تحضير اللقاح المخصب بالفيروسات للعدوى الفموية لنحل العسل (Apis mellifera)

Summary

هنا نصف بروتوكولين: الأول لنشر واستخراج وتنقية وقياس كميات كبيرة من جزيئات فيروس نحل العسل غير المغلفة ، بما في ذلك طريقة لإزالة شرانق نحل العسل وثانيا لاختبار آثار العدوى الفيروسية باستخدام فحص حيوي قفص عالي التكرار وعالي الإنتاجية.

Abstract

يتمتع نحل العسل بأهمية بيئية وزراعية كبيرة في جميع أنحاء العالم ولكنه يخضع أيضا لمجموعة متنوعة من الضغوط التي تؤثر سلبا على صحة النحل ، بما في ذلك التعرض لمسببات الأمراض الفيروسية. يمكن أن تسبب هذه الفيروسات مجموعة واسعة من الآثار المدمرة ويمكن أن يكون من الصعب دراستها في كثير من الأحيان بسبب عوامل متعددة تجعل من الصعب فصل آثار العلاجات التجريبية عن عدوى الخلفية الموجودة مسبقا. نقدم هنا طريقة لإنتاج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس إلى جانب فحص حيوي عالي الإنتاجية لاختبار العدوى الفيروسية وآثارها. وبسبب النقص الحالي في خط خلايا نحل العسل المستمر والخالي من الفيروسات، يتم تضخيم الجسيمات الفيروسية في الجسم الحي باستخدام شرانق نحل العسل، والتي يتم استخراجها من الخلية بكميات كبيرة باستخدام منهجية الحد الأدنى من الإجهاد. يمكن بعد ذلك استخدام جزيئات الفيروس هذه في المقايسات الحيوية لأقفاص نحل العسل لاختبار صلاحية التلقيح ، بالإضافة إلى العديد من ديناميكيات عدوى الفيروس الأخرى ، بما في ذلك التفاعلات مع التغذية والمبيدات الحشرية ومسببات الأمراض الأخرى. ومن المزايا الرئيسية لاستخدام هذه الجسيمات أنها تقلل إلى حد كبير من فرص إدخال متغيرات غير معروفة في التجارب اللاحقة عند مقارنتها بالبدائل الحالية، مثل العدوى عن طريق هيموليمفاوية النحل المصابة أو المتجانسة، على الرغم من أنه لا يزال ينبغي توخي الحذر عند الحصول على النحل، لتقليل تلوث الفيروسات في الخلفية. واختبارات الأقفاص ليست بديلا عن التجارب الميدانية الواقعية واسعة النطاق التي تختبر آثار عدوى الفيروس على مستوى المستعمرة، ولكنها تعمل بدلا من ذلك كطريقة لإنشاء استجابات فيروسية أساسية يمكن أن تكون بمثابة أدوات مهمة لدراسة الأبعاد المختلفة للتفاعلات الفسيولوجية بين نحل العسل وفيروس العسل.

Introduction

يلعب نحل العسل (Apis mellifera) دورا حاسما في المشهد الزراعي العالمي الحديث ولكنه يعاني حاليا من مزيج من الضغوطات الحيوية وغير الحيوية ، بما في ذلك التعرض لمبيدات الآفات والأعلاف الفقيرة والطفيليات ومسببات الأمراض ^1,2. واحدة من أهم مسببات الأمراض المثيرة للقلق هي الفيروسات ، وكثير منها ينتقل بواسطة آخر من الضغوطات الرئيسية لنحل العسل ، سوس الفاروا الطفيلي (Varroa destructor). يمكن أن تسبب هذه الفيروسات مجموعة من الآثار السلبية في نحل العسل بما في ذلك انخفاض بقاء الحضنة ، وعيوب النمو ، والشلل الذي يمكن أن يؤدي إلى انهيار الخلية الكلي قبل وبعد فترات الشتاء^3،4،5. على الرغم من وجود تقدم واعد في تطوير التقنيات المستخدمة لمكافحة عدوى الفيروس⁶،^7،8،^{9 ،} إلا أن الديناميكيات التي تنتشر بها العديد من الفيروسات وتنتشر وتتفاعل داخل نحلة العسل أو المستعمرة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد ^5,10 . إن فهم البيولوجيا الأساسية لنحل العسل وتفاعلات الفيروسات وعلاقاتها مع العوامل البيئية الأخرى أمر بالغ الأهمية لتطوير تقنيات فعالة لإدارة الفيروسات.

