:
      
      OBS: En ökad lutning (b) innebär en ökad spridningsgrad.

2. Tredimensionell (3D) kultur i källaren membran matris och immunofluorescerande protein detektion

1. 3D-kultur i källaren membran matris
   OBS: Detta protokoll har anpassats från Debnath et al., 2003¹⁰ och är optimerad för 24 brunnsplattor (se Tabell över material).
   1. Förbered materialet en dag före experimentet: pre-chill källaren membran matris över natten vid 4 °C och låt pipettspetsar, microcentrifugrör, och väl plattor svalna i frysen.
      OBS: Matrisen måste hållas vid -20 °C för långtidsförvaring. Gör alikvoter för att undvika flera frys-tina cykler.
   2. På dagen för experimentet, placera färdigkylt material på is.
   3. Skölj brunnar med kallsteril 1x PBS för att minska ytspänningen.
   4. Täck botten av varje brunn med 100 μL av källaren membranmatris.
      OBS: Dosera matrisen långsamt och sprida den i hela brunnen; det är avgörande att undvika bubbla bildning i bottenskiktet för att avvärja monolayer cellodling tillväxt.
   5. Placera plattan i inkubatorn, vid 37 °C, för att låta matrisskiktet stelna.
      OBS: Det tar vanligtvis ca 20 min att stelna.
   6. Under tiden, trypsinize celler som förklaras tidigare i steg 1.1. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min och resuspend i medium. Förbered en 400 000 celler/mL suspension och försiktigt disaggregate någon cell klump genom pipettering.
   7. Förbered mediet med 8% källarmembranmatris och blanda 1:1 (v/v) med cellulär fjädring för att få en 200 000 celler/mL-lösning i 4 % matris.
      OBS: Beräkna mängden medium som behövs för att undvika matris onödigt avfall.
   8. Placera 500 μL cellfjädring i matrislösning ovanpå det redan stelnade matrisskiktet för att så en total mängd av 100 000 celler i medium med 4% källarmembranmatris.
   9. Inkubera celler vid 37 °C i några minuter och tillsätt sedan 500 μL av mediet med 4% källarmembranmatris. Inkubera cellerna vid 37 °C i en inkubator med 5% CO₂ i 14 dagar. Seedade celler kommer att gruppera och föröka sig för att påbörja acini-liknande strukturer.
      OBS: Cellmotilitet och aggregering kan övervakas av time-lapse under 3D-bildningsprocessen. Använd programvara för bildanalys (t.ex. Fiji/ImageJ eller Imaris) för att utvärdera dessa händelser. Antalet och storleken på acini beror på aggregeringsprocessen och spridningshastigheten och kan variera mellan celltyper. Justera källaren membran matriskoncentration och seedade celler för att få önskade 3D-strukturer.
   10. Tillsätt 500 μL av mediet med 4% källarmembranmatris 2–3 gånger per vecka.
       OBS: Undvik störning av de lager som bär plattan försiktigt under manipuleringen.
   11. Om så önskas kan antalet och storleken på acini mätas under kulturperioden. För att göra det, ta slumpmässiga bilder vid olika tidpunkter efter sådd med hjälp av en faskontrast eller DIC inverterat mikroskop. Använd programvara för bildanalys för att mäta diametern på 100–200 3D-strukturer.
2. Immunfärgning
   OBS: Sterila förhållanden krävs inte under denna del av protokollet.
   1. Ta bort odlingsmediet.
   2. Riv källaren membran matris med hjälp av en p200 pipett spets med slutet avskurna. Placera ~50 μL disaggregerad matris ovanpå en glassply och smeta in den i ett område på 1–2 cm².
