Cancer Research

मानव स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं में ओंकोजेनिक परिवर्तन का विट्रो मूल्यांकन

Published: September 24, 2020 doi: 10.3791/61716

Joan Repullés^1,2, Mariona Terradas^1,3,4, Gemma Fuster^5,6,7, Anna Genescà¹, Teresa Anglada¹

¹Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona, ²Optical Microscopy Core Facilities, IDIBELL, ³Hereditary Cancer Program, Catalan Institute of Oncology, IDIBELL, ⁴Program in Molecular Mechanisms and Experimental Therapy in Oncology (Oncobell), IDIBELL, ⁵New Therapeutic Strategies in Cancer Group. Department of Biochemistry and Molecular Biomedicine, School of Biology, Institute of Biomedicine, University of Barcelona (IBUB), ⁶Department of Biochemistry & Physiology, School of Pharmacy and Food Sciences, University of Barcelona, ⁷Department of Biosciences, Faculty of Sciences and Technology, University of Vic

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव स्तन कोशिकाओं के परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगात्मक इन विट्रो उपकरण प्रदान करता है। अनुवर्ती सेल प्रसार दर, एंकरेज-स्वतंत्र विकास क्षमता, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ 3 डी संस्कृतियों में सेल वंश के वितरण के लिए विस्तृत कदम वर्णित हैं।

Abstract

ट्यूमरजीनेसिस एक बहु-चरण प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाएं ऐसी क्षमताएं प्राप्त करती हैं जो शत्रुतापूर्ण परिस्थितियों में उनके विकास, अस्तित्व और प्रसार की अनुमति देती हैं। विभिन्न परीक्षण कैंसर कोशिकाओं की इन पहचान की पहचान और मात्रा निर्धारित करना चाहते हैं; हालांकि, वे अक्सर सेलुलर परिवर्तन के एक पहलू पर ध्यान केंद्रित करते हैं और वास्तव में, उनके उचित लक्षण वर्णन के लिए कई परीक्षणों की आवश्यकता होती है। इस काम का उद्देश्य शोधकर्ताओं को व्यापक परिप्रेक्ष्य से विट्रो में सेलुलर परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपकरणों का एक सेट प्रदान करना है, जिससे ध्वनि निष्कर्ष निकालना संभव हो सके।

एक निरंतर प्रसार संकेत सक्रियण ट्यूमर ऊतकों की प्रमुख विशेषता है और समय के साथ प्राप्त जनसंख्या दोहरीकरण की संख्या की गणना करके इन विट्रो स्थितियों के तहत आसानी से निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों में कोशिकाओं का विकास आसपास की कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत की अनुमति देता है, जो वीवो में होता है। यह सेलुलर एकत्रीकरण के मूल्यांकन में सक्षम बनाता है और, एक साथ विशिष्ट सेलुलर मार्कर की इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग के साथ, ट्यूमर परिवर्तन की एक और प्रासंगिक विशेषता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए: उचित संगठन का नुकसान। परिवर्तित कोशिकाओं की एक और उल्लेखनीय विशेषता अन्य कोशिकाओं के प्रति लगाव के बिना और बाह्य मैट्रिक्स के लिए विकसित करने की उनकी क्षमता है, जिसका मूल्यांकन एंकरेज परख के साथ किया जा सकता है।

सेल विकास दर का मूल्यांकन करने, 3 डी संस्कृतियों में सेल वंश मार्कर की इम्यूनोफ्लोरेटेंट लेबलिंग करने और नरम आगार में एंकोरेज-स्वतंत्र सेल वृद्धि का परीक्षण करने के लिए विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाएं प्रदान की जाती हैं। स्तन कैंसर में इसकी प्रासंगिकता के कारण इन पद्धतियों को स्तन प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाओं (बीपीईसी) के लिए अनुकूलित किया जाता है; हालांकि, प्रक्रियाओं को कुछ समायोजन के बाद अन्य सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

नियोप्लाज्म विकास के लिए लगातार कई घटनाओं की आवश्यकता होती है। २०११ में, हहान और वेनबर्ग ने 10 क्षमताओं का वर्णन किया जो कोशिकाओं के विकास, अस्तित्व और प्रसार को बदल देते हैं: तथाकथित "कैंसर की पहचान"¹। यहां वर्णित पद्धति ट्यूमर कोशिकाओं की विशिष्ट विशेषताओं में से कुछ पर ध्यान केंद्रित करके इन विट्रो सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए तीन अलग-अलग उपकरण संकलित करती है। ये तकनीकें सेल प्रसार दर, कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन करती हैं जब 3 डी में सुसंस्कृत होती हैं और एंकरेज स्वतंत्रता के साथ उपनिवेश बनाने की उनकी क्षमता होती है।

सेल मॉडल विट्रो में परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कैंसर के अध्ययन के लिए सेलुलर परिवर्तन के प्रयोगात्मक मॉडल तैयार करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं ,³^,⁴. चूंकि स्तन कैंसर दुनिया भर में महिलाओं के बीच सबसे आम कैंसर है और महिलाओं के बीच कैंसर से होने वाली मौतों के लगभग 15% के लिए जिम्मेदार है,^5,स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं के उपयुक्त सेलुलर मॉडल प्रदान करना आगे की जांच के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। इस लेख में, हमने 2007⁶ में Ince और सहयोगियों द्वारा वर्णित स्तन प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाओं (बीपीईसीएस) परिवर्तन के प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग करके सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए तीन तकनीकों की क्षमता को चित्रित किया है और बाद में हमारी प्रयोगशाला⁷में लागू किया गया। यह प्रायोगिक मॉडल तीन लक्षित जीन (एसवी 40 बड़े टी और छोटे टी एंटीजन के अनुक्रमिक परिवर्तन पर आधारित है, जिसे टीटैग, एचआरटीटीऔर एचआरएएस कहा जाताहै) गैर-परिवर्तित बीपीईसी के जीनोम के लिए। इसके अलावा, BPECs व्युत्पन्न के लिए उपयोग की जाने वाली विधि चमकदार या मायोपिथेलियल मार्कर के साथ स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं के रखरखाव के पक्ष में है, जिसके परिणामस्वरूप एक विषम कोशिका संस्कृति होती है जो कुछ स्तन ग्रंथि शारीरिक लक्षणों को बरकरार रखती है।