ومع ذلك ، فإن دراسة التفاعلات بين نحل العسل وفيروسه تشكل تحديات مع العديد من العوامل المعروفة وغير المعروفة التي تعقد العملية. وتشمل هذه التفاعلات مع النظام الغذائي¹¹،¹² ، والتعرض لمبيدات الآفات¹³ ، والخلفية الوراثية للنحل^14،15. حتى عند التركيز على عدوى الفيروس وحدها ، فإن المضاعفات شائعة لأن مجموعات نحل العسل ، سواء المدارة أو البرية ، لديها دائما درجة معينة من عدوى الفيروس الخلفية ، على الرغم من أنها غالبا ما تكون دون إظهار أعراض حادة^16,17 ، وآثار العدوى المشتركة للفيروس ليست مفهومة جيدا ¹⁸. وقد جعل هذا من الصعب فصل دراسة آثار فيروس نحل العسل.

استخدمت العديد من دراسات فيروس نحل العسل عدوى الفيروسات الظرفية للبحث عن التفاعلات مع الضغوطات الأخرى ، مع ملاحظة كيفية تغير العدوى الخلفية مع العلاجات الأخرى¹²،^19،20،21. وفي حين أن هذا النهج كان ناجحا في تحديد الآثار الهامة، وخاصة اكتشاف كيفية تأثير مبيدات الآفات أو العلاجات الغذائية على مستويات الفيروس وتكراره، فإن التلقيح بعلاج الفيروس بمحتوى وتركيز معروفين أمر بالغ الأهمية للاختبار التجريبي لديناميات عدوى الفيروس. ومع ذلك ، فإن فصل العلاج التجريبي عن العدوى الخلفية يمكن أن يشكل أيضا تحديات. في الدراسات الميدانية ، قام الباحثون بالتمييز بين سلالات فيروس الجناح المشوه (DWV) لتقديم أدلة على انتقال الفيروس من نحل العسل إلى النحل الطنان²² ، ولكن استخدام هذا النهج سيكون صعبا داخل نحل العسل وحده. تعد الحيوانات المستنسخة المعدية للفيروسات أداة قوية ، ليس فقط لتتبع العدوى 23،24،²⁵ ولكن لدراسات علم الوراثة العكسية لفيروسات نحل العسل ولأبحاث التفاعل بين الفيروس والمضيف 26،^27،28. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، لا تزال هناك حاجة إلى استنساخ المعدية لتحقيق دورة العدوى داخل الخلايا لإنتاج الجسيمات. ويفضل استخدام هذه الجسيمات كلقاح للعلاجات التجريبية لأن عدويتها أعلى من الحمض النووي الريبي الفيروسي العاري والتلقيح بالجينوم المغلف يحاكي العدوى الطبيعية.

كما أن إنتاج لقاح فيروس نحل العسل النقي غير الملوث (سلالات الفيروسات من النوع البري أو تلك المشتقة من الحيوانات المستنسخة المعدية) يشكل أيضا تحديات. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الصعوبات في الحصول على خط خلايا نحل عسل موثوق به ومتكرر باستمرار وخال من الفيروسات لإنتاج فيروسات سلالة نقية^29,30. وفي حين تم إنتاج بعض خطوط الخلايا، لا تزال هذه النظم غير كاملة؛ ومع ذلك ، هناك أمل في إمكانية إنتاج خط خلوي قابل للحياة²⁹ ، مما سيسمح بتحكم أدق في إنتاج الفيروس والتحقيق فيه. وإلى أن يصبح هذا الخط متاحا على نطاق واسع، ستستمر معظم بروتوكولات إنتاج الفيروسات في الاعتماد على استخدام ^18،31،³²،^33،34 في إنتاج وتنقية الفيروسات في الجسم الحي. تتضمن هذه الأساليب تحديد وتنقية جزيئات الفيروس ذات الأهمية (أو إنتاج استنساخ معدي) واستخدامها لإصابة نحل العسل ، عادة ما تكون شرانق. يتم حقن الشرانق مع الفيروس المستهدف ثم التضحية بها ، ويتم استخراج المزيد من الجسيمات وتنقيتها. ومع ذلك ، نظرا لعدم خلو النحل من الفيروسات في البداية ، فهناك دائما درجة معينة من التلوث من آثار الفيروسات الأخرى في أي مركز من هذا القبيل ، وبالتالي ، يجب توخي الحذر الشديد في اختيار النحل مع احتمال منخفض للإصابة بالعدوى في الخلفية. علاوة على ذلك ، فإن طرق إزالة الشرانق من خلايا المشط لاستخدامها في هذه البروتوكولات³³ كثيفة العمالة للغاية ويمكن أن تحفز الإجهاد في النحل ، مما يحد من الإنتاج بهذه الوسائل ^18,32. هنا ، نبلغ عن طريقة بديلة تسمح بإزالة اليرقات على نطاق واسع مع القليل من العمالة والضغط الميكانيكي الأقل على النحل.