   3. Låt provet torka helt i rumstemperatur eller använd en värmeplatta vid 37 °C för att accelerera processen. Fixera prov med metanol:aceton (1:1, v/v) vid -20 °C i 30 min.
      OBS: Fluorescerande signal av tidigare markörer, såsom den hos fluorescerande proteiner som uttrycks av cellerna, kommer att raderas.
      VAR FÖRSIKTIG: Metanol är brandfarlig, giftig vid inandning, förtäring eller ifall den kommer i kontakt med hud. Använd personlig skyddsutrustning och arbeta inuti en rökhuva.
   4. Kassera fixeringslösningen och ta bort överskottet, om det finns något, genom att lutning av glid på filterpapper.
      OBS: Protokollet kan pausas här. När du är torr kan glidbanor förvaras vid -20 °C i flera månader.
   5. Blockprover epitopes med 5% normal get serum och 0.1% triton-X-100 i 1x PBS (blockerande lösning) för 2 h vid rumstemperatur.
   6. Under tiden, förbereda antikroppar arbetslösningar genom att späda primära eller sekundära antikroppar vid önskad koncentration i blockerande lösning.
      OBS: Antikroppskoncentrationen måste justeras noggrant beroende på celltyp och antikroppsreferensen. Som vägledning, för att identifiera celler från luminala och myoepitheliala härstamningar i BPEC, primära anti-Cytokeratin 14 och anti-Claudin-IV antikroppar (se Tabell of Materials) kan användas. Den rekommenderade arbetslösningskoncentrationen är 1:100 för dessa primära antikroppar och 1:500 för anti-Mouse och anti-Rabbit sekundära antikroppar (se Tabell av material).
   7. Tillsätt 30 μL primärantikroppar arbetslösning och täck den med en remsa av laboratorieinslagningsfilm för att undvika avdunstning. Inkubera över natten vid 4 °C i en fuktig kammare.
   8. Tvätta tre gånger med 1x PBS för 1 h vardera.
   9. Upprepa steg 2.2.7 för sekundära antikroppar. Inkubation bör utföras i mörker.
   10. Tvätta med 1x PBS för 2 h.
       OBS: Justera antikroppar koncentration, inkubationstid, och tvätt hårdhet för att förbättra signal / brusförhållandet för specifika prover.
   11. Ta bort resterande PBS och, när den är torr, motsylta med DAPI vid 0,25 μg/mL utspädd i antifade monteringsmedium. Täck diabilder med en coverslip genom att låta den bosätta sig utan att utöva tryck. Tätning med nagellack.
       OBS: Prover kan förvaras vid 4 °C i flera veckor. För långtidsförvaring, förvara dem vid -20 °C.
   12. Analysera fluorescerande signalfördelning för varje acinus med hjälp av ett konfokalmikroskop.
       OBS: Konfokal mikroskopkonfigurationen måste bestämmas exakt beroende på vilken utrustning som används och vilka antikroppar som appliceras på provet. Som vägledning, med den utrustning och de reagenser som beskrivs i materialtabellen, använd ett 40x-mål och följande laser- och detektorinställningar: för DAPI-användning excitation med en 405-laser (3%–5%), detektering med en PMT-detektor (800V, Offset: -9) och ett spektralband från 410 nm till 500 nm; för A488 (Claudin-IV) använd excitation med en 488 laser (7%–10%), detektion med en PMT-detektor (800V, Offset: -20) och ett spektralband från 490 nm till 550 nm; och för Cy3 (Cytokeratin 14) använder excitering med en 555-laser (2%–10%), detektion med en PMT-detektor (800V, Offset: -35) och ett spektralband från 560 nm till 600 nm.