स्तन ग्रंथि में, ल्यूमिनल स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं, जो दूध उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं, ल्यूमेन के पास स्थित होती हैं, जबकि मायोएपिथेलियल कोशिकाओं को ल्यूमिनल कोशिकाओं के आसपास निपटाया जाता है और दूध को निप्पल तक ले जाने वाले संकुचन आंदोलनों का ख्याल रखते हैं। इन सेल वंश के बीच उचित संगठन का नुकसान ट्यूमर परिवर्तन 8 की एक विशेषता है जिसे³ डी सेल संस्कृतियों में विशिष्ट वंश मार्कर के इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन के बाद विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है। ट्यूमर कोशिकाओं की एक और प्रमुख विशेषता अन्य कोशिकाओं से लगाव के बिना और बाह्राम मैट्रिक्स¹के लिए विकसित करने की उनकी क्षमता है । जब स्वस्थ कोशिकाओं को निलंबन में बढ़ने के लिए मजबूर किया जाता है, तो एनोकिस \ u2012 जैसे तंत्र एक प्रकार की कोशिका मृत्यु जो एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स से टुकड़ी के जवाब में प्रेरित होती है \ u2012⁹सक्रिय हैं। सेल डेथ की चोरी कैंसर की विशिष्ट पहचान में से एक है और इस प्रकार, परिवर्तित कोशिकाएं एनोकी को निष्क्रिय करने और एंकर-स्वतंत्र तरीके से जीवित रहने में सक्षम हैं। इस क्षमता का मूल्यांकन कोमल आगार का उपयोग करके एंकरेज-स्वतंत्र परख के साथ विट्रो में किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्यूमर ऊतकों की एक अंतर्निहित विशेषता उनकी निरंतर प्रसारीय संकेत क्षमता है, जिसे समय के साथ सेल संख्या में वृद्धि को मापने के द्वारा इन विट्रो स्थितियों के तहत आसानी से निगरानी की जा सकती है, न केवल निलंबन परख में बल्कि मोनोलेयर अनुयायी संस्कृतियों की वृद्धि दर की निगरानी करके भी।

ट्यूमरजनित क्षमता का परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल के बावजूद मुरीन मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं का टीका और सीटू में ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन है, यह जितना संभव हो प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में नियोजित जानवरों की संख्या को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, विट्रो में परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपयुक्त परीक्षण करना सर्वोच्च प्राथमिकता है। यहां, हम आंशिक रूप से और पूरी तरह से परिवर्तित स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं की ट्यूमरजनित क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपकरणों का एक सेट प्रदान करते हैं जिन्हें सेलुलर परिवर्तन मॉडल के साथ काम करने वाली अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से लागू किया जा सकता है।

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Protocol

निम्नलिखित प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले मानव नमूनों को मानक प्रक्रिया सहमति के तहत क्लेनिका पिलर संत जोर्डी (बार्सिलोना) में किए गए कम होने वाले मैमोप्लास्टीज से प्राप्त किया गया था। सभी प्रक्रियाओं को द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा मंत्रिमंडल में तब तक किया जाता है जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है।

1. मानव स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं और विकास वक्र भूखंड निर्माण की इन विट्रो संस्कृति

स्तन प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाओं (BPECs) की इन विट्रो संस्कृति: सेल पासaging
नोट: BPEC व्युत्पन्न और सेल संस्कृति के लिए Ince एट अल द्वारा वर्णित निर्देशों का पालन^{करें।}
1. मध्यम तैयारी।
  1. पूरक बुद्धि बेसल पी या टी की खुराक के साथ मध्यम परिभाषित, निर्माता द्वारा प्रदान की, कि क्या प्राथमिक या बदल BPECs सुसंस्कृत हैं पर निर्भर करता है ।
  2. में बदलाव वाले बीपीईसी के लिए प्राथमिक या 25 एनजी/एमएल के लिए 100 एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए पूरक बुद्धि माध्यम में हैजा टॉक्सिन जोड़ें।
    सावधानी: हैजा टॉक्सिन घातक है अगर निगल लिया । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। पर्यावरण के लिए इसकी रिहाई से बचें।
2. सेल संस्कृति रखरखाव और पासिंग।
  नोट: निम्नलिखित चरणों के लिए ध्यान रखें कि कोशिकाएं टी-25 फ्लास्क में बढ़ रही हैं। फिर भी, वॉल्यूम को सतह क्षेत्र के संदर्भ में समानता को बनाए रखने वाले अन्य सेल संस्कृति प्रारूपों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
  1. हर दिन सेल में नरमी की जांच करें। जब संस्कृति 90% कॉन्फ्ल्यूंट होती है, तो सेल पास्जेडिंग करें।
  2. प्रत्येक फ्लास्क के लिए 1x पीबीएस, 3x ट्राइपसिन, मध्यम और एक 15 एमएल शंकु नली का अधिग्रहण करें जिसमें भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का 2 एमएल होता है।
  3. मीडियम को फ्लास्क से निकालकर एफबीएस युक्त 15 एमएल शंकु नली में रख दें।
  4. 1x पीबीएस के साथ कुल्ला कोशिकाओं।
  5. 3x ट्राइप्सिन के 1 एमसीएल जोड़कर सतह से अलग कोशिकाओं को अलग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. जांच करें कि कोशिकाओं को अलग किया गया है या नहीं। कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग नहीं कर रहे हैं, तो जोरदार मिलाते हुए लागू करें।
  7. एफबीएस के साथ पूरक आरक्षित माध्यम जोड़कर ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करें।
  8. सेलुलर सस्पेंशन को हार्वेस्ट करें और इसे 15 एमएल शंकु नली में रखें।
  9. 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रलाइज, सुपरनैंट को खत्म करें, और ट्यूब के नीचे को उंगली से फ्लिक करके पैलेट्ड कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
  10. गोली में ताजा मीडिया के 1-2 एमएल जोड़ें और स्वचालित सेल काउंटर या एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता को मापें। इस डेटा का उपयोग बाद में जनसंख्या दोहरीकरण की गणना करने और विकास वक्र को आकर्षित करने के लिए किया जाएगा। संशोधित कोशिका संस्कृति सतह फ्लास्क (सामग्री की तालिकादेखें) में बीज 12,000 कोशिकाओं/सेमी² (उदाहरण के लिए, एक टी-25 फ्लास्क के लिए 300,000 कोशिकाएं)।
    नोट: उचित मात्राकरण सुनिश्चित करने के लिए एकाग्रता बहुत अधिक है, तो सेल निलंबन समाधान को पतला करें।
  11. 5 मिलीएल की अंतिम मात्रा में मध्यम जोड़ें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂ वायुमंडल में इनक्यूबेट करें।
  12. सेल कल्चर मीडियम को हर 48 घंटे में बदलें।
जनसंख्या दोगुनी गणना और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन
1. चरण 1.1.2.10 में प्राप्त सेल गणना के डेटा का उपयोग करके, संचित जनसंख्या दोहरीकरण (पीडी) मूल्यों को प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित सूत्र लागू करें:
  
  कहां, पीडी_मैं पिछले उपसंस्कृति तक कोशिकाओं द्वारा प्राप्त जनसंख्या दोहरीकरण की संख्या को दर्शाता है (यह पिछले उपसंस्कृति पर संचित पीडी को संदर्भित करता है), एन_एच काटा कोशिकाओं की संख्या है, और एन_एस वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या है ।
2. XY ग्राफ का उपयोग करके समय के एक विशिष्ट अंतराल के लिए डेटा का प्रतिनिधित्व करें जहां संस्कृति में दिनों की संख्या(एक्स-एक्सिस)और संचित पीडी (वाई-एक्सिस) का प्रतिनिधित्व कियाजाताहै।
3. सबसे अच्छा फिट लाइन और फिटिंग समीकरण प्राप्त करें:
  