بمجرد الحصول على الشرانق وحقنها بلقاح الفيروس المبتدئ ، يجب تحضينها لتوفير وقت الفيروس للتكاثر. في وقت لاحق ، يمكن معالجة جزيئات الفيروس المنتجة في شكل قابل للاستخدام لإصابة النحل التجريبي. هناك العديد من الطرق البسيطة لتحقيق ذلك ، بما في ذلك استخدام متجانس خام ^35,36 أو الهيموليمف الناتج عن النحل المصاب بالفيروسات كمصدر للعدوى³⁷. هذه الطرق فعالة ولكنها تواجه فرصة أكبر لإدخال متغيرات غير معروفة من الركيزة الخلفية (على سبيل المثال ، عوامل أخرى في متجانسات النحل الميت). بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن تركيز الجسيمات إذا كانت التجربة تتطلب إعطاء جرعة كبيرة ومعروفة من الفيروس في فترة زمنية قصيرة. لذلك ، من أجل تحكم أفضل ، من الأفضل استخدام طرق تسمح بمستوى معين من تنقية وتركيز جزيئات الفيروس. وعموما، ستؤدي سلسلة من خطوات هطول الأمطار والطرد المركزي إلى إزالة جميع مواد الفيروس غير المستهدفة المحتملة تقريبا³³.

بعد إنتاج هذا اللقاح المركز ، من المفيد تحديد كمية العيار الفيروسي (qPCR) وتوصيفه بالفحوصات الحيوية في الجسم الحي لاختبار قدرته على البقاء وقدرته على التسبب في الوفيات ، وكذلك للتأكد من أنه يتم الحصول على عيار الفيروس المتزايد بعد الإصابة. يمكن تحقيق ذلك من خلال تجارب الحقن (إما في الشرانق أو البالغين) أو تجارب التغذية (في اليرقات أو البالغين). في حين أن كل هذه الأساليب ممكنة ، فإن التغذية لمجموعات من النحل البالغ في قفص غالبا ما تكون الأسرع والأبسط. تستخدم طريقة فحص القفص أيضا على نطاق واسع لاختبار مختلف العلاجات الأخرى على النحل بما في ذلك سمية المبيدات^{الحشرية 38} ، وتطور المبيض³⁹ ، والتأثير الغذائي على السلوك^40,41 ، وبالتالي ، يمكن أن تشكل أساسا جيدا للتجارب التي تربط عدوى الفيروس بعوامل أخرى ⁴².

هنا نصف طريقة موثوقة لإنتاج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس شبه النقية وعالية التخصيب دون استخدام جهاز طرد مركزي فائق التكلفة ، بما في ذلك طريقة لإزالة الشرانق التي تقلل من العمالة والضغط الميكانيكي على النحل واختبار حيوي عالي الإنتاجية قابل للتكرار للغاية لاختبار العدوى الفيروسية وآثارها. من خلال التحكم بإحكام في نقاء اللقاح الفيروسي ، يستطيع الباحثون تقليل التباين في الاستجابة الفيروسية لنحل العسل مقارنة بطرق التلقيح الفيروسي الأخرى. علاوة على ذلك ، يمكن للفحص البيولوجي فحص التأثيرات الفيروسية على مستوى مجموعات صغيرة باستخدام وحدات تجريبية قابلة للتكرار للغاية قبل التوسع إلى إعدادات واقعية ميدانية ، والتي هي أكثر كثافة في العمالة لإدارتها. في تركيبة ، توفر هاتان الطريقتان الأدوات اللازمة للدراسات التي يمكن أن تساعد في تحسين فهمنا العام للتفاعلات الفسيولوجية بين نحل العسل وفيروس.

Protocol

1. خيار استخراج النحل الجماعي 1: الإزالة الذاتية لليرقات قفص ملكة نحل العسل على إطار لانغستروث فارغ وممتد وأعادها إلى مستعمرتها. اسمح للملكة بوضع البيض على هذا الإطار لمدة 24 ساعة. تحقق من الإطار بعد 24 ساعة للتأكد من أن معظم خلايا المشط تحتوي على بيض تم وضعه حديثا. اعتمادا على الملكة…

Representative Results

إن اتباع البروتوكولات بنجاح (الشكل 1) لحقن العذراء والاستخراج الفيروسي يجب أن ينتج كميات كبيرة من جزيئات الفيروس. ومع ذلك ، فإن أخذ العينات وحقن الشرانق التي يتم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من المستعمرات في نقاط زمنية متعددة يزيد من فرص الحصول على الفيروس المستهدف بتلوث منخفض. إ…

Discussion

لقد أوجزنا هنا طرقا تفصل كل خطوة من خطوات تضخيم الفيروس وعملية تحضير مخزون التلقيح ، بما في ذلك جمع اليرقات وانتشار الفيروس واستخراجه وتركيزه ، بالإضافة إلى العلاج الفيروسي في شكل تجارب تغذية الأقفاص. وتسمح هذه الطرق بإنتاج جزيئات فيروسية شبه نقية (الشكل 4)، يمكن قياس فعال?…

Materials

10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375