3. Anchorageoberoende analys, MTT-färgning och automatisk kolonikvantifiering

1. Anchorage-oberoende analys: agar och cellulär fjädring plätering
   OBS: Protokollet har anpassats från Borowicz et al., 2014¹¹ för att utföra experiment i BPECs.
   1. Bered en 1,2% agarlösning utspädd i ultrarent vatten i en steril flaska. Autoklavera lösningen och underhåll den vid 42 °C under experimentet. Agarlösningen kan förvaras vid 4 °C; när så krävs, värm agarlösningen tills den är flytande igen.
      FÖRSIKTIGHET: Använd värmetåliga handskar för att undvika brännskada efter autoklav.
      OBS: Från och med nu måste sterila förhållanden upprätthållas.
   2. Förbered en 0,6% agarlösning genom att blanda 1:1 (v/v) komplett förvarvat medium med 1,2 % agarlösning. Bibehåll vid 42 °C för att undvika för tidig stelning.
      OBS: Medium kan tidigare dubbel kompletteras för att få en fullt kompletterad 0,6% agar + medellösning en gång blandad.
   3. Täck botten av en 35 mm brunn med 1,5 mL på 0,6 % agar i medellösning och låt den stelna vid rumstemperatur. Se till att botten av plattan är helt täckt före agar stelning, annars kan celler vidhäfta till plattan och växa i monolayer.
      OBS: Vidhäftande och icke-vidhäftande ytplattor kan användas.
   4. Under tiden, trypsinize celler och, när centrifuged och resuspended i medium, förbereda en 50.000 celler / ml-lösning och försiktigt disaggregate någon cell klump genom pipettering upprepade gånger.
   5. Förbered en 0,3% agar + cellsuspension i mediet vid en slutkoncentration på 25 000 celler/mL.
      OBS: Optimal cellkoncentration kan skilja sig mellan celltyper. Prova olika koncentrationer tills individualiserade kolonier bildas.
      1. Placera ett 40 μm silfilter ovanpå ett 50 mL sterilt rör och filtrera de 50 000 cellerna/mL-lösningen som låter det falla ner i rörets botten.
      2. Ta bort filtret från det 50 mL sterila röret, luta det cellinnehållande röret till en 45° vinkel och släpp samma volym på 0,6 % agar + medellösning som häller det genom den inre väggen på röret. Detta gör det möjligt för agarlösningen att svalna precis tillräckligt för att inte skada cellerna och undvika dess förtida stelning.
   6. Homogenisera blandningen och deponera 1 mL av 0,3% agar + cell suspension i mediet (som innehåller 25.000 celler) ovanpå den tidigare stelnat botten agarskiktet.
   7. Visualisera seedade celler med hjälp av ett inverterat mikroskop för att se till att cellerna är individualiserade. Annars bör försöket upprepas.
   8. Vänta tills agarskiktet är helt stelnat, tillsätt sedan försiktigt 1 mL av det färska mediet ovanpå utan att störa de känsliga agarlagren under.
   9. Inkubera cellerna vid 37 °C och 5% CO_{2 i} en inkubator i 3 veckor.
      OBS: Den tid som krävs för kolonibildning kan variera mellan olika celltyper, men vanligtvis är 3 veckor tillräckliga.
   10. Byt medium två gånger per vecka. För att göra det, försiktigt luta plattan mot dig, aspirera medium i det nedre hörnet, och tillsätt 1 mL färskt medium.
       OBS: Undvik att vidröra agarlagren då de lätt lossnar från plattan.
2. MTT-färgning
   1. Bered Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromid (MTT) stamlösning vid 6 mg/mL i ultrarent vatten i en steril flaska och filterlösning med hjälp av 0,2 μm filter. Denna MTT-lösning kan förvaras i upp till 6 månader vid -20 °C.
      FÖRSIKTIGHET: MTT kan orsaka irritation och misstänks orsaka genetiska defekter. Använd skyddsglasögon, handskar och ett andningsfilter.
      OBS: Undvik upprepade frys-töcykler.
   2. Bered en arbetslösning av MTT vid 1 mg/mL genom att späda ut stamlösningen med sterilt ultrarent vatten.
   3. När kolonibildningsperioden har avslutats, ta bort mediet från plattan och tillsätt 1 mL på 1 mg/mL MTT till varje brunn.
   4. Inkubera i 24 h i inkubatorn. Ta bort MTT-lösningen genom att aspirera den försiktigt. Plattor kan förvaras vid 4 °C i flera veckor.
      OBS: Undvik ljusexponering för att förhindra ospecifik kristallbildning.
3. Kolonikvantifiering
   1. Skaffa bilder av varje platta med hjälp av ett inverterat mikroskop. Justera förstoringen för att förvärva det maximala synfältet med färre bilder och ändå kunna upptäcka små kolonier (vanligtvis 4x eller 10x mål).
      OBS: Se till att bilder presenterar en homogen bakgrund. Varken faskontrast eller differentialinterferenskontrast krävs eftersom icke-färgade kolonier inte kommer att kvantifieras.
   2. Ladda upp bilder till ImageJ/ Fiji programvara¹² för att räkna antalet kolonier och området för varje MTT-positiv koloni.
      OBS: Ett skript för automatisk kvantifiering tillhandahålls som en tilläggsfil. Om du vill exekvera koden klistrar du in den i makroredigeraren (Plugins | Nya | Makro) och följ instruktionerna.
      1. Skaffa en binär mask genom att tröskela den ursprungliga bilden( Bild | Justera | Tröskel) för att få väl avgränsade kolonier (figur 1).
         OBS: 8- eller 16-bitars bilder krävs vanligtvis för att utföra detta steg. Metoden "Minimum threshold" rekommenderas.
      2. Kör Extended Particle Analyzer från Biovoxxel plugin¹³ (Plugins | BioVoxxel | Utökad Partikelanalysator )för att identifiera MTT positiva kolonier (Bild 2). Inledande guidningsförhållanden: Storlek (μm²) = 250–Infinity; Soliditet = 0,75–1,00.
   3. Uppskatta den genomsnittliga diametern (D) från varje koloniområdesvärde (A) enligt formeln:
      