  नोट: एक बढ़ी हुई ढलान (ख) का अर्थ है बढ़ी हुई प्रसार दर।

2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और इम्यूनोफ्लोरेसेंट प्रोटीन का पता लगाने में त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति

तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में 3 डी संस्कृति
नोट: इस प्रोटोकॉल को देबनाथ एट अल, 2003¹⁰ से अनुकूलित किया गया है और 24 अच्छी प्लेटों के लिए अनुकूलित किया गया है (सामग्री की तालिकादेखें)।
1. प्रयोग से एक दिन पहले सामग्री तैयार करें: प्री-चिल बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर और पिपेट टिप्स, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, और अच्छी तरह से प्लेटें फ्रीजर में शांत होने दें।
  नोट: मैट्रिक्स को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। कई फ्रीज-गल चक्र से बचने के लिए aliquots बनाओ।
2. प्रयोग के दिन बर्फ पर प्री-कूल्ड मटेरियल रखें।
3. सतह तनाव को कम करने के लिए ठंडे बाँझ 1x पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला।
4. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 100 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे कवर करें।
  नोट: मैट्रिक्स को धीरे-धीरे बांटें और इसे पूरे कुएं में फैलाएं; मोनोलेयर सेल कल्चर ग्रोथ को टालने के लिए बॉटम लेयर में बबल फॉर्मेशन से बचना महत्वपूर्ण है।
5. मैट्रिक्स परत जमना जाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर, इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
  नोट: यह आमतौर पर जमना करने के लिए लगभग 20 मिनट लगते हैं ।
6. इस बीच, कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें जैसा कि पहले चरण 1.1 में समझाया गया था। 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और मध्यम में पुनर्सपेंड करें। 400,000 कोशिकाओं/एमएल निलंबन तैयार करें और धीरे-धीरे पाइपिंग करके किसी भी सेल झुरमुट को अलग करें।
7. 8% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ माध्यम तैयार करें और 4% मैट्रिक्स में 200,000 कोशिकाओं/एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए सेलुलर निलंबन के साथ 1:1 (v/v) मिलाएं।
  नोट: मैट्रिक्स अनावश्यक कचरे से बचने के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा की गणना करें।
8. मैट्रिक्स समाधान में सेल निलंबन के 500 माइक्रोन को पहले से ही जम गई मैट्रिक्स परत के शीर्ष पर रखें ताकि 4% बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के साथ मध्यम में 100,000 कोशिकाओं की कुल मात्रा को बीज किया जा सके।
9. कुछ मिनटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और फिर, 4% बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के साथ माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें। 14 दिनों के लिए 5% सीओ₂ के साथ एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। वरीयता प्राप्त कोशिकाएं असिनी जैसी संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए समूह और प्रसारित करेंगी।
  नोट: सेल मोटिवेशन और एकत्रीकरण की निगरानी 3डी गठन प्रक्रिया के दौरान समय-चूक से की जा सकती है। इन घटनाओं का मूल्यांकन करने के लिए इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी/इमेजजे या इमारिस) का उपयोग करें। असिनी की संख्या और आकार एकत्रीकरण प्रक्रिया और प्रसार दर पर निर्भर करता है और सेल प्रकारों के बीच भिन्न हो सकता है। वांछित 3 डी संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स एकाग्रता और वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को समायोजित करें।
10. प्रति सप्ताह 4% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2-3 बार के साथ माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  नोट: हेरफेर के दौरान धीरे से प्लेट ले जाने वाली परतों की अशांति से बचें।
11. यदि वांछित है, तो संस्कृति अवधि के दौरान असिनी की संख्या और आकार मापा जा सकता है। ऐसा करने के लिए, एक चरण विपरीत या डीआईसी उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सीडिंग के बाद अलग-अलग समय पर यादृच्छिक चित्र लें। 100-200 3डी संरचनाओं के व्यास को मापने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
इम्यूनोस्टेपिंग
नोट: प्रोटोकॉल के इस हिस्से के दौरान बाँझ स्थितियों की आवश्यकता नहीं है।
1. संस्कृति माध्यम को हटा दें।
2. अंत कट के साथ एक p200 पिपेट टिप का उपयोग कर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स आंसू। एक ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर अलग मैट्रिक्स के ~ 50 μL रखें और यह 1-2 सेमी²के क्षेत्र में धब्बा ।
3. नमूना कमरे के तापमान पर पूरी तरह से सूखने दें या प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग प्लेट का उपयोग करें। मेथनॉल के साथ नमूनों को ठीक करें: एसीटोन (1:1, v/v) 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  नोट: पिछले मार्कर के फ्लोरोसेंट संकेत, जैसे कि कोशिकाओं द्वारा व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन, मिट जाएगा ।
  सावधानी: मेथनॉल ज्वलनशील, विषाक्त है अगर साँस, निगल लिया या मामले में यह त्वचा के संपर्क में आता है । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और एक धुएं हुड के अंदर काम करते हैं।
4. निर्धारण समाधान को त्यागें और फ़िल्टर पेपर पर स्लाइड को झुकाकर अतिरिक्त, यदि कोई हो, को हटा दें।
  नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । एक बार सूखने के बाद, स्लाइड को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
5. 5% सामान्य बकरी सीरम और 1x पीबीएस (ब्लॉकिंग सॉल्यूशन) में 0.1% ट्राइटन-एक्स-100 के साथ 2 घंटे के कमरे के तापमान पर ब्लॉक नमूने एपिटोप होते हैं।
6. इस बीच, समाधान को अवरुद्ध करने में वांछित एकाग्रता पर प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी को कमजोर करके एंटीबॉडी काम करने वाले समाधान तैयार करें।
  नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता को कोशिका प्रकार और एंटीबॉडी संदर्भ के आधार पर सही ढंग से समायोजित किया जाना चाहिए। एक गाइड के रूप में, बीपीईसी में ल्यूमिनल और मायोपिथेलियल वंश से कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, प्राथमिक एंटी-साइटोकेरिन 14 और एंटी-क्लाउडिन-IV एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जा सकता है। अनुशंसित कार्य समाधान एकाग्रता इन प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए 1:100 और एंटी-माउस और एंटी-रैबिट माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्रियों की तालिकादेखें) के लिए 1:500 है।
7. प्राथमिक एंटीबॉडी काम समाधान के 30 μL जोड़ें और वाष्पीकरण से बचने के लिए प्रयोगशाला लपेटन फिल्म की एक पट्टी के साथ इसे कवर। एक आर्द्र कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
8. प्रत्येक 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
9. माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए चरण 2.2.7 दोहराएं। इनक्यूबेशन अंधेरे में किया जाना चाहिए।
10. 2 घंटे के लिए 1x पीबीएस के साथ धो लें।
  नोट: विशिष्ट नमूनों के लिए संकेत/शोर अनुपात में सुधार करने के लिए एंटीबॉडी एकाग्रता, इनक्यूबेशन समय, और धोने कठोरता को समायोजित करें ।
11. शेष पीबीएस को हटा दें और एक बार सूखने के बाद, एंटीफेड बढ़ते माध्यम में पतला ०.२५ μg/mL पर DAPI के साथ जवाबी कार्रवाई की । दबाव लागू किए बिना इसे व्यवस्थित करके कवरलिप के साथ स्लाइड कवर करें। नेल पॉलिश के साथ सील करें।
  नोट: नमूनों को कई हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। दीर्घकालिक भंडारण के लिए, उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
12. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक एकिनस के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल वितरण का विश्लेषण करें।
  नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप विन्यास का उपयोग किए गए उपकरणों और नमूने पर लागू एंटीबॉडी के आधार पर सटीक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। एक गाइड के रूप में, सामग्री की तालिकामें विस्तृत उपकरण और अभिकर्मकों के साथ, 40x उद्देश्य और निम्नलिखित लेजर और डिटेक्टर सेटिंग्स का उपयोग करें: डीएपीआई के लिए 405 लेजर (3%-5%), पीएमटी डिटेक्टर (800V, ऑफसेट: -9) और 410 एनएम से 500 एनएम तक एक स्पेक्ट्रल बैंड; A488 (क्लाउडिन-IV) के लिए 488 लेजर (7%-10%), पीएमटी डिटेक्टर (800V, ऑफसेट: -20) और 490 एनएम से 550 एनएम तक एक स्पेक्ट्रल बैंड; और Cy3 (Cytokeratin 14) के लिए 555 लेजर (2%-10%), पीएमटी डिटेक्टर (800V, ऑफसेट: -35) और 560 एनएम से 600 एनएम तक एक स्पेक्ट्रल बैंड के साथ एक्सट्रक्टेशन का उपयोग करें।