   4. Filtrera resultat genom att utesluta låga proliferativa kolonier (t.ex. låg diameter).
      1. Välj ett minsta antal indelningar per vecka (m) som skall anses (t.ex., 1).
      2. Uppskatta radien för en koloni (R) med n celler enligt följande formel:
         
         Var, r är den genomsnittliga radien av enskilda celler i suspension, n är antalet celler som bildar en koloni som lidit m divisioner varje vecka under w veckor i kultur. I exponentiell tillväxt: n = 2^{(m *w)}. ρ är Effektiviteten Packaging. Observera att, i slumpmässig rörelse, är förpackningseffektivitet ~ 0,64 och den mest största möjliga förpackningsfraktion för identiska sfärer är 0,74¹⁴.
      3. Kassera alla kolonier som uppvisar en diameter som är lägre än 2R eftersom deras celler inte har uppnått det minsta antal divisioner som betraktas i steg 3.3.4.1.

Representative Results

En experimentell modell av cellulär omvandling med införandet av tre genetiska element i BPECs valdes för att generera representativa resultat av onkogen omvandling^6,7 (Figur 3). Icke-omvandlas BPECs (N) härleddes från sjukdomsfria bröst vävnad som beskrivs av Ince och kollegor⁶ och odlade efter det protokoll som anges här. Efter att övervinna STASIS (stress eller avvikande signalering inducerad-senescence, ett fenomen som vanligtvis observerats i bröst epitelceller in vitro som övervinns runt 4 veckor efter cellodling etablering), celler var i följd transduced med de lentiviral partiklarna pRRL-CMV-Ttag-IRES-eGFP och pRRL-CMV-TERT-IRES-CherryFP att erhålla delvis omvandlas celler (dubbel transduced; D). Expression av den virala Ttag hämmar p53 och retinoblastom funktion, och ektopiska uttryck av hTERT genen kompenserar för spridning-beroende telomer längd avgång. Efter fluorescerande urval genom cell sortering, celler var transduced med pLenti-CMV/TORasV12-Puro, som ger en ihållande mitogenic signal, och sedan tillväxt i närvaro av antibiotika för att välja transduced celler (trippel transduced; T), som helt omvandlades enligt Ince och kollegor⁶.

Som framgår av figur 4, en ökning av lutningen på regressionslinjen (parameter b i ekvationen 1.2.3) observeras med det ökande antalet genetiska modifieringar som införts i BPEC (N: 0,47, D: 0,93, T: 1.13). För ett specifikt tidsintervall, delvis (D) och helt omvandlade (T) uppnådde celler ett högre antal populationsdubblingar jämfört med de icke-transformerade cellerna (N), alltså ökades celldelningshastigheten med omvandlingsprocessen. Samma resultat kan också uttryckas som den tid som behövs för att duplicera_populationenav celler (t d ), som kan erhållas efter att ha ersatt y med 1 (PD) i ekvationen y = bx, alltså t_d = 1/b. I motsats till lutningen, t_d minskar med omvandling. Medan icke-transformerade celler behövde mer än 2 dagar för att duplicera sin befolkning (N: t_d = 2,13 dagar), delvis transformerade celler gjorde det på halva tiden (D: t_d = 1,08 dagar). Tillägget av HRAS under reglering av en kontitutiv promotor ledde till en ökad spridning aktivitet och celler som behövs mindre än 1 dag att duplicera (T: t_d = 0,89 dagar) i samförstånd med den mitogenic aktiviteten av denna onkogen.

Medan monolayer cell kultur är ett användbart verktyg för att studera in vitro-cellers beteende, det är en starkt begränsad strategi eftersom det inte kan återge de flesta av de fysiologiska tillstånd. Istället tillåter den tredimensionella cellkulturtekniken som beskrivs här att celler från olika härstamningar kan aggregera och röra sig fritt i en 3D-miljö som bildar acinarstrukturer tack vare den cell-cell- och cell-matrix-knutpunktsskapandet (Figur 5A. Tidsfördröjning). Under de följande 2 veckorna distribuerar celler efter sin ursprungliga vävnadsfunktion och förökar sig ökande acinistorleken (Figur 5B). Den korrekta polariseringen av varje acinus kan bedömas noggrant tack vare kombinationen av immunofluorescerande detektering av luminal (Claudin-IV) och myoepithelial (Cytokeratin 14) härstamningsmarkörer med tredimensionell signalplats genom konfokalmikroskopi (figur 6A). Medan alla acini som bildas av icke-transformerade BPECs var korrekt organiserade (Claudin-IV positiva celler omgiven av Cytokeratin 14 positiva celler; Bild 6Ai), förlust av polarisering (Figur 6Aii) observerades i acini som bildas av delvis och helt omvandlas BPECs (Figur 6B).

En av de viktigaste egenskaperna hos en förvandlad cell är dess förmåga att växa med oberoendet av kontakt med den basala lamina. Denna egenskap utvärderades genom att odla cellerna inbäddade på agar i 3 veckor, undvika dess förankring till plattan yta (Figur 7A). Under de följande 3 veckorna gav de celler med förankringsoberoende tillväxtkapacitet upphov till kolonier som består av flera celler. Som framgår av figur 8, 2 dagar efter att ha blivit seedade i agar, drabbades vissa celler redan av 2–3 divisioner. Efter 1 vecka, celler med död-liknande morfologi kan observeras som anger att de celler som inte är kapabla att överleva under dessa förhållanden så småningom dog, troligen av anoikis. Icke desto mindre fortsätter vissa celler att dela och bilda små kolonier som växer under de andra och tredje veckorna av kulturen.

Efter att ha lagt MTT till kulturen, endast de celler metaboliskt aktiva, dvs. Dessa kristaller bildas dock inte bara av kolonier med levande celler utan också av enstaka celler som fortfarande lever efter 3 veckor i agar (Figur 9). Eftersom syftet med denna teknik är att bestämma cellernas förmåga att föröka sig på ett substratoberoende sätt, måste storleken på de MTT-positiva kolonierna utvärderas. Mätning av kolonidiameter kan bedömas genom automatisk bildanalys (Figur 7C) så att små kolonier eller individualiserade celler kan filtreras. Som framgår av figur 10, motsvarar grå prickar de kolonier som har lidit mindre än tre divisioner på 3 veckor och mäter därmed mindre än 65 μm diameter. Dessa händelser ingick i datavisualiseringen men uteslöts från den slutliga kvantifieringen.

Sammantaget tyder dessa resultat på att förankringsavhängighetsanalys tillåter diskriminering mellan olika grader av omvandling (figur 10). Antalet kolonier som bildades av icke-transformerade BPECs var försumbart i jämförelse med dem som bildades av delvis och helt omvandlade BPECs (koloninummer: N = 3; D = 278; T = 243). Också, när kolonin storlek ansågs, skillnader mellan delvis och helt omvandlade stater blev uppenbart (koloni medianstorlek: N = 70 μm; D = 83 μm; T = 114 μm). Med kolonistorleken i beaktande ger mer exakt information om tumorigenic potential av studerade cellinjer och därmed är det starkt rekommenderat att överväga det.