3. एंकोरेज-इंडिपेंडेंट परख, एमटीटी स्टेनिंग और ऑटोमैटिक कॉलोनी क्वांटिफिकेशन

एंकोरेज-स्वतंत्र परख: आगर और सेलुलर निलंबन चढ़ाना
नोट: प्रोटोकॉल को बीपीईसी में प्रयोग करने के लिए बोरोविज़ एट अल, 2014¹¹ से अनुकूलित किया गया है।
1. एक बाँझ बोतल में अल्ट्रापुरे पानी में पतला 1.2% एगर समाधान तैयार करें। प्रयोग के दौरान समाधान को ऑटोक्लेव करें और इसे 42 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। आगर समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; जब आवश्यक हो, तो आगर समाधान को तब तक गर्म करें जब तक कि यह फिर से तरल न हो जाए।
  सावधानी: ऑटोक्लेव के बाद जलने से बचने के लिए गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने का उपयोग करें।
  नोट: अब से, बाँझ स्थितियों को बनाए रखा जाना चाहिए ।
2. 1.2% एगर समाधान के साथ 1:1 (v/v) पूर्ण पूर्व-गर्म माध्यम को मिलाकर 0.6% एगर समाधान तैयार करें। समय से पहले जमना से बचने के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  नोट: मध्यम पहले एक पूरी तरह से पूरक 0.6% आगर + मध्यम समाधान प्राप्त करने के लिए एक बार मिश्रित डबल किया जा सकता है।
3. मध्यम समाधान में 0.6% एगर के 1.5 एमएल के साथ 35 मिमी अच्छी तरह से कवर करें और इसे कमरे के तापमान पर जमना दें। सुनिश्चित करें कि प्लेट के नीचे पूरी तरह से आगर ठोसकरण से पहले कवर किया जाता है, अन्यथा, कोशिकाएं प्लेट का पालन कर सकती हैं और मोनोलेयर में बढ़ सकती हैं।
  नोट: अनुयायी और गैर-अनुयायी सतह प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है।
4. इस बीच, कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें और एक बार मध्यम में अपकेंद्रित्र और पुनः निलंबित होने के बाद, ५०,००० कोशिकाओं/एमएल समाधान तैयार करें और बार-बार पाइपिंग करके किसी भी कोशिका झुरमुट को धीरे से अलग करें ।
5. 25,000 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर माध्यम में 0.3% एगर + सेल सस्पेंशन तैयार करें।
  नोट: इष्टतम कोशिका एकाग्रता सेल प्रकारों के बीच भिन्न हो सकती है। जब तक व्यक्तिगत उपनिवेश नहीं बन जाते तब तक विभिन्न सांद्रता का प्रयास करें।
  1. एक 50 एमएल बाँझ ट्यूब के शीर्ष पर एक 40 μm छलनी फिल्टर रखें और 50,000 कोशिकाओं को फ़िल्टर/
  2. 50 एमएल बाँझ ट्यूब से फिल्टर निकालें, सेल युक्त ट्यूब को 45 डिग्री कोण पर झुकाएं और ट्यूब की आंतरिक दीवार के माध्यम से इसे डालने के लिए 0.6% एगर + मध्यम समाधान की एक ही मात्रा को छोड़ दें। यह आगर समाधान को ठंडा करने की अनुमति देगा बस कोशिकाओं को नुकसान नहीं पहुंचाने और इसके समय से पहले ठोसकरण से बचने के लिए पर्याप्त है।
6. मिश्रण को समरूप करें और पहले से जम जाने वाली नीचे की परत के शीर्ष पर माध्यम (25,000 कोशिकाओं युक्त) में 0.3% एगर + सेल निलंबन के 1 मिलियन मिलियन जमा करें।
7. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को व्यक्तिगत किया जाता है, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की कल्पना करें। अन्यथा प्रयोग दोहराया जाना चाहिए।
8. जब तक आगर परत पूरी तरह से जम न जाए तब तक प्रतीक्षा करें, फिर ध्यान से नीचे नाजुक आगर परतों को परेशान किए बिना शीर्ष पर ताजा माध्यम का 1 एमएल जोड़ें।
9. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 को₃ सप्ताह तक इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  नोट: कॉलोनी गठन के लिए आवश्यक समय विभिन्न सेल प्रकारों के बीच भिन्न हो सकता है, लेकिन आमतौर पर 3 सप्ताह पर्याप्त होते हैं।
10. प्रति सप्ताह दो बार माध्यम बदलें। ऐसा करने के लिए, धीरे-धीरे प्लेट को आपकी ओर झुकाएं, निचले कोने में मध्यम को एस्पिरेट करें, और 1 एमएल ताजा माध्यम जोड़ें।
  नोट: आगर परतों को छूने से बचें क्योंकि वे आसानी से प्लेट से अलग हो जाते हैं।
एमटीटी धुंधला
1. 0.2 माइक्रोम फिल्टर का उपयोग करके अल्ट्रापुरे पानी में 6 मिलीग्राम/एमएल पर थियाजोलिल ब्लू टेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) स्टॉक समाधान तैयार करें। इस एमटीटी समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  सावधानी: एमटीटी जलन पैदा कर सकता है और आनुवंशिक दोष पैदा करने की आशंका है। सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, और एक श्वसन फिल्टर का उपयोग करें।
  नोट: बार-बार फ्रीज-गल चक्र से बचें।
2. बाँझ अल्ट्रापुरे पानी के साथ स्टॉक समाधान को पतला करके 1 मिलीग्राम/एमएल पर एमटीटी का एक कार्य समाधान तैयार करें।
3. एक बार कॉलोनी निर्माण अवधि समाप्त हो जाने के बाद, प्लेट से माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 1 मिलीग्राम/एमएल एमटीटी का 1 एमएल जोड़ें।
4. इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट। एमटीटी समाधान को धीरे-धीरे हटा दें। प्लेटों को कई हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  नोट: गैर-विशिष्ट क्रिस्टल गठन को रोकने के लिए प्रकाश जोखिम से बचें।
कॉलोनी मात्रा
1. उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक प्लेट की छवियां प्राप्त करें। कम छवियों के साथ देखने के अधिकतम क्षेत्र को प्राप्त करने और अभी भी छोटी उपनिवेशों (आमतौर पर 4x या 10x उद्देश्यों) का पता लगाने में सक्षम होने के लिए आवर्धन को समायोजित करें।
  नोट: सुनिश्चित करें कि छवियां एक सजातीय पृष्ठभूमि पेश करते हैं। न तो चरण-इसके विपरीत और न ही अंतर हस्तक्षेप के विपरीत की आवश्यकता है क्योंकि गैर-दाग वाली कॉलोनियों की मात्रा निर्धारित नहीं की जाएगी ।
2. कालोनियों की संख्या और प्रत्येक एमटीटी-पॉजिटिव कॉलोनी के क्षेत्र की गणना करने के लिए इमेजजे/फिजी सॉफ्टवेयर¹² पर छवियां अपलोड करें।
  नोट: एक अनुपूरक फ़ाइलके रूप में स्वचालित मात्राकरण के लिए एक स्क्रिप्ट प्रदान की गई है । कोड को निष्पादित करने के लिए, इसे मैक्रो एडिटर(प्लगइन्स |) पर चिपका दें नई | मैक्रो) और निर्देशों का पालन करें।
  1. मूल छवि को दहलीज के माध्यम से एक बाइनरी मास्क प्राप्त करें(इमेज | | समायोजित करें सीमा)अच्छी तरह से-सीमित कालोनियों(चित्रा 1)प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: इस चरण को करने के लिए आमतौर पर 8 या 16-बिट छवियों की आवश्यकता होती है। "न्यूनतम सीमा" विधि की सिफारिश की जाती है।
  2. बायोवोक्सेल प्लगइन¹³ से एक्सटेंडेड पार्टिकल एनालाइजर चलाएं(प्लगइन्स | बायोवोक्सेल | विस्तारित कण विश्लेषक)एमटीटी सकारात्मक कॉलोनियों(चित्रा 2) कीपहचान करने के लिए । प्रारंभिक मार्गदर्शक स्थितियां: आकार (μm²⁾= 250-अनंत; दृढ़ता = 0.75-1.00।
3. सूत्र के अनुसार प्रत्येक कॉलोनी क्षेत्र मूल्य (ए) से औसत व्यास (डी) का अनुमान लगाएं:
4. कम प्रोलिफेरिव कॉलोनियों (जैसे, कम व्यास) को छोड़कर फ़िल्टर परिणाम।
  1. विचार किए जाने वाले प्रति सप्ताह कम से कम डिवीजनों(एम)का चयन करें (उदाहरण के लिए, 1)।
  2. निम्नलिखित सूत्र के अनुसार एन कोशिकाओं के साथ एक कॉलोनी(आर)के त्रिज्या का अनुमान लगाएं:
    