Bild 1: Skärmdump exemplifierar bildtröskning efter MTT-färgning med hjälp av Fiji-programvara. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 2: Skärmdump av Den Utökade partikelanalysatorn från Biovoxxel plugin villkor och utfall i Fiji programvara. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 3: Schematisk representation av den experimentella modellen för cellulär transformation. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 4: Spridningsgrad i icke-transformerad, delvis och helt omvandlad BPECs. Bäst-fit linjer och 95% konfidensband (prickade linjer) av den linjära regressionen visas. ANCOVA för en linjär regressionsmodell tillämpades för jämförelsen mellan villkor; * p-värde < 0,0001. Denna siffra har anpassats från Repullés et al. 2019⁷. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 5: Acini bildning och tillväxt efter sådd BPECs i källaren membran matris. (A) Representativa bilder av en time-lapse för de inledande tiderna (från 0 till 7 timmar) efter seedning BPECs i källaren membran matris. Skala bar = 100 μm. (B) Acini storlek under de 14 dagarna av kultur i källaren membran matris för den icke-transformerade, delvis, och helt omvandlas BPEC. Felstaplar indikerar SEM. Inga statistiska skillnader mellan förhållanden på dag 14 (One-way ANOVA och Tukey korrigering; p-värde > 0,05). Denna siffra har anpassats från Repullés et al. 2019⁷. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 6: Acini polarisering i icke-transformerade, delvis (D), och helt omvandlas (T) BPECs efter 3D-kultur i källaren membran matris. (A) Representativa bilder av en polariserad och en icke-polariserad acinus efter Cytokeratin 14 (K14, röd) och Claudin-IV (Cl-IV, grön) immunofluorescens. Polariserad acini (i) ansågs när Cytokeratin 14-positiva celler omgivna Claudin-IV positiva celler; annars ansågs acini vara icke-polariserade sedan Cytokeratin 14 och Claudin-IV positiva celler var belägna både i mitten och perifera platser (ii). Skala bar = 25 μm. (B) Procent av acini polariserad. Ett minsta antal 10 acini analyserades för varje villkor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 7: Schematisk återgivning av de olika steg som används för den förankringsoberoende tillväxtanalysen i BPECs. Celler odlades i 3 veckor i mjuk agar (A) och sedan MTT färgning tillämpades (B). Skala bar = 5 mm. (C) MTT positiva kolonier kvantifierades med hjälp av Fiji programvara. Olika steg om bildbehandling är markerade. Skala bar = 200 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 8: Evolution av celltillväxt under 3 veckor efter sådd individualiserade celler i 0,3% agar. Bilder förvärvas från en delvis transformerad BPEC-kultur. Skala bar = 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 9: Representativa bilder av MTT-färgningen och kvantifieringen. Exempel med en MTT-positiv koloni (rad 1), två MTT-negativa kolonier (rad 2) och enstaka celler positiva eller negativa för MTT-färgning (rad 3) visas. A anger området för MTT-positiva kolonin eller cellen. Skala bar = 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 10: Kolonikvantifiering efter förankringsoberoende analys i icke-transformerad (N), delvis (D), och helt transformerad (T) BPECs. (A) Antal och diameter på de kolonier som erhålls för de olika förhållandena. Varje prick motsvarar en koloni. Mjuka grå prickar representerar MTT positiva kolonier, som uteslöts i resultaten eftersom deras diameter var lägre än 65 μm (minsta storlek beaktas efter applicering av ekvationen nummer 4 och med hänsyn till minst en division per vecka). Den röda linjen anger mediankolonidiametern för varje grupp. Två oberoende repliker utfördes för varje villkor. Olika bokstäver (a, b, c) anger statistiskt signifikanta skillnader för antalet kolonier (Fishers exakta test; p-värde < 0,05) och för deras mediandiameter (Kruskal-Wallis-test med flera jämförelser korrigering; p-värde < 0,05). Denna graf har anpassats från Repullés et al. 2019⁷. (B) Representativa bilder av hela brunnar efter MTT färgning. Skala bar = 5 mm; Inset skala bar = 2,5 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Kompletterande Fil. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil. 