    जहां, आर निलंबन में व्यक्तिगत कोशिकाओं का औसत त्रिज्या है, एन एक कॉलोनी है कि संस्कृति में डब्ल्यू सप्ताह के दौरान हर हफ्ते एम विभाजन का सामना करना पड़ा बनाने कोशिकाओं की संख्या है । घातीय विकास में: एन = 2^{(एम * डब्ल्यू)}। पैकेजिंग दक्षता है। ध्यान दें कि, यादृच्छिक आंदोलन में, पैकेजिंग दक्षता ~ 0.64 है और समान क्षेत्रों के लिए सबसे घना संभव पैकिंग अंश 0.74¹⁴है।
  3. 2आर से कम व्यास पेश करने वाली सभी कॉलोनियों को त्यागें क्योंकि उनकी कोशिकाओं ने चरण 3.3.4.1 में विचार किए गए डिवीजनों की न्यूनतम संख्या हासिल नहीं की है।

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Representative Results

बीपीईसी में तीन आनुवंशिक तत्वों की शुरूआत के साथ सेलुलर परिवर्तन का एक प्रयोगात्मक मॉडल ऑन्कोजेनिक परिवर्तन^6,⁷ (चित्रा 3)के प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए चुना गया था। गैर-परिवर्तित बीपीईसी(एन)रोग मुक्त स्तन ऊतक से प्राप्त किए गए थे जैसा कि Ince और सहयोगियों द्वारा वर्णित किया गया था^और यहां बताए गए प्रोटोकॉल के बाद सुसंस्कृत थे। STASIS पर काबू पाने के बाद (तनाव या विचलित संकेत प्रेरित-सेनेसेंस, एक घटना आम तौर पर विट्रो में स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं में देखी जाती है जो कोशिका संस्कृति स्थापना के लगभग 4 सप्ताह बाद दूर होती है), कोशिकाओं को लगातार लेंटीवायरल कणों के साथ ट्रांसड्यूड किया गया था pRRL-CMV-Ttag-IRES-IRES-eGFP और pRRL-CMV-TERT-IRES-चेरीएफपी आंशिक रूप से परिवर्तित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए (डबल ट्रांसड्यूड; घ)वायरल टैटैग की अभिव्यक्ति p53 और रेटिनोब्लास्टोमा समारोह को रोकती है, और एचटीईआरटी जीन की एक्टोपिक अभिव्यक्ति प्रसार-निर्भर टेलोमेरे लंबाई उदासीनता के लिए क्षतिपूर्ति करती है। सेल छंटाई द्वारा फ्लोरोसेंट चयन के बाद, कोशिकाओं को पूर्ण-सीएमवी/टोरासवी12-पुरो के साथ स्थानांतरित किया गया था, जो एक निरंतर मिटोजेनिक संकेत प्रदान करता है, और फिर ट्रांसड्यूड कोशिकाओं (ट्रिपल ट्रांसड्यूड) का चयन करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में वृद्धि करता है; टी), जो पूरी तरह से Ince और सहयोगियों के अनुसार बदल रहे थे⁶.

जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है, प्रतिगमन रेखा की ढलान में वृद्धि (समीकरण 1.2.3 में पैरामीटर बी) बीपीईसी(एन:0.47, डी:0.93, टी:1.13) में पेश किए गए आनुवंशिक संशोधनों की बढ़ती संख्या के साथ मनाया जाता है। समय के एक विशिष्ट अंतराल के लिए, आंशिक रूप से(डी)और पूरी तरह से परिवर्तित(टी)कोशिकाओं ने गैर-परिवर्तित कोशिकाओं(एन)की तुलना में जनसंख्या दोगुनी की अधिक संख्या हासिल की, इस प्रकार परिवर्तन प्रक्रिया के साथ सेल डिवीजन दर में वृद्धि हुई। एक ही परिणाम भी कोशिकाओं की आबादी (टी डी) की नकल करने के लिए आवश्यक समय के रूप में व्यक्त किया जा सकता_है,जो समीकरण y = bx में 1 (पीडी) द्वारा y की जगह के बाद प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार टी_डी = 1/b । ढलान के विपरीत, टी_डी परिवर्तन के साथ कम हो जाती है। जबकि गैर-परिवर्तित कोशिकाओं को अपनी आबादी को डुप्लिकेट करने के लिए 2 दिनों से अधिक की आवश्यकता थी(एन:टी_डी = 2.13 दिन), आंशिक रूप से परिवर्तित कोशिकाओं ने इसे आधे समय में किया(डी:टी_डी = 1.08 दिन)। एक संविलियन प्रमोटर के नियमन के तहत एचआरएएस के अलावा प्रसार गतिविधि में वृद्धि हुई और कोशिकाओं को इस ऑनकोजीन की मिटोजेनिक गतिविधि के साथ समझौते में डुप्लिकेट(टी:_टी डी = 0.89 दिन) की आवश्यकता हुई।

जबकि मोनोलेयर सेल संस्कृति इन विट्रो सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, यह एक दृढ़ता से सीमित दृष्टिकोण है क्योंकि यह अधिकांश शारीरिक स्थितियों को पुन: पेश नहीं कर सकता है। इसके बजाय, यहां वर्णित त्रि-आयामी कोशिका संस्कृति तकनीक विभिन्न वंशों से कोशिकाओं को सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स जंक्शन निर्माण(चित्रा 5A)के लिए धन्यवाद 3 डी पर्यावरण में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देती है। समय-चूक)। अगले 2 हफ्तों के दौरान, कोशिकाएं अपने मूल ऊतक कार्य के अनुसार वितरित करती हैं और असिनी आकार(चित्रा 5B)में वृद्धि करती हैं। प्रत्येक एकिनस के उचित ध्रुवीकरण का सही आकलन किया जा सकता है, जो ल्यूमिनल (क्लाउडिन-IV) और मायोएपिथेलियल (साइटोकेराटिन 14) वंश मार्कर के साथ तीन-आयामी सिग्नल स्थान के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 6 ए)के इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन के संयोजन के संयोजन के लिए धन्यवाद है। जबकि गैर-परिवर्तित बीपीईसी द्वारा गठित सभी असिनी को ठीक से व्यवस्थित किया गया था (साइटोकेरटिन 14 सकारात्मक कोशिकाओं से घिरे क्लाउडिन-IV सकारात्मक कोशिकाएं; चित्रा 6Ai),ध्रुवीकरण की हानि(चित्रा 6Aii)आंशिक रूप से और पूरी तरह से बदल BPECs(चित्रा 6B)द्वारा गठित acini में मनाया गया था ।

एक परिवर्तित कोशिका के मुख्य गुणों में से एक बेसल लैमिना के साथ संपर्क की स्वतंत्रता के साथ बढ़ने की क्षमता है। इस संपत्ति का मूल्यांकन 3 सप्ताह के लिए एगर पर एम्बेडेड कोशिकाओं को बढ़ाकर किया गया था, जो प्लेट सतह(चित्रा 7A)के लिए अपने एंकरेज से परहेज करता था। निम्नलिखित 3 हफ्तों के दौरान, एंकरेज-स्वतंत्र विकास क्षमता वाले उन कोशिकाओं ने कई कोशिकाओं से बनी उपनिवेशों को जन्म दिया। जैसा कि चित्रा 8में दिखाया गया है, आगर में वरीयता प्राप्त होने के 2 दिन बाद, कुछ कोशिकाओं को पहले से ही 2-3 डिवीजनों का सामना करना पड़ा। 1 सप्ताह के बाद, मृत्यु जैसी आकृति विज्ञान वाली कोशिकाओं को यह दर्शाता देखा जा सकता है कि इन स्थितियों के तहत जीवित रहने में सक्षम कोशिकाएं अंततः मर गईं, एनोकिसद्वारा सबसे अधिक संभावना है। बहरहाल, कुछ कोशिकाओं को विभाजित करने और संस्कृति के दूसरे और तीसरे सप्ताह में बढ़ रही छोटी कालोनियों के गठन जारी है ।

एमटीटी को संस्कृति में जोड़ने के बाद, केवल वे कोशिकाएं मेटाबोलिक रूप से सक्रिय हैं, यानी, जीवित, एमटीटी के टेट्राज़ोलियम रिंग को क्लीव करने में सक्षम हैं जिसके परिणामस्वरूप 24 घंटे बाद(चित्रा 7B)बैंगनी एमटीटी formazan क्रिस्टल होता है। हालांकि, ये क्रिस्टल न केवल जीवित कोशिकाओं के साथ उपनिवेशों द्वारा बनाए जाते हैं बल्कि एकल कोशिकाओं द्वारा भी एगर(चित्रा 9)में 3 सप्ताह के बाद जीवित हैं। चूंकि इस तकनीक का उद्देश्य कोशिकाओं की क्षमता को सब्सट्रेट-स्वतंत्र तरीके से पैदा करना है, इसलिए एमटीटी-पॉजिटिव कॉलोनियों के आकार का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। कॉलोनी व्यास के माप का मूल्यांकन स्वचालित छवि विश्लेषण(चित्रा 7 सी)द्वारा किया जा सकता है ताकि छोटी उपनिवेशों या व्यक्तिगत कोशिकाओं को फ़िल्टर किया जा सके। जैसा कि चित्रा 10में दिखाया गया है, ग्रे डॉट्स उन कॉलोनियों के अनुरूप हैं जिन्होंने 3 सप्ताह में तीन डिवीजनों से कम का सामना किया है, इस प्रकार व्यास के 65 माइक्रोन से कम मापते हैं। इन घटनाओं को डेटा विज़ुअलाइज़ेशन में शामिल किया गया था लेकिन अंतिम परिमाणीकरण से बाहर रखा गया था।

कुल मिलाकर, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एंकरेज स्वतंत्रता परख परिवर्तन के विभिन्न डिग्री(चित्रा 10)के बीच भेदभाव की अनुमति देता है । गैर-परिवर्तित बीपीईसी द्वारा गठित कॉलोनियों की संख्या आंशिक रूप से और पूरी तरह से परिवर्तित बीपीईसी (कॉलोनी संख्या: एन = 3; द्वारा गठित लोगों की तुलना में नगण्य थी। D = 278; टी = 243)। इसके अलावा, जब कॉलोनी के आकार पर विचार किया गया था, तो आंशिक रूप से और पूरी तरह से परिवर्तित राज्यों के बीच मतभेद स्पष्ट हो गए (कॉलोनी औसत आकार: एन = 70 माइक्रोन; D = 83 माइक्रोन; T = 114 माइक्रोन)। कॉलोनी के आकार को ध्यान में रखते हुए अध्ययन सेल लाइनों की ट्यूमरजन्य क्षमता के बारे में अधिक सटीक जानकारी प्रदान करता है और इस प्रकार इस पर विचार करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

चित्रा 1: फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एमटीटी धुंधला होने के बाद स्क्रीनशॉट छवि थ्रेसहोल्ड का उदाहरण देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: फिजी सॉफ्टवेयर में बायोवोक्सेल प्लगइन स्थितियों और परिणाम से विस्तारित कण विश्लेषक का स्क्रीनशॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3: सेलुलर परिवर्तन के प्रयोगात्मक मॉडल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4: गैर-परिवर्तित, आंशिक रूप से और पूरी तरह से परिवर्तित BPECs में प्रसार दर। सबसे फिट लाइनों और ९५% विश्वास बैंड (बिंदीदार लाइनों) रैखिक प्रतिगमन के दिखाए जाते हैं । एक रैखिक प्रतिगमन मॉडल के लिए ANCOVA शर्तों के बीच तुलना के लिए लागू किया गया था; * पी-वैल्यू< 0.0001। यह आंकड़ा Repullés एट अल से अनुकूलित किया गया है । २०१९⁷। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 5: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में बीपीईसी सीडिंग के बाद असिनी गठन और विकास। (ए)बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में बीपीईसी सीडिंग के बाद प्रारंभिक समय (0 से 7 घंटे तक) के लिए एक समय-चूक की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 100 माइक्रोन (बी) असिनी आकार गैर-रूप से, आंशिक रूप से, और पूरी तरह से परिवर्तित बीपीईसी के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में संस्कृति के 14 दिनों में। त्रुटि सलाखों एसईएम इंगित करता है। 14 दिन पर शर्तों के बीच कोई सांख्यिकीय मतभेद (एक तरह से ANOVA और Tukey सुधार; पी-वैल्यू>0.05) । यह आंकड़ा Repullés एट अल से अनुकूलित किया गया है । २०१९⁷। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 6: गैर-परिवर्तित, आंशिक रूप से(डी)में असिनी ध्रुवीकरण, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में 3 डी संस्कृति के बाद पूरी तरह से बदल(टी)बीपीईसी। (A)साइटोकेराटिन 14 (K14, लाल) और क्लाउडिन-IV (सीएल-IV, ग्रीन) इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद एक ध्रुवीकृत और गैर-ध्रुवीकृत acinus की प्रतिनिधि छवियां । ध्रुवीकृत असिनी (i) पर विचार किया गया जब साइटोकेराटिन 14-सकारात्मक कोशिकाओं ने क्लाउडिन-IV सकारात्मक कोशिकाओं को घेर लिया; अन्यथा, असिनी को गैर-ध्रुवीकृत माना जाता था क्योंकि साइटोकेराटिन 14 और क्लाउडिन-IV सकारात्मक कोशिकाएं मध्य और परिधीय स्थानों (ii) दोनों में स्थित थीं। स्केल बार = 25 माइक्रोन(बी) असिनी ध्रुवीकृत का प्रतिशत। प्रत्येक स्थिति के लिए न्यूनतम 10 असिनी का विश्लेषण किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 7: BPECs में एंकोरेज-स्वतंत्र विकास परख के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कोशिकाओं को नरम आगर(ए)में 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर एमटीटी धुंधला(बी)लागू किया गया था । स्केल बार = 5 मिमी(सी)एमटीटी सकारात्मक उपनिवेशों को फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। छवि प्रसंस्करण पर विभिन्न चरणों पर प्रकाश डाला जाता है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 8: 0.3% आगर में व्यक्तिगत कोशिकाओं को बोने के बाद 3 सप्ताह के लिए कोशिका विकास का विकास। छवियां आंशिक रूप से परिवर्तित बीपीईसी संस्कृति से प्राप्त की जाती हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 9: एमटीटी धुंधला और मात्राकरण के प्रतिनिधि छवियां। एमटीटी-पॉजिटिव कॉलोनी (पंक्ति 1), दो एमटीटी-नकारात्मक उपनिवेशों (पंक्ति 2) और एमटीटी धुंधला (पंक्ति 3) के लिए सकारात्मक या नकारात्मक कोशिकाओं के साथ उदाहरण दिखाए जाते हैं। एक एमटीटी पॉजिटिव कॉलोनी या सेल के क्षेत्र को इंगित करता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10: नॉन-ट्रांसफॉर्मेड(एन),आंशिक रूप से(डी)में एंकरेज-इंडिपेंडेंट परख के बाद कॉलोनी क्वांटिफिकेशन, और पूरी तरह से बदल(टी)बीपीईसी। (A)विभिन्न परिस्थितियों के लिए प्राप्त कॉलोनियों की संख्या और व्यास। प्रत्येक डॉट एक कॉलोनी से मेल खाती है। सॉफ्ट ग्रे डॉट्स एमटी पॉजिटिव कॉलोनियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिन्हें परिणामों में बाहर रखा गया था क्योंकि उनका व्यास 65 माइक्रोन से कम था (समीकरण संख्या 4 लागू करने और प्रति सप्ताह कम से कम एक डिवीजन को ध्यान में रखने के बाद न्यूनतम आकार माना जाता है)। लाल रेखा प्रत्येक समूह के लिए औसत कॉलोनी व्यास को इंगित करती है। प्रत्येक स्थिति के लिए दो स्वतंत्र प्रतिकृतियां प्रदर्शन की गईं। विभिन्न पत्र (ए, बी, सी) कालोनियों की संख्या के लिए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर इंगित करते हैं (फिशर का सटीक परीक्षण; पी-वैल्यू& 0.05) और उनके औसत व्यास के लिए (कई तुलना सुधार के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण; पी-वैल्यू< 0.05)। इस ग्राफ को रिपुलेस एट अल से अनुकूलित किया गया^है। (ख)एमटीटी धुंधला होने के बाद पूरे कुओं की प्रतिनिधि छवियां । स्केल बार = 5 मिमी; इनसेट स्केल बार = 2.5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फाइल। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पत्र में वर्णित प्रायोगिक प्रोटोकॉल इन विट्रो सुसंस्कृत कोशिकाओं के ऑन्कोजेनिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं। प्रत्येक तकनीक परिवर्तन प्रक्रिया के विशिष्ट पहलुओं का मूल्यांकन करती है, और इस प्रकार, एक विश्लेषण से निष्कर्ष निकालते समय विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। विकास घटता निर्माण एक दृष्टिकोण है कि पहले से ही उपलब्ध जानकारी की मांग जब अंय प्रयोजनों के लिए कोशिकाओं culturing है । कि इस तकनीक को सस्ता और अन्य सेल प्रसार परख की तुलना में लागू करने के लिए आसान बनाता है। हालांकि, वैध परिणाम प्राप्त करने के लिए, हर बार जब वे उपसंस्कृत होते हैं तो गणना और सीडिंग कोशिकाओं पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। बढ़ी हुई वृद्धि दर सेलुलर परिवर्तन¹का संकेत है, लेकिन इसका उपयोग अकेले नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि एंटीबायोटिक और एंटीफंगल पदार्थों को अलग/हटाने या संस्कृति की स्थितियों में भिन्नता (जैसे, तापमान, सीओ₂₎भी सेलुलर विभाजन को प्रभावित कर सकते हैं । यह भी विचार करना महत्वपूर्ण है कि दवाओं के साथ कोशिकाओं के लेनदेन या उपचार आने वाले दिनों या हफ्तों में उनकी विकास दर को प्रभावित कर सकते हैं और इस प्रकार दीर्घकालिक प्रसार क्षमता का विकृत दृष्टिकोण देते हैं । इस संबंध में, उचित नियंत्रण किया जाना चाहिए ।

तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में 3 डी संस्कृति एक पूरी कार्यात्मक इकाई, acinusके भीतर सेल वितरण के आकलन की अनुमति देता है । एक परिवर्तित संगठन एक अंतरकोशिकीय संचार हानि का संकेत है जो कार्य की हानि का कारण बन सकता है, ट्यूमर ऊतकों की विशेषता। तथ्य यह है कि कुछ असिनी वर्तमान गैर-ध्रुवीकृत संगठन इंगित करता है कि कुछ कोशिकाओं ने परिवर्तन प्रक्रिया शुरू की है। तकनीकी मुद्दों के बारे में, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की इष्टतम एकाग्रता और मैट्रिक्स की एकाग्रता को सही ढंग से निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। ये दो पैरामीटर परिणामी असिनी की संख्या और आकार को प्रभावित कर सकते हैं और यह उनकी संगठनात्मक क्षमता में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के हेरफेर के अनुभव की एक निश्चित डिग्री की आवश्यकता है क्योंकि इसे धीरे से संभाला जाना चाहिए। एक श्रमसाध्य तकनीक होने के बावजूद, तीन आयामों में कोशिकाओं का विकास इन कोशिकाओं के शारीरिक संदर्भ जैसा दिखता है और मूल्यांकन को न केवल स्तन वंश मार्कर^7,¹⁵ के वितरण के मूल्यांकन की अनुमति देता है^{बल्कि}अन्य संरचनाओं की भी अनुमति देता है जो ट्यूमर की सुविधाओं के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, जैसे कि तहखाने झिल्ली¹⁶का व्यवधान। 3 डी सेल संस्कृति सेल संस्कृति अनुसंधान में भविष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। वास्तव में, 3 डी वृद्धि माइक्रोएनवायरमेंट तत्वों को ध्यान में रखते हुए और हमें बहुत सारे विभिन्न अध्ययनों के साथ-साथ चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और मूल्यांकन, सेल से सेल इंटरैक्शन, या स्टेम सेल जांच के साथ प्रदान करते हुए अधिक शारीरिक और दिलचस्प निष्कर्षों को जन्म दे सकती है।

एंकोरेज-अनुयायी कोशिकाओं का स्वतंत्र विकास परिवर्तन प्रक्रिया का एक स्पष्ट इलाज है। जबकि आंशिक रूप से और पूरी तरह से परिवर्तित बीपीईसी में से कुछ अभी भी एक संरचित एसिनसको जन्म देने में सक्षम थे, वे निलंबन में व्यक्तिगत रूप से बढ़ने के लिए मजबूर होने पर उपनिवेश बनाने की अपनी क्षमता प्रकट करते हैं। तकनीकी स्तर पर, एंकरेज परख भी जटिल है क्योंकि आगर हेरफेर (उदाहरण के लिए, उच्च तापमान) के दौरान या ट्राइसाइनाइजेशन के बाद कोशिकाओं के विघटन के दौरान छोटे बदलाव सेल कॉलोनी गठन को बेहद प्रभावित कर सकते हैं। हालांकि, आवश्यक सामग्री 3 डी सेल संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की तुलना में सस्ता है जो एंकरेज-स्वतंत्र विकास का आकलन अधिक किफायती बना रही है। इसके अलावा, एमटीटी इसके अलावा से पहले, एकल उपनिवेशों को उठाया जा सकता है और एक अनुयायी सतह के साथ प्लेटों में एगर से बाहर निकलने की अनुमति दी जा सकती है। इन उपनिवेशों के परिणामस्वरूप क्लोनल सेल लाइनें हो सकती हैं जो निलंबन में बढ़ती रहेंगी या फिर से पालन कर सकती हैं। डीएनए, आरएनए, और/या प्रोटीन आगे विश्लेषण के लिए इन कोशिका संस्कृतियों से निकाला जा सकता है ।

यहां वर्णित तरीकों के बारे में एक सामान्य सीमा है: वे बहुत समय लेने वाले हैं, और परिणाम प्राप्त करने में कई सप्ताह लगते हैं। हालांकि, चूंकि प्रत्येक परीक्षण एक विशिष्ट ट्यूमर विशेषता का आकलन करता है, परिणामों के पूरे सेट को ध्यान में रखते हुए किए गए निष्कर्ष बहुत मजबूत होते हैं। इसलिए, तीनों परीक्षण एक साथ सेलुलर परिवर्तन के शक्तिशाली संकेतक हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एजी प्रयोगशाला स्पेनिश परमाणु सुरक्षा परिषद द्वारा वित्त पोषित है । टीए और एजी जनरलिट डी कैटालुन्या (2017-एसजीआरआर-503) द्वारा मान्यता प्राप्त एक शोध समूह के सदस्य हैं। एमटी के पास साइंटिफिक फाउंडेशन एसोसिएन एस्पानोला कॉन्ट्रा एल कांसर [एईसीसी-इनव्से190222टीआर] द्वारा वित्त पोषित अनुबंध है। G.F. अनुबंध सेलेक्स फाउंडेशन से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित है ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture

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References

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Cancer Research

मानव स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं में ओंकोजेनिक परिवर्तन का विट्रो मूल्यांकन

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Introduction

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Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

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