Discussion

De experimentella protokoll som beskrivs i detta dokument tillhandahåller användbara verktyg för att bedöma den onkogena omvandlingen av in vitro-odlade celler. Varje teknik utvärderar specifika aspekter av omvandlingsprocessen, och därmed måste särskild uppmärksamhet ägnas när man drar slutsatser från en enda analys. Tillväxtkurvor uppbyggnad är ett tillvägagångssätt som kräver information som redan finns tillgänglig när odlingsceller för andra ändamål. Det gör denna teknik billigare och lättare att tillämpa jämfört med andra cell spridning analyser. Men för att få giltiga resultat måste särskild uppmärksamhet ägnas vid räkning och sådd celler varje gång de är subkulturerade. En ökad tillväxthastighet är ett tecken på cellulär omvandling¹, men det bör inte användas ensam eftersom andra exogena faktorer, såsom tillägg/ borttagning av antibiotiska och svampdödande ämnen eller variationen i odlingsförhållanden (t.ex. temperatur, CO₂) också kan påverka cellulär delning. Det är också viktigt att beakta att transduktion eller behandling av celler med läkemedel kan påverka deras tillväxttakt under de kommande dagarna eller veckorna och därmed ge en snedvriden syn på långsiktig spridningskapacitet. I detta avseende måste lämpliga kontroller utföras.

3D-kulturen i källaren membran matrisen tillåter bedömning av cellfördelning inom en hel funktionell enhet, den acinus. En förändrad organisation är vägledande för en intercellulär kommunikation nedskrivningar som skulle kunna leda till en förlust av funktion, en egenskap av tumoral vävnader. Det faktum att vissa acini presentera icke-polariserad organisation indikerar att vissa celler har inlett omvandlingsprocessen. När det gäller tekniska frågor är det viktigt att exakt bestämma den optimala koncentrationen av sådd celler och koncentrationen av matrisen. Dessa två parametrar kan påverka antalet och storleken på den resulterande acini och detta skulle kunna störa deras organisatoriska kapacitet. Också, manipulering av källaren membranmatris kräver en viss grad av erfarenhet som det måste försiktigt hanteras. Trots att en mödosam teknik, tillväxten av celler i tre dimensioner liknar fysiologiska sammanhang av dessa celler och gör utvärderingen inte bara av fördelningen av bröst härstamning markörer⁷,^{15 men}också av andra strukturer som ger information om tumoral funktioner, såsom störningar av källaren membranet¹⁶. 3D-cellkulturer representerar framtiden inom cellkulturforskningen. I själva verket kan 3D-tillväxt ge upphov till mer fysiologiska och intressanta resultat samtidigt som hänsyn tas till mikromiljöelement och ger oss en massa olika studier samt terapeutiska mål identifiering och utvärdering, cell till cell interaktioner, eller undersökningar stamceller.

Anchorage-oberoende tillväxt av anhängare celler är en entydig behandling av omvandlingsprocessen. Medan några av de delvis och helt omvandlade BPECs fortfarande kunde ge upphov till en strukturerad acinus, de manifesterar sin förmåga att bilda kolonier när tvingas växa individuellt i suspension. På den tekniska nivån är förankringsanalysen också komplex eftersom små variationer vid agarmanipulation (t.ex. hög temperatur) eller under disaggregering av celler efter trypsinization kan notoriskt påverka cellkolonibildningen. Det material som krävs är dock billigare än källaren membran matris som används för 3D-cellkulturer gör bedömningen av förankringsoberoende tillväxt billigare. Före MTT-tillägg kan också enstaka kolonier plockas och tillåtas växa ut ur agaren i plattor med en vidhäftande yta. Dessa kolonier kan resultera i klonala cellinjer som kan fortsätta växa i suspension eller hålla igen. DNA, RNA, och/eller protein kan extraheras från dessa cellkulturer för ytterligare analyser.

Det finns en allmän begränsning när det gäller de metoder som beskrivs här: de är mycket tidskrävande, och det tar flera veckor att få resultaten. Men eftersom varje test bedömer en specifik tumör egenskap, slutsatser som gjorts med tanke på hela uppsättningen av resultat är mycket sund. Därför är alla de tre testerna tillsammans kraftfulla indikatorer på cellulär omvandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture